방법 논문

신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

DOI:

10.3791/68517

⸱

2025년 7월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 운동 기능 장애를 정량화하여 초파리(Drosophila melanogaster) 의 신경독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 전통적인 포유류 모델은 효과적이기는 하지만 자원 집약적이고 윤리적으로 제약이 있어 대안 적인 생체 내 모델의 필요성을 강조합니다. 현재 접근 방식은 기존 climbing assay를 실시간 모니터링 플랫폼과 통합하여 개별 파리의 운동 장애를 포착합니다. 이 결합된 시스템은 감도, 자동화 및 재현성을 향상시켜 신경독성학 스크리닝을 위한 확장 가능한 전략을 제공합니다. 중요한 절차적 단계에는 표준화된 사육 조건, 파리 폐사 또는 행동 변화를 최소화하기 위한 신중한 마취 및 취급, 시스템의 적절한 보정이 포함됩니다. 미세모세관 기반 공급을 통해 섭취 정량화의 선택적 통합을 가능하게 하여 운동 분석을 보완하고 필요할 때 화합물 섭취량을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 실시간 및 장기 행동 모니터링을 지원하고, 관찰자 편향을 줄이며, 실험을 중단하지 않고 일일 진행 상황을 평가할 수 있습니다. 직접 측정을 사용하여 광 선호도 테스트를 통합할 수 있습니다. 이 플랫폼은 동작 해결, 처리량 및 데이터 일관성에서 상당한 이점을 제공합니다. 일부 대체 시스템에서 볼 수 있는 실시간 형광 기능은 부족하지만 대규모 행동 스크리닝에는 여전히 매우 효과적입니다. 이 프로토콜은 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 생체 내 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 하는 실험실에 특히 유용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경독성 평가는 발달 중인 신경계에 대한 환경 및 제약 화합물의 잠재적 부작용을 평가하는 데 중요합니다1. 전통적인 신경독성 검사는 설치류와 같은 포유류 모델에 의존하는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적으로 제약이 있습니다2. 따라서 신경독성 물질의 신속한 고처리량 스크리닝을 가능하게 하는 대체 모델이 필요합니다3. 연구에 따르면 초파리는 잘 특성화된 유전학, 보존된 신경 발달 경로 및 짧은 수명 주기로 인해 신경독성을 연구하기 위한 강력한 모델 유기체로 부상했습니다 4,5. 행동 종점 중 운동 기능 장애는 신경 발달 장애의 민감하고 정량화 가능한 바이오마커 역할을 하여 인간의 신경 장애와 상관관계가 있을 수 있는 신경독성 효과를 조기에 감지할 수 있습니다6.

파리의 운동 분석은 신경독성에 대한 정량화 가능한 측정을 제공하고 용량 반응 평가를 가능하게 하여 인체 신경독성 위험 감소와 관련이 있습니다7. negative geotaxis assay (climbing)는 파리가 바이알의 바닥을 두드린 후 본능적으로 상승하는 널리 사용되는 접근 방식으로, 이는 운동 발달, 조정 및 균형 수준을 반영합니다 8,9. 이 방법은 간단하고 비용 효율적이며 심각한 운동 이상과 명백한 장애를 평가하는 데 유용하지만, 움직임에 대한 1차원적 평가만 제공할 뿐이며 미묘한 운동 장애, 미세 변화 및 신경 독성 물질에 의해 유발된 증상에 대한 장기적인 행동 모니터링을 감지하는 데 민감도가 부족할 수 있습니다8. 이러한 한계를 극복하기 위해, 에토스코프(Ethoscope) 시스템과 같은 보다 발전된 모션 트래킹 기술이 개발되었다10. 이 자동 녹화 시스템은 높은 정밀도와 재현성으로 파리의 행동을 분석하도록 특별히 설계된 고처리량 비디오 추적 장치입니다11. 기존의 운동 분석과 달리 이 시스템은 움직임을 지속적으로 실시간으로 모니터링하여 기존 등반 분석에서 간과할 수 있는 미묘한 행동 이상을 포착합니다 11,12,13. 이 기술은 고해상도로 파리의 움직임을 지속적으로 기록하는 적외선 조명 카메라 시스템을 사용하여 자동화된 비디오 추적을 제공하여 관찰자 편향을 제거하고 실험 재현성을 개선합니다13. 또한 미세한 움직임을 감지하여 걷기, 휴식, 그루밍, 수유 또는 경련과 같은 미세한 움직임을 구별하여 운동 행동에 대한 보다 자세한 분석을 제공합니다13. 장기간의 행동 모니터링이 가능하여 장기간에 걸쳐 지속적인 추적이 가능하므로 진행성 신경독성 영향을 평가하는 데 이상적이다10. 비디오 녹화 시스템의 확장성과 높은 처리량 용량으로 인해 여러 파리를 동시에 추적할 수 있어 여러 신경독성 화합물과 유전적 상태를 동시에 쉽게 스크리닝할 수 있습니다10. 또한 이 시스템은 오픈 소스 소프트웨어를 통합하여 연구원이 수면-각성 주기, 일주기 리듬 및 상세한 운동 지표를 포함한 실험적 요구 사항에 따라 분석 파이프라인을 사용자 정의할 수 있도록 합니다10,14. Python 기반 프레임워크인 Ethoscopy의 통합과 같은 최근의 발전은 데이터 분석을 향상시켜 행동 연구의 접근성과 재현성을 향상시켰습니다14. 이 프레임워크를 통해 연구원은 더 복잡한 운동 분석을 수행하는 동시에 비전문가 사용자의 장벽을 줄일 수 있습니다. Jupyter 기반 환경인 ethoscope-lab은 원활한 데이터 처리를 더욱 촉진하고 공동 연구를 촉진하며 실험적 재현성을 보장합니다14.

이 연구는 기존 등반 분석법과 함께 고처리량 비디오 추적 플랫폼을 활용하여 발달 신경 독성 물질 노출 후 운동 기능 장애에 대한 포괄적이고 민감한 평가를 제공합니다. 미세한 운동 결함을 분석할 수 있는 능력은 신경 발달 및 운동 조정을 방해하는 화합물을 스크리닝하는 강력한 도구입니다. 신경독성 검사에 초파리를 사용하면 비용 제약으로 인해 대규모 검사가 제한되는 척추동물 모델에 비해 비용 효율성과 높은 처리량 능력을 포함한 여러 가지 이점이 있습니다15. 파리 모델은 질병 상태를 모방하고 신경독의 영향을 받는 분자 경로를 식별하기 위해 신속한 유전자 조작을 가능하게 합니다16. 파리는 포유류의 신경계보다 단순하지만, 신경 발달 및 운동 조절에 관여하는 주요 보존 경로를 유지하고 있다17. 실시간 비디오 레코더 시스템과 같은 고해상도 추적 방법은 데이터 정확성과 재현성을 향상시켜 독성 물질 노출로 인한 운동 장애를 조기에 감지할 수 있도록 합니다11.

추적 기술과 기존 등반 분석법의 통합으로 지속적인 고해상도 행동 모니터링이 가능하여 신경 독성 물질 노출로 인한 미묘한 운동 장애를 감지할 수 있는 강력하고 확장 가능한 방법을 제공할 수 있었습니다. 유전 도구, 짧은 수명 주기 및 고급 행동 분석의 조합으로 초파리는 신경독성 검사를 위한 척추동물 모델의 강력한 대안으로 자리매김하여 궁극적으로 보다 안전한 약물 개발과 환경 위험 평가 개선에 기여합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

예를 들어, 이 프로토콜은 Physalis physalis 독 분획의 신경독성 가능성을 평가하는 데 사용되었습니다. 대조군은 시험 화합물 없이 생리학적 완충액과 자당 용액만 받았습니다. 모든 실험은 W118 균주에 대해 수행되었습니다. 초파리를 사용한 실험은 동물 관리 규정의 적용을 받지 않기 때문에 윤리적 승인이 필요하지 않습니다.

1. 시약 및 시료 준비

  1. 특정 분석의 요구 사항에 따라 PBS(10mM, pH 7.0) 또는 HEPES(10mM, pH 7.0)와 같은 생물학적 완충액과 10M 자당 원액을 준비합니다. 반복 횟수와 실험 기간을 기준으로 표본 부피를 계산합니다.
  2. 생물학적 완충액을 사용하여 샘플을 원하는 농도로 희석하고 최종 농도 1M까지 자당 용액을 보충합니다. 샘플이 투명한 경우 적절한 식용 염료(예: 0.1mg/mL 파란색 또는 빨간색 염료)를 추가하여 섭식 거동을 육안으로 평가할 수 있습니다. 본 연구에서는 PBS를 사용하여 Physalia physalis 의 독 분획을 10μg/μL의 최종 농도로 희석하고 자당 용액 및 식용 염료를 추가로 보충했습니다.
  3. 완충액만 함유하는 음성 대조 용액을 준비하고 용액에 최종 농도 1M까지 자당을 보충하고 식품 염료를 첨가합니다. 본 연구에서는 자당과 식용 염료를 보충한 PBS를 음성 대조 용액으로 사용하였다.
  4. 초파리 미디어의 경우18에 제공된 프로토콜을 따릅니다.

2. 생물학적 물질 유지 관리

  1. 건강하고 성적으로 성숙한 성인은 갓 준비된 식품 배지가 들어 있는 병으로 파리를 옮깁니다. 계속 진행하려면 파리를 병 바닥으로 탭하고 연 다음 병 반전을 통해 파리 배지가 들어 있는 새 병으로 옮깁니다. 25시간의 라이트/다크 주기와 12% 습도로 설정된 인큐베이터에 병을 넣습니다. 파리가 하룻밤(약 16-22시간) 알을 낳아 충분한 동기화된 알을 모을 수 있도록 합니다.
  2. 알을 낳은 후에는 에탄올이 70% 함유된 새 병을 사용하여 성충 파리를 버립니다. 이것은 추가적인 알을 낳는 것을 방지하고 나이의 동기화를 보장하며, 이는 최소한의 연령 변화를 가진 성인 코호트를 얻는 데 중요합니다.
  3. 균일한 발달을 지원하려면 동일한 제어 조건(25°C, 12시간 라이트/다크 사이클, 50% 습도)에서 병을 유지하십시오. 성충은 9일 또는 10일쯤에 나오기 시작합니다. 발달 진행 상황을 모니터링하면 성체가 출현하는 시기를 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  4. 수집된 파리가 분석에 대해 원하는 연령에 도달할 때까지 동일한 통제된 조건에서 유지합니다. 출현 후 24-48시간 이내에 사용하십시오. 이 제어된 노화 공정은 변동성을 최소화하고 실험 결과의 신뢰성을 향상시킵니다.

3. 네거티브 지오택시 분석

참고: negative geotaxis assay의 개략도는 보충 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 실험 당일에는 파리를 빈 병에 부드럽게 옮깁니다.
  2. 파리는 움직임과 취급 스트레스를 최소화하기 위해 이송 전에 얼음 위에서 잠시 마취해야 합니다. 이를 위해 파리가 들어있는 병을 얼음 상자 안에 넣고 병 전체를 덮습니다.
  3. 1분 후 병을 부드럽게 두드려 모든 파리가 마취되었는지 확인합니다. 스트레스를 유발하거나 등반 능력에 영향을 주지 않고 완전한 마취를 보장하기 위해 얼음 위에서 1분 더 유지하십시오.
    참고: CO2와 같은 특정 마취제는 등반 행동 장애를 포함한 후속 행동에 영향을 미칠 수 있으며 음성 지오택시 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
  4. 파리가 마취되는 동안 얼음으로 채워진 더 작은 용기를 준비하고 얼음 위에 페트리 접시나 평평하고 깨끗한 표면을 놓아 식힌 플랫폼을 만듭니다. 이 설정은 분류 중 마취를 유지하고 회복 시 파리의 움직임을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
  5. 얼음 위에서 2분 후 파리가 완전히 움직이지 않는지 확인하여 마취를 평가합니다. 완전히 마취되면 식힌 페트리 접시 위에 튜브를 뒤집어 파리를 부드럽게 두드려 파리를 풀어줍니다. 차가운 표면은 취급하는 동안 파리를 고정하는 데 도움이 됩니다.
  6. 미세한 붓을 사용하여 실체 현미경(사용 가능한 경우 10배 및 20배 배율)으로 크기 및 색소 패턴과 같은 구별되는 특성에 따라 수컷과 암컷 파리를 부드럽게 분리합니다. 수컷은 일반적으로 넓은 검은색 띠를 가지고 더 작고 암컷은 더 가볍고 길쭉한 복부를 가지고 있습니다. 파리에 대한 마취의 영향을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하십시오.
    참고: 실험에 성별 구분이 필요하지 않은 경우 분리 단계를 생략합니다. 노출 시간을 최소화하고 파리를 부드럽게 다루어 스트레스와 잠재적인 행동 변화를 줄이십시오.
  7. 분류된 파리를 적절한 할당과 함께 빈 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 분석을 진행하기 전에 통제된 환경(25°C, 12시간/12시간 명암/암흑 주기, 50% 습도)에서 약 30분 동안 마취에서 회복할 수 있도록 합니다.
  8. 미세모세관 공급 준비의 경우 피펫을 사용하여 10μL의 테스트 용액을 각 미세모세관에 수동으로 로드합니다. 공급 조건을 표준화하기 위해 모든 샘플에서 부피가 일정한지 확인합니다.
  9. 피펫을 사용하여 3-5 μL의 미네랄 오일을 미세모세관의 열린 끝 부분에 추가합니다. 이렇게 하면 실험 중에 샘플이 증발하거나 누출되는 것을 방지할 수 있습니다.
  10. 미리 채워진 미세 모세관을 면 바이알 플러그의 구멍을 통해 삽입하여 단단히 고정되었는지 확인합니다. 필요한 경우 미리 자른 팁을 사용하여 공기 흐름을 방해하지 않고 면에 단단히 맞도록 합니다.
  11. 파리가 들어 있는 바이알을 25시간/12시간 라이트/다크 주기로 12°C로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 실험 기간 동안 그대로 두고 지속적인 노출을 보장하기 위해 매일 미세 모세관을 갓 준비된 음식으로 수동으로 교체하십시오. 노출 기간은 샘플의 독성 및 특성에 따라 다르며 일반적으로 2일에서 7일 사이입니다.
  12. 12시간 간격으로 파리를 깨끗하고 빈 바이알에 옮겨 운동 활동을 평가합니다.
  13. 영구 마커를 사용하여 바이알 바닥에서 7cm 떨어진 선을 측정하고 표시합니다. 이 높이는 등반 목표가 됩니다.
  14. 등반 동작을 기록하기 위해 카메라나 휴대폰을 안정된 위치에 배치하십시오. 분석을 위해 적절한 조명과 투명한 배경을 확인합니다. 실험 설정이 카메라의 시야와 호환되는지 확인합니다.
  15. 바이알을 부드럽게 두드려 파리를 바닥으로 가져온 다음 즉시 녹음을 시작하십시오. 파리를 다치게 하거나 방향 감각을 잃게 할 수 있는 과도한 힘을 가하지 마십시오.
  16. 기록을 검토하고 각 파리가 표시된 7cm 선에 도달하는 데 걸리는 시간을 측정합니다. 최대 시간 제한을 설정합니다(예: 30초). 라인에 도달하지 못한 플라이에 이 시간을 할당합니다.
  17. 조정되지 않은 움직임, 등반 시작 지연 또는 불규칙한 등반 패턴과 같은 비정상적인 행동에 세심한 주의를 기울이십시오. 이러한 징후는 테스트된 화합물의 신경독성 효과를 나타낼 수 있습니다.
    참고: 사료 준비에 대한 자세한 지침은 CAFE(Capillary Feeder) 분석 프로토콜19를 참조하십시오. 이 방법은 초파리를 위한 액체 먹이 공급원을 준비하기 위한 정확한 지침을 제공하여 음식 섭취량의 정확한 정량화를 보장하고 먹이 실험의 변동성을 최소화합니다.

4. 실시간 모니터링 분석

알림: 추적 시스템 구성 요소 및 교정 프로토콜의 개략도를 포함한 설정은 이전 간행물11,12를 따르십시오. 실험에 대한 일반적인 개요는 보충 그림 2에 나와 있습니다.

  1. 실시간 이동 분석(추적 분석)
    1. 3.8-3.9단계를 반복하여 샘플과 미네랄 오일 씰이 있는 공급 마이크로 캐필러리를 준비합니다.
    2. 각각 약 6cm 길이의 투명한 플라스틱 빨대를 사용하여 개별 이동 챔버를 준비합니다. 이 빨대는 녹음에 적합한 비용 효율적이고 투명한 인클로저 역할을 합니다. 튜브는 고처리량 행동 연구를 위해 20개의 튜브를 수용하는 수면 아레나11과 호환되어야 합니다.
    3. 각 빨대의 한쪽 끝을 투명 필름으로 밀봉하여 밀폐되도록 합니다. 밀봉된 끝 부분 근처에 공급 미세모세관을 삽입할 수 있는 작은 구멍을 만듭니다. 분석 중에 누출이나 움직임을 일으키지 않고 미세 모세관을 단단히 고정할 수 있을 만큼 구멍이 충분히 큰지 확인하십시오.
    4. 3.1-3.6단계를 반복하여 마취하고, 선택적으로 분리하고, 미세한 붓을 사용하여 마취된 파리 하나를 각 튜브에 부드럽게 넣습니다. 각 튜브의 열린 끝을 투명 필름이나 면 플러그로 밀봉하여 공기 흐름과 플라이 억제를 보장합니다.
    5. 조립된 튜브를 경기장에 배치하여 각 미세 모세관이 매일 교체할 수 있도록 외부에서 접근할 수 있도록 합니다. 각 튜브에 미리 채워진 미세 모세관을 삽입합니다. 분석을 시작하기 전에 약 30분 동안 파리가 회복하고 적응할 때까지 기다립니다.
    6. 제어된 환경 조건(예: 25°C, 12시간/12시간 라이트/다크 사이클, 50% 습도)이 있는 챔버에 장치를 놓습니다. 장치를 네트워크 또는 로컬 추적 시스템에 연결합니다.
    7. 플랫폼에 액세스하고 실험에 할당된 장치를 찾습니다. 시스템이 마커에 표시된 대로 각 플라이를 정확하게 추적하는지 확인합니다. 모든 관련 실험 메타데이터를 입력하고 분석 기록을 시작합니다. 고급 데이터 분석을 위해 고처리량 행동 데이터 분석을 위해 설계된 R 패키지인 레토믹스 프레임워크(rethomics framework)를 사용하십시오11,12.
    8. 미세모세혈관에 있는 음식을 매일 갓 준비한 용액으로 교체하십시오. 일반적으로 3일에서 5일 사이에 연장되는 실험 기간 동안 생존과 적절한 행동을 보장하기 위해 매일 각 파리를 육안으로 검사합니다.
  2. 일주기 리듬 평가
    1. 파리의 일주기 리듬과 잠재적인 변화를 조사하려면 실험이 정의된 명암 주기와 동기화되어 시작되어야 합니다. 내인성 리듬의 방해를 피하기 위해 녹음 단계 전반에 걸쳐 12시간의 밝은 광주기와 12시간의 어두운 광주기를 유지합니다. 조건이 설정되면 4.1.1-4.1.8 단계를 반복하여 모든 절차가 밝은/어두운 단계에서 일관되게 수행되도록 합니다.
  3. Light/Dark 선호 동작 평가
    1. 3.1-3.11단계를 반복하여 파리와 먹이 미세모세관을 준비합니다.
    2. 수유 바이알이 준비되면 인큐베이터에 넣어 파리가 테스트 샘플을 2시간(또는 이전 운동 활동 데이터에 의해 결정된 다른 기간) 동안 먹일 수 있도록 합니다.
    3. 빛 선호 거동을 평가하기 위해 각 튜브의 50%를 덮는 개별 운동 챔버를 알루미늄 호일로 준비하여 정의된 어두운 영역을 만듭니다. 표준화된 비교가 가능하도록 모든 튜브에 걸쳐 일관된 적용 범위를 보장합니다.
    4. 4.1.2-4.1.4 단계를 반복하여 파리를 개별적으로 운동 챔버로 이동시키고 미세 모세관 삽입을 생략합니다.
    5. 준비된 튜브를 경기장에 놓고 파리가 약 30분 동안 적응하도록 합니다.
    6. 4.1.6-4.1.7단계를 반복하고 60분 동안 파리의 행동을 기록합니다. 움직임이 감소된 튜브가 기록되면 추적 시스템이 호일로 덮인 영역에 위치한 파리를 감지하여 방해 신호를 보내지 않기 때문에 어두운 선호도를 나타낼 수 있습니다.

5. 데이터 분석

  1. ID, 처리, 화합물 세부 정보, 분석 기간 및 기타 관련 변수와 같은 필요한 모든 정보를 포함하여 메타데이터 템플릿을 준비합니다. 템플릿 예제와 해당 데이터 처리 파이프라인은 보충 표 1에 포함되어 있습니다.
  2. 완료된 메타데이터 파일을 CSV 형식으로 저장합니다. 호환성을 보장하려면 텍스트 편집기에서 CSV 파일을 열어 불필요한 문자나 형식 문제가 없는지 확인합니다. 불필요한 문자가 있는 경우 제거합니다.
  3. 데이터 분석을 진행하기 전에 데이터 백업을 만듭니다. 터미널을 열고 sudo python backup_tool.py 명령을 실행합니다. 이 단계는 분석 중에 발생할 수 있는 손실 또는 손상으로부터 데이터를 보호합니다.
  4. 실험에 해당하는 데이터 파일의 위치를 식별하고 기록해 둡니다. 분석을 위해 이러한 파일에 액세스할 수 있는지 확인합니다.
  5. Rethomics를 사용하여 데이터를 분석합니다. RStudio를 열고 동작 데이터 분석에 필요한 Rethomics 패키지를 로드합니다. 자세한 지침과 자습서는 Rethomics 웹 사이트에서 확인할 수 있습니다. https://rethomics.github.io/scopr.html

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

예를 들어, 이 프로토콜은 Physalis physalis 독 분획의 신경독성 가능성을 평가하는 데 사용되었습니다. 처리한 그룹은 자당 용액(최종 농도 1M까지)이 보충된 생리학적 완충액과 테스트 독 분획을 먹인 파리로 구성되었습니다. 대조군은 시험 화합물 없이 생리학적 완충액과 자당 용액만 받았습니다. 모든 실험은 W118 균주에 대해 수행되었습니다.

설명된 방법에서, 치료되지 않은 파리, 대조군은 전형적인 운동 및 상승 행동(음성 표현형)을 보인 반면, 독성 분획에 노출된 파리는 치료 그룹(양성 표현형)을 나타내며 종종 손상된 운동 활동을 보였습니다. 대표적인 결과로는 등반 속도 감소, 등반 표시에 도달하는 시간 증가, 플랫폼에 기록된 총 이동 거리 감소 등이 있습니다.

등반 성능은 음성 지오택시 분석을 사용하여 평가되었습니다. 본 연구에서, 그림 1

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우선, 치명적이지 않은(이하 치명적인) 용량을 설정하는 것은 신경독성 실험을 수행하기 위한 중요한 초기 단계입니다. 이를 통해 파리가 연구 전반에 걸쳐 생존 가능한 상태를 유지할 수 있으므로 사망률의 교란 요인 없이 행동 및 운동 효과를 관찰할 수 있습니다. 본 연구에서 Physalia physalis 독 분획의 치사량 이하량은 10μg/μL로 결정되었습니다. 확실하고 재현성 있는 결과를 보장하기 위해 치료군당 최소 3개의 생물학적 복제가 권장되며, 각 복제는 10마리의 파리와 최소 3개의 기술적 복제로 구성됩니다. 이는 실험 조건당 최소 30마리의 파리에 해당하며, 3개의 독립적인 실험에서 테스트되었습니다. 이 설정은 통계적 검정력을 향상시키고 변동성을 최소화하여 치료로 인한 행동 변화를 확실하게 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 데이터를 사용하여 수치를 구성했으며, 이는 신경독성 변화를 감지하는 방법의 민감성을 입증했습니다. 실험 초기 기간...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 Zuzanna Tomkielska는 Mesosystem S.A.에 고용되어 있었고 저자 Ana Casas도 Mesosystem S.A.에 소속되어 있습니다. 나머지 저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 EEA 보조금 프로젝트 MOD의 지원을 받았습니다. PN입니다. FRM.059.PT.V03 – Physalia physalis: 고부가가치 화장품의 혁신적이고 미개척 소스; 차세대 EU 유럽 기금 및 포르투갈 회복 및 탄력성 계획(PRR)이 자금을 지원하는 WP5 – 조류 수직 내의 "Pacto da Bioeconomia Azul"(프로젝트 번호 C644915664-00000026)에 의해; 및 CBA(UIDB/05292/2020 및 UIDP/05292/2020)를 통해 FCT(Fundação para a Ciência e a Tecnologia)에 의해.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일 --
파란색 염료   레이너-레이너스 블루 염료 28ml
카메라 모듈 2 NoIR라즈베리 파이 096-4062Mauser.pt 에 공급
코튼 로빙시그마-알드리치BR28205
초파리 스톡 병VWRVWRI734-1249보틀 플라이 라운드 60Z
초파리 바이알VWRWRI734-2255
유리 페트리 접시시그마-알드리치BR455701
마이크로 헤마토크리트 모세혈관시그마-알드리치BR749321
MicroSD 카드--Producent는 Raspberry Pi OS 설치를 위해 최소 32GB의 저장 공간이 있는 SD 카드를 사용할 것을 권장합니다.
마이크로 USB 전원 공급 장치라즈베리 파이 096-4585Mauser.pt 에 공급
미네랄 오일 바이오 RAD#1632129
페인트 브러시--
인산염 완충 살리인(PBS)다양한 회사에서 공급되는 구성 요소-대조군을 위한 식품을 준비하는 데 사용되며 샘플 희석에 사용되는 완충액; 10 mM pH 7
초파리 바이알 및 병용 플러그VWRVWRI734-2875
초파리 바이알 및 병용 플러그VWRVWRI734-2673
씰링 필름시그마-알드리치HS234526C
단일 보드 컴퓨터  (3 모델 B)라즈베리 파이 096-5700Mauser.pt 에 공급
자당류시그마-알드리치S9378
투명 플라스틱 빨대--Ethoscopic 수면 경기장(6,5cm x 0,5cm)과 호환되는 모든 것

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).
  4. Gupta, S. C., et al. Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species. Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).
  5. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).
  6. Bal-Price, A., et al. International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes. Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).
  7. Cabrita, R., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  8. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster. Elife. 2, e00231(2013).
  9. Dubovický, M., et al. Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development. Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).
  10. Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. Quantifying behavior to understand the brain. Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).
  11. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics. PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).
  12. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data. PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).
  13. Blackhurst, L., Gilestro, G. F. Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility. Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).
  14. gilestrolab/ethoscopy. , https://github.com/gilestrolab/ethoscopy (2025).
  15. Bilder, D., Irvine, K. D. Taking stock of the Drosophila research ecosystem. Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).
  16. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  17. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model. Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).
  18. Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. protocols.io. , (2020).
  19. Diegelmann, S., et al. The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), e55024(2017).
  20. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  21. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).
  22. Ardekani, R., et al. Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies. PLoS One. 7 (7), e40506(2012).
  23. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문