방법 논문

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

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DOI:

10.3791/68530

⸱

2025년 6월 20일

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

초록

거대 단층 소포(GUV) 형태의 생체 모방 지질막은 GUV 내부의 단백질 재구성, 시각화 및 세포막-단백질 역학에 대한 이해가 용이하기 때문에 세포막 거동을 모방하는 데 일반적으로 사용됩니다. 그러나 세포막은 세포막에 다른 지질이 존재하여 발생하는 지질 뗏목(또는 도메인)으로 구성됩니다. 모델 시스템의 이러한 복잡성 증가는 지질 조성을 미세하게 조정할 수 있는 상 분리 GUV로 이어지도록 통합될 수 있습니다. 동질적인 GUV를 생성하기 위한 캡슐화 방법은 널리 알려져 있지만, 상 분리된 GUV 내에서 단백질을 캡슐화하는 방법은 제한적입니다. 여기서, 이 프로토콜은 액체 무질서(Ld) 및 액체 정렬(Lo) 도메인으로 구성된 상 분리 GUV의 단순화된 단일 냄비 생산을 제공하여 서로 다른 세포골격 단백질, 즉 FtsZ 및 actin을 효율적으로 캡슐화하여 이 방법을 최소 세포 생산을 위한 다목적 도구로 만듭니다. 특히, 이 접근 방식은 에멀젼 전송 프로토콜을 사용하여 캡슐화 효율이 높은 GUV를 생성합니다. 이 방법에서는 먼저 지질/오일 혼합물에서 단백질 용액을 유화하여 지질-단층을 생성하며, 여기서 다양한 상전이 온도의 지질을 선택하여 결과 GUV에서 상 분리를 생성합니다. 이 에멀젼은 다른 튜브의 지질 내 유성 용액 위에 부드럽게 전달되어 물-오일 계면이 형성됩니다. 그런 다음 용액을 고온(단백질 활성을 유지하기 위해 이상적으로는 37°C)에서 원심분리한 후 이미징을 위해 GUV를 수집합니다. 이 방법은 번거로운 실험실 설정을 사용하지 않고 상분리된 GUV 내에서 세포골격 단백질의 체외 재구성을 단순화하므로 밀폐 상태에서 세포골격-막 상호 작용의 역학을 연구하기 위한 편리한 방법으로 사용됩니다.

서론

거대 소포는 세포 기능을 이해하기 위한 모델 시스템 역할을 합니다 1,2. 생산의 용이성, 시각화, 조정 가능성 및 생체 분자의 체외 재구성으로 인해 이러한 생체 모방 모델은 많은 연구 연구에서 선택되는 시스템입니다 3,4,5. GUV를 만드는 방법에는 전기형성6, cDICE 7,8, 에멀젼 전달 및 기타 미세유체 기반 방법(9,10)과 같은 몇 가지 알려진 방법이 있습니다. 이러한 방법을 사용한 GUV 생산은 문헌 3,11에 보고되어 있습니다. 더욱이, 시험관내에서, GUV 내부의 세포골격 네트워크의 재구성은 이전에 어떠한 복잡한 설정도 필요로 하지 않는 이 원-팟 형성 방법의 용이성으로 인해 에멀젼 전달 방법을 사용하여 설명되었다12. 그러나 이러한 재구성은 세포막의 복잡성을 완전히 모방하지 않는 시스템인 균질한 GUV에서 매우 일반적으로 보고됩니다.

이 프로토콜은 지질막의 복잡성을 나타내는 상분리된 GUV 내부의 세포골격 네트워크의 체외 재구성을 설명합니다. 이러한 네트워크는 이전에 막 표면(외부)에 결합하는 것으로 보고되었지만 거대 소포13,14 내에 국한되지 않는 것으로 보고되었지만, 본 에멀젼 전달 기술은 상 분리를 수득하고 세포골격의 네트워크 형성 활성을 유지하기 위한 프로토콜에 초점을 맞춥니다. 이 기술의 주요 과제 중 하나는 온도입니다. 상 분리 GUV를 생성하기 위한 표준 생산 방법은 구성 지질의 상전이 온도에 따라 달라지는 상승된 온도를 사용해야 합니다. 그러나 세포골격 단백질은 이러한 고온에서 고차원 구조로 중합할 수 없습니다 15,16,17. 따라서 이 프로토콜은 지질 조성물을 사용하여 실온에서 GUV에서 상 분리를 수율할 뿐만 아니라 생리학적 온도에서 우수한 GUV 수율을 생성하도록 조건을 최적화합니다.

재구성 GUV 시스템을 생산할 때 고려해야 할 또 다른 측면은 필요한 캡슐화된 생체 분자의 부피입니다. 대부분의 단백질의 경우, 더 많은 양의 단백질을 생산하는 것은 여러 번의 정제 과정을 거쳐야 하는 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 또한, 체외 재구성 실험은 일반적으로 최적화된 내부 용액 함량을 달성하기 위해 생체 분자 농도, 완충액 조성 등을 먼저 테스트하는 초기 탐색 단계를 필요로 합니다. 따라서 이 프로토콜은 앞서 언급한 전제에 적응하는 두 가지 다른 분석에 대해 GUV 생산 프로토콜을 최적화합니다. 한편으로, 이 프로토콜은 상대적으로 더 많은 양의 단백질을 포함하고 튜브에서 고수율 GUV 생산을 생성하여 나중에 96웰 플레이트의 이미징으로 전환되는 표준 역 에멀젼 프로토콜을 최적화하는 하나의 분석을 설명합니다. 다른 한편으로, 여기에 설명된 접근법은 이미징 웰 플레이트에서 직접 위상 분리 GUV 생산을 위한 프로토콜을 최적화하여 더 적은 부피의 생체 분자(튜브 생산에 필요한 양의 ~1/4)를 사용하고 GUV 직렬 생성을 가능하게 하여 한 번의 원심분리 단계에서 많은 캡슐화된 조건을 달성합니다. 따라서 여기에 제시된 프로토콜은 하나의 캡슐화 방법을 보여주지만 사용자가 요구 사항에 따라 두 설정 중 하나를 선택할 수 있도록 합니다.

또한 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 세포골격 네트워크인 FtsZ 및 actin에 대한 캡슐화에 최적화된 방법을 설명합니다. 이 두 단백질은 서로 다른 완충액 및 밀집 조건을 필요로 하기 때문에 프로토콜은 최적의 네트워크 재구성을 달성하기 위해 필요한 후속 변화를 처리합니다. 따라서 여기에 제시된 접근 방식은 상 분리된 GUV 내에서 필요한 생체 분자를 캡슐화하는 데 사용 및 일반화될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 지질 혼합물 제제

  1. 5mL 유리 바이알에 클로로포름 0.5mL를 섭취합니다. 17.5μL DOPC, 7.4μL DOPG, 29.6μL DPPC(모두 클로로포름으로 준비된 25g/L 지질 원료에서), 32.2μL의 10g/L DPPG 및 20.6μL의 18g/L 콜레스테롤을 추가합니다. 1.2μL의 1g/L Atto655-DOPE 염료를 추가합니다. 지질 혼합물을 부드럽게 와류로 만들고 질소 흐름에서 클로로포름을 증발시키고 총 400μL 클로로포름에서 박막을 다시 현탁시킵니다.
  2. FtsZ의 캡슐화를 위해, 제조된 최종 지질 혼합물은 0.001 mol% Atto655-DOPE로 표지된 DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol ratio)의 비율입니다. 캡슐화된 번들-액틴을 사용한 GUV의 생산을 위해, 지질 혼합물은 비오틴화된 지질을 함유하고, 0.001 mol% Atto655-DOPE로 표지된 DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1)의 비율로 제조된다.
  3. 지질 혼합물(32 mM, 50 μL)을 클로로포름에 용해시키고N2 가스 흐름으로 유리 바이알에서 ~15분 동안 건조시킵니다.
  4. 그런 다음 유리 바이알을 진공 상태에서 건조기에 ~30분 동안 보관하여 잔류 클로로포름의 흔적을 제거합니다.
  5. 건조된 필름을 유리 바이알에 데칸(20 μL)과 미네랄 오일(500 μL)의 혼합물로 분산시켜 최종 농도 3.2 mM를 생성하고 수조 초음파 처리기를 사용하여 ~30분 동안 고온(~50 °C)에서 초음파 처리합니다.
  6. 지질-인-오일(lipid-in-oil) 혼합물을 튜브로 옮기고 다음 단계를 진행하기 전에 37°C에서 ~10분 동안 튜브를 배양합니다.
  7. 단백질을 위한 내부 캡슐화 혼합물을 준비합니다.

2. 캡슐화를 위한 내부 용액 준비

  1. FtsZ 필라멘트 혼합물
    1. 마이크로튜브에서 총 부피 10μL의 FtsZ 단백질 혼합물을 준비합니다. FtsZ 필라멘트 네트워크의 경우 0.87μL의 23μM FtsZ-YFP-mts, 1.31μL의 381g/L Ficoll70, 1.11μL의 271g/L BSA 및 1μL의 25mM GTP를 5.71μL FtsZ 반응 완충액(RB)에 추가합니다. 용액의 총 부피는 최종 용액에서 2μM FtsZ-YFP-mts, 50g/L Ficoll70, 30g/L BSA 및 2.5mM GTP를 포함하는 10μL입니다. GUV 내에서 캡슐화하기 위해 사용하기 전에 얼음 위에 보관하십시오.
      참고 : FtsZ 반응 완충액 (RB)에는 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM GluK, 5mM GluMg가 포함되어 있습니다.
  2. 액틴-번들 혼합물
    1. 액틴 번들을 캡슐화하려면 먼저 물 중 86% G-actin, 10% Atto488-actin 및 4% biotinylated actin을 포함하는 10μL 액틴 마스터 믹스(A-Mix)를 준비합니다. 이 단계에서는 제조업체의 지침에 따라 단백질 스톡 용액을 준비합니다. 그런 다음 35.42μM A-Mix의 최종 농도를 위해 6.39 μ L의 2 g/L G-액틴, 1 g/L Atto488-actin 1.48 μL, 0.5 g/L 비오틴화 액틴 1.19 μL 및 0.9 μL H2O를 추가합니다.얼음 위에 보관하고 빛을 피하십시오.
    2. GUV 외부에서 액틴의 사전 중합 및 번들링을 방지하려면 캡슐화 몇 분 전에 최종 액틴 용액을 준비합니다. 최종 용액은 7% 요오딕사놀, 0.01g/L 뉴트라비딘, 2.4μM A-Mix, 0.6μM Fascin, 10g/L BSA, 20g/L Ficoll70 및 5mM ATP로 구성됩니다.
      1. 항상 얼음 위에 보관해야 하는 이 최종 용액을 준비하려면 다음 순서로 추가합니다: 60% 요오딕산올 2.92μL, 10.25μL H2O, 0.1g/L 뉴트라비딘 2.5μL, 271g/L BSA 0.92μL, 381g/L Ficoll70 1.31μL, 10x 액틴 중합 완충액 2.5μL, 35.42μM A-Mix 1.69μL, 9μM Fascin 1.65μL 및 100mM ATP 1.25μL. 잘 혼합하고 캡슐화에 필요한 5 μL를 빠르게 취합니다.
        알림: 이 내부 용액의 삼투압을 삼투압계(~430mOsm/Kg)로 측정합니다. 동일한 삼투압 값에 도달할 때까지 포도당을 물에 희석하여 일치하는 외부 용액 혼합물을 준비해야 합니다(3.2단계 참조). 10x Actin 중합 완충액에는 100mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM KCl 및 50mM MgCl2가 포함되어 있습니다.

3. GUV 생산 및 생체외 캡슐화

  1. 튜브의 GUV 생산: FtsZ의 캡슐화
    1. FtsZ 캡슐화의 경우, 1.5mL 플라스틱 튜브에 500μL의 FtsZ 반응 완충액(RB)을 추가하고 200μL 지질 내 오일 혼합물(위의 1.6단계에서 준비)을 부드럽게 첨가하여 오일-물 계면의 형성 및 이 계면에서 지질 단층의 증착을 허용합니다.
    2. 에멀젼을 형성하려면 먼저 1.5mL 튜브를 더 넣고 200μL 지질-in-오일을 추가합니다. 에멀젼을 형성하기 전에 이 튜브를 37°C에서 ~10분 동안 배양합니다.
    3. 배양이 완료되면 이 튜브에 FtsZ 단백질 혼합물 5μL(2.1.1에서 준비)를 추가합니다. 수성 매질의 5 μL 단백질은 액적처럼 튜브 바닥으로 가라앉습니다.
    4. 용액이 눈에 띄게 탁해질 때까지 튜브 바닥을 5-6회 부드럽게 두드려 에멀젼을 만듭니다.
    5. 이 에멀젼을 부드럽게 피펫팅하고 오일-물 계면 위에 놓습니다(위의 3.1.1단계에서 준비).
    6. 이를 6000 x g 에서 37°C의 예열 온도에서 30분 동안 원심분리하고 소포 생산이 끝날 때까지 이 온도를 유지합니다.
    7. 이미징하기 전에 샘플을 거의 30분 동안 실온으로 식힙니다.
    8. 튜브 상단에서 부드럽게 피펫팅하여 오일의 최상층을 제거하고 이미징을 위해 거의 100-200 μL 용액을 남깁니다.
    9. 피펫 팁을 가위로 비스듬히 자르고 튜브 바닥에서 50-100 μL의 GUV 용액을 부드럽게 집어 올립니다. 이 솔루션은 이미징에 사용됩니다.
  2. 96-well 플레이트에서 직접 GUV 생산: 액틴 캡슐화
    1. 액틴 캡슐화의 경우, 먼저 내부 액틴 혼합물과 동일한 삼투압을 가진 외부 용액 혼합물(물 속의 포도당)을 준비합니다. 내부 혼합물의 ~430 mOsm/Kg과 일치시키려면 802 μL H2O에 198 μL의 2 M 포도당을 첨가하여 외부 용액 혼합물을 만듭니다.
    2. 웰 플레이트에 직접 소포를 만들려면 먼저 96웰 플레이트의 한 웰을 부동태화합니다. 웰에 100 μL의 10 g/L BSA를 넣고 10-15분 동안 배양합니다. 그런 다음 100μL 외부 용액으로 웰을 5회 세척하고 피펫 팁으로 부동태화된 유리 바닥을 건드리지 않도록 주의합니다. 세척 완료 후 100μL의 외부 용액 혼합물을 웰에 그대로 두십시오.
    3. 50μL 지질 내 오일 혼합물을 웰에 부드럽게 첨가하여 외부 용액 위에 지질 단층을 준비합니다. 수성상 위에 오일이 올바르게 침전되도록 하려면 피펫 팁을 우물의 한쪽에 놓고 오일이 우물 벽에서 미끄러지도록 합니다.
    4. 에멀젼을 형성하려면 먼저 1.5mL 튜브를 취하고 100μL 지질 내 오일을 추가합니다. 에멀젼을 형성하기 전에 이 튜브를 37°C에서 ~10분 동안 배양합니다.
    5. 100μL 지질 내 오일 혼합물이 포함된 튜브에 최종 액틴 용액 2.5μL(단계 2.2.2)를 추가합니다(위의 단계 1.6). 수성 매질의 2.5μL 단백질은 액적으로 튜브 바닥으로 가라앉습니다.
    6. 용액이 눈에 띄게 탁해질 때까지 튜브 바닥을 10-20회 부드럽게 두드려 에멀젼을 만듭니다.
    7. 이 에멀젼을 부드럽게 피펫으로 씌우고 오일-물 계면 위에 놓습니다(위의 3.2.3단계에서 준비). 피펫 끝을 오일 단층 중간에 조심스럽게 담그고 에멀젼을 침전합니다. 에멀젼은 오일 단층 상에 국한된 탁한 구름을 형성합니다.
    8. 37°C의 예열 온도에서 20분 동안 200 x g 의 96웰 플레이트를 원심분리하고 소포 생산이 끝날 때까지 이 온도를 유지합니다.
      참고: 소포 생산 시간을 단축하기 위해 400 x g 에서 10분 동안 원심분리기. 그러나 최상의 결과를 얻으려면 이러한 원심분리 파라미터를 고수하십시오. 400 x g 이상의 원심분리는 이미징 플레이트의 바닥에 지질 응집체가 축적된 압축된 소포를 생성합니다.
    9. 이미징하기 전에 샘플을 거의 30분 동안 실온으로 식힙니다.
      참고: 직접 이미징은 오일의 최상층을 제거하거나 소포를 다른 챔버/웰로 옮길 필요 없이 웰에서 수행할 수 있습니다.

4. 이미징 및 3D 이미지 재구성

  1. 96 이미징 웰 플레이트를 가져와서 샘플을 이미징 웰 플레이트로 옮기기 전에 ~10분 동안 BSA로 부동태화합니다(3.2.2단계 참조).
  2. GUV 용액을 부동태화된 웰 플레이트로 옮깁니다.
  3. 스테이지에 웰 플레이트를 설정합니다.tage 40x 물 대물렌즈의 도립 컨포칼 현미경.
  4. 관심 영역(ROI)에 초점을 맞추고 고정된 z-단계 간격으로 선택한 ROI에서 z-stack 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 이 프로토콜은 5-30μm 크기의 GUV를 생성하므로 필요에 따라 간격을 0.5-1μm로 고정할 수 있습니다.
  5. 각 z-stack 이미지 시퀀스를 .tiff 형식으로 저장합니다.
  6. 이미지 처리 소프트웨어(ImageJ/Fiji)에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 엽니다. 강도가 가장 높은 이미지를 식별합니다. ctrl+shift+c 를 눌러 밝기 및 대비 창을 열고 자동을 클릭합니다.
  7. ImageJ/Fiji 메뉴에서 분석 > 배율 설정으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 해당 단위를 입력합니다.
  8. ImageJ/Fiji 메뉴에서 Image > Stacks > Z 프로젝트 로 이동하여 z 스택에서 3D 이미지를 재구성합니다. 프로젝션 유형을 표준 편차로 설정합니다. 기본 옵션은 나머지 설정(시작 슬라이스 및 중지 슬라이스)에 사용할 수 있습니다.
    참고: 3D 재구성에서 겹치는 z-스택으로 인해 발생하는 표준 편차 투영 아티팩트에 주의하십시오. 아티팩트가 없는지 확인하려면 구의 아래쪽 반구에서 z 스택을 제거하여 위쪽 절반 프로젝션만 관찰합니다.

5. 크기에 따른 GUV 빈도의 통계적 분석

  1. 4.4단계와 4.5단계에서 설명한 대로 관심 있는 GUV의 Z 스택 이미지를 획득합니다. 넓은 시야에서 가능한 한 많은 GUV를 이미지화하려면 1배 또는 2배 줌에서 컨포칼 스택을 획득합니다.
  2. 4.6에 설명된 대로 이미지 처리 소프트웨어(이 경우 ImageJ/Fiji)에서 Z 스택 시퀀스를 엽니다.
  3. 멤브레인 형광 신호가 촬상된 디스플레이 채널을 이미지 아래에 있는 c 로 표시된 막대를 클릭하여 선택합니다. 4.6에 설명된 대로 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
  4. 열린 이미지 아래의 z 막대를 클릭하여 획득한 다양한 평면을 탐색합니다. 분석할 소포의 지름이 가장 큰 평면을 선택합니다.
  5. > 도구 분석 > ROI 관리자를 클릭하여 ImageJ/Fiji에서 ROI 관리자를 엽니다.
  6. ImageJ/Fiji 기본 패널에서 사용할 수 있는 도구에서 타원형 선택 영역을 클릭합니다.
  7. GUV 멤브레인의 형광 강도를 따라 GUV에 맞는 원을 그립니다. 원 선택 영역을 그리려면 Shift 키를 누른 상태에서 마우스를 끌어 원을 소포 크기까지 확장합니다. 원 선택은 소포 중앙에 있는 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 원하는 위치로 드래그하여 동시에 이동할 수 있습니다.
  8. ROI Manager의 옵션 패널에 있는 Add [t]를 클릭하여 ROI Manager에 그려진 원 선택 항목을 저장합니다.
  9. 소포의 크기를 미크론 단위로 얻으려면 ROI Manager의 패널에 있는 Measure 를 클릭하십시오. 새 창이 나타납니다. Major(주) 또는 Minor(부) 열에 표시된 값(두 열 모두 타원 축을 참조하는 것과 동일한 값을 가져야 함)을 소포 지름에 대한 측정으로 사용합니다.
  10. 플로팅 소프트웨어(Excel, Origin, Prism)를 사용하여 다양한 크기 범위에 대한 GUV의 비율이 지정된 막대 그래프를 생성합니다.

결과

첫 번째 단계로, 변형된 역 에멀젼 접근법에 따라 멤브레인 상 분리가 있는 GUV가 생성되었습니다(그림 1A). 그 결과 높은 수율의 GUV가 생성되며, 이는 Ld 도메인과 L d 도메인과 라벨링되지 않은 Lo 도메인에 해당하는 어두운 영역의 Atto 655-DOPE 라벨로 표현되는 바와 같이 Ld 및 Lo 도메인으로 혼합된 멤브레인을 나타냅니다(그림 1B). 이 방법은 고온에서 5-30μm(그림 1C) 범위의 위상 분리 GUV를 생성합니다(모든 단계는 37°C에서 수행되고 RT에서 이미징됨). 또한, 원심분리 속도를 조정하여 GUV 내에 원래 성분 지질이 통합되도록 하고 과도한 과잉 증식을 방지했습니다.

또한, 현재 프로토콜에 설명된 에멀젼 방법을 사용하여 생체 분자의 성공적인 캡슐화를 입증하기 위해 FtsZ와 액틴 네트워크를 개별 실험에서 재구성했습니다. FtsZ 네트워크는 2.5mM GTP 및 50g/L Ficoll70(그림 2 참조)이 존재할 때 막 표적화 서열(MTS)을 통해 Ld 도메인에 우선적으로 결합하는 필라멘트로 나타나는 GUV 내부로 요약됩니다. 네트워크는 캡슐화 단계 후 약 1시간 후에 관찰되었습니다. 그러나 액토미오신 네트워크는 GUV 내에서 재구성 후 얇은 다발(FtsZ의 두꺼운 네트워크와 대조적으로)로 나타납니다(그림 3). 비오틴화된 지질은 액토미오신 네트워크가 GUV의 막에 결합하는 데 중요한 역할을 한다는 점에 유의해야 합니다. 비오틴화된 지질이 없으면 액토미오신 다발은 곡선 구성을 채택할 수 없으며 긴 다발의 얽힌 그물망으로 멤브레인에 부착되는 대신 내강에서 곧고 짧고 뻣뻣한 다발로 남아 있습니다(그림 4).

변형된 에멀젼 프로토콜에서는 앞서 언급한 바와 같이 상분리된 GUV를 얻기 위해 원심분리 속도를 조정합니다. 실제로, 액토마이신 네트워크(15분 동안 600 x g )를 포함하는 샘플의 더 높은 원심분리 속도는 소포가 생산 웰 내부에서 조직과 같은 구성으로 응집되는 결과를 낳습니다. 따라서 액토미오신 네트워크의 모든 표준 재구성 실험에서 최적의 원심분리 속도를 200 x g 로 설정하여 응집되지 않은 GUV를 얻었습니다(그림 5).

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그림 1: 이중 에멀젼 전달 방법을 사용하는 상 분리 GUV의 원팟 생성. (A) 이중 에멀젼 전달을 통한 상 분리 소포의 원포트 생산의 핵심 단계에 대한 실험 계획. (B) A. 스케일 바에 설명된 방법에 따라 생성된 결과 GUV의 컨포칼 Z-투영 이미지는 50μm입니다. (C) 직경에 따라 생성된 위상 분리된 GUV의 분율이 있는 막대 그래프. 수행된 실험 n = 3, 실험당 분석된 총 GUV 수 = 100. 평균값으로 표시된 데이터, 개별 데이터 포인트는 세 가지 독립적인 실험입니다. 오차 막대는 세 가지 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 캡슐화된 FtsZ 네트워크가 있는 위상 분리된 소포. (A) FtsZ 네트워크를 포함하는 위상 분리 GUV의 완전히 획득된 z-스택에서 수행된 컨포칼 3D 투영 이미지. (B) 소포의 위쪽 절반에서만 수행된 컨포칼 Z-투영 이미지. GUV 표면에 걸쳐 도메인이 이질적으로 형성되기 때문에 획득된 공초점 절편의 3D 재구성은 소포의 상단과 하단 영역에서 지질 도메인이 겹치는 것을 보여줍니다. 중복을 방지하고 도메인의 시각적 검사를 용이하게 하기 위해 획득한 z-스택의 아래쪽 절반이 파일에서 제거됩니다. 결과 상단 절반은 표준 편차를 통한 3D 투영에 사용됩니다. 눈금 막대는 모두 20μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 캡슐화된 액토마이신 네트워크가 있는 위상 분리된 소포. (A) 소포 생산 후 웰의 축소 보기가 있는 전체 획득 스택의 공초점 Z 투영 이미지. 얻어진 소포의 높은 수율은 소포 내의 다양한 액토마이신 구조를 연구할 수 있게 합니다. 스케일 바는 50μm입니다. (B) 소포의 위쪽 절반에서 수행되는 컨포칼 Z 투영 이미지. 지질 영역의 시각적 분석을 용이하게 하기 위해 이미지 슬라이스의 위쪽 절반만 3D 투영을 수행하는 데 사용됩니다. 눈금 막대는 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 상분리된 소포 내부의 막결합 액토미오신 네트워크 생성을 위한 비오틴화된 지질의 중요성. 연결되지 않은 액토미오신 네트워크가 있는 위상 분리된 소포를 묘사하는 컨포칼 3D 투영. 비오틴화된 지질이 혼합물에 통합되지 않으면 액토미오신 구조가 내강에서 형성되고 소포의 내부 소엽에서 곡선 구성을 획득하지 않습니다(오른쪽 패널, Atto488로 표지된 액틴). 눈금 막대는 50μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 에멀젼 전달을 통한 상 분리 소포 생산에 대한 원심분리 속도의 효과. 15분 동안 600 x g의 원심분리력을 사용하여 생성된 GUV 샘플을 보여주는 컨포칼 2D 이미지. 최적화된 200 x g보다 빠른 원심분리 속도는 웰 내부에서 소포를 조직과 같은 구성으로 응집시킵니다. 눈금 막대는 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

멤브레인 기반 모델 시스템의 체외 재구성의 주요 과제 중 하나는 고온에서 준비하기 때문에 상 분리된 GUV 내부에 단백질을 캡슐화하는 것입니다. 실제로, one-pot synthesis를 통한 이러한 유형의 상 분리 소포의 생성은 고온에서 단백질의 분해로 인해 발생하는 어려움을 초래할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 캡슐화된 단백질의 활성을 동시에 유지하면서 생리학적 온도에서 GUV 생산을 위한 이중 에멀젼 방법에 따라 막 상 분리를 관찰하기 위한 최적화된 조건을 설명합니다. 이 접근법은 정전기 상호 작용이 전제 조건일 때 원하는 단백질의 결합을 용이하게 하기 위해 두 도메인에 음전하를 도입합니다. FtsZ의 캡슐화의 경우, 두 도메인 모두에 음전하가 존재함에도 불구하고 세포골격 네트워크는 Ld 도메인에 우선적으로 발달하고 결합하며, 이는 음전하와 함께 막의 유동성이 단백질 결합에 필수적인 요구 사항임을 나타냅니다18. 또한, 액틴 캡슐화(actin encapsulation)의 경우, 네트워크는 비오틴화된 지질(biotinylated lipid)이 통합된 멤브레인 영역에서 발달합니다19.

에멀젼 전달 분석법은 문헌에서 널리 사용되지만 균질한 GUV의 생산에만 적용되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 멤브레인에서 도메인 형성을 관찰할 수 있도록 하는 분석의 몇 가지 수정된 측면으로 구성됩니다. 이와 관련하여 중요한 측면 중 하나는 온도입니다. 도메인을 관찰하고 단백질의 기능(특히 세포골격 네트워크 형성)을 유지하기 위해 이 프로토콜은 37°C를 사용하여 GUV를 생성합니다. 한편으로, GUV가 더 높은 온도에서 생성되면 캡슐화된 단백질은 기능을 잃고 내강에 상주하며 고차원 구조로 중합되지 않습니다. 반면에 GUV가 더 낮은 온도에서 생성되면 멤브레인에서 상 분리가 관찰되지 않습니다. 따라서 37°C는 실험에서 GUV 생산을 위한 최적의 온도가 됩니다.

이 프로토콜은 동일한 에멀젼 전달 원리에 따라 GUV를 생산할 수 있는 두 가지 가능한 분석 시스템, 즉 튜브와 웰 플레이트 내에서 제공한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 둘 다 장점과 단점을 제시하며, 사용자는 자신의 요구에 가장 적합한 시스템을 결정하기 위해 실험 계획 단계에서 고려해야 할 수 있습니다. 실제로, 플라스틱 튜브는 웰 플레이트용 로터가 장착된 원심분리기가 필요하지 않고, 취급이 더 쉬우며, 생산 후 및 이미징 전에 소포의 희석 계수를 제어할 수 있습니다. 그러나 GUV 추출을 위해 생산 후 더 많은 부피(오일 및 수성 상 모두)와 오일 층의 제거가 필요하며, 이 단계를 주의 깊게 수행하지 않으면 이미징 웰에 오일 잔여물이 남을 수 있습니다. 또는 웰 플레이트는 더 적은 양의 시료를 사용해야 하고, 서로 다른 내부 조건을 직렬 및 한 번에 캡슐화할 수 있으며, 동일한 생산 웰에서 생산 직후 소포를 이미지화할 수 있기 때문에 GUV 추출이 필요하지 않습니다. 웰 플레이트의 주요 단점은 소포가 응집되어 있고 튜브에서 관찰되는 것과 유사한 소포 생산 수율에 도달하기 위해 원심분리 매개변수를 조정해야 한다는 것입니다.

사용된 캡슐화 시스템(튜브 또는 웰 플레이트)과는 별개로, 이 접근 방식은 GUV를 생산하고 캡슐화된 단백질의 중합을 촉진하기 위해 최적의 밀집 조건이 필요하다는 것을 보여줍니다. 특히, 이 프로토콜에 따라, 캡슐화된 FtsZ를 가진 GUV에 대한 최상의 조건은 30 g/L BSA 및 50 g/L Ficoll7018로 관찰되었다. 반면 액틴의 경우 10g/L BSA, 7% 요오딕산올 및 20g/L Ficoll70의 혼합물이 필요했다19.

GUV 생산의 또 다른 중요한 측면은 원심분리 속도와 시간입니다. 위에서 언급한 밀집 농도 하에서 FtsZ 네트워크를 형성하기 위해 6000 x g 에서 30분 동안 원심분리하면 이미징 웰 플레이트에 잘 분포되고 분리된 GUV 모집단이 생성됩니다. 반대로, 액틴의 경우 20분 동안 200 x g 를 투여하면 높은 GUV 생산 수율을 얻을 수 있습니다. 원심분리 속도 또는 시간이 감소하면 GUV의 수율에 영향을 미치는 반면, 상기 값 이상으로 증가하면 GUV가 응집됩니다. 상기 조건에서 이 프로토콜은 캡슐화 효율이 최대인 GUV를 생성할 뿐만 아니라 개별 GUV가 서로 달라붙지 않습니다.

이 프로토콜은 모든 지질 및 캡슐화된 생체 분자로 일반화될 수 있지만, 원하는 멤브레인 구성과 소포의 내용물에 따라 원심분리 매개변수가 결정되며, 이는 상 분리된 소포의 생성을 허용합니다. 따라서 이 프로토콜은 멤브레인 도메인이 있는 다양한 소포를 생산할 수 있도록 하는 지침 역할을 합니다.

이와 같이 상분리된 GUV 내에서 시험관 내 재구성 방법론은 세포막의 복잡성을 고려하면서 지질 도메인을 통해 매개되는 복잡한 단백질-막 역학을 이해하는 데 중요합니다14. 이러한 지질 도메인의 작은 크기와 매우 동적인 특성으로 인해 in vivo에서 계면 상호 작용의 특성화를 어렵게 만듭니다. 따라서 GUV는 상대적으로 준비의 용이성과 물리화학적 조절뿐만 아니라 광학 현미경20에 의한 분석에 대한 적합성으로 인해 중요한 도구 역할을 합니다.

더하여, 이질적인 biointerface 내의 기능적인 분자의 캡슐화는 nanomedicine의 분야에 있는 유망한 응용을 선물합니다. 특히, 생체 분자의 비대칭 분포 및 표면의 제한된 영역으로의 분할에서 발생하는 다양한 특성을 가진 기능화된 약물 전달 시스템의 개발21. 약물-지질 상호작용은 약물의 수송, 분포 및 축적과 같은 약물의 약동학적 특성에서 중요한 역할을 하며, 이는 궁극적으로 사용되는 약물의 효능에 영향을 미친다22. 따라서 약물의 약동학적 특성에 대한 이러한 상호 작용의 역할을 이해하는 것은 효과적인 약물을 개발하는 데 매우 중요합니다. 모델 지질막을 탐색하여 펩타이드, 폴리머 및 나노 전달체와의 상호 작용 메커니즘을 이해할 수 있습니다23. 따라서, 특정 질병 조건에서 세포와 조직의 지질 조성 변화는 생물물리학적 상호작용을 변화시킬 수 있으며, 이는 표적 특이적 약물 및 약물 전달 시스템을 개발하기 위해 탐구될 수 있다24.

결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 내부 지질 소엽에 고정된 캡슐화된 단백질을 사용하여 상 분리된 GUV를 생성하는 손쉬운 전략을 제공합니다. 이러한 소포 시스템의 생성은 생명 공학 및 합성 생물학과 같은 분야에서 유망한 사용을 유지하고 있으며, 세포와 같은 기능을 모방하는 복잡한 기능을 가진 다중 구성 요소 어셈블리는 혁신적인 솔루션과 새로운 응용 분야를 가져올 수 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 단백질 정제에 도움을 준 MPIB Core Facility, 플라스미드 클로닝을 제공한 Michaela Schaper, 단백질 정제를 제공한 Kerstin Röhrl, 지질 제제를 제공한 Sandra Ortmeier에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 크라우더 조건과 단백질 캡슐화에 대한 유용한 토론을 해준 Adrián Merino-Salomón과 Shunshi Kohyama에게 감사를 표합니다. M.R.-L. 연방 정부 및 Länder의 우수성 전략에 따라 바이에른 자유주뿐만 아니라 연방 교육 연구부(BMBF)가 지원하는 IMPRS-ML 및 ONE MUNICH 프로젝트의 일부입니다. 저자들은 또한 뮌헨의 나노과학 센터(Center for Nanoscience, CeNS)의 지원을 인정하고 싶습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨염)(DOPG)Avanti 극성 지질840475클로로포름
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)Avanti 극성 지질850375로로포름
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(캡 비오티닐)(나트륨염)(18:1 비오티닐 캡 PE)Avanti 극성 지질870273 클로로포름
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨염)(DPPG)Avanti 극성 지질840455클로로포름
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)Avanti 극성 지질850355로로포름
96웰 평바닥 마이크로플레이트(SensoPlate)액
틴(알파-액틴 골격근, 토끼)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (알파-액틴 골격근, 토끼)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16분말
목욕 초음파 처리기Branson 1510R-MTH브랜소닉 초음파 세척기
비오틴-액틴(알파-액틴 골격근, 토끼)HYPERMOL8109-01
BSA시그마 알드리치A6003
원심분리기엡펜도르프5424R
원심분리기엡펜도르프5804 R
클로로포름시그마 알드리치67-66-3
콜레스테롤(양)Avanti 극성 지질700000클로로포름
데칸TCI Deutschland GmbHD0011
Fascin(인간, 재조합)Cytoskeleton Inc(Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol(OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 공초점 레이저 주사 현미경Carl ZeissC-Apochromat 40  &시간;  /1.2 침수 대물렌즈. 다이오드 펌핑 고체 레이저: 488  NM 및 640&Thinsp; nm.
미네랄 오일Sigma Aldrich8042-47-5
Myosin II (토끼 골격근)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
삼투압계Fiske AssociatesFiske Micro-Osmometer 모델 120
Greiner Bio-One  글로벌07-000-109
클 클

참고문헌

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