방법 논문

13C2-레티닐 아세테이트의 합성 및 레티놀 동위원소 희석 테스트를 위한 용량 준비

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DOI:

10.3791/68535

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2025년 8월 22일

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

레티닐 아세테이트는 일반적으로 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법이 혈청 및 모유 분석에 사용될 때 2개의 13C로 표지됩니다. 이 논문은 13C2-레티닐 아세테이트의 합성 및 용적식 피펫 또는 투베르쿨린 주사기로 전달되는 레티놀 동위원소 희석 테스트를 위한 용량 준비에 대해 설명합니다.

초록

레티놀 동위원소 희석(RID) 검사는 참조 표준으로 간주되는 총 간 비축량을 추정하여 비타민 A 상태를 평가하는 가장 민감한 방법입니다. 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법 검출을 위해 레티놀 부분에 13C를 첨가합니다. 13C-레티닐 아세테이트의 합성 절차는 자연적으로 발생하는 β-이오논으로 시작됩니다. 간단히 말해서, C18-테트라엔 케톤은 β-이오논에서 합성되어 정제됩니다. 13C4-레티닐 아세테이트가 필요한 경우, 13C2-표지 트리에틸포스포노아세테이트의 카바니온을 사용하여 아세톤의 3개의 탄소를 첨가하기 전에 β-이오논 부분에 2개의 13C를 첨가하여 C18-테트라엔 케톤을 합성할 수 있다. 13C3-레티닐 아세테이트가 필요한 경우 아세톤의 3개 탄소를 13C로 표지할 수 있습니다.

가스-크로마토그래피-연소 동위원소 비율 질량 분석법에 의한 향후 분석을 위해 가장 일반적으로 사용되는 13C2-레티닐 아세테이트의 경우 수정된 Wittig-Horner 절차가 사용되고, 표지되지 않은 C18 테트라엔 케톤을 13C2-표지된 트리에틸포스포노아세테이트의 카바니온과 반응시켜 레티놀 분자의 14 및 15 위치에 2-13C를 첨가합니다. 생성된 에틸 에스테르는 알코올로 환원되고 무수 아세트산과 함께 13C2-레티닐 아세테이트로 에스테르화됩니다. 올-트랜 스 이성질체는 상대적으로 무해하고 휘발성이 높은 용매(헥산 및 디에틸 에테르)를 사용하여 8% 물 비활성화 알루미나에서 정제되며, 이는 오일 용량의 회전 증발 및 음파화에 의해 제거됩니다. 이 제품은 분석 표준에 대한 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광법, 박층 크로마토그래피(TLC) 및 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 특징으로 합니다. 농축된 용량은 -80°C에서 대두유에 용해시켜 보관합니다. 최종 용량은 대두유(~200μL/용량)로 희석되고 비히클 대두유에 대한 UV-Vis 분광법으로 정량화됩니다. RID 테스트를 위해 용적식 피펫 또는 투베르쿨린 주사기를 사용하여 인간에게 전달하기 위해 용량을 측정합니다. 적절한 가정을 사용하여 전체 신체 저장량을 계산하고 총 간 비축량을 추정합니다.

서론

레티놀 동위원소 희석(RID)은 전신 비타민 A 저장량(TBS)을 정량적으로 측정하고 적절한 가정을 통해 총 간 예비량(TLR)을 추정할 수 있는 비타민 A 상태의 유일한 바이오마커입니다. 이는 비타민 A 상태와 미리 형성된 레티놀 또는 프로비타민 A 카로티노이드를 포함하는 개입의 영향을 측정하는 가장 민감한 방법입니다. 기술적으로 어렵지만 RID는 간 생검이 아닌 혈액 샘플만 필요하기 때문에 정확하고 최소 침습적입니다1. RID 테스트에는 질량 분석기 플랫폼에 따라 중수소화 또는 13C 표지 레티닐 아세테이트의 투여가 포함됩니다. 용량 투여 전에 기본 혈액 샘플을 수집하는데, 이는 13개의 C-라벨을 사용할 때 필수적이지만 무작위로 선택된 하위 그룹에서 수행할 수 있습니다. 두 번째 샘플은 13C-표지 레티닐 아세테이트가 TBS1과 혼합된 후 수집됩니다.

결핍을 예방하기 위한 비타민 A 개입에는 식품 강화, 생물 강화, 식이 다양화 및 보충이 포함됩니다. 그러나 일부 국가에서는 동일한 사람들을 대상으로 하는 중복 개입이 있어 비타민 A2 과다증이 발생하여 프로그램 결과를 평가하기 위한 모니터링 프레임워크가 필요했습니다. 따라서 비타민 A 상태를 정량적으로 측정하는 방법이 필요합니다. 국제원자력기구(IAEA)는 회원국과 협력하여 연구 및 평가에서 동위원소의 평화적 사용을 촉진하여 RID 테스트의 적용을 지원합니다. RID 테스트는 추진력을 얻고 있으며 비타민 A 개입을 시행하는 국가에서 비타민 A 상태가 결핍에서 과잉까지 평가하기 위해 대규모 인구 조사에 곧 사용될 수 있습니다3.

이전에는 중수소화 레티닐 아세테이트에 대해 Bergen et al.의 변형을 사용하여 10,11,14,15-13 C4-레티닐 아세테이트가 합성되었습니다. 이 화합물은 분석에 적합한 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GCCIRMS)을 사용하여 쥐6 및 인간 실험에 사용되었습니다7. 이러한 귀중한 실험을 통해 우리는 GCCIRMS가 매우 민감하여 GCCIRMS를 사용한 RID 테스트에 4개의 13C가 필요하지 않다는 것을 확인했습니다. 따라서 레티놀 분자의 14 및 15 위치에 두 개의 13C만 사용함으로써 추적자의 비용이 절감됩니다(그림 1). 이러한 변형은 합성과 관련된 비용을 줄이고 합성 경로로 인해 수율을 증가시킵니다. 여기서, 그 합성을 위한 스케일 업 프로토콜이 설명된다.

GCCIRMS는 안정 동위원소측정에 대해 다른 유형의 질량 분석법보다 더 민감하며8 식이 변화 및 혈청 레티놀의 자연적인 13C-농축 변화에 반응할 수 있습니다. 이것은 옥수수를 섭취하는 게르빌9 및 인간10, 그리고 야채 개입에 등록된 인간11에서 설명되었습니다. 실제로, 13C의 자연 풍부도는 모집단마다 다르며 RID 평가에 등록된 피험자에서 결정되어야 합니다12. 그러나 가나와 태국 어린이13,14 및 태국 여성15에서 RID를 사용한 자연 농축 측정에 작은 하위 그룹이 사용되었습니다. 개별 기준선13C 농축은 개별 수준12에서 TBS의 가장 정확한 결정을 위해 결정되어야 합니다.

프로토콜

참고: 연구, 개입 또는 평가 연구를 위해 인간 피험자를 등록할 때 적절한 정보에 입각한 동의 절차를 통해 IRB(Institutional Review Board) 승인을 받아야 합니다.

1. 13C2 - 레티닐 아세테이트의 합성 (그림 2)

참고: 모든 합성 절차 및 정량화는 화합물 분해 및 이성질화를 방지하기 위해 금 형광등 조명에서 수행됩니다.

  1. 시중에서 판매되는 β-이오논에서 β-이오닐 아세테이트를 대량으로 합성합니다. 예를 들어, 수소화나트륨(NaH)(4g, 0.16몰)을 100mL의 에테르로 덮습니다. 표지되지 않은 트리에틸포스포노아세테이트(36g, 0.16몰)를 에테르 100mL에 적가하여 첨가하고 2시간 동안 저어줍니다.H2 가 방출되고 초기 현탁액이 투명하고 호박색이 됩니다.
    주의: 수소화나트륨(NaH)은 광범위한 화학 반응에 유용한 강력한 환원제입니다. 그러나 실험실 화재는 대기 중 물과의 발열 반응이 매우 높기 때문에 발생할 수 있습니다16,17. 안전 보건 자료에 액세스하는 것이 좋습니다. NaH와 같은 적당히 발화성 고체를 취급하기 위한 추가 지침이 발표되었습니다18. 취급하는 동안 오일 또는 비반응성 용매에 현탁하여 보관하고, 반응 용기 및 불활성 가스(예: 질소 또는 아르곤)가 포함된 저장 용기를 세척하고, 반응 용기를 냉각하고, 건조한 환경에 보관된 밀봉 용기에 보관하십시오. 우리 연구실에서는 NaH를 질소 환경에서 소량(~1g)씩 바이알로 옮긴 다음 사용할 때까지 밀봉된 건조기에 보관합니다.
  2. β-이오논(21g, 0.12몰)을 에테르 40mL에 첨가하고 하룻밤(20°C에서 ~15시간)을 반응시킵니다. 2일째에 반응을 물로 담금질하고 에틸-β-이오닐리덴 아세테이트를 헥산으로 추출하고 일련의 분리 깔때기에서 물로 반복적으로 세척하여 회수율을 극대화합니다. 유기층(무수 MgSO4)을 건조시키고 여과하여 농축합니다.
    참고: 박층 크로마토그래피(TLC)는 일반적으로 합성의 이 단계에서 미미한 불순물만 검출합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 -80°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
  3. 에틸-β-이오닐리덴 아세테이트(28g, 0.11몰)를 디에틸 에테르에서 1몰 리튬 알루미늄 수소화물(LiAlH4) 120mL와 반응시킵니다. 반응 용기를 드라이아이스 아세톤 수조에 담그고 용액을 계속 저어주어 β-이오닐리덴 에탄올을 생성합니다.
    주의: 리튬 알루미늄 수소화물(LiAlH4)은 강력한 환원제입니다. 안전 보건 자료에 액세스하고 LiAlH418,19와 같은 중간 발화성 고체 취급에 대한 추가 지침을 참조하십시오. 대부분의 안전 예방 조치의 주요 목표는 LiAlH4가 대기에 노출될 위험을 최소화하고 폭주 반응을 방지하는 것입니다. 여기에는 일반적으로 취급하는 동안 이러한 화합물을 오일 또는 비반응성 용매에 현탁시켜 두고, 반응 용기 및 저장 용기를 불활성 가스(예: 질소 또는 아르곤)로 세척하고, 반응 용기를 냉각하고, 건조한 환경에 보관된 밀봉된 용기에 LiAlH4를 보관하는 것이 포함됩니다. 우리 연구실에서는 리튬 알루미늄 수소화물을 분말 형태 대신 밀봉된 1몰 병으로 구입하고 주사기로 필요한 부피를 제거하고 병의 대기를 질소로 대체합니다.
  4. 28g(0.12몰)의 β-이오닐리덴 에탄올을 헥산 300mL에 녹입니다. 3일(51g, 52g 및 54g)에 걸쳐 하루에 약 50g의 90% MnO2 를 첨가하고 반응 혼합물을 더 많은 시간 동안 교반합니다(종종 20°C에서 2일). 마지막으로 MnO2 35g을 첨가하고 약 15시간 동안 밤새 방치합니다. 반응은 약 90% 완료되었습니다. MnO2 에서 β-이오닐리덴 아세트알데히드를 디클로로메탄으로 여과하고 세척합니다.
  5. 조 β-이오닐리덴 아세트알데히드(22g, 0.10몰)를 아세톤 150mL에 녹여 일정하게 교반하고, 1N 수산화나트륨 10mL를 적가한다. 반응을 6시간 동안 그대로 둡니다.
  6. C18 테트라엔 케톤을 헥산으로 추출하고 일련의 분리 깔때기를 사용하여 물로 반복적으로 세척하여 회수율을 극대화합니다. 생성된 용액을 회전식 증발기로 건조시켜 조한 시스-트랜 스 C18 테트라엔 케톤을 생성합니다. 트랜스 이성질체는 인간 연구에 가장 바람직하기 때문에 헥산에서 0-10% 에틸 아세테이트의 느린 구배를 사용하여 4% 물 비활성화 실리카겔(300g)에서 혼합물을 정제합니다.
  7. NaH(1.2g, 0.05몰)를 에테르 50mL와 함께 저어줍니다. 에테르 50mL에 용해된 13C2-트리에틸포스포노아세테이트(11g, 0.049몰)를 적가하여 2시간 동안 저어준다. C18 테트라엔 케톤(12g, 0.044몰)을 에테르 50mL에 용해시키고 20°C에서 약 15시간 동안 밤새 반응시킨다.
  8. 물로 반응을 담금질하고 헥산으로 14,15-13C 2-레티노산 에틸 에스테르를 추출하고 분리 깔때기에서 물로 세척합니다. 무수 MgSO4로 유기층을 건조시키고 농축합니다. 헥산 구배에서 0-3% 디에틸 에테르와 함께 8% 물로 비활성화된 중성 알루미나(400g)를 정제하여 시스/트랜스 이성질체를 생성합니다.
    참고: 종종 첫 번째 정제에는 TLC에서 판단한 오염 물질이 있습니다. 오염 물질은 TLC 플레이트를 요오드 증기와 반응시켜 시각화합니다. 오염 물질이 존재하는 경우 순수한 14,15-13C 2-레티노산 에틸 에스테르를 생성하려면 400% 헥산과 함께 8% 물 비활성화 중성 알루미나 100g을 재정제하는 것이 중요합니다.
  9. 14,15-13 C 2-레티노산 에틸 에스테르(3.7 g)를 건아이스 아세톤 수조에서 15 mL의 1몰 리튬 알루미늄 수소화물로 환원시키면서 교반하여 14,15-13 C2-레티놀을 생성합니다(그림 1).
  10. 14,15-13C 2-레티놀(3.5g)을 트리에틸아민 20mL에 녹입니다. 용액을 저어주면서 무수아세트산 3.5mL와 트리에틸아민 7mL를 혼합하고 플라스크에 적가합니다. 14,15-13 C2-레티닐 아세테이트가 형성되도록 플라스크를 냉장고에 밤새 두십시오(약 15시간).
  11. 조 14,15-13C2-레티닐 아세테이트 3.9g을 헥산으로 추출하고, 건조, 농축 및 헥산 구배에서 천천히 0-3% 디에틸 에테르와 함께 500% 물 비활성화 중성 알루미나 8g에서 정제합니다. 325nm에서 자외선 가시광선(UV-Vis) 분광 광도계로 분획을 모니터링합니다. 회전 증발기로 남아 있는 모든 용매를 제거합니다. HPLC 및 포토다이오드 검출로 최종 제품을 평가하여 cis/trans 비율을 결정합니다. 초압 액체 크로마토그래피를 사용하여 cis/trans 프로파일을 분리하는 고급 그래디언트 시스템의 예는 보충 그림 S1에서 확인할 수 있습니다.
    참고: 이 단계에서 시스/트랜 스 비율은 일반적으로 >95% 올트랜 스입니다.
  12. 보관을 위해 all-trans 14,15-13 C 2-retinyl acetate를 다른 첨가물이 없는 식품 등급 대두유에 녹이고 -80°C에서 질소로 세척된 호박색 유리에 보관하고 농축 원고로 라벨을 붙입니다.

2. 안정 동위원소 표지 레티닐 아세테이트의 유성 용액의 용량 준비

참고: 동위원소로 표지된 레티닐 아세테이트는 캡슐(20 ) 또는 250μL 용적식 피펫(21 ) 또는 의료용 주사기(22 )와 함께 전달되는 오일 용액에 투여되었습니다(그림 3). 아래에 설명된 캡슐의 안정성을 테스트했습니다(그림 4).

  1. 합성 직후, 표지된 레티닐 아세테이트를 결정화되기 시작하기 전에 ~15mL의 강화되지 않은 식물성 기름(예: 식품 등급 대두유)에 용해하고 최종 용량을 준비할 준비가 될 때까지 -30 내지 -80°C에서 24mL 호박색 바이알에 보관합니다.
    1. 라벨이 붙은 레티닐 아세테이트를 구입한 경우 줄로 채점을 찍어 진공 밀봉 앰플의 상단을 조심스럽게 떼어내거나 스크류 탑 병의 밀봉을 깨뜨립니다. 필요한 질량에 따라 24mL 갈색 호박색 병에 무게를 달았던 양을 넣고 소량의 식물성 기름을 첨가합니다(10mL면 충분할 수 있음). 혼합물이 투명한 용액이 될 때까지 초음파 처리하십시오.
  2. 피험자 수에 200μL를 곱하여 필요한 최종 오일의 양을 추정합니다. 예를 들어, 60명의 피험자를 등록해야 하는 경우 낭비에 충분하기 위해 약 70회 용량을 구성합니다(약 10-20%). 따라서 200μL× 70은 14mL입니다.
    알림: 합성 오일이나 결정의 질량에 의존하지 마십시오. 분광 광도계를 사용하여 선량을 정량화해야 합니다. 모든 합성 비타민 A에는 잔류 용매가 포함되어 있습니다. 이들은 음파화 또는 부드러운 질소 흐름에 의해 소멸될 수 있지만 질량만으로는 동위원소 선량을 결정하는 데 사용할 수 없는 주된 이유입니다.
    표지된 레티닐 아세테이트 용액을 사용하지 않고 냉동실에 매우 오랫동안 보관하는 경우 상당한 분해가 발생했는지 확인하기 위해 재분석해야 합니다.
  3. 레티닐 아세테이트를 정량화하려면:
    1. UV-Vis 분광 광도계(스캐닝 이중 빔 분광 광도계 선호)와 연결된 컴퓨터(해당되는 경우)를 켭니다. 제조업체의 지침에 따라 UV-Vis 분광 광도계를 시작합니다. 판독하기 전에 분광 광도계를 최소 30분 동안 예열시키십시오.
    2. 25mL 부피 플라스크 2개와 캡을 설치하고 각각 거의 선까지 25mL의 헥산을 채웁니다. 하나의 플라스크에 "오일" 또는 "블랭크", 다른 플라스크에 "비타민 A" 또는 "용량"이라는 라벨을 붙입니다. 그런 다음 블랭크가 실행될 때까지 비타민 A 플라스크를 따로 보관하십시오.
    3. 일회용 플라스틱 컵에 순수한 콩기름을 붓고 오일 플라스크에 20-40μL를 추가하여 시스템을 비웁니다.
      참고: 우리는 종종 20μL를 사용하지만 블랭크와 동위원소 용량량이 동일한 한 더 많이 사용할 수 있습니다.
    4. 4-5배 뒤집어 오일과 헥산을 혼합한 다음 이 용액으로 두 분광 광도계 석영 큐벳을 모두 헹구고 둘 다 ~75% 가득 채웁니다.
    5. 두 큐벳을 분광 광도계에 넣고 투명한 앞면과 뒷면을 만지지 않도록 주의합니다(반투명 측면만 핸들). 최상의 정확도를 위해 일치하는 각 큐벳의 번호가 매겨진 앞면이 사용자를 향하도록 하십시오.
    6. 샘플 위의 빛 차단 도어를 닫습니다.
    7. Blank 또는 Baseline 기능을 클릭하고 시스템이 오일과 헥산의 기준선 흡광도를 측정하도록 합니다. 이것은 오일 블랭크 헥산 용액의 흡수를 수정합니다. 260에서 400nm까지 스캔; 이 프로세스가 완료된 후 400nm에서 판독값이 "0"인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 제로 버튼을 누르고 스캔을 다시 실행하십시오. 완료되면 시스템은 레티닐 아세테이트 선량 흡광도를 측정할 준비가 된 것입니다.
    8. 샘플 큐벳의 내용물을 버리고 Dose 헥산 용액으로 채웁니다. 샘플을 적절한 지점에 놓고 스펙트럼을 스캔합니다. 피크를 선택하고 흡광도를 읽습니다. 순수 레티닐 아세테이트는 325nm에서 최대 람다가 하나만 있습니다.
      참고: 피크가 두 개 이상 있거나 280nm에 피크가 있는 경우 레티닐 아세테이트가 분해되어 투여에 사용해서는 안 됩니다.
  4. 2.3단계에 대한 계산
    참고: 레티놀의 E 1%, 1cm는 헥산에서 325nm에서 1,810입니다. 레티놀 등가물로 레티닐 아세테이트를 정량화하게 됩니다.
    1. 흡광도를 0.181로 나누어 μg/mL의 용액을 얻습니다.
    2. 25mL를 곱하여 20마이크로리터의 오일 용액에 μg를 얻습니다.
      참고: 예: 헥산 25mL에서 오일 20μL의 흡광도는 0.295입니다.
      오일 20μL에 0.295/0.181 = 1.630μg/mL × 25mL = 40.75μg
      용량에 286μg이 필요한 경우 140.4μL입니다. 이것은 1μmole이지만 라벨 때문에 288μg의 13C2-레티놀이 장에서 만들어집니다. 200μL 용량에 가까워지도록 희석하고 위의 정량화를 다시 실행할 수 있습니다.
  5. 안정성을 테스트하기 위한 캡슐 준비
    1. 캡슐을 더 큰 흰색 바닥과 더 작은 파란색 캡으로 분리합니다.
    2. 흰색 캡슐 바닥을 피펫 팁 상자(상자당 96캡슐)에 넣고 먼지가 캡슐에 들어가지 않도록 닫고 파란색 캡을 지퍼가 달린 비닐 봉지에 밤새 넣습니다. 금이 간 캡슐은 버리십시오.
    3. 레티닐 아세테이트 오일 용액을 실온에 두십시오. 사용하지 않은 작은 플라스틱 컵에 소량(~5mL)을 붓습니다.
    4. 5mL 주사기(1 = 100μL)를 로드하고 트리거 프레스당 200μL를 분배하도록 "2"로 설정하여 리피터 피펫을 준비합니다.
    5. 로딩 암을 끌어올려 레티닐 아세테이트 오일을 리피터 피펫에 넣습니다. 최소 4 x 200 μL 분취량을 컵에 다시 분배하여 팁에서 기포를 제거합니다.
    6. 피펫의 끝을 캡슐의 내벽에 가볍게 대고 방아쇠를 눌러 흰색 캡슐 바닥당 1 x 200 μL 분취량을 분배합니다.
    7. 리피터 피펫이 거의 비어 있으면 더 많은 오일을 흡입하십시오.
    8. 96캡슐 전체 세트를 완성한 후 오일을 컵에 다시 분배한 다음 캡이 깨지지 않도록 주의하면서 파란색 캡을 각 흰색 바닥에 가볍게 밀어 넣기 시작합니다.
    9. 모든 캡을 캡슐에 끼운 후 각 캡슐을 들어 올리고 캡이 단단히 닫혀 있는지 가볍게 확인한 다음 팁 상자에 교체합니다.
    10. 선택한 온도와 조건에서 캡슐을 보관하십시오. 어둠은 알루미늄 호일 아래 랙에 캡슐을 보관하면 얻을 수 있습니다. 다음은 예입니다.
      a.  냉동실에서: 어둠 속에서 -20 °C
      b.  냉장고에서: 어둠 속에서 4°C
      c. 벤치에서: 어둠 속에서 20°C(실온)
      d. 벤치에 있지만 제외: 표준 형광등에 노출된 20°C(실온)
      e.  오븐에서 다른 위치에서 더 높은 주변 온도 복제: 어둠 속에서 37°C

3. 용량 투여

참고: 용적식 피펫은 기술자 간의 정확성과 정밀도를 결정하기 위해 투베르쿨린 주사기와 직접 비교되었습니다(그림 5).

용량은 250μL Rainin 용적식 피펫 또는 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 투여됩니다.

  1. 냉동 복용량을 해동하거나 현장에 가는 경우 얼음 팩과 함께 쿨러에 넣으십시오. 운송 중에 복용량은 일반적으로 해동됩니다.
  2. 쿨러에서 호박색 유리 바이알을 꺼내 엽니다. 바이알이 넘어지지 않도록 "머그잔"이나 비커에 보관하십시오.
  3. 피펫 팁이나 투베르쿨린 주사기를 오일에 삽입하고 소량을 흡입합니다. 플런저를 빠르게 눌러 형성되었을 수 있는 기포를 제거합니다. 필요한 양을 피펫이나 주사기에 천천히 끌어당깁니다. 거품이 없는지 확인하십시오.
  4. 팁의 바깥쪽을 티슈로 닦습니다. 피펫 팁이나 주사기의 끝을 만지면 액체가 빠져나올 수 있으므로 만지지 마십시오.
  5. 팁을 참가자의 입에 넣고 오일을 입에 넣고 입을 다물고 삼키도록 지시합니다.
    참고: 참가자가 투약을 위해 머리를 약간 뒤로 젖힐 수 있으면 도움이 됩니다.
  6. 복용 후 최소 10g의 지방을 제공하는 "체이서" 또는 지방이 많은 간식을 투여하십시오. 어린 아이들의 경우, 플라스틱 숟가락에 담긴 강화되지 않은 오일 1mL를 체이서로 투여하십시오. 나이가 많은 어린이와 성인의 경우 땅콩 버터 샌드위치 반 개, 튀긴 흰 감자 또는 초콜릿 스프레드를 곁들인 바게트가 좋은 후속 간식입니다.
    참고: 어떤 간식이 현지에서 허용되는지 결정하기 위해 유익한 연구를 수행해야 합니다.

결과

시중에서 판매되는 β-이오논을 시작으로 28g의 에틸-β-이오닐리덴 아세테이트를 합성하였다. 환원 후, 염기성 조건에서 22g의 β-이오닐리덴 아세트알데히드를 아세톤과 반응시켜 C18-테트라엔 케톤을 생성하였다. 정제된 C18-테트라엔 케톤 12g을 얻었는데, 이는 ~90%가 all-trans였습니다. 이후, 레티놀 분자의 위치 14, 15에 2개의 13C를 추가하기 위해 수정된 Wittig-Horner 절차를 사용하여 13C2-트리에틸포스포노아세테이트의 카바니온과 반응시켰다. 생성된 에틸 에스테르(3.7g 수율)를 알코올로 환원시키고 트리에틸아민에 용해된 무수아세트산으로 13C2-레티닐 아세테이트로 에스테르화했습니다. 합성 비타민은 휘발성이 높은 유기 용매인 헥산과 디에틸 에테르를 사용하여 8% 수분 비활성화 알루미나에서 정제되었습니다. 생성된 제제는 UV-Vis 분광법, TLC 및 HPLC를 사용하여 특성화되었습니다. 장기 보관을 위해 표지된 레티닐 아세테이트를 -80°C에서 대두유에 용해시켜 보관합니다.

위에서 설명한 14,15-13C2-레티닐 아세테이트에 대한 성공적인 합성 계획은 그림 2에 나와 있습니다. β-이오논으로 시작하는 전체 경로는 7단계로 구성됩니다. 첫 번째 수율은 0.9g의 all-trans 14,15-13 C 2-retinyl acetate였습니다. Cis/trans 이성질체 분획물(1.2g)을 300g의 8% 물-비활성화 중성 알루미나에서 결합하고 재정제하여 추가로 0.3g의 all-trans 14,15-13 C2-레티닐 아세테이트를 생성했습니다.

캡슐 내 레티닐 아세테이트의 안정성을 결정하기 위해 레티닐 아세테이트(1g)를 헥산에 용해시키고 헥산을 용매로 하는 8% 물 비활성화 알루미나 300g을 사용하여 오픈 컬럼 크로마토그래피로 정제했습니다. 레티닐 아세테이트는 TLC 및 UV-Vis 분광법으로 모니터링되었으며 순수 분획만 사용되었습니다. 이 공정은 위에서 설명한 RID 테스트를 위해 Tanumihardjo 실험실에서 13C2-레티닐 아세테이트의 합성 및 정제에 사용되는 것과 동일합니다. 정제된 레티닐 아세테이트를 대두유에 용해시키고, 회전식 증발기로 유기 용매를 제거하고, 최종 농도 7.5μM까지 더 많은 오일을 첨가했습니다(200μL당 1.5μmol을 산출하기 위해, GCCIRMS를 분석에 사용할 때 RID 테스트를 위한 성인과 어린이의 용량 사이의 중간점). 농도는 위에서 설명한 바와 같이 UV-Vis 분광법에 의해 결정되었습니다.

안정성 연구를 위해 오일 200μL의 분취량을 크기 3 셀룰로오스 캡슐(최대 부피 300μL)에 분배했습니다. 각 용량의 캡슐은 5가지 조건에서 보관되었습니다. 어둠은 알루미늄 호일 아래 랙에 캡슐을 보관함으로써 달성되었습니다. 총 750개의 캡슐에 대해 각 조건에 대해 캡슐(150개)을 준비했습니다: i) 냉동실에서: 어둠 속에서 -20°C; ii) 냉장고에서: 어둠 속에서 4°C; iii) 벤치에서: 어둠 속에서 20°C(실온); iv) 벤치에 있지만 제외: 표준 형광등에 노출된 20°C(실온); v) 오븐에서 다른 위치에서 더 높은 주변 온도를 복제합니다: 어둠 속에서 37°C.

캡슐 안정성 연구에서는 각 시점(-20°C, 4°C, 실온 어두움, 실온 밝음, 37°C)에서 각 조건의 캡슐 3개를 측정하였다. 모든 캡슐을 실온에 두었습니다(실온 캡슐을 먼저 분석함). 온도 변화는 흡광도 변화를 일으킵니다. 캡슐은 480일까지 측정되었습니다. 캡슐은 -20°C 및 4°C에서 9개월 동안 안정적으로 유지되었습니다(그림 4).

일회용 투베르쿨린 주사기를 참조 표준으로 Rainin 용적식 피펫과 비교하기 위해 방법 비교를 수행했습니다. Rainin 용적식 피펫은 현지 온도와 압력을 고려하여 물로 보정한 다음 세 개의 팁으로 세 번 테스트하여 용감이 있는 계량 보트에 200μL 설정으로 분배된 목표 오일량을 결정했습니다. 조제 프로토콜은 경험 수준에 따라 10명의 기술자가 수행했습니다. 각 기술자에 대해 8개의 주사기를 세 번으로 테스트하고 피펫 참조와 비교했습니다. 피펫 측면을 티슈로 닦고 오일을 비스듬히 계량 보트에 분배하여 오일을 최대한 방출했습니다. 기술자는 프로토콜 전반에 걸쳐 분배된 질량의 결과에 대해 눈이 멀었습니다. 기름 덩어리는 별도의 기술자가 기록했습니다. 이 과정은 8개의 투베르쿨린(예: Norm-Ject) 주사기를 사용하여 200μL의 대두유로 반복되었습니다.

R 통계 소프트웨어를 사용하여 분산 성분 모델(FitVCA)22 를 적합시켰습니다(그림 5). 측정된 가변성 요인에는 기술자, 기술자 내 주사기 및 복제 오류가 포함되었습니다. 피펫 전달량과 비교할 때 평균(95% CI) 정규화된 주사기 전달 값은 0.996(0.912, 1.08)이었습니다. 반복 오류로 인한 분산은 전체 분산의 64.8%를 차지했으며, 이는 변동성의 가장 큰 원인이 동일한 주사기 내에서 반복 측정에서 비롯된 것임을 나타냅니다. 기술자 내 기술자 및 주사기의 백분율 차이는 각각 22.9%와 12.3%로 훨씬 낮았습니다.

하위 그룹 분석은 경험에 따라 기술자를 두 그룹(n = 5/그룹)으로 나누어 수행했습니다. 평균 표준화된 주사기 전달은 두 그룹 간에 유사했지만 경험이 많은 기술자의 경우 95% CI가 더 좁았습니다. 각각 1.001(0.939, 1.063) 및 0.998(0.900, 1.100). 경험이 많은 기술자 내에서 대부분의 분산은 기술자 내 주사기(57.0%)와 복제 오류(42.9%)에서 발생한 반면, 경험이 부족한 기술자의 경우 대부분의 분산은 기술자(32.7%)와 복제 오류(67.2%)에서 발생했습니다.

figure-results-1
그림 1: 탄소에 번호가 매겨진 레티놀의 구조. 13C는 일반적으로 가스 크로마토그래피-연소 질량 분석법과 함께 사용하기 위해 14 및 15 위치에 추가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법을 혈청 또는 모유 분석에 사용할 때 레티놀 동위원소 희석 테스트에 사용되는 14,15-13 C2-레티닐 아세테이트의 합성 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 팁에 사량이 없는 1mL 투베르쿨린 주사기 및 추적자 연구에서 투여에 사용되는 250μL 용적식 피펫. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 5가지 조건에서 캡슐에 저장된 레티닐 아세테이트의 분해 곡선. 조건은 -20°C, 4°C, 어두운 곳에서 20°C(실온), 표준 형광등 아래에서 20°C(실온), 37°C입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 평가 중 결과를 알지 못한 10명의 기술자를 대상으로 1mL 투베르쿨린 주사기와 250μL 용적식 피펫을 비교한 용량 전달량의 분산 성분 분석. 값은 용적식 피펫으로 정규화된 주사기에서 분배된 오일 질량(200μL)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 초압 액체 크로마토그래피에 의한 14,15-13C-레티닐 아세테이트의 최종 순도 검사의 예. 해당 스펙트럼은 비타민의 시스/트랜스 형태의 특징입니다. UPLC 조건은 용매 A 70:25:5(아세토니트릴:물:이소프로판올)과 10mM 암모늄 아세테이트, 용매 B는 75% 아세토니트릴, 25% 이소프로판올이었습니다. 사용된 컬럼은 Acquity UPLC, BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 100 mm 컬럼이었습니다. 컬럼은 29°C로 설정되었고 유속은 0.4mL/min이었습니다. 그래디언트는 100% 용매 A로 시작하여 5.0분 동안 유지한 후 7분 동안 98% 용매 B로 전환하고 8분 동안 유지한 후 1분에 걸쳐 100% 용매 A로 다시 전환하고 4분 동안 평형을 유지했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

중수소화 및 13C 표지 레티닐 아세테이트의 상업적 공급원이 있지만 숙련된 유기 화학자를 위한 문헌에는 레티놀에 대한 여러 합성 경로가 있습니다. 우리는 중수소화 레티닐 아세테이트가 따라야 할 합성 경로를 선택하고 위에서 설명한 레티놀 부분의 백본에 13C를 추가하도록 적절한 조정을 수행했습니다. 14,15-13 C2-레티닐 아세테이트의 합성은 상업적으로 이용 가능한 β-이오논으로 시작하는 7단계 절차를 사용하여 수행되었습니다. β-이오논은 자연적으로 발생하는 식물 성분이며 장미와 같은 향기에 기여합니다. 합성 경로에서 가장 중요한 단계는 C18 테트라엔 케톤의 형성입니다. 이 중간 화합물은 좋은 수율을 생성하기 위해 후속 단계를 위해 순도가 90% 이상이어야 합니다.

라벨링은 상업적으로 이용 가능한 13C2-트리에틸포스포노아세테이트와 함께 수정된 Wittig-Homer 절차를 사용하여 수행되었습니다. 표지된 화합물은 TBS를 결정하고 TLR을 추정하기 위해 RID 테스트에 사용됩니다. 이 방법은 표지된 화합물의 생리학적 수준을 투여받은 개인의 혈청 또는 모유에서 정제된 레티놀을 분석하기 위해 GCCIRMS를 활용합니다. 가장 일반적인 복용량은 어린이의 경우 1μmole, 성인의 경우 2μmole입니다. GCCIRMS 분석은 동위원소 농축에 민감하지만, 혈청 분석은 GC에 도입하기에 충분한 레티놀 질량을 얻기 위해 최소 400μL의 혈청이 필요합니다.

13C-RID 테스트는 임상 연구23,24 및 아프리카 어린이 그룹25에서 사용되었으며 향후 인구 기반 작업에 접근할 수 있도록 할 계획입니다. 우리는 이러한 변형이 인구 연구에 적합한지 여부를 조사하기 위해 캡슐과 주사기로 실험을 수행했습니다. 캡슐은 똑바로 세워야 하며 그렇지 않으면 누출됩니다. 우리는 현장에서 사용하기 위해 일반 호박색 알약병에 보관할 수 있다는 생각을 재빨리 버렸습니다. 캡슐은 냉장고와 냉동고 온도에서 ~9개월 동안만 안정적이었습니다. 밀봉된 캡슐을 생산하면 보관 중 대기에 대한 약간의 노출을 줄여 안정성을 향상시킬 수 있습니다. 캡슐 사용은 구현하기 전에 사용자 그룹에서 테스트하고 검증해야 합니다.

최종 오일 용액은 실온에서 ~2개월 동안 안정적이지만 일단 분해되기 시작하면 분해가 빠르게 계속됩니다. 투여량이 TBS 계산에 사용되므로 RID 테스트에 허용되는 부분 활동은 없습니다. 사용하는 동안 용액을 현장의 얼음 팩에 보관하고 투여가 완료된 후 가능한 한 빨리 다시 얼리는 것이 가장 좋습니다. 하루에 필요한 것보다 몇 복용량만 더 가져오고 나머지는 냉동 보관하는 것이 가장 좋습니다. 오일 자체에 항산화제가 포함되어 있기 때문에 냉동 및 해동은 이러한 용액에 영향을 미치지 않습니다. 오일 용액은 혈액 샘플보다 더 견고하지만 항상 어둠 속에 보관하고 사용하지 않을 때는 냉동해야 합니다.

용량은 250μL Rainin 용적식 피펫 또는 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 투여됩니다. 공기 치환 피펫은 오일에 용해된 용량에는 적합하지 않습니다. 우리 연구실은 이 두 가지 방법을 실험적으로 비교했습니다(대표 결과 참조). 피펫이나 주사기를 사용한 투여는 약간의 편차가 있지만 유사합니다. Rainin 용적식 피펫은 연구 또는 임상 연구에 권장되지만 주사기는 인구 기반 작업에 사용할 수 있습니다. 선량 정밀도를 최대화하기 위해 팁의 사량이 거의 없는 주사기를 사용하는 것이 좋습니다(예: Norm-Ject).

RID 테스트에 대한 계산에는 투여된 용량의 양이 포함되며 투여된 용량의 오류는 TBS의 결과 추정치의 오류에 비례합니다. 투베르쿨린 주사기 대 용적식 피펫을 사용하는 경우 평균 정규화된 주사기 전달은 1에 가까웠으며, 이는 주사기가 인구 연구에 정확한 용량 전달을 제공할 수 있음을 나타냅니다. 95% 신뢰 한계는 목표 용량 전달의 약 ± 8%였습니다. 주사기에 대한 사전 경험이 더 많은 기술자는 경험이 적은 기술자(± 10%)에 비해 95% CI(± 6%)가 더 좁았고 기술자의 분산 기여도가 더 낮았습니다. 이는 현장에서 구현하기 전에 차량 오일을 사용한 교육 프로토콜 및 검증을 수행해야 함을 시사합니다. 이러한 결과는 인구 기반 연구에서 용량 반응 및 RID 테스트에서 용량을 투여하기 위해 비용 효율적이고 시간을 절약하는 전달 방법으로 일회용 투베르쿨린 주사기를 사용하려는 각 실험실에서 추가 검증이 필요합니다.

보고된 정확도와 정밀도가 ≤1%이기 때문에 RID 테스트를 사용하여 연구 및 임상 연구를 위해 용적식 피펫을 선택했습니다. 이에 비해 수정된 상대 용량 반응 테스트는 정성적이며1에 주어진 용량의 양을 기반으로 계산하지 않습니다. 따라서 인구 기반 조사에서 테스트에 주사기를 사용하고 용량을 약 0.7mL의 비히클에 용해시킬 것을 권장했습니다.

RID 검사는 TBS를 정량화하고 비타민 A 상태를 평가하기 위한 참조 표준인 TLR을 추정하는 민감한 방법입니다. 중수소 또는 13C라벨링을 사용하는 많은 연구 응용 분야에 사용되었습니다. 현재 및 미래의 응용 프로그램은 임상 환경에서 RID 테스트를 사용하고 설문 조사에서 인구 하위 그룹을 사용합니다. 투약의 단순화는 이러한 응용 분야에서 중요합니다.

공개 사항

저자는 이 원고의 내용과 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NIH-R01 DC019357와 IAEA 조정 연구 프로젝트 E43035의 자금 지원을 받았습니다. 일회용 주사기 방법 비교 분석에 도움을 준 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스 통계 컨설팅 그룹의 Nicholas Keuler에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무수아세트산시그마 알드리치242845
아세톤시그마 알드리치179124
산화알루미늄시그마 알드리치199974
비커어떤모든 유리 공급 회사 
베타-이오논시그마 알드리치W259500
에테르시그마 알드리치673811
유리 파스퇴르 피펫어떤모든 유리 공급 회사 
헥산시그마178918
표지된 트리에틸포스포노아세테이트시그마 알드리치293202
리튬 알루미늄 수소화물 용액아크로스 오가닉스199511000
산화망간시드마 알드리치310700
용적식 피펫레인인17008579
레티닐 아세테이트시그마 알드리치R4632
분리 깔때기어떤모든 유리 공급 회사 
실리카겔시그마 알드리치1.07734
수소화나트륨알드리치223441
수산화나트륨피셔 사이언티픽S318-100
분광 광도계모든 스캔더블 빔이 선호됩니다.
트리에틸아민시그마 알드리치471283
트리에틸포스포노아세테이트알드리치티61301
투베르쿨린 주사기노름-젝트19G334
식물성 기름콩식료품점
부피 플라스크(25mL)어떤모든 유리 공급 회사 

참고문헌

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비타민 A 상태13C 레티닐 아세테이트간 비타민 A가스 크로마토그래피동위원소 비율 질량 분석법Wittig-Horner 합성박층 크로마토그래피UV-Vis 분광법고성능 액체 크로마토그래피

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