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방법 논문

N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 유발 흥분독성 하에서 망막신경절세포의 해부학적 특징 검사

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68537

⸱

2025년 9월 19일

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

이 논문에서

요약

여기에서는 NMDA 유도 흥분 독성 하에서 마우스 망막의 해부학적 특징과 표현형을 조사하기 위해 유전적으로 지시된 알칼리성 포스파타제(AP) 표지 방법의 사용을 설명합니다. 여러 망막 신경절 세포(RGC) 하위 유형 특이적 리포터 라인과 함께 퇴행성 과정 전반에 걸쳐 죽어가는 RGC에서 새로운 표현형을 발견합니다.

초록

망막 신경절 세포(RGC)는 망막의 출력 뉴런으로 시각적 정보를 뇌로 전달하는 역할을 합니다. 성숙한 마우스 망막에서는 게놈, 형태학적, 기능적 특성을 기반으로 40개 이상의 RGC 유형이 확인되었습니다. RGC 변성은 녹내장 및 외상성 시신경병증을 포함한 다양한 쇠약하게 만드는 망막 질환의 특징입니다. 다양한 질병 상태에 걸쳐 RGC 변성, 생존 및 회복력의 기초가 되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 통찰력을 얻는 것은 효과적인 치료 개입을 개발하는 데 중요합니다. RGC 변성을 조사하기 위해 우리는 이전에 RGC 형태 및 중앙 투영에 대한 망막 발달 연구에서 광범위하게 사용되었던 간단하면서도 강력한 기술을 채택했습니다. 여기에서 우리는 NMDA 유도 흥분독성 하에서 RGC의 해부학적 표현형을 평가하기 위해 이 방법을 적용합니다. 이 접근 방식을 사용하면 시간이 지남에 따라 많은 수의 퇴행성 RGC를 시각화할 수 있으므로 퇴행성 사건의 순서를 매핑하고, 죽어가는 RGC의 특징적인 표현형을 식별하고, NMDA 유발 손상에 저항하는 RGC를 구별할 수 있습니다.

서론

외상성 뇌 손상(TBI)은 뇌에 신경 손상을 일으키는 갑작스러운 손상입니다. 자동차 사고나 스포츠 충돌, 폭발로 인한 폭발 부상으로 인한 것과 같은 심각한 형태의 TBI에서 기계적 힘은 세포 구조를 파괴하여 염증, 산화 스트레스, 흥분 독성 및 결국 신경 세포 사멸을 유발할 수 있습니다 1,2.

중추신경계(CNS)에서 가장 접근하기 쉬운 부분인 망막은 흥분 독성의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 위한 전략을 개발하기 위한 모델 TBI 시스템 역할을 해왔습니다 3,4,5. TBI 연구에 가장 적합한 망막 모델은 시신경 분쇄 모델과 망막의 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 유발 흥분 독성입니다. NMDA 유도 흥분독성 망막 모델에서 망막 신경절 세포(RGC)는 글루타메이트를 주요 흥분성 신경 전달 물질로 활용하고 AMPA 수용체(AMPAR), KAPA 수용체(KAPAR) 및 NMDA 수용체를 포함한 다양한 유형의 글루타메이트 수용체를 활용하여 축삭 전위를 유발하기 때문에 망막 신경절 세포(RGC)가 가장 민감한 유형의 망막 뉴런으로 확인되었습니다 6. RGC 외에도 다른 망막 세포 및 신경 회로도 NMDA 치료의 영향을 받을 수 있습니다 7,8,9. NMDA의 유리체 내 적용은 NMDA 수용체의 장기간 개방을 유도하여 칼슘이 세포로 과도하게 유입되어 과잉 흥분 신경 활동과 불균형한 칼슘 항상성을 유발합니다 10,11,12,13.

NMDA 수용체는 GluN1, GluN2 및 GluN3 14,15,16,17,18의 세 가지 서브유닛으로 구성된 이종 복합체입니다. Grin1에 의해 암호화되는 GluN1은 Grin1의 선택적 접합으로 인해 마우스에서 8개의 이소형을 포함합니다. 4개의 서로 다른 GluN2 서브유닛(a-d)이 있으며, 이는 4개의 개별 유전자에 의해 암호화됩니다: Grin2a-2d. Grin3a와 3b로 인코딩되는 두 가지 GluN3 서브유닛(a와 b)이 있습니다. scRNA-seq 데이터19,20에 따르면, Grin1은 대부분의 RGC 아형(그림 1A)과 약하거나 중간 정도의 발현 수준을 갖는 일부 무축삭 세포(AC) 아형(그림 1B)에서 높게 발현됩니다. Grin2a는 더 적은 수의 RGC 및 AC 아형에서 풍부한 반면, Grin2b는 대부분의 RGC 및 많은 AC 아형에서 적당히 발현됩니다(그림 1A,B). RGC 및 AC에서 Grin2c, Grin2d 및 Grin3b의 발현 수준은 매우 낮습니다(그림 1A,B). Grin3a 발현은 몇 가지 RGC 아형에서 볼 수 있고 일부 AC에서는 약하게 볼 수 있습니다(그림 1A,B). NMDA 수용체의 역할 외에도 칼슘 투과성 AMPAR를 통한 칼슘 유입 유발 흥분 독성이 여러 질병 모델에서 설명되었습니다21. NMDA 수용체 서브유닛의 발현은 NMDA 유도 흥분독성이 주로 RGC 및 AC 9,10,14,22,23을 표적으로 삼는 이유에 대한 단서를 제공할 수 있습니다.

총체적인 NMDA 유도 망막 표현형을 평가하는 기존의 방법에는 조직학적 이상을 검출하기 위한 헤마트실린 및 에오신(H&E) 염색, 세포 사멸을 위한 TUNEL 분석 및 세포 유형 특이적 바이오마커를 사용한 면역형광(IF) 염색이 포함됩니다 8,10,24,25,26 . 세포 수준에서 공초점 이미징 및 염료 충전 기술은 NMDA 유도 망막 모델에서 죽어가는 RGC의 사건 순서를 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 방법은 죽어가는 RGC의 세포 내 구획에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 NMDA 모욕 하에서 생존하는 탄력성 RGC 유형을 식별할 수 있게 했습니다27,28.

여기서, 우리는 유전적으로 활성화된 알칼리성 포스파타제(AP) 염색을 사용하여 NMDA 유도 흥분독성 하에서 마우스 망막 뉴런의 해부학적 특징과 표현형을 조사합니다 29,30,31. 이 방법을 선택하는 이유는 단순성, 비용 효율성 및 전체 망막에 걸쳐 신경 아형의 해부학적 특징에 대한 포괄적인 개요를 얻을 수 있는 능력 때문에 전체 평가 및 대규모 비교 분석에 매우 적합하기 때문입니다. 이 접근법은 뚜렷하고 유전적으로 표시된 망막 뉴런이 총 수준과 세포 내 수준 모두에서 NMDA에 어떻게 반응하는지에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 이 전략이 신경 구조 및 시냅스 조직에 영향을 미치는 다양한 질병 모델의 형태학적 변화를 평가하는 데 광범위하게 적용할 수 있을 것으로 예상합니다 4,26,32,33.

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프로토콜

모든 동물 절차는 실험 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 미국 공중 보건 서비스 정책을 따랐으며 휴스턴에 있는 텍사스 대학교 맥거번 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 용액의 구성은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 타목시펜 주사

  1. 타목시펜 30mg과 에탄올 30μL를 혼합합니다. 끓는 물에 해바라기씨 기름 1mL와 타목시펜/에탄올 혼합물을 가열합니다.
  2. 타목시펜이 에탄올에 녹은 후 가열된 해바라기씨 오일 1mL를 타목시펜 용액에 빠르게 첨가합니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다.
  3. 2개월에서 6개월 사이의 다양한 연령의 성별 마우스를 사용했습니다. 인슐린 주사기를 사용하여 100μg/g 체중의 용량으로 타목시펜 용액을 복강 주사합니다. 마우스 계통을 기준으로 타목시펜 주사 횟수를 결정합니다. 이 프로토콜에서 타목시펜은 연속 4일 동안 1일 1회 투여되었습니다.
    참고: 타목시펜 용액은 밀도가 높은 오일과 혼합되어 있기 때문에 바늘이 분리 가능한 주사기로는 다루기 어렵습니다. 따라서 타목시펜 주사에는 바늘이 부착된 인슐린 주사기가 선호됩니다.
  4. 개별 환기가 가능한 케이지에 5마리 이하의 그룹으로 마우스를 보관하십시오. NMDA 주사까지.

2. 마우스 눈에 NMDA 용액 주입

  1. 멸균 1x PBS에서 20mM의 NMDA 용액을 준비합니다. 100% 에탄올을 사용하여 부착된 35G 바늘로 나노 인젝터를 20배 세척한 다음 멸균 초순수로 추가로 20배 세척합니다. 나노 인젝터에 1μL의 NMDA 용액을 채웁니다.
  2. 1X PBS(체중 kg당 80/10mg) 용액 혼합물에 케타민/자일라진을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 꼬리와 발가락 꼬집기에 대한 반사 철수 반응으로 무의식을 평가합니다.
  3. 마취된 마우스를 실체현미경에 놓습니다. 마우스의 오른쪽 눈이 위를 향하고 코가 오른쪽을 향하도록 배치합니다. 국소 마취를 위해 0.5% 프로파라카인 염산염 용액을 오른쪽 안구에 한 방울 떨어뜨립니다.
  4. 멸균 30G 주사 바늘을 사용하여 7시 위치의 윤부에 구멍을 뚫어 작은 구멍을 만듭니다. 입체 현미경으로 바늘의 위치와 방향을 모니터링합니다. 쉽게 삽입할 수 있도록 주사 바늘의 크기가 나노 주사 바늘보다 약간 큰지 확인하십시오.
  5. 안구에서 주사 바늘을 조심스럽게 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 안내를 위해 실체현미경을 사용하고 나노 주입 바늘을 윤부를 통해 유리체에 45° 각도로 삽입합니다.
  6. 1μL의 NMDA 용액을 유리체에 천천히 주입합니다. 주사 후 나노 주입 바늘을 유리체에 약 10초 동안 유지하여 주입된 용액의 유출을 방지합니다.
  7. 나노 주사 바늘을 눈에서 조심스럽게 천천히 빼냅니다. 0.5% 에리스로마이신 안과용 연고를 주사한 눈의 각막에 바릅니다.
  8. 마우스를 가열 패드의 케이지에 놓습니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 15분마다 마우스를 모니터링합니다. 조직 수집까지 1-2주 동안 마우스를 수용합니다.

3. 조직 수집 및 알칼리성 포스파타제(AP) 염색

  1. CO2 질식으로 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 시킨다. 안구와 시신경에 연결된 근육을 Vanna 가위로 조심스럽게 자릅니다.
  2. 그런 다음 안구를 집게로 집어 별도의 라벨이 붙은 2.0mL 튜브로 옮겼습니다.
  3. 실온에서 10분 동안 10% 중성 완충 포르말린에 안구를 고정합니다. 아래 설명된 대로 망막을 질산셀룰로오스 멤브레인 필터에 평평하게 장착합니다.
    1. 안구를 1x PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시로 옮깁니다. 겸자를 사용하여 안구에 부착된 근육 조직을 잡습니다. 30G 주사 바늘을 사용하여 윤부에 구멍을 만듭니다. Vanna 가위의 끝을 구멍에 삽입하고 ora serrata 주위를 자릅니다. 집게를 사용하여 아이컵에서 렌즈를 제거합니다.
    2. 안컵에 3-4개의 상처를 만들고 집게를 사용하여 RPE를 잡고 망막에서 RPE를 부드럽게 제거합니다.
    3. 질산셀룰로오스 멤브레인 필터의 작은 조각을 자르고 1x PBS에 담그십시오. 분리된 망막을 필터 위에 놓습니다. 가는 붓 끝으로 망막의 주변 부위를 부드럽게 밀어 망막의 가장자리를 필터에 부착합니다.
    4. 필터의 가장자리를 잡고 1x PBS에서 천천히 당겨 망막이 부착된 상태로 필터에 평평해지도록 합니다. 망막/필터를 종이 타월 위에 1분 동안 올려 부착된 망막을 필터에 고정합니다.
    5. 망막/필터를 1x PBS가 있는 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 집게 및/또는 미세한 붓을 사용하여 망막에서 부스러기, 머리카락 및 유리체를 가능한 한 조심스럽게 제거하십시오. 주입된 망막과 주사되지 않은 망막을 구별하려면 필터를 다른 모양으로 다듬습니다.
  4. 망막/필터를 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 망막을 10% 중성 완충 포르말린에 실온에서 5분 동안 부드럽게 교반합니다.
  5. 65°C 수조를 준비합니다. 50mL 유리 비커에 30mL의 1x PBS를 예열합니다. 망막/필터를 예열된 1x PBS로 직접 옮깁니다. 망막을 65°C에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 열처리는 내인성 AP 활성을 비활성화하여 망막에 배경 염색을 유발합니다. 이 배경을 효과적으로 제거하려면 가열된 용액에서 망막을 처리하는 것이 중요합니다.
  6. 열처리 후, 망막을 AP 완충액(100mM Tris, pH 9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl2)이 들어 있는 30mm 페트리 접시로 옮깁니다.
  7. 실온에서 5분 동안 AP 완충액에서 망막을 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
    참고: 이 단계는 망막의 완충액을 1x PBS에서 AP 완충액으로 교환하여 발색 중 화학적 침전을 방지합니다.
  8. AP 완충액을 염색 용액(10mL AP 완충액에 10 mg/mL BCIP 30 μL 및 10 mg/mL NBP 60 μL)으로 교체합니다.
  9. 페트리 접시를 빛이 차단되는 상자에 넣습니다. AP 염색의 강도가 이미징에 만족스러울 때까지 부드럽게 교반하면서 실온에서 1-2일 동안 AP 반응을 전개합니다.
  10. 망막을 1x PBS로 실온에서 5분, 2회 세척하여 반응을 중지합니다.
  11. 10% 중성 완충 포르말린으로 망막을 10분 동안 실온에서 부드럽게 교반합니다.
  12. 망막을 1x PBS로 실온에서 5분, 3회 부드럽게 교반하면서 세척합니다. 망막을 30% 에탄올에 배양한 다음 50% 에탄올을 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반하여 탈수합니다.
  13. 고운 붓을 사용하여 여과지에서 망막을 부드럽게 제거합니다. 필터가 없는 망막을 70% 에탄올에서 30분 동안 탈수한 후 실온에서 부드럽게 교반하면서 100% 에탄올에서 30분 동안 두 번 배양합니다.
  14. 벤질 벤즈산/벤질 알코올(2:1, v/v) 투명 용액과 함께 유리 페트리 접시에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분에서 2시간 동안 망막을 제거합니다.
    참고: 이 투명 절차는 장기간 배양하면 종종 AP 염색이 손실될 수 있으므로 밤새 수행해서는 안 됩니다. 투명 용액은 플라스틱을 녹일 수 있으므로 유리 용기에서 절차를 수행해야 합니다.
  15. 망막을 유리 슬라이드에 장착하려면 슬라이드에 양면 테이프를 붙여 커버슬립과 망막을 위한 플랫폼을 만듭니다. 망막을 슬라이드 위에 놓고 공간을 투명 용액으로 채우고 커버슬립을 바르고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하여 망막과 커버슬립을 고정합니다.
  16. Zeiss Apotome 현미경을 사용하여 AP 염색 망막을 이미지화합니다.

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결과

유리체에 NMDA를 적용하면 RGC 사멸이 유도되며, 이는 전통적으로 RGC 마커를 사용한 조직학적 염색 또는 면역형광(IF) 염색을 사용하여 검출되었습니다. 우리의 실험 설정에서 범-RGC 마커 RBPMS와 함께 기존의 IF 전략을 사용하여 NMDA 주사 1주일 후에 RGC의 수가 약 65% 감소했음을 확인했습니다(그림 2E-G). 이전 연구에서는 Tbr2 발현 RGC가 실제로 ipRGC임을 발견했습니다34,35. Tbr2CreER2에서 AP 염색 사용; RosaiAP 망막에서 우리는 소수의 Tbr2 발현 RGC만이 생존한 반면 대부분의 Tbr2 발현 RGC 및 AC는 주사 후 1주일 후에 사라진 것을 관찰했습니다(그림 2A,B

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토론

이 연구에서 우리는 다양한 RGC 및 AC 아형에서 NMDA 유발 퇴행성 사건을 조사하기 위해 유전적으로 조작된 여러 마우스 계통과 함께 유전적으로 지시된 희소 AP 표지 시스템을 활용하고 몇 가지 특징적인 표현형을 발견했습니다 29,31,39. 가장 눈에 띄는 표현형은 NMDA 주입 망막에서 RGC 및 AC의 상당한 감소이며(그림 2A-D), 세포 유형 특이적 리포터 라인 또는 범-RGC 마커를 사용한 IF 염색을 사용한 이전 연구의 관찰과 일치합니다(그림 2E-F). 우리는 이전에 Tbr2 발현 RGC가 본질적으로 ipRGC

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공개 사항

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 국립 보건원-국립 안과 연구소에서 CAM(EY024376)에 대한 보조금과 부분적으로 국립 안과 연구소 시력 핵심 보조금 P30EY028102(UTHealth)의 지원을 받았습니다. 또한 Stephen Lasher Endowment(UTHealth)와 Raye White Endowment(UTHealth)의 재정 지원에도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5% 에리스로마이신 안과용 연고 바우쉬+롬24208-910-55
0.5% 프로파라카인 염산염 바우쉬+롬24208-730-06
10% 중성 완충 포르말린 VWR89370-094
10cm 페리디코 닝430167
PBS 10배피셔 사이언티픽BP399 시리즈물에 희석하여 1x PBS 및 오토클레이브를 만듭니다. 
2.0ml 튜브VWR525-1136
30 게이지 주입 바늘엑셀린트 인터내셔널26437
30mm 페리디송골매35208
벤질 알코홀 아크로스 오가닉스447000010
벤질 벤즈에이트아크로스 오가닉스105860010
질산셀룰로오스 멤브레인 필터사이티바7188-002
커버 슬립전자현미경 과학72204-01
양면 테이프스카치597020
에탄올데콘 연구소2716AP 염색 후 탈수질을 위해 Fisher Bioreagents(Cat#: BP2818)를 피하십시오. 이 시약은 망막을 왜곡합니다.
집게테드 펠라505
가열 패드테라템710298-001
인슐린 주사기BD329424
케타민데크라17033010110
현미경자이스Axio 이미저 2
매니큐어전자현미경 과학72180
나노필 인젝터세계 정밀 기기나노필
나노필 바늘세계 정밀 기기NF25BL
NBT/BICP 시약 키트인비트로젠N6547
NMDA시그마-알드리치M3262
페인트 브러시킹아트6650
슬라이드 유리피셔 사이언티픽12-550-15
실체 현미경모틱DM143
해바라기씨 오일시그마-알드리치S5007
타목시펜시그마-알드리치티5648타목시펜 용액을 4도 및 온도에서 보관하십시오. 차광 상자에 C. 일주일 이내에 타목시펜 용액을 사용하십시오.
반나 가위 정밀 과학 도구15000-00
수조랩 라인18052
자일라진데크라17033-0099-05상품명: 롬푼

참고문헌

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