여기에서는 NMDA 유도 흥분 독성 하에서 마우스 망막의 해부학적 특징과 표현형을 조사하기 위해 유전적으로 지시된 알칼리성 포스파타제(AP) 표지 방법의 사용을 설명합니다. 여러 망막 신경절 세포(RGC) 하위 유형 특이적 리포터 라인과 함께 퇴행성 과정 전반에 걸쳐 죽어가는 RGC에서 새로운 표현형을 발견합니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막 신경절 세포(RGC)는 망막의 출력 뉴런으로 시각적 정보를 뇌로 전달하는 역할을 합니다. 성숙한 마우스 망막에서는 게놈, 형태학적, 기능적 특성을 기반으로 40개 이상의 RGC 유형이 확인되었습니다. RGC 변성은 녹내장 및 외상성 시신경병증을 포함한 다양한 쇠약하게 만드는 망막 질환의 특징입니다. 다양한 질병 상태에 걸쳐 RGC 변성, 생존 및 회복력의 기초가 되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 통찰력을 얻는 것은 효과적인 치료 개입을 개발하는 데 중요합니다. RGC 변성을 조사하기 위해 우리는 이전에 RGC 형태 및 중앙 투영에 대한 망막 발달 연구에서 광범위하게 사용되었던 간단하면서도 강력한 기술을 채택했습니다. 여기에서 우리는 NMDA 유도 흥분독성 하에서 RGC의 해부학적 표현형을 평가하기 위해 이 방법을 적용합니다. 이 접근 방식을 사용하면 시간이 지남에 따라 많은 수의 퇴행성 RGC를 시각화할 수 있으므로 퇴행성 사건의 순서를 매핑하고, 죽어가는 RGC의 특징적인 표현형을 식별하고, NMDA 유발 손상에 저항하는 RGC를 구별할 수 있습니다.
서론
외상성 뇌 손상(TBI)은 뇌에 신경 손상을 일으키는 갑작스러운 손상입니다. 자동차 사고나 스포츠 충돌, 폭발로 인한 폭발 부상으로 인한 것과 같은 심각한 형태의 TBI에서 기계적 힘은 세포 구조를 파괴하여 염증, 산화 스트레스, 흥분 독성 및 결국 신경 세포 사멸을 유발할 수 있습니다 1,2.
중추신경계(CNS)에서 가장 접근하기 쉬운 부분인 망막은 흥분 독성의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 위한 전략을 개발하기 위한 모델 TBI 시스템 역할을 해왔습니다 3,4,5. TBI 연구에 가장 적합한 망막 모델은 시신경 분쇄 모델과 망막의 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 유발 흥분 독성입니다. NMDA 유도 흥분독성 망막 모델에서 망막 신경절 세포(RGC)는 글루타메이트를 주요 흥분성 신경 전달 물질로 활용하고 AMPA 수용체(AMPAR), KAPA 수용체(KAPAR) 및 NMDA 수용체를 포함한....
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프로토콜
모든 동물 절차는 실험 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 미국 공중 보건 서비스 정책을 따랐으며 휴스턴에 있는 텍사스 대학교 맥거번 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 용액의 구성은 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 타목시펜 주사
- 타목시펜 30mg과 에탄올 30μL를 혼합합니다. 끓는 물에 해바라기씨 기름 1mL와 타목시펜/에탄올 혼합물을 가열합니다.
- 타목시펜이 에탄올에 녹은 후 가열된 해바라기씨 오일 1mL를 타목시펜 용액에 빠르게 첨가합니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다.
- 2개월에서 6개월 사이의 다양한 연령의 성별 마우스를 사용했습니다. 인슐린 주사기를 사용하여 100μg/g 체중의 용량으로 타목시펜 용액을 복강 주사합니다. 마우스 계통을 기준으로 타목시펜 주사 횟수를 결정합니다. 이 프로토콜에서 타목시펜은 연속 4일 동안 1일 1회 투여되었습니다.
참고: 타목시펜 용액은 밀도가 높은 오일과 혼합되어 있기 때문에 바늘이 분리 가능한 주사기로는 다루기 어렵습니다. 따라서 타목시펜 주사에는 바늘이 부착된 인슐린 주사기가 선호됩니다.
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결과
유리체에 NMDA를 적용하면 RGC 사멸이 유도되며, 이는 전통적으로 RGC 마커를 사용한 조직학적 염색 또는 면역형광(IF) 염색을 사용하여 검출되었습니다. 우리의 실험 설정에서 범-RGC 마커 RBPMS와 함께 기존의 IF 전략을 사용하여 NMDA 주사 1주일 후에 RGC의 수가 약 65% 감소했음을 확인했습니다(그림 2E-G). 이전 연구에서는 Tbr2 발현 RGC가 실제로 ipRGC임을 발견했습니다34,35. Tbr2CreER2에서 AP 염색 사용; RosaiAP 망막에서 우리는 소수의 Tbr2 발현 RGC만이 생존한 반면 대부분의 Tbr2 발현 RGC 및 AC는 주사 후 1주일 후에 사라진 것을 관찰했습니다(그림 2A,B
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토론
이 연구에서 우리는 다양한 RGC 및 AC 아형에서 NMDA 유발 퇴행성 사건을 조사하기 위해 유전적으로 조작된 여러 마우스 계통과 함께 유전적으로 지시된 희소 AP 표지 시스템을 활용하고 몇 가지 특징적인 표현형을 발견했습니다 29,31,39. 가장 눈에 띄는 표현형은 NMDA 주입 망막에서 RGC 및 AC의 상당한 감소이며(그림 2A-D), 세포 유형 특이적 리포터 라인 또는 범-RGC 마커를 사용한 IF 염색을 사용한 이전 연구의 관찰과 일치합니다(그림 2E-F). 우리는 이전에 Tbr2 발현 RGC가 본질적으로 ipRGC
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공개 사항
저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원-국립 안과 연구소에서 CAM(EY024376)에 대한 보조금과 부분적으로 국립 안과 연구소 시력 핵심 보조금 P30EY028102(UTHealth)의 지원을 받았습니다. 또한 Stephen Lasher Endowment(UTHealth)와 Raye White Endowment(UTHealth)의 재정 지원에도 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 에리스로마이신 안과용 연고 | 바우쉬+롬 | 24208-910-55 | |
| 0.5% 프로파라카인 염산염 | 바우쉬+롬 | 24208-730-06 | |
| 10% 중성 완충 포르말린 | VWR | 89370-094 | |
| 10cm 페리디 | 코 닝 | 430167 | |
| PBS 10배 | 피셔 사이언티픽 | BP399 시리즈 | 물에 희석하여 1x PBS 및 오토클레이브를 만듭니다. |
| 2.0ml 튜브 | VWR | 525-1136 | |
| 30 게이지 주입 바늘 | 엑셀린트 인터내셔널 | 26437 | |
| 30mm 페리디 | 송골매 | 35208 | |
| 벤질 알코홀 | 아크로스 오가닉스 | 447000010 | |
| 벤질 벤즈에이트 | 아크로스 오가닉스 | 105860010 | |
| 질산셀룰로오스 멤브레인 필터 | 사이티바 | 7188-002 | |
| 커버 슬립 | 전자현미경 과학 | 72204-01 | |
| 양면 테이프 | 스카치 | 597020 | |
| 에탄올 | 데콘 연구소 | 2716 | AP 염색 후 탈수질을 위해 Fisher Bioreagents(Cat#: BP2818)를 피하십시오. 이 시약은 망막을 왜곡합니다. |
| 집게 | 테드 펠라 | 505 | |
| 가열 패드 | 테라템 | 710298-001 | |
| 인슐린 주사기 | BD | 329424 | |
| 케타민 | 데크라 | 17033010110 | |
| 현미경 | 자이스 | Axio 이미저 2 | |
| 매니큐어 | 전자현미경 과학 | 72180 | |
| 나노필 인젝터 | 세계 정밀 기기 | 나노필 | |
| 나노필 바늘 | 세계 정밀 기기 | NF25BL | |
| NBT/BICP 시약 키트 | 인비트로젠 | N6547 | |
| NMDA | 시그마-알드리치 | M3262 | |
| 페인트 브러시 | 킹아트 | 6650 | |
| 슬라이드 유리 | 피셔 사이언티픽 | 12-550-15 | |
| 실체 현미경 | 모틱 | DM143 | |
| 해바라기씨 오일 | 시그마-알드리치 | S5007 | |
| 타목시펜 | 시그마-알드리치 | 티5648 | 타목시펜 용액을 4도 및 온도에서 보관하십시오. 차광 상자에 C. 일주일 이내에 타목시펜 용액을 사용하십시오. |
| 반나 가위 | 정밀 과학 도구 | 15000-00 | |
| 수조 | 랩 라인 | 18052 | |
| 자일라진 | 데크라 | 17033-0099-05 | 상품명: 롬푼 |
참고문헌
- Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
- Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino,....
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재인쇄 및 허가
