과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

요약

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

초록

이 프로토콜은 살아있는 세포의 피루브산 대사를 실시간으로 측정하기 위해 과분극 ^13C핵 자기 공명(NMR) 분광법과 자체 구축한 생물 반응기 시스템을 통합하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 안정적인 세포 배양 환경을 유지하면서 과분극 기질 주입 및 NMR 신호 획득의 정확한 타이밍을 허용하는 생물 반응기 시스템의 구축을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 60초 측정 창 내에서 피루브산에서 젖산으로의 대사 변환을 안정적으로 감지하는 동시에 프로세스 전반에 걸쳐 충분한 신호 대 잡음비를 유지합니다. 시스템의 현장 혼합 기능은 NMR 신호 감지를 가속화하고_T1 완화 손실을 줄입니다. 이 프로토콜에는 세포를 캡슐화하고 생물반응기 내에 배치하기 위한 알긴산 겔 준비에 대한 자세한 지침도 포함되어 있습니다. 제안된 방법은 기존 방법에 비해 향상된 재현성과 운동 정확도를 보여 암 대사 연구 및 약물 스크리닝에 잠재적인 응용 분야를 나타냅니다. 대안적인 겔 매트릭스의 채택과 같은 시스템의 추가 개선은 다양한 생물학적 연구에서 다양성을 향상시킬 수 있습니다.

서론

특히 동적 핵 분극(DNP)을 통한 과분극 NMR은 NMR 신호 강도¹를 크게 향상시키고 크게 향상된 감도 ^2,3로 대사 변화를 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 기술은 효모^4,5, 암세포 모델 ^6,7,8 및 미생물 ^9,10을 포함한 다양한 생물학적 시스템에 성공적으로 적용되었습니다. 또한 해당과정 ^11,12, 산화환원 항상성 ^13,14 및 pH 조절^15,16과 같은 주요 대사 경로를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 기본 연구를 넘어 과분극 NMR은 이제 MRI를 통한 임상 영상에 활용되어 세포에서 전신 규모까지 대사 평가를 가능하게 합니다¹⁷. 이러한 발전은 다양한 생물학적 맥락에서 과분극 NMR의 광범위한 사용을 촉진하는 접근 가능한 프로토콜에 대한 수요가 증가하고 있음을 강조합니다.

다재다능함에도 불구하고 과분극 NMR을 사용하여 살아있는 세포에서 실시간 대사 측정을 구현하는 것은 기술적으로 여전히 어렵습니다. 기존 시스템은 재현성이 부족하고 광범위한 전문 지식 없이는 작동하기 어려운 복잡한 실험실별 설정에 의존하는 경우가 많습니다 8,18,19,20. 이는 생물학 또는 중개 연구에 이 기술을 채택하려는 연구자에게 큰 장벽이 됩니다. 광학 이미징 또는 질량 분석법과 같은 대체 방법과 비교하여 hyperpolarized ¹³C NMR은 파괴적인 샘플링 없이 특정 대사 반응의 비침습적 시간 분해 모니터링을 가능하게 합니다. 시간적 정밀도로 직접적인 생화학적 정보를 제공하므로 세포 대사의 동적 연구에 매우 적합합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 이 연구는 연구자들이 최소한의 기술적 장애물로 살아있는 세포 대사의 과분극 NMR 측정을 수행할 수 있도록 특별히 설계된 실용적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 살아있는 세포에서 피루브산 대사의 기본 측정을 위한 포괄적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다른 ¹³개의 C-표지 프로브에 적용할 수 있지만, 피루브산은 빠른 세포 흡수, 잘 특성화된 대사 경로 및 세포 대사에서 중심적인 역할로 인해 특히 적합합니다. 절차는 (i) 세포 샘플 준비, (ii) 알기네이트 겔의 캡슐화, (iii) DNP 편광자를 사용한 과분극 및 (iv) 400MHz 분광계에서 실시간 ^13CNMR 측정으로 구성됩니다(그림 1). 또한 표준 NMR 하드웨어와의 재현성 및 호환성을 보장하기 위해 생물 반응기 시스템을 구성하기 위한 주요 매개변수가 제공됩니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 사용하여 쉽게 구현할 수 있도록 최적화되어 있으며 연구자, 특히 이 기술을 처음 접하는 연구자가 실험 요구 사항에 대한 적합성을 결정하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 생물반응기 설정(그림 2A-B)

1. NMR 튜브 조립
   1. 튜빙 삽입을 위해 상단 캡이 열린 나사 캡 NMR 튜브(직경 10mm, 길이 178mm)를 사용합니다.
   2. 실리콘/PTFE 바이알 격막(직경 9mm)을 준비하고 단단히 밀봉하기 위해 PEEK 튜브를 삽입합니다(보충 그림 1).
   3. 내화학성 PEEK 튜빙(내경 1.0mm, 외경 1.6mm, 벽 두께 0.3mm, 길이 1m)이 있는 격막을 수정된 캡의 개구부에 삽입합니다.
   4. NMR 튜브와 개방형 상단 캡 사이에 격막을 놓고 캡을 단단히 닫아 고정합니다. 이 설정은 격막을 제자리에 고정하고 관류 또는 주입 중 누출을 방지할 수 있는 충분한 밀봉을 제공합니다.
2. 매체 전달 튜빙 설정(그림 2C)
   1. PEEK 튜브를 NMR 튜브의 입구 및 출구 포트에 연결하여 지속적인 관류를 가능하게 합니다. 누출을 방지하기 위해 플랜지가 없는 피팅 세트를 사용하여 연결을 고정합니다.
3. 매체 온난화 구성 요소 설치
   1. PEEK 튜빙을 약 0.2mL/분의 안정적인 유속으로 조정할 수 있는 연동 펌프에 연결하여 외부 순환 키트를 통해 지속적인 매체 순환을 보장합니다. 온도를 유지하기 위해 37°C로 설정된 수조에 매체 저장소를 놓습니다.
4. 젤 누출 방지 성분 추가
   1. NMR 튜브 직경에 맞게 밀도가 높은 스폰지를 자릅니다. 스펀지를 튜브 바닥에 삽입하여 알긴산 젤 누출을 방지하고 매체 흐름을 허용합니다.
5. 3D 프린팅 스폰지 고정 부품의 제작 및 삽입(그림 2D-F)
   1. 광조형 3D 프린팅과 호환되는 포토폴리머 수지를 사용하여 원통형 홀더(외경 9.1mm, 길이 20mm, 중앙 구멍 직경 1.5mm)를 3D 프린팅합니다. 설계 사양은 첨부된 보충 파일 1에 제공됩니다.
   2. 3D 프린팅 홀더의 미리 형성된 구멍을 통해 붕규산 유리 모세관(외경 1.5mm, 내경 약 0.9mm, 길이 90mm)을 삽입합니다.
   3. 방수 특성이 있는 UV 경화 수지를 사용하여 홀더의 플랫폼에 스펀지를 부착합니다. 응고를 보장하기 위해 자외선 아래에서 30초 동안 경화합니다.
   4. 스폰지가 있는 조립된 홀더를 NMR 튜브에 삽입합니다.

2. 세포 준비(측정 2주 전에 시작)

1. 얼어붙은 세포 스톡(SCCVII 또는 HeLa)을 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다. 약 1 × 10⁶ 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청과 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 10mL RPMI-1640 배지로 전달합니다.
2. 37°C에서 5% CO₂로 세포를 배양하고 70%-80% 농도에 도달하면 2-3일마다 배양합니다. 약 2주 동안 배양을 계속하여 ~4 x 10⁷ 세포를 얻을 수 있으며, 5개의 10cm 접시에서 약 90% 포화도로 성장한 것으로 추정됩니다(각각 ~8 x 10⁶ 세포 생성).

3. 알긴산 젤 준비

1. 알긴산 용액의 제조
   1. 생물학 연구용 알긴산 나트륨 분말을 탈이온수에 용해시켜 2%(w/v) 용액을 준비합니다. 용액을 25 °C 이상에서 밤새 부드러운 종단 간 교반으로 배양합니다. 약 10-20rpm으로 설정된 튜브 로테이터를 사용하여 기포를 방지하고 균일한 용해를 보장합니다.
2. 알긴산 겔(alginate gel)에 세포를 캡슐화(Encapsulation of cells)
   1. 10cm 접시에 0.25%(v/v) 트립신-EDTA 2mL를 추가합니다. 접시를 기울여 전체 표면을 덮고 과도한 트립신-EDTA를 흡인합니다.
   2. 접시를 37 ° C에서 2 분 동안 배양합니다.
   3. 접시에 배양 배지 10mL를 추가합니다. 세포를 분리하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 전체 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 모읍니다.
   4. 약 10μL의 현탁액을 취하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 일반적으로 후속 절차에는 약 1 × 10⁷ 개의 셀이 필요하지만 실제 수는 측정을 통해 확인해야합니다.
   5. 나머지 세포 현탁액을 120 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 4mL의 2%(w/v) 알긴산 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 거품 생성을 최소화하기 위해 천천히 피펫을 삐걱 거리십시오.
3. 칼슘 가교에 의한 겔 형성(그림 3)
   1. 50mL 원심분리 튜브에 50mM CaCl₂ 용액 10mL를 추가합니다(그림 3A).
   2. 300μL의 세포-알긴산 혼합물을 30G, 10mm 바늘이 장착된 0.5mL 주사기에 넣고 원심분리 튜브의 캡에 고정합니다(그림 3B).
   3. 주사기를 고정한 원심분리기 튜브의 캡을 단단히 닫고 전체 어셈블리를 200×g에서 5분 동안 부드럽게 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포 로딩 겔을 배지에 재현탁합니다(그림 3C-D).
4. NMR 튜브에 겔 로딩
   1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포로 캡슐화된 겔을 NMR 튜브로 옮깁니다. 스폰지 고정 장치를 삽입하고 단단히 밀봉하십시오.
   2. 1.3.2 단계에서 준비한 매체 저장 탱크 (5 % (v / v)_D2O 포함)를 수조에서 37 ° C로 예열하고 약 500 μL / h의 속도로 순환시켜 조건을 안정화합니다.
   3. NMR 튜브를 자석에 삽입하기 전에 누출이 없는지 확인하십시오. PEEK 튜브를 똑바로 유지하면서 NMR 튜브를 자석에 삽입합니다. 겔 크기, 비드 수, 피펫팅 속도를 세포 유형 및 실험 요건에 따라 조정하십시오.

4. DNP 편광자를 사용한 과분극 프로브 준비(그림 4)

1. 샘플 바이알의 준비
   1. 25mM OX063이 도핑된 18μL의 [^1-13C] 피루브산(14.2 M)을 샘플 바이알에 추가합니다. 바이알을 DNP 편광판 시스템의 유체 경로에 연결합니다.
2. 샘플의 편광
   1. 바이알을 DNP 편광판의 보어 유닛(6.7 T, 1.25 K, 1.2 mbar)에 삽입합니다. 약 188GHz(22mW)에서 60-80분 동안 마이크로파 조사를 적용합니다.
3. 편광 중 신호 모니터링
   1. DNP 시스템에 내장된 고체 상태의 NMR 분광계를 사용하여 ^13C신호 강도를 모니터링합니다. NMR 소프트웨어(SPINit)를 사용하여 5분마다 신호 데이터를 기록합니다.
4. Hyperpolarized 용액을 용해하고 준비합니다.
   1. 편광된 시료를 3.2mL의 예열된 용해 완충액(40mM Tris, 50mM NaCl, 80mM NaOH, 100mg/L EDTA)에 빠르게 용해시킵니다. NMR 측정을 위해 전송하기 전에 용액이 생물학적 온도(308-313 K, pH ~7)에 도달했는지 확인하십시오.
      알림: 압력이 높은 부품을 다룰 때는 주의하십시오. 용출 버퍼를 ~461K로 예열하여 효율적인 전달과 시료 무결성을 보장합니다.

5. NMR 설정

1. NMR 분광계의 준비
   1. 샘플을 NMR 튜브에 넣고 분광계에 삽입합니다.
   2. 샘플이 삽입된 자동 절차를 사용하여 NMR 콘솔에서 잠금, 튜닝, 매칭 및 시밍을 수행하여 스펙트럼 분해능과 신호 안정성을 최적화합니다.
2. 획득 매개 변수 설정
   1. 프로톤 디커플링이 활성화된 ^{상태에서 13C}펄스 획득 시퀀스(예: zg2d)를 로드합니다(예: 13-CPD).
   2. 90μs 펄스(P1)를 사용하여 플립 각도를 1°로 설정합니다. 획득 시간을 1.376초로, 스펙트럼 폭을 23,663Hz로, 획득 지점(TD) 수를 65,536으로 설정합니다. 이완 지연(D1)을 0초로 설정합니다.
   3. 시간 증분(TD1) 수를 150으로 설정하여 의사 2D 모드에서 150개의 순차 스펙트럼을 획득합니다. 수신기 게인을 낮은 값(예: ~1)으로 조정하여 과분극 샘플의 신호 포화를 방지합니다.
      알림: 과분극 NMR의 신호 강도가 높기 때문에 수신기 이득을 일반적으로 사용 가능한 최대 이득의 1% 미만에 해당하는 낮은 값(예: ~1)으로 설정하십시오. 수신기 이득은 신호 증폭을 제어하는 내부의 단위 없는 매개변수입니다. 값이 너무 높으면 신호 포화가 발생할 수 있습니다.

6. NMR 측정

1. 측정 준비
   1. 공기 갇힘을 방지하기 위해 입구 튜브에서 NMR 튜브까지의 전체 입구 튜브 경로를 용해 버퍼로 채웁니다(그림 2B). 주입구 튜브는 매체 관류 및 과분극 프로브 주입 모두에 사용됩니다.
   2. 이 영역의 기포는 NMR 측정 중 신호 획득을 방해할 수 있으므로 이 영역의 기포가 입구 튜브 또는 NMR 튜브 내부에 존재하지 않는지 주의 깊게 확인하십시오.
2. hyperpolarized solution의 주입을 위한 준비
   1. 주입 튜브를 통해 과분극 용액을 주입하기 전에 연동 펌프를 중지하여 매체 순환을 일시적으로 중단합니다.
   2. 주입 후 NMR 검출 부위에 도착하는 즉시 신호가 캡처되도록 하기 위해 과분극 기판을 용해하기 약 10초 전에 스펙트럼 수집을 시작합니다.
   3. DNP 편광판에서 용액이 나올 때 주사기로 용액 1mL를 추출합니다.
3. hyperpolarized solution의 주입 및 신호 확인
   1. 생물반응기 입구의 3방향 밸브를 위치 B로 전환하여 과분극 용액을 NMR 튜브에 주입합니다.
   2. 주입 후 밸브를 다시 A 위치로 전환하여 매체 순환을 재개하고 역류를 방지합니다.
   3. 수집 소프트웨어에서 FID(Free Induction Decay) 신호의 증가를 관찰하여 성공적인 주입 및 기판 도착을 확인합니다.

7. 데이터 처리 및 분석

1. 스펙트럼 데이터 처리
   1. 시간 분해 NMR 스펙트럼을 데이터 처리 소프트웨어에 로드합니다. 데이터가 SER 파일 형식으로 저장된 경우 해당 파일을 찾아 로드합니다.
2. 스펙트럼 분석
   1. 푸리에 변환(FT)을 수행하여 원시 FID를 주파수 영역으로 변환합니다. 위상 보정을 수동 또는 자동으로 적용합니다. 왜곡을 제거하기 위해 기준선 보정을 수행합니다.
3. 대사 산물 변환의 시각화
   1. 피루브산 C1(~171ppm)과 젖산 C1(~183ppm)에 대한 시간 경과 신호를 플로팅합니다.
4. 대사 전환의 정량화
   1. 피루브산 및 젖산 피크에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.
   2. 젖산의 AUC를 피루브산의 AUC로 나누어 [젖산]/[피루브산] 비율을 결정합니다.
      참고: 큰 과분극[1-¹³C] 피루브산 신호로 인한 울림 아티팩트의 영향을 최소화하기 위해 피크 높이 대신 AUC가 사용됩니다. AUC 값은 각 피크에 대해 정의된 적분 범위 내에서 신호 강도를 단순하게 합산하여 얻습니다.

결과

본 연구에서는 살아있는 세포의 피루브산 대사를 실시간으로 측정하기 위해 제작된 시스템을 과분극 ^13CNMR 분광법과 결합했습니다. 1D ^13CNMR 스펙트럼에서 검출된 주요 신호는 피루브산(약 171ppm) 및 젖산(약 183ppm)²¹에 해당하여 생리학적 조건에서 피루브산의 젖산으로의 대사 전환을 평가할 수 있었습니다(그림 4).

스펙트럼 품질 및 신호 역학
과분극 MRI 연구에 자주 사용되는 마우스 편평 세포 암종기인 SCCVII 세포를 사용하여 동일한 샘플에서 반복 측정한 대표적인 결과가 그림 5에 나와 있습니다. 첫 번째 측정에서는 젖산 신호가 뚜렷하게 증가하여 활발한 대사 전환을 나타냈습니다. 그러나 1.5시간 간격으로 실시한 후속 측정에서는 대사 활동이 점진적으로 감소하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시간 의존적 감소는 초기 피루브산 주입으로 인한 생물학적 스트레스 또는 적응을 반영하는 것으로 보입니다. 특히, 과분극 MRI 및 EPRI를 사용한 생체 내에서 유사한 일시적인 대사 조절이 보고되었는데, 여기서 피루브산 투여 후 종양 산소화가 일시적으로 감소했다²². 이러한 결과는 이러한 측정의 반복성이 동적 대사 변화를 비파괴적으로 추적할 수 있음을 보여주며, 이는 파괴적인 방법으로는 달성하기 어려운 이점입니다²³.

이 프로토콜이 다른 세포 유형에 적용할 수 있는지 평가하기 위해 널리 사용되는 인간 암 세포주인 HeLa 세포를 사용하여 추가 측정을 수행했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 HeLa 세포는 또한 명확한 피루브산에서 젖산으로의 변환을 보여주었습니다. T1 이완으로 인해 신호 강도가 점차 감소했지만, 신호 대 잡음비는 60초 획득 기간 동안 충분하게 유지되었습니다. 이러한 결과는 현재 프로토콜이 광범위하게 적용할 수 있으며 다양한 세포 유형에서 실시간 대사 프로파일링을 위한 다목적 도구 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

빠른 신호 감쇠는 DNP 기반 NMR의 고유한 한계이지만, 당사의 현장 혼합 시스템은 용해와 측정 사이의 지연을 최소화하여 검출 감도를 향상시킵니다. 겔 매트릭스 조성 최적화와 같은 추가 개선은 이 방법의 적용 가능성을 더 넓은 범위의 생물학적 시스템으로 확장할 수 있습니다.

그림 1: 세포 배양에서 과분극 NMR 측정까지의 전체 워크플로우에 대한 개략도. 이 공정은 세포 배양(~2주)으로 시작하여 안정적인 측정을 위해 세포를 캡슐화하기 위한 알긴산 겔 준비(~60분)로 이어집니다. 다음으로, DNP 편광자 시스템(~60분)을 사용하여 과분극을 수행하고, 400MHz NMR 분광계(~5분)를 사용하여 NMR 측정을 수행합니다. 오른쪽 사진은 이 워크플로우에 사용된 해당 기기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 과분극 NMR 측정을 위한 바이오리액터 설정. (A) 생물반응기 설정의 개략도. 배양 배지는 주입구 A를 통해 NMR 튜브로 도입된 후 폐기물로 유도됩니다. 살아있는 세포를 포함하는 알긴산 비드를 NMR 튜브 내부에 배치합니다. 과분극 NMR 측정 중에 과분극 프로브는 과분극 프로브 유입구로 표시된 입구 B를 통해 주입됩니다. (B) 입구 및 출구 튜브에 명확하게 레이블이 지정된 전체 생물 반응기 설정의 사진. (C) 입구 A(중간 관류) 및 입구 B(과분극 프로브 주입)를 보여주는 입구 튜빙 스위치의 클로즈업 보기. (D) CAD 설계 및 (E) NMR 튜브 내부에 배치된 3D 프린팅 스폰지 고정 부품의 대표 사진. 이 구성 요소에는 안내를 위한 구멍, 과분극 기판 용액을 전달하는 유리 모세관, 스펀지를 담을 수 있는 플랫폼이 포함되어 있습니다. 구성 요소 자체가 NMR 튜브의 내벽에 단단히 맞지 않습니다. (F) 대신 스폰지를 삽입하여 틈을 채웁니다. 이 구조는 구성 요소를 안정화하고 폐기물 매체가 스펀지를 통해 위쪽으로 흐르도록 하여 추가 배출 구멍이 필요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 알긴산 겔 제제. (A) 알긴산 겔볼 형성 장치의 개략도 및 (B) 사진. 왼쪽 이미지는 수정된 뚜껑에 주사기가 고정된 원심분리기 튜브를 포함한 전체 설정을 보여줍니다. 오른쪽 상단 이미지는 주사기 팁을 위한 작은 구멍이 있는 뚜껑을 보여주고, 오른쪽 하단 이미지는 안정적인 주사기 위치를 위해 사각형 구멍이 있는 뚜껑을 보여줍니다. 원심분리기 튜브에는 10mL의 염화칼슘 용액이 미리 채워져 있어 주사기 끝에서 나오는 알긴산 용액이 겔화되어 알긴산 겔 볼을 형성할 수 있습니다. (C) 알긴산 겔 볼의 형태를 보여주는 대표적인 현미경 이미지. (D) HeLa 세포를 포함하는 알긴산 겔 볼의 형태를 보여주는 대표적인 현미경 이미지. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: NMR 측정 및 과분극을 위한 준비 단계의 개략도. ~60분 DNP 빌드업 프로세스 동안 NMR 설정은 지연을 최소화하기 위해 병렬로 수행됩니다. 준비에는 NMR 튜브에 알긴산 비드 로딩 후 ^1H잠금 조정, shimming 및 프로브 튜닝이 포함되어 시스템이 즉시 측정할 준비가 되었는지 확인합니다. 용해 및 현장 혼합 후 시간 분해 ¹³C NMR 분광법은 투명한 피루브산 및 젖산 피크를 나타냅니다. 약 171ppm, 179ppm 및 183ppm에서 관찰된 피크는 각각 피루브산, 피루브산 수화물 및 젖산에 해당합니다. 알기네이트 겔에 캡슐화된 약 4 ×^{10 7}개의 HeLa 세포가 NMR 측정에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 반복 측정에서 피루브산 및 젖산 신호의 시간 분해 검출. 동일한 SCCVII 세포-캡슐화된 샘플의 과분극된 ^13CNMR 스펙트럼을 반복적인 비파괴 측정의 타당성을 평가하기 위해 1.5시간 간격으로 획득했습니다. 피루브산(열린 원) 및 젖산(채워진 원, 1000×로 조정됨) 최고 강도는 각 획득에 대해 시간 경과에 따라 표시됩니다. (A) 첫 번째 측정. (B) 1.5시간 후의 두 번째 측정은 젖산 생산의 현저한 감소를 보여줍니다. (C) 1.5시간 후 세 번째 측정에서 낮은 대사 활성이 지속되는 것을 확인했습니다. AUC(Area Under the Curve)를 기반으로 한 정량 분석에서 [젖산]/[피루브산] 비율이 0.00134(1차 측정)에서 0.00019(2차) 및 0.00027(3차)로 감소한 것으로 나타났습니다. 알기네이트 겔의 최종 세포 농도는 약 1.0 ×^{10 7} cells/mL (4 mL 내 4 × 10⁷ cells)였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: HeLa 세포에서 피루브산이 젖산으로 전환됨. 피루브산 및 젖산의 시간 분해 과분극 ^13CNMR 신호를 살아있는 HeLa 세포에서 측정했습니다. 피루브산 신호 강도는 시간 0에서 최대값으로 정규화됩니다. 젖산 신호 강도는 가시성을 위해 10³의 계수로 조정됩니다. AUC(Area Under the Curve)를 기반으로 한 정량 분석에서는 [젖산]/[피루브산] 비율이 0.00121로 나타났습니다. 알긴산 겔의 최종 세포 농도는 약 7.5 ×^{10 6} cells/mL (4 mL 내 3 × 10⁷ cells)였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

보충 그림 1. 생물반응기 시스템에 사용된 바이알 격막의 대표 이미지. (A) 사용하기 전에 실리콘/PTFE 격막(직경 9mm). (B) 구멍이 뚫린 구멍을 통해 삽입된 PEEK 튜브와 함께 실제로 사용되는 것과 동일한 격막. 격막 재료의 탄성으로 인해 튜브 주위를 다시 밀봉할 수 있어 과분극 기질 주입 중에 기밀 상태를 유지할 수 있습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 외부 혼합 후 획득된 시간 분해 과분극 ^13CNMR 스펙트럼. 과분극 피루브산과 NMR 튜브 외부 세포의 외부 혼합 후 벤치탑 NMR 시스템을 사용하여 측정한 [^1-13C] 피루브산 대사의 대표적인 시간 분해 스펙트럼. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 원통형 홀더의 CAD 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜의 중요한 단계
이 프로토콜의 성공 여부는 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 높은 신호 대 잡음비를 유지하기 위해 과분극 ^13C피루브산염의 적절한 용해 및 전달을 보장하는 것이 중요합니다. 피루브산에서 젖산으로의 초기 대사 전환을 포착하려면 과분극 프로브의 주입 타이밍과 NMR 획득을 동기화해야 합니다. 또한 실험 전반에 걸쳐 세포 생존력을 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 매개변수에서 벗어나면 대사 활동이 감소하고 신호가 손실될 수 있습니다.

방법의 수정 및 문제 해결
이 프로토콜은 실시간 대사 모니터링을 위한 강력한 접근 방식을 제공하지만 특정 수정 사항은 적용 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, NMR 획득의 플립 각도를 조정하면 신호 강도와 편광 감소의 균형을 맞춰 데이터 수집을 최적화할 수 있습니다. 또한, 일정 크기의 알기네이트 겔을 안정적으로 제조하기 위한 방법이 도입되었지만, 생성하고자 하는 겔의 크기는 주사기 또는 바늘을 선택함으로써 용이하게 조절할 수 있다. 이는 세포가 NMR 튜브에서 탈출하는 것을 방지하는 것 외에도 저산소 환경²⁴ 을 재현하는 데 기여할 수 있습니다. 또한, 알기네이트 겔은 NMR 튜브 내부, 특히 NMR 측정 영역에서 조밀하고 점성이 있습니다. PEEK 튜브에서 배양 배지 또는 과분극 프로브를 주입할 때 공기가 유입되면 NMR 측정 부위에 남아 있을 가능성이 높으며, 이로 인해 스펙트럼의 품질이 저하됩니다.

방법의 한계
과분극 측정은 NMR 신호의 감도가 높다는 장점이 있지만 고유한 한계가 있습니다. 과분극된 ¹³C 피루브산의 T₁ 이완으로 인해 대사 측정 시간이 약 1분으로 제한되어 장기적인 대사 변화의 관찰이 제한됩니다. 또한, 세포 샘플을 한 번 측정한 후 몇 시간이 지나면 측정하기 어려운데, 이는 한 번의 측정에서 많은 양의 피루브산이 떨어지는 것과 관련이 있을 수 있습니다. 이는 관련 그룹이 하루 후에 스펙트럼을 측정했다는 사실과 동일하며(¹⁸), 측정 간격이 그만큼 길어야 합니다.

기존 기법과 비교한 이 방법의 중요성
기존의 대사 분석법과 비교했을 때, 당사의 방법은 세포 대사에 대한 실시간 통찰력을 제공한다는 점에서 질량 분석 및 생화학적 분석과 같은 종말점 측정에 비해 이점이 있습니다. 생물반응기를 사용하지 않고도 유사한 과분극 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있지만, 이완의 속도를 감안할 때 현장 혼합으로 즉시 측정을 시작할 수 있는 기능이 유리합니다. 또한 주입 전에 안정적인 환경에서 세포를 사전 설정할 수 있어 대사 분석의 재현성과 운동 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 이러한 이점은 보충 실험(보충 그림 2)에 의해 뒷받침되며, 여기서 외부 혼합 후 벤치탑 NMR 시스템을 사용하여 시간 분해 스펙트럼을 획득했습니다. 이 설정에서는 mixing과 signal acquisition 사이에 약 30초의 지연이 발생하여 상당한 편광 손실이 발생했으며, 특히 젖산 검출에 영향을 미쳤습니다. 이는 현장 혼합이 빠른 T₁ 감쇠 조건에서 운동 측정의 충실도를 향상시킨다는 것을 확인합니다. 그러나 이 in situ 설정에서 신호 강도가 더 낮았는데, 이는 최적화가 필요한 문제인 중간 관류로 인한 희석 때문일 수 있습니다.

중요성 및 잠재적 응용 분야
이 방법은 다양한 생명체의 대사 특성을 이해하는 데 응용할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 대사 플럭스의 실시간 측정을 통해 연구자들은 대사 억제제의 효과를 동적으로 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식을 다른 측정 기술과 통합하면 세포 내 대사 분석의 정확도를 더욱 향상시킬 수 있습니다.

우리는 파괴적인 고처리량 대사체학을 사용하여 후보 경로를 식별한 다음 과분극 ^13CNMR을 사용하여 살아있는 세포의 효소 기능 및 플럭스 역학을 평가하는 실시간 검증을 수행하는 실용적인 실험 워크플로우를 구상하고 있습니다. 이 접근 방식을 사용하면 생리학적 조건에서 일시적인 대사 반응을 직접 검출할 수 있으며, 이는 일반적으로 정적 대사 산물 수준을 측정하거나 외인성 프로브가 필요한 면역 분석 또는 형광 센서를 사용하여 달성하기 어려운 것입니다. 형광 이미징 및 면역 분석은 각각 공간 국소화 및 고처리량 스크리닝에 필수적이지만, hyperpolarized NMR은 비파괴 방식으로 반응 역학을 캡처하는 보완적인 기능 판독을 제공합니다. 이 전략은 세포 수준에서 기계론적 통찰력을 촉진할 뿐만 아니라 조직 또는 유기체 규모에서 진단 응용 분야로 향하는 다리 역할을 합니다. 특히, 기능적 대사 변화를 실시간으로 포착할 수 있는 능력은 복잡한 생물학적 시스템에서 대사 장애 및 치료 반응을 조기에 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 다양한 대사 경로와 특정 효소를 위해 설계된 합성 기질을 표적으로 하는 대사 프로브의 개발이 진전을 이루어 대사 연구의 가능성이 확대되었습니다^25,26. 더욱이, 자기 터널⁽²⁷-)을 통해 편광자로부터 NMR로 직접 과분극 기판을 전달하는 것과 같은 과분극 기술의 발전은 신호 유지를 향상시키고 생물 의학 연구에서 이 방법의 잠재적 응용을 확장할 수 있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
[1-13C] 피루브산	케임브리지 Isot ope Laboratories, Inc.	CLM-8077
3D 프린터	엘레구	토성 2
염화칼슘	나칼라이 테스크, Inc.	06729-55
D2O	시그마-알드리치	151882
펌프용 외부 순환 키트	하나로	1-4141-02
태아 소 세럼	깁코	10270106
플랜지리스 피팅 세트	GL 사이언스 주식회사	6010-46390
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PEEK 튜브	하나로	3-780-05
페니실린-스트렙토마이신	나칼라이 테스크, Inc.	26252-94
연동 바이오 미니 펌프	아토	1221200	안정적인 매체 흐름을 위한 고정밀, 넓은 유량 유형
수지	시라야 테크	스모키 블랙
RPMI-1640 미디엄	나칼라이 테스크, Inc.	30264-85
실리콘/PTFE 바이알 격막	GL 사이언스 주식회사	1030-50009
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