방법 논문

원래 종양 특성을 유지하는 환자 유래 신경교종 세포의 분리 및 장기 배양을 위한 최적화된 워크플로우

DOI:

10.3791/68566

⸱

2025년 7월 8일

 , 
1Beijing Institute for Brain Research, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Chinese Institute for Brain Research

이 논문에서

요약

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이 연구는 환자 유래 신경교종 세포주(PDGC)를 확립하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시하여 유전적 및 표현형 충실도를 보장합니다. 기저막 매트릭스 추출물 보조 부착 배양 시스템은 세포 성장과 균질성을 향상시켜 약물 스크리닝 및 교모세포종 연구에 유용한 모델을 만듭니다.

초록

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교모세포종(GBM)은 가장 공격적인 원발성 뇌종양으로, 이질성이 높고 표준 치료법에 대한 내성이 있는 것이 특징입니다. 기존의 신경교종 세포주는 종종 환자 특이적 유전적 및 표현형 특성을 유지하지 못하여 번역 관련성을 제한합니다. 이 문제를 해결하기 위해 무혈청 신경줄기세포 배양 시스템을 사용하여 50개의 환자 유래 신경교종 세포주(PDGC)를 구축했습니다. 이 프로토콜은 교모세포종 환자로부터 얻은 종양 샘플의 수집, 처리 및 장기 배양을 간략하게 설명하여 주요 분자 특징의 보존을 보장합니다. 당사의 방법론에는 효소 조직 해리, 적혈구 용해 및 기저막 기질 추출물 보조 부착 배양이 포함되며, 이는 세포 생존력을 개선하고 고처리량 약물 스크리닝을 용이하게 합니다. 전체 게놈 및 전사체 염기서열분석 및 면역형광 염색을 통한 PDGC의 특성 분석은 일반적인 교모세포종 유전자 변형과 신경 줄기세포 및 전구 마커의 보유를 확인합니다. 또한, 이러한 세포는 이종 이식 모델에서 종양 형성 잠재력을 나타냅니다. 이 프로토콜은 배양 조건을 최적화함으로써 생물학적으로 관련된 교모세포종 모델을 생성하기 위한 표준화된 프레임워크를 제공하여 치료법 발견 및 기계론적 연구를 지원합니다.

서론

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가장 흔한 원발성 두개내 종양인 신경교종(Glioma)은 유전적 돌연변이를 겪은 신경줄기세포나 전구세포에서 유래한다1. 세계보건기구(WHO)는 병리학적 및 분자적 특성에 따라 신경교종을 1-4등급으로 분류하며, 낮은 등급에서높은 등급 2까지 다양합니다. 4등급 신경교종인 교모세포종(GBM)은 모든 신경교종의 약 57%와 원발성 악성 중추신경계 종양의 약 48%를 차지한다3. 다형성 교모세포종 환자는 평균 생존 기간이 2년 미만이고 5년 생존율이 5.4%4에 불과할 정도로 예후가 좋지 않습니다. 표준 치료는 최대한의 안전한 절제술 후 방사선 요법과 테모졸로마이드 화학요법을 시행하는 것이다5. 이러한 중재에도 불구하고 교모세포종은 침투성 특성과 치료제에 대한 선천적 내성으로 인해 치료가 불가능하여 새로운 치료 접근법이 시급히 필요합니다.

연구자들은 일반적으로 암 발생 및 치료 메커니즘을 연구하기 위한 모델로 인간 유래 종양 세포주를 사용합니다. 그러나 혈청 함유 배지에서 유지되고 시험관내에서 광범위하게 계대측정된 고전적인 신경교종 세포주는 환자 종양에 비해 표현형 특성과 유전적 프로파일에 상당한 변화를 보입니다 6,7,8. 결과적으로, 이러한 세포주를 기반으로 하는 전임상 스크리닝 모델은 임상 환경에 효과적으로 적용되는 치료 표적 및 분자를 식별하지 못하는 경우가 많습니다. 교모세포종 치료의 성공은 종양의 이질성과 가소성으로 인해 더욱 복잡해진다9. 이러한 이질성은 전사체 아형(transcriptomic subtype, proneural, mesenchymal)뿐만 아니라 구성 세포(constituent cells)의 다양한 발달 상태에서도 나타납니다10. 교모세포종은 신경 발달 기전을 사용하며 종양 증식을 촉진하고 방사선 요법 및 화학요법에 대한 저항성이 향상된 교모세포종 줄기세포(GSC) 하위 집단을 포함합니다11,12. 환자 유래 신경교종 세포를 무혈청 신경줄기세포 배지에서 배양하면 부분적인 GSC 특성을 유지하면서 원래 종양의 돌연변이 스펙트럼과 유전자 발현 패턴을 효과적으로 보존할 수 있습니다8.

신경구 배양 모델과 비교했을 때, 기저막 매트릭스 추출물 보조 부착 배양은 보다 안정적이고 빠른 세포 성장을 촉진하여 화학적 및 유전자 스크리닝에 더 적합합니다13. 이 접근법을 사용하여 50개의 환자 유래 교모세포종 세포주를 확립하고 전체 게놈 염기서열분석, 전사체 염기서열분석 및 FDA 약물 라이브러리 스크리닝을 통해 이를 특성화하여 잠재적인 치료 전략을 모색했습니다. 이 자료는 신경교종 연구를 진전시키는 데 도움이 되며, 자세한 결과는 이전 연구에서 발표되었다14. 여기에서는 환자 유래 신경교종 세포주(PDGC)를 개발하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 병원 협력을 통해 얻은 환자 유래 신경교종 조직 및 혈액 샘플을 활용합니다. 모든 샘플링 절차 및 실험 프로토콜은 Capital Medical University, Beijing Tiantan Hospital의 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(KY 2020-093-02 및 KY 2014-021-02). 환자는 수술 전에 서명된 동의서를 제공하며, 샘플이 실험실로 이송되기 전에 모든 신원 정보는 익명화됩니다. 연구자는 이 프로토콜을 구현하기 전에 기관 윤리 위원회의 승인을 받고 환자의 동의를 얻어야 합니다.

1. 샘플 처리 전 준비

  1. 가위, 핀셋 및 기타 기구를 고압증기멸균으로 소독합니다.
  2. DMEM/F12 47.5mL, N2 500μL, B27 1mL, 100x 페니실린/스트렙토마이신 500μL, 100x 글루타민 치환체 250μL, 2.5M HEPE 100μL, 30% 포도당 100μL, 50mM β-메르캅토에탄올 50μL, 1μg/mL 표피 성장 인자(EGF) 1.5mL를 결합하여 PDGC 배양 배지를 준비합니다. 및 1.5mL의 1μg/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF).
  3. 물에 염화암모늄 8.29g, 중탄산칼륨 1g, EDTA 37mg을 용해한 후 1L로 희석하여 1x 적혈구 용해 완충액(ACK)을 준비합니다.
  4. 멸균된 기구, PBS 완충액, 폐기물 용기, 원심분리기 튜브 및 기타 소모품을 생물 안전 캐비닛에 넣고 30분 동안 UV 살균을 수행합니다.
  5. 절연 용기에 액체 질소를 넣으십시오.

2. 환자 샘플 수집

참고: 후속 세포 배양의 박테리아 오염을 방지하기 위해 엄격한 멸균 조건에서 모든 조직 채취 절차를 수행합니다. 전체 워크플로우에서 무균 기술을 유지합니다.

  1. 수술 전에 혈액 샘플을 채취하고 환자의 뇌에서 종양 조직을 절제합니다. 종양을 주변의 정상 조직과 구별하기 어려운 크고 침투성이 높은 종양의 경우, 중요한 기능적 뇌 영역을 보존하면서 종양 주위 조직 절제를 극대화합니다. 약 500-2,000 mm3 의 종양 코어 조직을 분리하고 10 mL의 저체온 보존 배지가 들어 있는 15 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
  2. 샘플 튜브를 밀봉하고 아이스 박스에 넣은 다음 처리를 위해 실험실로 신속하게 운반합니다.
    참고: 샘플 수집과 처리 사이의 간격이 4°C에서 6시간을 초과하지 않는지 확인하십시오. 검체를 채취하는 동안 탄 조직과 종양 괴사 부위를 조심스럽게 제외합니다. 절개 부위의 표면은 수술 중에 사용되는 전기 칼에 의해 그을리는 경우가 많으며, 이는 배양 시 세포 생존력을 손상시킬 수 있습니다.

3. 혈액 샘플 처리

  1. 1,000 × g 에서 10분 동안 혈액 샘플 튜브를 원심분리하고 상부 혈장층을 버립니다.
  2. 남은 백혈구와 적혈구층을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1x ACK 10mL를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해시킵니다.
  3. PBS 40mL를 첨가하여 용해를 종료하고 부드럽게 혼합한 다음 1,000×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다.
  4. 상등액을 버리고 1x ACK 3mL를 첨가한 후 실온에서 5분 동안 배양하여 두 번째 적혈구 용해 단계를 진행합니다.
  5. PBS 12mL를 첨가하여 용해를 종료하고 부드럽게 혼합한 다음 1,000×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다.
  6. 상등액을 버리고 말초혈액 단핵세포(PBMC) 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁시킨 후 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 510×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다.
  7. 상등액을 버리고 PBMC 펠릿을 액체 질소에 동결시킨 후 -80°C에서 보관합니다.

4. 종양 조직 처리

  1. 샘플 튜브에서 조직 보존 용액을 제거하고 PBS에서 조직을 세척하여 눈에 보이는 혈전과 괴사 조직을 제거합니다. 나머지 조직에 대해 두 번째 PBS 세척을 수행합니다.
  2. 가장 손상되지 않은 조직 부분을 잘라내고 4°C에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 밤새 고정합니다.
    참고: 고정 조직의 크기는 약 10mm입니다. 샘플이 작은 경우 이 단계를 건너뜁니다.
  3. 2-4개의 작은 조직 조각을 잘라 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 액체 질소에 얼린 다음 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 작은 조직 조각의 크기는 일반적으로 염기서열분석에 필요한 DNA와 RNA의 양에 따라 5mm에서 10mm 사이입니다.
  4. 남은 종양 조직을 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 얼음 위에 올려 가위를 사용하여 고운 반죽으로 다집니다.
  5. 1-3mL의 세포 박리 용액을 넣고 다진 조직을 소화관으로 옮깁니다. 조직 해리기를 사용하여 37°C에서 16분 동안 조직을 소화합니다.
  6. PBS 부피의 3배를 첨가하여 분해를 중지하고 세포 현탁액을 70μm 세포 스트레이너가 있는 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 수집을 최대화하기 위해 작은 막대로 체를 통해 조직을 부드럽게 갈아줍니다. 510 ×g에서 10 분 동안 원 심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
  7. 1-3 mL의 1x ACK를 첨가하고 적혈구를 용해시키기 위해 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. PBS의 4배 부피를 첨가하여 용해를 중단하고 부드럽게 혼합한 후 510 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거합니다.
  8. PDGC 배지에서 세포를 재현탁하고 배양 플레이트에서 세포 현탁액의 일부를 시드합니다. 플레이트를 37°C 저산소 인큐베이터에 넣습니다. 10% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 나머지 세포를 동결합니다.
    참고: 일반적으로 약 10-20mm를 측정하는 조직 샘플의 경우 세포 현탁액의 약 1/3에서 1/10을 3mL의 배양 배지가 있는 6cm 접시에 시딩하고 나머지 세포는 세포 수율에 따라 2-4개의 바이알에 동결 보존합니다.
  9. 얼음처럼 차가운 PBS에 기저막 매트릭스 추출물을 1:100 비율로 첨가하여 플레이트를 코팅하고 실온에서 진탕 인큐베이터에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. PDGC 배양 배지를 첨가하기 전에 PBS를 폐기하십시오.
    참고: 모든 후속 세포 계대 및 배양은 기저 멤브레인 매트릭스 추출물 코팅 플레이트를 사용하여 수행합니다.
  10. 2일 후, 배양된 세포를 기저막 매트릭스 추출물 코팅된 플레이트로 옮겨 세포 접착 및 성장을 가능하게 합니다.

5. 세포 배양 및 계대

  1. 세포가 배양 플레이트에 부착되면 부착되지 않은 세포를 제거하고 2-3일마다 배양 배지를 교체하거나 보충합니다.
    참고: 접착 능력은 세포마다 다릅니다. 기저막 매트릭스 추출물이 존재하더라도 BNI7-11과 같은 세포의 작은 부분이 부착되지 않은 상태로 남아 있을 수 있으며, 이는 지속적인 현탁 배양이 필요합니다. 또한 일부 세포는 BNI20과 같은 반부착 성장 패턴을 나타냅니다. 따라서 세포 상태를 주의 깊게 관찰하는 것이 필수적입니다. 비부착성 세포의 경우, 부유 세포의 증가를 확인할 수 있습니다. 세포 응집체가 어둡고 면화와 같은 구조로 나타나고 시간이 지나도 큰 변화를 보이지 않으면 일반적으로 장기적으로 팽창할 수 없습니다.
  2. 세포가 합류점에 도달하면 세포 해리 용액을 추가하여 세포를 분리합니다. 3x PBS와 250 × g 에서 3분 동안 원심분리기로 해리를 종료합니다. 1:2에서 1:4 비율로 세포를 계대탐색합니다. 10% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 나머지 세포를 동결합니다.
  3. 안정적인 세포주를 구축하기 위해 최소 10-20세대 동안 계대법을 계속합니다.
    1. 각 통로 동안 이미지로 세포 형태를 문서화하고 통로 번호를 기록합니다. 초기 세포 동결에 자세한 정보(예: 통로 번호)를 명확하게 표시합니다.
    2. 세포주가 안정화되면 2-3개의 세포 펠릿 튜브(300,000-1,000,000 세포/튜브)를 수집하고 -80 °C에서 보관합니다.

6. 후속 실험 작업

  1. PFA 고정 샘플의 경우, 하룻밤 고정 후 60% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올을 각각 40분 동안 두 번 차례로 침지하여 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액을 통해 샘플을 탈수합니다. 그 후, 각각 40분 동안 크실렌을 두 번 변화시켜 샘플을 세척한 다음 각각 40분 동안 두 번의 파라핀 용액을 침투시킵니다. 마지막으로, 탈수 및 침투된 샘플을 파라핀 블록에 삽입하여 후속 절편 및 염색15.
  2. -80°C에서 보관된 PBMC 펠릿, 종양 조직 또는 종양 세포 샘플의 경우 필요에 따라 전체 게놈 염기서열분석, 엑솜 염기서열분석, 벌크 RNA 염기서열분석 및 단일 세포 RNA 염기서열분석을 포함한 다양한 오믹스 연구를 위해 DNA 및 RNA를 추출합니다.
  3. 마우스 이종이식 모델 구축, 고처리량 약물 스크리닝, 메커니즘 연구 및 기타 관련 실험에 안정적인 PDGC 세포주를 사용합니다.
    1. PDGC의 두개내 정소성 이종이식 모델을 확립하려면 세포를 해리하고 계수한 다음 기저막 매트릭스 추출물과 얼음처럼 차가운 PBS를 1:1 혼합물로 재현탁시켜 최종 농도 100,000 cells/μL까지 재현탁합니다. 마이크로 주사기와 표준 입체 기구를 사용하여 6-8주 된 면역결핍 마우스의 왼쪽 선조체에 5μL의 세포 현탁액을 정위 정위 주입합니다. 브레그마를 기준으로 주입 좌표를 +0.5mm 전방-후방(AP), -1.9mm 내측-외측(ML) 및 -3.6mm 배측-복부(DV)로 설정합니다.
    2. 루시퍼라아제 발현 PDGC를 생성하고 종양 성장의 생물 발광 이미징을 위한 두개내 이종이식편을 확립합니다.
      1. luciferase-tdTomato 리포터 유전자를 렌티바이러스 입자로 패키징한 다음 PDGC를 패키징된 렌티바이러스로 감염시켜 안정적인 발현을 확립합니다16.
      2. 감염 후 유세포 분석법으로 tdTomato 양성 세포를 분류하여 루시페라제를 발현하는 안정적인 세포 집단을 얻습니다.
      3. 이미징 전에 15mg/mL D-루시페린 용액을 사용하여 체중 10μL/g의 용량으로 D-루시페린을 복강내 주입합니다. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 D-루시페린 주사 후 10분 동안 기다립니다. 마우스를 생물 발광 이미징 시스템에 넣습니다. 이미징 중 노출 시간을 자동 모드로 설정17.

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결과

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그림 1은 프로토콜의 포괄적인 워크플로우 개요를 제공합니다. 환자 샘플에는 말초 혈액 및 종양 코어 조직이 포함됩니다. 혈액 샘플은 혈장을 제거하기 위해 원심분리를 거친 후 두 번의 ACK 용해 라운드를 거쳐 염기서열분석 분석을 위한 대조군 역할을 하는 PBMC를 얻습니다. 종양 샘플은 작은 조각으로 처리되기 전에 혈전과 괴사 부위를 제거하기 위해 PBS 세척됩니다. 여러 조직 조각은 향후 DNA/RNA 추출 및 염기서열분석을 위해 동결 보존되며, 손상되지 않은 조각은 조직학적 분석을 위해 PFA로 고정되고 파라핀이 포함됩니다. 나머지 종양 조직은 균질해질 때까지 얼음 위에서 철저히 다진 다음 효소 및 기계적으로 해리되어 단세포 현탁액으로 만들어집니다. 적혈구를 제거하기 위한 ACK 처리 후, EGF 및 bFGF와 함께 무혈청 PDGC 배지에서 세포를 배양합니다. 서로 다른 PDGC는 전사체 아형과 독립적으로 뚜렷한 형태를 보여줍니다(그림...

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토론

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교모세포종의 이질성은 심각한 치료 문제를 야기합니다. 기존 GBM 세포주는 종종 균질한 유전적 배경을 발달시키고 혈청 함유 배지에서 확장된 배양 후 환자의 종양 특성을 잃게 되어 번역 가치가 제한됩니다. 교모세포종 배양 조건을 최적화하고 환자 검체 처리 워크플로우를 표준화하는 것은 연구에서 제한된 임상 자원을 극대화하는 데 필수적입니다. 포괄적인 교모세포종 세포 모델 시스템은 교모세포종 이질성에 대한 이해를 높이고 치료 전략을 개선할 것입니다.

이 프로토콜은 교모세포종 환자 샘플의 처리 워크플로우와 PDGC 배양 방법론에 대해 자세히 설명합니다. 종양 시료 품질은 성공적인 일차 세포 배양에 결정적인 영향을 미칩니다. 수술 샘플링 및 실험실 취급 중 엄격한 무균 기술이 필수적이며, 세포 생존력을 유지하기 위한 신속한 수술 후 처리도 필수적입니다. 예비 연구에서는 86개의 GBM 샘플에서 28개의 PDGC 라인을 확립했습니...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(#2022YFA1103900에서 J.C.까지), Changping Laboratory 및 CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(CIFMS)의 자금 지원을 받았습니다(#2024-I2M-3-022 to J.C.). J.C.에 대한 추가 자금은 중국 뇌 연구소(Chinese Institute for Brain Research)에서 제공합니다. 그림 1 은 https://BioRender.com 년에 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
70 & 무; m 세포 스트레이너Falcon352350
Accutase 세포 박리 용액BioLegend423201
염화암모늄알라딘60-92-4
항-Sox2 항체MerckmilliporeAB5603
BeyotimeP0131NOVUS가 포함된 퇴색 방지 마운팅 매체
NB100-1604
비타민 서플레메트 Gibco 12587010
Baria Fusion Flow CytometerBD Biosciences/
세포 배양 접시NEST705001
D-Luciferin, 칼륨 염InvitrogenL2916
DMEM/F12GibcoC11330500BT
DMSOSinopharm30072418
EDTABBI 생명 과학A600107-0500
포도당Sangon BiotechA50991-0500
GlutaMAXGibco35050-061글루타민 대체물
헤마목실린-에오신 염색 키트SolarbioG1120
HEPESBeyotimeST090
인간 bFGFOrigeneTP750002
인간 EGF노보단백질C029-500μ g
온온 보존 배101104HypoThermosol FRSBiolife Solutions
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
IVIS Lumina XR III PerkinElmer/생물 발광 이미징 시스템
MatrigelCorning356231기저막 매트릭스 추출물
마이크로시린지Hamilton80300
N2 보충제Gibco17502048
Nunclon Sphera 6웰 플레이트Thermo Scientific174932초저부착 플레이트
파라포름알데히드Sangon BiotechA500684-0500
PBS 완충액SolarbioP1010-100*2L
페니실린/스트렙토마이신SolarbioP8420/S8290
탄산칼륨Sangon BiotechA501195-0500
RWD 조직 해리제RWD 생명 과학DSC-410
표준 정위 기기RWD 생명 과학68801
조직 샘플 처리 튜브RWD 생명 과학SCT-100
&베타;-메르캅토에탄올시그마M3148-100mL
DAPI 항-네스틴 항체BD FACS가 없는 B27저지 중

참고문헌

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