방법 논문

가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법에 의한 생물학적 샘플에서 비타민 A의 13C농축 분석

491 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

이 논문은 추적자 적용을 위한 레티놀 및 레티닐 에스테르의 13C-농축에 대한 혈청, 모유 및 간 샘플의 분석에 대해 설명합니다. 고성능 액체 크로마토그래피는 레티놀 농도를 정제 및 정량화하는 데 사용되며, 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GC-C-IRMS)은 정제된 추출물을 분석하는 데 사용됩니다.

초록

비타민 A는 건강에 매우 중요하지만 비타민 A 상태를 평가하는 것은 어렵습니다. 혈액 속을 순환하는 비타민 A는 항상성적으로 조절되며 종종 비타민 A 결핍 또는 과잉을 반영하지 않습니다. 13C-비타민 A를 사용하면 전신 비타민 A 저장량과 약동학 및 대사에 대한 추가 정보를 추적 및 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GC-C-IRMS)을 사용하여 혈청, 모유 및 조직 샘플에서 비타민 A의 13C-동위원소 농축의 추출, 정제 및 측정을 설명합니다. GC-C-IRMS를 사용한 분석은 특히 자연 풍부도 수준에 가까운 13C 농축이 있는 샘플에 대해 민감하고 정밀한 농축 값을 제공합니다. 이를 통해 더 작은 추적자 용량과 장기 약동학 샘플링을 사용할 수 있는 연구 설계의 유연성이 가능합니다. 간단히 말해서, 0.4 내지 1 mL의 혈청에 에탄올을 첨가하여 단백질을 침전시키고, C-23 β-아포-카로테놀을 내부 표준으로 첨가하고, 헥산을 사용하여 레티노이드를 추출한다. 추출물은 이후 메탄올에 재현탁되고 HPLC를 사용하여 정제됩니다. 그런 다음 레티놀 분획을 헥산에 재현탁하고 GC-C-IRMS 시스템에 주입합니다. 원자 %(At%)는 원소 분석기를 사용하여 자당 표준에 대해 보정된 이산화탄소를 기준으로 직접 계산됩니다. GC-C-IRMS로 분석된 다른 조직 유형에는 비누화 후 모유와 간이 포함됩니다. 고체상 추출 기술은 이러한 매트릭스 또는 기타 복잡한 매트릭스의 정제를 지원하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 원소 분석기를 IRMS에 부착하여 총 13C함량에 대한 식품 샘플을 분석할 수 있습니다.

서론

비타민 A(VA)는 시력, 면역 기능, 세포 분화 및 대사 조절에 필요한 필수 미량 영양소입니다. VA 상태를 최적화하는 것은 결핍 또는 과잉이 건강 결과를 손상시킬 수 있기 때문에 여전히 글로벌 건강 과제로 남아 있습니다. VA 상태의 정확한 평가는 적절한 개입을 안내하는 임상 또는 인구 연구에 매우 중요합니다. 그러나 혈청 레티놀 농도만으로는 광범위한 전신 저장량(TBS)에 걸쳐 항상성 조절을 받고 염증 및 기타 영양 결핍의 영향을 받기 때문에 열악한 바이오마커 및 진단 도구입니다 1,2.

동위원소 표지 추적자는 레티놀 동위원소 희석(RID) 테스트 3,4,5를 사용하여 TBS의 정량적 평가를 가능하게 함으로써 VA 연구를 극적으로 변화시켰습니다. RID의 경우 13C또는 2H에 풍부한 VA 추적자를 투여하고 신체 저장과 평형을 이루고 MS를 사용하여 혈청(또는 혈장) 레티놀 추적자 대 추적 비율(TTR)을 측정합니다. 동위원소 희석 방정식은 TBS를 계산하기 위해 VA 대사와 관련된 특정 가정과 함께 적용됩니다 5,6.

혈청 레티놀 TTR(예: GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS)을 측정하기 위해 다양한 크로마토그래피 및 MS 조합을 사용할 수 있습니다. TBS는 TTR에 반비례하기 때문에 정확한 RID 추정치에는 분석 정밀도가 중요합니다. LC-MS/MS는 표지가 심하고 추적자 용량이 상대적으로 높은 용량을 사용할 때 처리량이 많은 응용 분야에 매우 적합합니다. 일반적인 LC-MS/MS 분석법은 분석 내 3-6%, 분석 간 7의 경우 <8%의 레티놀 상대 표준 편차(RSD)를 보고하지만 TTR의 정확도와 정밀도에 대한 데이터는 제한적입니다. 대조적으로, 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GCCIRMS)은 일반적인 13C/12C 동위원소 풍부도 RSD가 ~0.02-0.05 8,9인 13C-레티놀 농축에 대해 탁월한 정밀도를 제공합니다. 이를 통해 농축이 낮은 샘플에서 추적자 농도를 정확하게 결정할 수 있습니다. RID 응용 분야에 IRMS를 사용하면 추적자 용량과 추적자 내 표지 원자를 적게 사용하여 적절한 분석 신호를 얻을 수 있으므로 추적자 용량과 관련된 비용을 절감할 수 있습니다.

이 원고는 GC-C-IRMS를 사용하여 혈액, 모유 및 조직에서 13C-레티놀에 대한 분석을 간략하게 설명합니다. 테스트 중인 생물학적 샘플에 따라 GC-C-IRMS를 사용한 13C 표지 레티놀 분석은 표지된 레티놀을 포함하는 비극성 화합물을 분리하기 위한 몇 가지 잠재적인 추출 방법 중 하나로 시작됩니다. 혈청 샘플의 경우 여기에는 에탄올과 헥산을 첨가하고 헥산 분획을 수집하여 액체-액체 추출이 포함됩니다. 모유를 테스트하는 경우 샘플을 먼저 수산화칼륨으로 비누화한 다음 혈청과 유사한 액체-액체 추출을 수행합니다. 이러한 모유 샘플은 또한 남아 있는 다른 지질의 양을 줄이기 위해 고체상 추출 카트리지를 사용하여 정제됩니다. 조직(예: 간)에서 추출하는 경우 샘플을 무수 황산나트륨으로 분쇄하여 물을 제거하고 염화메틸렌으로 추출한 다음 회전식 증발을 위해 부피 또는 둥근 바닥 플라스크에 여과합니다. 분취량을 건조시키고, 에탄올에 재현탁하고, 비누화하고, 모유와 동일한 방법으로 추출합니다. 각 샘플의 이러한 비극성 용액은 질소 하에서 건조되고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 정제 및 정량화를 위해 메탄올에서 재구성됩니다.

IRMS의 민감도를 통해 장기 수학적 모델링 응용 분야를 위한 약동학 샘플 또는 VA 대사의 정확한 추적을 위한 간외 조직 샘플과 같이 샘플 농축이 낮은 샘플의 농축을 결정할 수 있습니다. 이론적 피험자10에서 효능을 결정하기 위해 개입 전후의 VA 상태를 평가하기 위해 단일 용량, 쌍을 이루는 RID 테스트가 제안되었으며, 이는 인간에서 검증될 경우 유망한 접근 방식이 될 수 있습니다. IRMS는 자연 농축 값 근처에서 VA 추적자를 검출할 수 있으므로 샘플링 프로토콜에서 긴 후속 조치 기간과 유연성을 허용합니다.

모유는 VA 상태 평가를 위한 덜 침습적인 대체 샘플링 접근 방식인 것으로 나타났습니다1. 모유 레티놀은 RID 테스트의 샘플링 소스로 사용할 수 있으며 VA 저장량이 낮은 잠비아 여성의 혈청 유래 RID 값과 강한 상관관계를 보여주었습니다11. 조직 및 모유 샘플의 경우 고체상 추출 기술은 복잡한 매트릭스에서 이러한 샘플을 정제하는 데 도움이 될 수 있습니다. IRMS는 또한 VA의 식품 공급원을 구별하고 혈청 레티놀 9,12,13의 자연 13C풍부도의 변화를 사용하여 상대적인 식이 기여도를 결정하는 데 사용되었습니다. 원소 분석기를 IRMS와 함께 사용하여 총 13C함량에 대한 식품 샘플을 분석하고 이를 VA 농축과 비교할 수도 있습니다.

13C 라벨을 사용할 때 자연적으로 발생하는 13C(총 탄소의 ~1.1%)로 인해 기준선 13C 레티놀 농축을 이해하는 것이 중요하며, 이는 개인과 인구 모두가 소비하는 VA 공급원에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 개인 수준에서 최상의 정확도를 위해 기본 혈액 샘플을 권장합니다. 모집단 평가의 경우, 모집단 기반 추정치는 무작위로 선택된 하위 그룹 또는 동일한 모집단 그룹14에서 분리된 개인을 사용하여 생성될 수 있습니다.

프로토콜

1. 생물학적 시료에서 레티놀 추출

참고: 모든 샘플 취급 및 추출 절차는 열화를 최소화하기 위해 노란색 또는 UV 필터링된 빛 아래에서 수행됩니다.

  1. 혈청에서 추출
    1. 1mL의 혈청(또는 사용 가능한 만큼)을 13 x 100mm(또는 유사한 크기) 유리 시험관에 피펫팅합니다. 사용된 혈청량을 기록합니다.
      알림: 용적식 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 200프루프 에탄올의 1.5배를 추가합니다.
    3. C-23 β-아포-카로테놀(all-trans retinal에서 합성, abs = 0.9)9과 같은 내부 표준 25μL를 첨가합니다. 샘플에 캡을 씌우고 15초 동안 와류에 의해 혼합합니다.
    4. 헥산 1mL를 첨가하고 15초 동안 와류에 의해 혼합한 다음 실온에서 2분(~1,300× g) 동안 원심분리합니다.
    5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단 헥산 층을 새 유리 시험관(12 x 75mm 또는 13 x 100mm)에 조심스럽게 피펫팅합니다.
    6. 1.1.4 및 1.1.5 단계를 2회 반복하여 두 번째 튜브에 3개의 헥산 추출물을 풀링합니다. 풀링된 헥산 추출물을 건조될 때까지 부드러운 질소 흐름 아래에 놓습니다.
    7. 건조된 샘플에 100μL의 메탄올을 첨가하고 즉시 캡을 씌웁니다. 용액을 튜브 측면을 위아래로 휘젓고 15초 동안 와류에 의해 샘플을 혼합합니다.
    8. 샘플을 -80°C 냉동고에 최소 5분 동안 넣습니다.
      참고: 샘플은 다음 날까지 -80°C에서 이 단계에서 보관된 상태로 유지될 수 있습니다.
  2. 모유 샘플 추출
    1. 우유 샘플을 완전히 해동하고 샘플이 균일하도록 여러 번 부드럽게 뒤집습니다. 10mL 유리 스크류 탑 원심분리기 튜브에 0.5-1.5mL(표준 1.0mL)의 우유 분취량을 측정하고 사용된 양을 기록합니다.
    2. 200프루프 에탄올(0.1% 부틸화 하이드록시 톨루엔(w:v) 함유)의 1.5배를 첨가하고 15초 동안 와류와 혼합합니다.
    3. C-23 β-아포-카로테놀(all-trans retinal에서 합성, abs = 0.9)15와 같은 내부 표준물질 25μL를 추가합니다. 샘플에 캡을 씌우고 와류에 의해 혼합합니다.
    4. 50:50 수산화칼륨의 우유 샘플 부피의 0.8배를 물에 첨가하고(w:v로 제조, 예를 들어, 50mL의 물에 용해된 50g의 KOH) 15초 동안 와용돌이에 의해 혼합합니다.
      참고: KOH:물은 플라스틱 용기(예: HDPE)에 담겨 있어야 합니다.
    5. 샘플을 45°C 수조에서 1시간 동안 비누화하고 15분마다 와류와 잠시 혼합합니다.
    6. 차가운 탈이온수 또는 역삼투압수를 시작 우유량과 동일한 양으로 추가합니다.
    7. 헥산 1mL를 첨가하고 15초 동안 와류에 의해 혼합한 다음 실온에서 2분(~1,300× g) 동안 원심분리합니다.
    8. 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단 헥산 층을 새 유리 시험관(12 x 75mm 또는 13 x 100mm)에 조심스럽게 피펫팅합니다.
    9. 1.2.7 및 1.2.8단계를 두 번 더 반복하여 두 번째 튜브에 헥산을 고칩니다.
    10. 고체상 추출(SPE)을 통해 각 샘플을 채취합니다. 먼저 필요한 SPE 카트리지(PE 500mg/3mL의 -NH2)를 진공 매니폴드에 연결합니다.
    11. 각 카트리지를 통해 3 x 2mL의 헥산을 통과시켜 각 카트리지를 컨디셔닝하고 용매 수준이 포장재 상단 아래로 떨어지지 않도록 합니다. 헥산을 16 x 75mm 유리관에 모아 적절하게 폐기하십시오.
    12. 샘플을 카트리지에 넣고 용매가 포장재 수준 바로 위에 올 때까지 진공으로 당깁니다. 1.2.11단계와 동일한 방식으로 각 카트리지를 3 x 2mL의 헥산으로 헹굽니다. 폐용매를 폐기하고 유리 수집 튜브를 샘플 ID가 표시된 동일한 크기의 새 것으로 교체하십시오.
    13. 레티놀을 염화메틸렌 3 x 2 mL로 세척하여 이 분획을 수집합니다.
    14. 질소 하에서 용출액을 건조시키고 100μL의 메탄올(MS 등급)으로 재구성합니다. 소용돌이로 샘플을 혼합하고 튜브의 모든 면에 용매를 소용돌이치게 합니다. 20-30초 동안 원심분리합니다.
    15. 샘플을 -80°C 냉동고에 최소 5분 동안 넣습니다.
      참고: 샘플은 다음 날까지 -80°C에서 이 단계에서 보관된 상태로 유지될 수 있습니다.
  3. 간 샘플 추출
    1. 직경 8cm의 유리 깔때기에 15cm Whatman #1 여과지를 접어서 원뿔 모양으로 놓습니다. 깔때기 아래에 50mL 부피 플라스크를 놓습니다.
    2. 조직을 해동하고 0.5g 또는 사용 가능한 만큼의 샘플을 측정합니다. 사용된 조직 무게를 기록합니다.
    3. 샘플을 절구와 유봉에 옮기고 약 5g의 황산나트륨으로 갈아줍니다.
    4. C-2315와 같은 내부 표준물질 250μL를 첨가합니다.
      참고: 에스테르화된 형태의 비타민 A(즉, 레티닐 아세테이트, 레티닐 부티레이트)는 샘플이 결국 비누화되어 표준이 내인성 레티놀과 구별할 수 없게 되므로 사용해서는 안 됩니다.
    5. 흄 후드에서 10-15mL의 염화메틸렌을 간 샘플과 함께 모르타르에 붓고 유봉을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
    6. 여과지를 통해 염화메틸렌을 부은 부피 플라스크에 붓습니다.
    7. 1.3.5단계와 1.3.6단계를 두 번 더 반복하여 부피 플라스크의 총 용매가 선 아래에 유지되도록 합니다.
    8. 파스퇴르 피펫을 사용하여 절구의 나머지 내용물을 염화메틸렌으로 깔때기로 헹굽니다. 부피 플라스크의 용매가 선에 도달할 때까지 파스퇴르 피펫을 사용하여 깔때기에 염화메틸렌을 계속 추가합니다. 부피 플라스크의 뚜껑을 덮고 캡을 제자리에 고정하면서 플라스크를 여러 번 뒤집습니다.
    9. 약 10mL의 염화메틸렌 추출물을 25mL 삼각 플라스크에 붓습니다. 용액 5mL를 스크류 탑 캡이 있는 10mL 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 부드러운 질소 가스 흐름 아래에서 샘플을 건조시킵니다.
    10. 샘플을 2mL의 에탄올 + 0.1% 부틸화 하이드록시 톨루엔에 재구성하고 와류를 일으켜 샘플을 혼합합니다.
    11. 0.8mL의 50:50(w:v) 수산화칼륨을 물에 넣고 15초 동안 와류에 의해 혼합합니다.
    12. 샘플을 45°C 수조에서 1시간 동안 비누화하고 15분마다 와류와 잠시 혼합합니다.
    13. 차가운 탈이온수 또는 역삼투압수 0.1mL를 추가합니다.
    14. 헥산 1mL를 첨가하고 15초 동안 와류에 의해 혼합한 다음 2분(~1,300× g) 동안 원심분리합니다.
    15. 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단 헥산 층을 새 유리 시험관(12 x 75mm 또는 13 x 100mm)에 조심스럽게 피펫팅합니다.
    16. 1.3.14 및 1.3.15 단계를 두 번 더 반복하여 두 번째 튜브에 헥산을 고칩니다.
    17. 풀링된 헥산을 질소 하에서 건조시키고 100μL의 메탄올(MS 등급)으로 재구성합니다. 소용돌이로 샘플을 혼합하고 튜브의 모든 면에 용매를 소용돌이칩니다. 20-30초 동안 원심분리하고 샘플을 -80°C 냉동고에 최소 5분 동안 넣습니다.
      참고: 샘플은 다음 날까지 -80°C에서 이 단계에서 보관된 상태로 유지될 수 있습니다.

2. 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 시료 정제 및 정량

  1. C18(5μm, 4.6 x 250mm) 컬럼과 325nm로 설정된 UV-Vis 검출기로 HPLC 시스템 1을 준비합니다.
  2. 아세토니트릴과 물의 부피를 따로 측정한 후 아세토니트릴에 물을 부어 92:8 아세토니트릴:물의 이동상을 준비합니다. 혼합 용액을 진공 여과하여 용존 가스를 제거합니다.
  3. HPLC 시스템 1을 켜고 필요한 경우 HPLC에서 용매 퍼지를 수행한 다음 최소 15분 동안 유속을 1mL/min으로 설정하여 시스템을 완전히 평형화합니다.
  4. HPLC 시스템에 표준물질을 주입합니다.
    1. 레티놀 농도를 정량화하기 위해 25μL의 C-23 내부 표준 용액을 주입하고 결과를 3배 기록하여 샘플과 비교합니다.
    2. 레티놀 표준물질을 주입하여 분획 수집 및 레티놀 정량화를 안내하는 데 사용되는 시스템의 정확한 머무름 시간을 결정합니다.
  5. HPLC 시스템 2를 준비합니다(구성 요소는 시스템 1과 동일함). 두 단계 모두에 하나의 HPLC 시스템을 사용하는 경우 1차 정제에 사용된 컬럼을 두 번째 동일한 컬럼으로 교체하여 샘플에서 화합물의 잠재적 캐리오버를 최소화합니다.
  6. 시스템 2의 경우 메탄올을 진공 필터로 필터링하고 HPLC 이동상을 퍼지한 다음 0.7mL/min을 20분 동안 실행하여 평형을 이룹니다.
  7. -80°C 냉동고에서 샘플을 한 번에 하나씩 꺼내고 실온에서 1,300× g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
  8. 펠릿 물질을 피하면서 전체 샘플을 HPLC에 주입합니다. 레티놀을 정량화하는 경우 기록을 시작합니다.
  9. 용매가 검출기를 통과할 때 레티놀 피크를 작은 유리관(12 x 75mm 또는 13 x 100mm)에 수집합니다. 피크의 중간 부분을 수집하여 순도를 최대화하며, 일반적으로 흡광도 값은 0.1 흡광도 단위보다 크며(그림 1), 샘플 레티놀 농도에 따라 조정할 수 있습니다. C-23 피크가 용리될 때까지 기다렸다가 기록을 중지합니다.
  10. 부드러운 질소 흐름 아래에서 샘플을 건조시킵니다.
  11. 건조된 샘플에 100μL의 메탄올(MS 등급)을 첨가하고 즉시 캡을 씌웁니다. 용액을 튜브 측면을 위아래로 휘젓고 15초 동안 와류에 의해 샘플을 혼합합니다. 샘플을 -80°C 냉동고에 최소 5분 동안 넣습니다.
    참고: 샘플은 다음 날까지 -80°C에서 이 단계에서 보관된 상태로 유지될 수 있습니다.
  12. -80°C 냉동고에서 한 번에 하나씩 샘플을 꺼냅니다. 1,300 × g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
  13. 전체 샘플을 HPLC 시스템 2에 주입하고 펠릿 물질을 피합니다.
  14. 레티놀 피크가 용리되면 검출기를 통과할 때 용매를 원추형 바닥이 있는 작은 유리 바이알(<1mL)에 모은 다음 샘플 바이알을 12 x 75mm 시험관에 부드럽게 밀어 넣습니다.
  15. 진공 농축기를 켜고 응축기를 20분 동안 식힙니다.
  16. 캐러셀에 샘플을 균형 잡힌 형태로 놓고 열 설정을 없음으로 설정하고 진공을 05.1로 설정한 다음 뚜껑을 닫고 실행을 누릅니다.
    알림: 샘플은 일반적으로 건조하는 데 10-20분이 걸립니다. 가스 크로마토그래피에서는 시료에서 모든 메탄올이 제거된 것이 중요합니다.
  17. 건조되면 HPLC 바이알을 나사 캡 뚜껑이 있는 4mL 호박색 바이알로 옮기고 4-7μL의 헥산으로 샘플을 재구성합니다.
    참고: 이것은 일반적으로 7 μL이지만 정제 중에 샘플이 낮은 농도로 결정되면 감소합니다. 간 샘플은 훨씬 더 농축될 수 있으므로 더 많은 부피로 재구성하십시오. 75ng/μL에서 400ng/μL 사이를 목표로 합니다.
  18. 약 75ng의 레티놀을 주입하는 데 필요한 샘플의 농도를 기준으로 적절한 신호를 얻기 위해 GC-C-IRMS에 1-5μL를 주입합니다.

3. GC-C-IRMS를 사용한 시료 분석

  1. 컬럼(100% 디메틸폴리실록산, 비극성, 15m, 0.25mm ID, 0.25μm 필름) 및 1.2mL/min의 헬륨 유속으로 GC를 준비합니다.
  2. 시스템 검사를 수행하여 누출이 없는지, IRMS 소스가 질량 44, 45 및 46에 적절하게 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.
    머무름 시간을 결정하고 시스템 성능을 확인하기 위해 매일 2 μL의 75 ng/μL 13C가 풍부한 레티놀 표준물질을 첫 번째 주입으로 주입합니다.
  3. 수집 소프트웨어에서 기기 분석법을 로드하고 샘플 이름을 입력한 다음 샘플 실행을 누릅니다. GC-C-IRMS 시스템은 사전 주입 시스템 설정 루틴을 수행합니다. GC 전면의 녹색 주입 준비 완료 표시등이 켜지면 미리 정해진 양의 샘플을 프로그래밍 가능한 온도 기화 PTV 인젝터에 주입하고 주사기를 제거한 다음 시작 버튼을 누릅니다.
  4. PTV 인젝터를 PTV Splitless 모드에서 작동하고, 시뮬레이션된 온컬럼 주입을 위해 가드 컬럼을 인젝터 인서트 상단에 장착합니다. 인젝터 프로그램을 초기 온도 50°C에서 시작하여 1.05분 동안 유지한 다음 14.5°C/s의 속도로 200°C로 높이고, 200°C에서 1분 동안 유지하고, 14.5°C/s에서 300°C로 전환한 다음 다음 주입을 위해 50°C로 돌아가기 전에 50mL/min의 헬륨 분할 흐름으로 4분 동안 인젝터를 퍼지하도록 유지합니다.
  5. GC 오븐 온도를 초기 온도 50°C로 프로그래밍하고 1분 동안 유지한 다음 30°C/min에서 150°C로 램프한 다음 15°C/min에서 265°C로 램프한 다음 40°C/min에서 최대 295°C까지 유지한 다음 다음 주입을 위해 50°C로 냉각하기 전에 2.50분 동안 유지합니다.
  6. 각 크로마토그램이 자당(IAEA-CH-6)에 대해 보정된 CO2 (순도 99.999%)의 3펄스로 시작하는지 확인합니다. 획득 소프트웨어에서 결과에 액세스합니다.
  7. 각 주입 후 각 크로마토그램을 검사하여 레티놀 피크가 존재하는지, 통합이 적절한지 확인합니다. 소프트웨어를 사용하여 레티놀 피크를 최대한 자동으로 통합하여 수동 통합으로 인한 잠재적 편향을 최소화합니다. 20mV/s의 표준 시작 및 끝 기울기 감지 설정을 활용합니다.
    참고: 200mV 이하의 피크 진폭은 정확한 13C비율 측정을 제공하기에는 너무 작습니다.
  8. 크로마토그램 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다. 다음과 같은 필수 데이터 범주를 포함합니다: 샘플 이름, 피크 머무름 시간, 질량 45에서의 피크 진폭 및 AT%.
    참고: 내보내는 데이터는 정의된 내보내기 방법을 사용하여 지정할 수 있습니다. δ 값은 해석의 용이성에 도움이 되지만 계산에는 필요하지 않습니다.

4. 비타민 A 전신 저장 및 간 농도 계산

  1. 레티놀 동위원소 희석 방정식.
    참고: 일부 연구자가 사용하는 선호하는 동위원소 균형 방정식 및 해당 표기법은 국제 순수 및 응용 화학 연맹(International Union of Pure and Applied Chemistry)의 권장 사항을 기반으로 합니다16. 일부 연구 그룹은 RID 방정식에 사용된 요인의 역사적 사용을 유지하려고 시도하는 표기법을 사용한다는 점에 주목합니다. 또한 요인과 지원 문헌은 연구 설계, 실험 모델 및 분석 결과에 따라 TBS 또는 간 VA 농도에 대한 계산에 더 직접적으로 적용되는지 여부가 다를 수 있습니다.
    1. 다음 방정식에 따라 연소 후 CO2 13C의 동위원소 풍부도를 사용하여 혈청 레티놀 TTR을 결정합니다.
       figure-protocol-1    
      여기서 F는 추적자 용량(Fa), 기준선에서의 혈청 레티놀(Fb) 및 투여 및 체내 풀과 혼합 후의 혈청 레티놀(Fc)의 동위원소 풍부도(동위원소 양 분율, 약칭 'x'라고도 함)입니다. 사용되는 혼합 기간은 일반적으로 인간의 경우 약 14-21일이지만 특정 연구 설계에 따라 더 짧거나 길어질 수 있습니다.
    2. RID 방정식을 사용하여 다음 기본 방정식에 따라 VA TBS를 계산합니다.
      figure-protocol-2
      어디
      figure-protocol-3
      참고: 흡수 및 저장에 사용되는 요인에는 i) 평형 시 용량 저장 (용량 흡수)이 포함되며 일반적으로 건강한 개인의 경우 75%에서 90% 사이로 추정됩니다. 염증이 있는 경우 추정치를 줄일 수 있습니다. ii) 용량 유지; 상수: e-kt; k = ln(2)/레티놀의 반감기; 어린이의 경우 32일에서 136일; 성인의 경우 140일); t = 투약 후 일수(보통 14-21일); 혈청/간 추적자 분할: TTRserum / TTRliver; 0.65-0.9 혼합 기간 동안 VA 섭취; 낮은 추적자 용량, 통제된 VA 섭취 및 공복 샘플링을 사용하는 경우 0.9-.1.
      figure-protocol-4
    3. 간 무게와 간 내 VA TBS 비율에 대한 추가 가정을 사용하여 간 VA 농도를 계산합니다.
      figure-protocol-5
      어디
      figure-protocol-6
      간 대 체중 비율은 일반적으로 연령별 상수로 추정됩니다: 유아: 4-4.2%; 어린이: 3%; 성인: 2.4%; 간의 TBS 분획은 비타민 A 상태에 따라 다릅니다. 이전에 사용된 추정치는 한계 또는 낮은 VA 상태입니다: 0.5; 적절한 VA 상태: 0.8-0.9.

결과

325nm에서 모니터링된 혈청 샘플 크로마토그램의 예는 프로토콜 섹션 2에 대해 제공됩니다(그림 1). 사용되는 특정 시스템 및 컬럼에 따라 레티놀의 일반적인 머무름 시간은 4-6분이고 내부 표준의 경우 6-8분입니다. 녹색 음영 영역은 불순물을 최소화하기 위한 레티놀 분획의 목표 수집 범위를 나타냅니다. 혈청에서 레티놀의 추출 효율은 일반적으로 ≥ 85%인 반면, 비누화된 모유 및 조직 샘플은 평균 ~70-80%로 효율성이 낮은 경향이 있습니다. 소량의 레티놀 시스-이성질체는 HPLC 정제 중 주요 올-트랜스 피크 직전 또는 직후에 용출되는 것을 관찰할 수 있습니다. 그림 1에 제시된 샘플에서 눈에 띄는 시스-이성질체는 관찰되지 않았지만 참조17의 보충 그림 1에서 볼 수 있습니다. 종종 추가 이성질체는 두 번째 HPLC 정제(그림 없음) 또는 GC 분리 중에 분리됩니다(그림 2).

표준물질, 혈청 샘플 및 블랭크에 대한 GC-C-IRMS 크로마토그램의 예는 프로토콜 섹션 3에 대해 나와 있습니다(그림 2)9. 각 샘플에는 IAEA 자당 표준(IAEA-CH-6)에 따라 보정된 13C농축이 있는 참조 CO2 피크가 포함되어 있습니다.

1) 참조 CO2에 대한 13C/총 C의 동위원소 풍부도에 대한 실험적 IRMS 정밀도(CV%)는 안정성에 대해 0.012이고 선형성에 대해 0.031이었습니다(각각 n = 10); 2) 레티놀 표준은 일간 안정성에 대해 0.036, 일중 선형성에 대해 0.022였습니다(각각 n = 4); 3) 실험은 저빌의 기준선 및 8개 식이 치료 그룹(9개 그룹에 걸쳐 n = 46)에서 0.073 ± 0.061이었습니다9.

다음은 결과 혈청 GC-C-IRMS 데이터를 사용하여 방법 4에 대한 RID 방정식을 사용하여 용량 투여 후 14일에 결정된 TBS 및 간 VA 농도를 계산하는 방법의 예입니다.

연구 참가자 특성:

연령:4년
체중:16.0kg
Fa(2개의 탄소 라벨과 천연 풍부함):0.11
Fb:0.010757
FC:0.011057
적용된 추적자 용량:1.0 μmol
투약 후 시간:14 일
VA 반감기:32일
흡수:0.8
혈청/간에서 TTR의 비율(식이요법이 조절되지 않음):0.9
간의 TBS 분획:0.8

계산:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0.0110568 - 0.010757) / (0.11 - 0.0110568) = 0.0030300213
1/TTR = 1 / 0.0030300213 = 330.03

용량 유지 = 반감기가 32일이고 샘플링 시간이 14일인 e-kt
케이 = ln (2) / 36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
티 = 14
e-kt = e-0.02166 x 14= 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330.03 x 0.8 x 0.738413073 × 0.9 = 175μmol

간 VA 농도 계산:
간 무게(g) = 1,000 × 체중(kg) × 3%(어린이의 경우 추정치)
간 무게 = 1,000 x 16.0 x 0.03 = 480g
figure-results-2
간 VA 농도 = (175 / 480) x 0.8 = 0.29 μmol/g

figure-results-3
그림 1: 인간 혈청 샘플의 HPLC 크로마토그램. 등용매 이동상 90:10 MeOH:H2O 및 325 nm에서 검출되는 HPLC 시스템 1. 레티놀 피크는 ~0.1 이상의 흡광도 값(녹색 음영 영역)에 대해 수집됩니다. 내부 표준 C-23 β-apo 카로티놀은 이 단계에서 혈청 레티놀 농도(원하는 경우)를 정량화하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 2: 레티놀 13 C/12 C 측정을 보여주는 GC-C-IRMS 크로마토그램. (A) 레티놀 표준, (B) 혈청에서 정제된 레티놀 및 (C) Gannon et al.9에서 채택한 블랭크 주입의 GC-C-IRMS 크로마토그램. 세 가지 트레이스는 질량 44(12C16O2에 해당), 45(13C16O2 또는 12C16O17O에 해당) 및 46(주로 12C16O18O에 해당, 17O 기여도에 대한 질량 45를 수정하는 데 사용됨)에 대한 것입니다. 200초 이전의 3개의 넓은 피크는 자당 13C 참조 물질로 보정된 CO2 기준 피크입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

GC-C-IRMS를 사용하여 레티놀의 13C농축을 측정하기 위해 설명된 방법은 식이 개입, 18 비타민 A 동역학 모델링, 19,20,21 임상 연구 또는 VA 상태의 개선된 추정치를 위해 RID를 통합한 인구 연구를 평가하는 데 귀중한 데이터를 제공할 수 있습니다22.

이 테스트에서 생물학적 샘플에서 정제된 레티놀은 온도 구배가 있는 연구 등급 헬륨(순도 >99.99999%)에 의해 GC 컬럼을 통해 운반되어 샘플에 남아 있는 불순물과 분리됩니다. 레티놀이 연소되어 CO2 와 물을 형성하고 물이 제거됩니다. CO2 는 질량 44, 45 및 46이 측정되는 IRMS로 운반되고 자당 표준(IAEA-CH-6)에 대해 추가로 보정된 CO2 가스 기준을 기준으로 δ 및 AT%가 결정됩니다.

주사용 레티놀을 준비할 때 추출된 레티놀은 재현 가능한 동위원소 비율을 달성하고 철저한 세척 사이에 분석 플랫폼의 수명을 최대화하기 위해 최고 순도여야 합니다. 추출에 사용되는 용매는 일반적으로 MS 등급인 가장 높은 순도 등급이어야 합니다. 추출 튜브, 파스퇴르 피펫 및 HPLC 주입 바이알과 같은 모든 유리 제품은 MS 분석을 위해 적절하게 세척하기 어렵기 때문에 새 것이어야 합니다. GC 및 연소 컬럼에 축적되는 추출물의 가소제를 최소화하기 위해 플라스틱이 아닌 유리관과 피펫을 사용하는 것이 중요합니다.

이 샘플 분석 워크플로는 특정 연구 설계 및 샘플링 소스에 따라 수정될 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 HPLC 시스템은 레티놀 정제에 최적화될 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 이를 위해서는 이동상에 물이 필요하며 이동상 구배가 필요하거나 GC-C-IRMS에 주입하기 전에 시료 건조 시간을 늘려야 합니다. 우리는 짧은 등용매 분석법을 사용하여 두 개의 HPLC 시스템을 사용하면 GC-C-IRMS에서 명확한 신호를 얻으면서 분석 요구 사항의 균형을 맞추는 것을 발견했습니다(그림 2). LC-MS/MS를 사용하면 RID 샘플에 대한 보다 간소화된 분석 워크플로우를 제공할 수 있습니다7. 그러나 GC-C-IRMS의 감도는 더 낮은 선량 및 동위원소 표지 양을 사용할 수 있고, 더 긴 시점에서 추적자를 정량화하고, 시료 농축이 낮은 시료를 분석할 수 있다는 뚜렷한 이점이 있습니다.

이 방법의 한계에는 여러 기기가 필요하고, 숙련된 기술 처리, 더 긴 시료 준비 시간으로 인한 시료 처리량 제약이 포함됩니다. HPLC 정제 단계는 등용매 방법을 사용하므로 자동화된 분획 수집 기능이 있는 HPLC를 구현하여 각 샘플을 준비하는 데 필요한 인력을 개선하여 분석물 머무름 시간을 일관되게 할 수 있습니다. 이 방법은 하나의 HPLC 정제만 사용하도록 최적화될 수 있습니다. 우리는 두 개의 시스템을 병렬로 사용하여 처리량을 늘리고 헥산으로 재구성하고 GC-C-IRMS에 주입하기 전에 시료 건조를 용이하게 합니다.

GC-C-IRMS는 동위원소 비율을 결정하는 데 매우 민감하지만 적절한 레티놀 신호를 위해서는 더 많은 총 시료 레티놀 질량이 필요합니다. 시료 요구 사항은 시료 양과 시료 VA 농도에 따라 다릅니다. 일반적으로 75ng의 레티놀은 강한 피크를 목표로 하여 GC 전달 및 연소 효율의 변화를 허용합니다. 실제로 최적의 작동 조건에서 샘플로 적절한 신호를 얻어 25ng의 낮은 GC-C-IRMS 주입을 얻을 수 있습니다. 이는 부피가 적고(~0.4mL), 레티놀 농도가 낮고(~0.5μmol/L), 추출 및 정제 절차에서 약간의 손실이 있는 혈청 샘플에 해당합니다. RID 방법의 분석 개발에서 주요 개선은 PTV 인젝터로 전환하는 것이었습니다. 낮은 시작 온도는 시료를 운반하는 헥산이 너무 빠르게 팽창하는 것을 방지하여 시료의 시뮬레이션된 온컬럼 주입을 가능하게 합니다. 컬럼에 직접 주입하면 레티놀의 신호가 최대화되지만 피크 모양이 다소 나쁘고 유지 관리가 더 지속된다는 단점이 있습니다.

모유는 RID 테스트에서 혈청 샘플의 대체품으로 제안되었습니다. 이것은 VA11의 비축량이 거의 없는 잠비아 수유 여성에서 검증되었습니다. 고소득 국가에서 볼 수 있는 것과 같이 미리 형성된 VA를 더 많이 섭취하는 여성이나 식이 섭취, 식품 강화 및 보충을 포함하여 VA의 여러 공급원을 소비하는 인구에서 아직 검증되지 않았습니다.

모유 VA 평가는 VA 상태의 다른 생화학적 지표에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 채혈 전문의가 필요하지 않기 때문에 모유 수집은 종종 혈액보다 쉽고 모유 수집은 일반적으로 피험자에게 덜 침습적인 것으로 간주됩니다23. 캐주얼 모유 샘플을 사용하는 것이 편리하며 우유 5mL만 필요합니다. 또한 샘플을 즉시 처리할 필요가 없으므로 특히 현장 환경에서 샘플 처리 시간이 단축됩니다. 그러나 지방과 레티놀의 농도는 전유보다 뒷유에서 더 높고, 유지방과 레티놀 농도는 하루 중 시간과 마지막 수유 이후의 간격에 따라 달라지는 경향이 있기 때문에 전체 모유 샘플에 대한 샘플 수집의 표준화가 중요합니다 1,24. 캐주얼 샘플의 경우 레티놀 농도는 유지방 g당 가장 잘 표현됩니다. 유지방은 이상적으로는 크림토크리트 방법(25)을 사용하여 수집 직후에 결정되어야 합니다. 샘플은 빛으로부터 보호되어야 합니다. HPLC 분석을 위한 분취량(일반적으로 1-5mL)은 우유가 냉동 및 해동 후 균질하지 않기 때문에 수집 시 준비해야 합니다.

간에서 VA의 13C-농축을 측정하는 것이 가능하고 흥미로운 두 가지 주요 상황이 있습니다. 가장 일반적인 상황은 간을 채취할 때 동물 연구에서 13C 표지 레티놀을 사용할 때입니다. VA의 계산된 TBS는 HPLC/UPLC에 의해 결정된 간 내 VA 농도와 비교되지만 간 저장의 13C-농축은 추적자가 장기 저장에 비해 순환에 어떻게 분포되는지 결정하는 데에도 유용합니다. 또한, 일부 독특한 상황에서는 동의하고 라벨이 붙은 용량의 비타민 A26,27을 복용한 인간으로부터 간 생검 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 샘플은 13C-레티놀 혼합의 검증 및 테스트에도 유용합니다. 간 샘플 처리는 측정된 샘플을 무수 황산나트륨으로 분쇄하여 물을 가두어 조직을 분해하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 여과지를 통해 50mL의 염화메틸렌으로 추출합니다. 분획물을 질소 하에서 건조시키고 방부제로 첨가된 0.1% 부틸화 하이드록시 톨루엔을 첨가한 에탄올에서 재구성합니다. 샘플은 모유에 사용되는 것과 동일한 절차로 비누화되고 추출됩니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NIH-R01 DC019357와 IAEA 조정 연구 프로젝트 E43035의 자금 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
VPDB-LSVEC 스케일(자당)로 추적 가능한 13C 참조 물질국제원자력기구IAEA-CH-6 국립표준기술연구소 명칭: RM 8542
아세토니트릴(HPLC 등급)피셔 사이언티브UN1648
에탄올(순수 200도, 무수, & 99.5%)시그마459836
유리 파스퇴르 피펫어떤
유리 시험관어떤
헬륨 (연구 은총, (>99.9995% 순도)어떤
헥산시그마178918
메탄올 (MS 등급)VWRMSPP-A-456
절구와 페스텔, 도자기어떤
양위 피펫 3-25 및 마이크로; L길슨FD10002
양방향 피펫 10-100 및 마이크로; L길슨FD10004
양위 피펫 50-250 및 마이크로; L길슨FD10005
양위 피펫 100-1000 및 마이크로; L길슨FD10006
수산화칼륨피셔 사이언티브UN1813
정성적 여과지 #1 150mm왓맨1001-150
분리형 굴뚝어떤
무수성 황산나트륨피셔 사이언티브S415-212
부피 플라스크 (50 mL)어떤

참고문헌

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

재인쇄 및 허가

태그

A13C AHPLC

이 논문이 게재되었습니다

동영상 곧 제공

문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.