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방법 논문

현장 MTT 기반 냉동절개 영상을 이용한 간세포암종 조직에서 대사 활성 세포의 검출

324 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

2025년 10월 31일

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 MTT 기반 냉동절편 영상을 사용하여 간세포 암종 조직에서 대사 활성 세포를 검출하는 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 조직이나 기관에서 활성 세포를 제자리에서 검출하는 데에도 사용될 수 있습니다.

초록

이전 연구를 포함한 새로운 증거는 우수한 대사 활동과 스트레스 저항성을 나타내는 간세포 암종(HCC) 조직 내 세포의 하위 집단을 강조합니다. 이 세포는 종양 진행 및 치료 저항성의 핵심 동인입니다. 그러나 제자리 생존 세포 검출을 위한 기존 방법은 종종 조직 무결성을 손상시키거나 세포 생존력을 변경하거나 기술적으로 까다롭습니다. 이 연구는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)의 미토콘드리아 의존적 환원을 통해 간세포암종 조직에서 대사 활성 세포의 현장 검출을 위한 새롭고 간단한 비파괴 접근법을 제시합니다. 조직 단편 크기(1 × 1 × 0.2 cm3), 배양 조건(20% FBS, 1 mg/mL MTT 및 간헐적 소용돌이를 통한 3시간 배양) 및 냉동 절개 매개변수(20 μm 두께, 4% PFA 고정 및 DAPI 대조염색)를 최적화함으로써 생존 가능한 HCC 세포의 공간 매핑이 5시간 이내에 달성되었습니다. 이 비용 효율적인 프로토콜은 특수 장비가 필요하지 않으며 조직 구조를 유지하므로 표면 영역에서 생존율이 높고 스트레스 저항성이 뛰어난 세포 클러스터를 공간적으로 식별할 수 있습니다. 제한 사항에는 6시간 이상의 점진적인 생존력 손실과 절편 중 결정 변위가 포함되며, 이는 FBS 보충 및 제어된 동결을 통해 완화될 수 있습니다. 이 방법은 치료 저항성 하위 집단의 단일 세포 분리를 위한 실용적인 플랫폼을 제공하여 HCC 미세 환경 연구를 발전시킵니다.

서론

전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인인 간세포 암종(HCC)은 높은 이질성과 재발률을 특징으로 합니다1. 이러한 공간적, 시간적 이질성은 종양 조직 내의 특정 세포 집단을 대사, 증식, 진행, 스트레스 내성 및 약물 내성에서 다른 세포 집단보다 더 활성화하게 만듭니다. 간세포암종 조직 내 생존 세포의 현장 검출은 이러한 세포가 증식하는 서브클론, 치료 저항성 집단 및 전이 개시 세포를 포함하기 때문에 심오한 임상적, 생물학적 중요성을 갖습니다. 이러한 생존 가능한 세포는 종양 재발, 면역 회피 및 치료 실패의 중요한 동인 역할을 할 수 있습니다2.

그러나 현재의 공간 프로파일링 기술(예: 공간 전사체학)은 특수 기기가 필요하고 높은 비용과 관련이 있는 반면, 기존의 벌크 분석은 생존 세포의 공간적 이질성과 간질 구성 요소와의 동적 상호 작용을 간과하는 경우가 많습니다3. 예를 들어, 절제 후 잔류 생존 가능한 간세포암종 세포는 해리된 세포 시스템에서 충실하게 요약할 수 없는 뚜렷한 대사 프로필을 나타냅니다4. 따라서 공간적으로 분해된 검출 기술을 발전시키는 것은 생존 가능한 종양 세포와 미세 환경 사이의 기능적 누화를 밝혀 궁극적으로 정밀 치료 전략을 알리는 데 필수적입니다. 우리 그룹은 간세포암종에서 생존 가능한 세포를 검출하기 위해 유세포 분석 또는 면역조직화학(IHC)과 같은 기존 방법을 사용했지만 조직 해리 또는 고정이 필요하므로 공간적 맥락을 잃고 세포-세포 상호 작용 분석을 방해합니다 5,6. 따라서 생존 세포의 현장 검출을 위한 비파괴 고해상도 기술을 개발하는 것은 간세포암종 내성 메커니즘을 밝히고 정밀 치료법을 안내하는 데 중요합니다.

파괴적인 처리 없이 HCC 조직의 생존 세포를 신속하게 검출하고 표시하기 위해 간단한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 기반 조직 배양 방법이 개발되었습니다. 간단히 말해서, 신선한 얇은 간세포암종 조직(약 1 × 1 × 0.2cm3)을 먼저 20% 태아 소 혈청(FBS) 및 MTT(1 mg/mL)를 포함하는 DMEM 배지에서 3시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정 및 DAPI 함유 마운팅 후, OCT 포매 냉동 조직 슬라이드(두께 20μm)를 밝은 광선 또는 자외선 아래에서 현미경으로 관찰했습니다. 생존 세포는 보라색, 보라색-빨간색 또는 보라색-검정색을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하여 5시간 이내에 HCC 조직에서 생존 세포를 성공적으로 검출했습니다. 한편, 이 방법은 3D 마이크로아키텍처를 보존하고 다운스트림 멀티오믹스 분석과 호환되며 간단하고 시간과 비용 친화적입니다. 그러나 이 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 세척, 절편 및 배양의 다단계 과정은 조직, 특히 본 연구에서 HCC 조직과 같은 대사율이 높은 샘플에서 구조적 변형 및 세포사멸을 유도할 수 있습니다. 또한 냉동절편 슬라이스의 두께가 증가하면 현미경 관찰의 선명도와 평탄도가 손상됩니다.

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프로토콜

모든 실험은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 취안저우 제1부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(No. FJMU IACUC2021257). 간세포암종 조직은 환자의 사전 동의를 받아 푸젠 의과대학 부속 취안저우 제1병원에서 외과적으로 제거 및 수집되었습니다. 이 실험에는 실험실 가운, 일회용 마스크 및 장갑 착용을 포함한 표준 보호 조치가 필요합니다.

1. 조직 준비

  1. 멸균된 9cm 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 30mL를 첨가합니다.
  2. 외과적으로 절제된 인간 간세포암종 조직을 즉시 PBS로 옮깁니다.
  3. 접시를 5초 동안 부드럽게 휘젓어 혈액 오염 물질을 제거합니다. 멸균 피펫을 사용하여 PBS를 흡인합니다.
    알림: 세 번 반복합니다.
  4. 티슈를 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다.
    참고: 티슈는 나중에 더 잘 취급할 수 있도록 젖지 않은 페트리 접시 뚜껑에 쉽게 부착됩니다.
  5. 멸균 수술용 칼날(No. 11)을 사용하여 조직을 약 1 × 1 × 0.2cm3 조각으로 자릅니다.
    참고: 조각의 길이와 너비는 변경할 수 있지만 깊이는 0.2cm 미만이어야 합니다.
  6. 조각을 얼음처럼 차가운 PBS 30mL로 채워진 신선한 9cm 접시에 다시 넣습니다.
  7. 접시를 5초 동안 부드럽게 휘젓어 혈액 오염 물질을 제거합니다. 멸균 피펫을 사용하여 PBS를 흡인합니다.
    알림: 1.7단계를 세 번 반복합니다. PBS(95°C, 10분)에서 끓인 1개의 조직 조각을 음성 대조군으로 설정했습니다. 멸균 상태에서 모든 단계를 수행합니다.

2. 조직 배양

  1. 포도당(최종 농도 = 4.5g/L) 및 L-글루타민(최종 농도 = 2mM)을 함유한 완전 배양 배지 DMEM(37°C로 예열) 1.8mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 그런 다음 0.6mL FBS(최종 농도 = 20% v/v) 및 0.6mL MTT 스톡(최종 농도 = 1mg/mL)을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
  2. 멸균 겸자를 사용하여 조직 조각을 우물로 옮깁니다.
  3. 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 37°C에서 5% CO2와 함께 3시간 동안 배양합니다.
    알림: 3분마다 30초 동안 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 조직 조각의 표면이 보라색 또는 보라색-검정색으로 변하면 배양을 종료할 수 있습니다.

3. 종료 및 고정

  1. MTT 배지를 흡인합니다. 얼음처럼 차가운 식염수로 조직 조각을 씻으십시오.
    알림: 다섯 번 반복합니다.
  2. 2mL의 4% 중성 완충 포르말린(NBF)을 6웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
  3. 플레이트를 4°C의 냉장고에 1시간 동안 넣습니다.

4. 냉동절편

  1. 깨끗한 흡수성 종이에 조각을 부드럽게 닦아냅니다.
  2. OCT 화합물로 채워진 냉동몰드에 조직을 넣습니다.
    알림: 조직이 OCT 화합물로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
  3. 조직을 -80°C의 저온 냉장고에서 20분 동안 냉동합니다.
  4. 냉동 블록을 -20°C의 극저온 조절기 척에 장착합니다.
  5. 조직 표면이 노출될 때까지 -20°C에서 100μm 절편을 절단합니다.
    참고: 조직 표면은 보라색과 같은 색을 나타냅니다.
  6. 접착제로 코팅된 슬라이드를 사용하여 20μm 슬라이스를 수집합니다.
    참고: 조직 조각은 보라색, 보라색-빨간색 또는 보라색-검정색 음영으로 나타나야 합니다.
  7. 슬라이스를 실온에서 2분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정합니다.
  8. 슬라이드를 PBS로 1분 동안 부드럽게 헹굽니다.
    알림: 세 번 반복합니다.

5. 장착

  1. DAPI 함유(최종 농도: 1μg/mL) 설치 매체 1방울을 도포합니다..
  2. 커버슬립으로 덮습니다.
  3. 매니큐어로 가장자리를 밀봉하십시오.
    참고: 가장자리가 밀봉된 슬라이드는 현미경 검사를 즉시 수행하지 않으면 어둠 속에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.

6. 현미경

  1. 명시야 현미경을 사용하여 명시야에서 20× 배율로 보라색, 보라색-빨간색 또는 보라색-어두운 포르마잔 침전물(생존 세포)을 시각화합니다.
  2. 형광 현미경을 사용하여 UV 조명 하에서 파란색 DAPI(핵)를 검출합니다.
  3. 공간 상관 관계를 위해 명시야 채널과 형광 채널을 병합합니다.
    참고: 여기에 사용된 소프트웨어는 NIS Element F(버전 4.00.06)입니다.

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결과

이 연구는 조직 구조를 방해하지 않고 간세포암종 조직에서 대사 활성 세포를 성공적으로 검출했습니다. 첫째, 명시야 이미지(그림 1A)는 조직 표면이 조밀한 세포 피복과 슬라이드 전체에 걸쳐 세포의 다층 적층을 나타내는 것을 보여주었으며, 이는 배양 및 처리 전반에 걸쳐 HCC 조직의 보존된 구조적 무결성을 확인했습니다. 특히, 표면 영역 내의 세포 클러스터는 생존 가능한 세포 집단에서 미토콘드리아 활동을 나타내는 뚜렷한 보라색-빨간색 포르마잔 침전물을 나타냈습니다. 둘째, DAPI 핵 대조염색은 형광 이미지에서 세포의 위치와 윤곽을 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 1B). 이 이미지는 또한 섹션 전체에 걸쳐 균일하게 온전한 핵을 나타내어 프로토콜에 의해 달성된 세포 구조 보존을 확인했습니다. 셋째, 명시야 이미지(그림 1A)와 해당 형광 이미지(

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토론

현장 생존 세포 검출을 위한 현재 방법론은 여전히 다면적인 한계에 직면해 있습니다. 증식 마커 또는 세포사멸 관련 단백질을 식별하는 데 널리 사용되는 IHC 및 면역형광(IF)은 포름알데히드 고정에 의해 유도된 막 무결성 파괴로 고통받습니다7. 더욱이, 두꺼운 조직 절편에서 항체 침투는 차선책입니다8. Calcein-AM과 같은 형광 생존율 프로브는 생체 외에서 에스테라제 활성 살아있는 세포를 표지하는 데 효과적이지만 변경된 효소 활성 및 괴사 영역으로의 비특이적 확산으로 인해 저산소성 HCC 영역에서 감소된 특이성을 나타냅니다9. 레이저 캡처 미세해부(LCM)는 생존 가능한 세포 클러스터의 정밀한 분리를 가능하게 하지만 낮은 처리량으로 작동하고 공간적 맥락을 희생하여 세포-세포 통신 역학을 연구하는 데 유용성...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 샤먼시 과학기술국(No. 3502Z20227197), 푸젠 의과대학의 과학 연구 창업 기금(2021QH1240)의 자금 지원을 받았습니다. 기술 지원을 해주신 Xianying Zhang, Jingjing Zhou 및 Shaocong Weng(Huaqiao University)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
-80 & 도; C 냉동고(업라이트)써모피셔 사이언티브TSX60086V
클린 벤치(수직 층류 흐름)에어테크SW-CJ-1FD
CO2 인큐베이터 (165L)써모피셔 사이언티브헤라셀 VIOS 160i (예: 51030400 / 51033559)
커버슬립 (24시간 이상; 50 mm, #1.5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
배양용 페트리 접시 (90 mm)둥지752001 (예시)
DAPI 함유 마운팅 매체비요타임P0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (고혈당, 피루브산 포함)인비트로젠 (Gibco)11995-065
FBS (자격, 미국 출신)인비트로젠 (Gibco)A3160501
형광 현미경니콘ECLIPSE Ti2 시리즈
냉동 미세토름 (냉동조절기)라이카CM1950
현미경 슬라이드(일반 25배; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
MTT 시약(분말)비요타임ST316
네일 폴리시 (투명)비요타임—
NBF(중성 완충 포르말린)비요타임—
OCT 복합물사쿠라 (사쿠라 파네텍)4583
광학 현미경(직립 상태)니콘ECLIPSE Ci 시리즈(예: Ci-L)
PBS (500 mL)비요타임C0221A
PFA, PBS 4% (고정제)비요타임P0099
피펫 팁 (1 mL, 저결합)키르겐KG1313-L
피펫 팁 (200 µ L)악시겐 (코닝)T-200-Y (벌크) / T-200-Y-R-S (진열형, 멸균형)
피펫터 (단일 채널)써모피셔 사이언티브핀피펫 F2 (사격장별 캣#)
메스히스틱모델은 다양합니다(예: 공급업체 참조 100022208326)
트위터히스틱모델은 다양합니다

참고문헌

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
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  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
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  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

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