질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

요약

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

초록

광범위한 실험적 증거는 후생유전학적 메커니즘이 암의 발병, 진행, 재발에 미치는 역할을 뒷받침합니다. 이 중 히스톤 변이체와 그 번역 후 변형(PTM)은 크로마틴 조직과 역학, 유전체 접근성을 조절하여, 전사, 복제, DNA 손상 복구와 같은 주요 DNA 기반 과정에 이른바 히스톤 코드를 통해 영향을 미칩니다. 히스톤 PTM 패턴 조절 이상은 암에서 자주 관찰되며, 일부 마커는 진단 및 예후 생물학적 표지자로 기능하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 임상 샘플에서 편향 없고 포괄적인 히스톤 PTM 프로파일링을 가능하게 하는 새로운 방법론은 종양의 후생유전학적 지형을 특성화하는 데 매우 가치가 있습니다. 여기서는 임상 샘플에서 히스톤을 효율적으로 추출하기 위한 프로토콜을 제시하는데, 여기에는 스냅 냉동, 최적 절단 온도(OCT) 냉동, 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 생검 등이 포함됩니다. 이 방법은 고성능 액체 크로마토그래피와 연계된 연계 질량분석(LC-MS/MS)을 통한 상향식 분석을 위한 충분한 양과 품질의 히스톤 단백질을 제공합니다. 이 워크플로우는 주요 히스톤 변형, 특히 라이신 아세틸화 및 메틸화를 원차 종양 샘플에서 견고하게 검출하고 정량할 수 있게 하여 암 특성화를 위한 추가적인 분자층을 제공합니다.

서론

진핵세포의 핵에서는 히스톤이 DNA와 결합하여 염색질의 기본 구조 단위인 뉴클레오솜을 형성합니다. 각 뉴클레오좀은 약 146 bp의 DNA가 두 개의 핵심 히스톤 H2A와 H2B, 그리고 두 개의 이중체 히스톤 H3와 H4로 구성된 옥타머를 감싸고 있습니다. 또한 링커 히스톤 H1도 존재하며, 뉴클레오좀과 링크 DNA 신장을 결합하여 염색질의 고차 조직을 촉진^합니다. 히스톤은 주로 N-말단 꼬리에 나타나는 다양한 번역 후 변형(PTM)으로 장식되어 있습니다. 이러한 변형에는 메틸화, 다양한 유형의 아실화(아세틸화, 프로피오닐화, 부티릴화 등), 인산화, SUMOylation, 유비비퀴티화, ADP-리보실화, 크로토니화가 포함되며, 그중 라이신과 아르기닌 메틸화, 라이신 아세틸화가^{가장 특징적입니다}. 히스톤 변형의 특정 유형, 위치, 조합이 히스톤 코드라고 불리는 것을 만듭니다. 이 코드는 히스톤의 N-말단 꼬리에 작용하는 다양한 번역 후 변형(PTM)으로 구성되며, 특정 히스톤 변형 효소에 의해 추가되거나 제거됩니다. 이러한 변형은 효과기 단백질에 의해 인식되어, 압축이나 응축과 같은 염색질 구조 변화를 일으켜 DNA 손상 복구, 복제, 특히 유전자 전사를 포함한 여러 생물학적 과정에 영향을 미친다 ^3,4.

DNA 메틸화와 히스톤 PTM^{은 암에서} 가장 많이 연구된 후생유전학적 특징 중 하나입니다. 최근 실험적 증거는 여러 암 유형에서 다양한 히스톤 PTM 수치에 변화가 있음을 보여주었습니다. 특히 H4K20me3와 H4K16ac의 손실은 암의 특징으로 보고되었으며,^{정상 조직에} 비해 거의 모든 종양에서 이들 수치가 감소한 것으로 나타났습니다. 우리 연구팀은 질량분석(MS) 기반 접근법을 사용하여 정상 암에 비해 여러 암에서 H3K14ac 감소를 정량화하여 암의 잠재적 특징으로 확인했습니다^. 5. 더불어, 수많은 연구에서 히스톤 PTM의 예후적 가치를 강조하여, 주로 환자 생검에서 면역조직화학으로 평가되는 전반적 수치 변화가 암 진행, 조직학적 등급,^{치료 반응과} 상관관계가 있음을 보여주^{었습니다.} 따라서 암 샘플에서 히스톤 PTM 분석은 새로운 진단 및 예후 바이오마커와 이른바 에인 약물의 잠재적 표적을 식별하는 데^{중요합니다.}

세포주 및 임상 샘플에서 히스톤 PTM 분석에 매우 일반적인 방법은 면역블롯팅, 면역조직화학, 효소 결합 면역흡착법(ELISA⁾⁹과 같은 항체 기반 기법에 의존합니다. 그러나 항체 기반 방법은 교차 반응성 또는 반대로 에피토프 마스킹 등 여러 제한 문제를 겪^습니다. 교차 반응성은 항체가 유사한 에피토프를 가진 의도치 않은 표적에 결합하여 잠재적인 위양성을 초래할 때 발생하며, 에피토프 마스킹은 인접 잔기에 다른 변형이 존재하여 특정 에피토프(히스톤 PTM 또는 변이)를 놓치는 것을 의미합니다. 더불어, 항체를 이용한 히스톤 변형 분석에 필요한 조직량은 종종 많은데, 이는 동시에 검출할 수 있는 PTM의 수가 제한적이기 때문에, 다중화 분석을 위해 여러 조직 조각을 처리해야^합니다. 질량분석법(MS)은 항체 기반 접근법의 한계를 극복하며 히스톤 PTM과 변이체 프로파일링의 선택적 방법으로 부상했습니다 ^5,8. MS는 펩타이드와 단백질의 이론적 질량과 실험적으로 측정된 질량 간의 질량 차이(Δm, 델타 질량)를 검출하는 데 의존합니다. 이 방법은 PTM과 변이를 사전 지식 없이도 식별하고 정량화할 수 있어 편향 없이, 포괄적이며, 정량적입니다. 이로 인해 MS는 암 및 기타 병리학적 상태에서 히스톤 PTM 변화의 민감하고 정확한 분석에 특히 가치가 있습니다⁸.

여기서는 임상 샘플에서 히스톤 추출을 위한 최적화된 프로토콜과 MS 기반 히스톤 PTM 프로파일링, 이후에는 epi-proteomics 워크플로우를 결합한 방식을 설명합니다. 환자 생검은 주로 신선한 냉동(FF) 샘플, 최적 절단 온도(OCT) 냉동 샘플, 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 샘플로 보관됩니다¹². 신선한 생검은 보존 배지¹³ 없이 액체 질소 또는 미리 냉각된 이소펜탄에 급동하는 반면, OCT 냉동 생검은 주로 폴리비닐 알코올과 폴리에틸렌글리콜로 구성된 수용성 냉동 보호 매체를 포함하여 조직 절단을 용이하게 합니다^. 반면, FFPE 샘플은 포르말린에 고정되어 파라핀에 내장되어 임상 표본에서 가장 일반적인 보관 방식을 대표하며, 상온에서 수년간 보관할 수 있어 저온 또는 초저온에서의 비용이 많이 드는 유지보수를 피할 수 있습니다¹⁵. 보존 첨가물이 없기 때문에 급동생검은 히스톤 추출을 위해 직접 처리할 수 있으며, OCT 냉동 및 FFPE 생검은 매개체 내비/고정제 제거 초기 단계가 필요합니다. FFPE 샘플은 또한 광범위한 단백질 탈가교 및 항원 회출이 필요합니다.

이 프로토콜은 신선 냉동, OCT 임베드, FFPE 임상 샘플에서 히스톤을 추출하는 상세 방법을 개괄하며, 각 샘플 보존 유형과 관련된 구체적인 도전 과제를 고려하여 하위 MS 분석을 위한 충분한 양과 품질을 보장합니다(1단계). 임상 샘플에서 정제된 히스톤은 변성 조건에서 단백질 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 분리한 후 유도체화 단계를 거쳐, 효소적으로 분해되어 적절한 길이(4-15 아미노산)의 펩타이드를 생성하여 하향식 질량분석법¹⁶(단계 2)을 사용합니다. 더 구체적으로, 히스톤은 ArgC 유사 전략으로 소화되는데, 보통 변형되지 않은 라이신(K)과 아르기닌(R)의 C-말단을 절단하는 트립신이, 이전에 프로피온 무수물(PRO)로 변형되지 않고 단일메틸화된 라이신이 화학적 아일화를 수행함에 따라 아르기닌의 C-말단에서만 절단되도록 유도됩니다. 다음으로, Arg-C 유사 소화 히스톤 펩타이드는 N-말단 꼬리에서 페닐 이소시아네이트(PIC)를 첨가하여 아실화됩니다. 이러한 추가 유도화는 펩타이드 소수성을 높이고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 통해 짧은 히스톤 펩타이드의 더 나은 분리를 가능하게 하여 등압 펩티도폼^17,18(단계 3)의 식별 및 정량화를 향상시킵니다. 여기서 설명한 방법들은 암 후생유전학 연구에서 MS 기반 히스톤 프로파일링의 힘을 강조합니다.

프로토콜

신선 냉동 및 OCT 냉동 조직 생검은 밀라노 유럽종양학 연구소에서 수술을 받는 환자들의 동의 하에 이루어졌으며, FFPE 생검은 밀라노 카를로 베스타 신경학 연구소에서 수술을 받는 환자들로부터 취득되었습니다. 이 연구는 유럽종양학연구소 윤리위원회(연구 UID 2550)와 카를로 베스타 신경학연구소(연구 CET 39/24)의 승인을 받았습니다.

1. 환자 유래 조직에서의 히스톤 추출(그림 1A)

참고: 대표적인 종양 세포 집단에서 히스톤을 분석하고 표본 간 변동성을 줄이기 위해, 종양 세포수가 최소 50% 이상이고 괴사 부위 및/또는 광범위한 면역 침윤이 없는 임상 생검을 사용하는 것이 권장됩니다.

1. 신선 냉동 조직에서 히스톤 농축 (예상 소요 시간: 60분)
   참고: 모든 동작은 얼음 위에서 수행해야 합니다.
   1. 조직을 얼음 위에 녹이고 약 20-30mg 크기의 조직 조각을 잘라내세요. 보통 약 2 mm³ 크기에 해당합니다.
   2. 샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 가위로 조직을 작은 조각으로 잘게 만듭니다(재료표).
   3. 재료표에 명시된 프로테아제 억제제를 새로 보충한 핵 분리 버퍼 1mL(표 1)를 추가합니다. 그 후에 잘 섞으세요.
   4. 샘플을 Dounce 균질기(재료표)로 옮기세요.
      참고: 큰 조직 조각이 있을 때는 p1000 팁을 사용해 가위로 팁을 자르면 샘플을 더 잘 채취할 수 있습니다.
   5. 먼저 LOOSE, 그다음 TIGHT 공자(재료표)를 사용해 조직 조각이 육안으로 보이지 않을 때까지 균질화합니다.
   6. 균질화된 샘플을 100 μm 세포 체(재료표)로 여과하여 조직 이물질을 제거합니다.
   7. p200으로 피펫을 위아래로 격렬히 움직여 원형질막을 녹이고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
   8. 벤치탑 원심분리기를 사용해 2,300 x g 원심분리기(4°C)에서 15분간 원심분리하여 세포 핵을 펠릿 처리합니다(재료표).
   9. 상청액을 버리고 핵 펠릿을 50-100 μL 핵 격리 버퍼에 재현탁하며, 핵막을 용해하기 위해 0.1% SDS를 보조합니다(재료표).
   10. 250 U의 벤조나제 뉴클레아제를 추가하여 핵산을 소화하고, 잘 섞은 후 37°C에서 2분간 배양합니다(재료표).
       참고: 샘플이 여전히 점성이 있을 경우, 음파 세척(설정: 10분 30초 켜짐/30초 꺼짐; 출력: 높음; 온도: 4 °C)에서도 초음파 검사를 수행할 수 있습니다. 이 단계 이후에는 샘플을 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
2. OCT 샘플에서의 히스톤 농축 (추정 소요 시간: 90분)
   참고: 이 프로토콜은 20-60 mg 조직에 해당하는 10 μm 두께의 OCT 절편 4개 중 5개에 최적화되어 있습니다. 하지만 조직 절개 개수는 임상 생검 유형과 전체 조직 면적에 따라 달라집니다. 임상 표본이 부족함을 고려할 때, 시작 조직에서 적은 양의 추출이 가능하지만, 이는 히스톤 변형 검출 감소를 초래할 수 있습니다.
   1. 약 20-60 mg 조직에 해당하는 두께의 10 μm 조직 절편 4개 중 5개를 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
   2. 70% EtOH(표 1)를 얼음처럼 차갑게 차갑게 넣은 1mL로 4°C에서 회전 휠(재료표)에서 2분간 세척합니다.
   3. 벤치탑 원심분리기에서 16,000 x g 압력으로 4 °C에서 2분간 원심분리기를 사용합니다.
   4. 1.2.2와 1.2.3 단계를 총 3번 반복합니다.
   5. 샘플을 1mL의 이중 증류수(ddH_2O)에 4 °C에서 회전시키며 2분간 재수화합니다(재료표).
   6. 벤치 상판 원심분리기에서 16,000 x g 압력으로 4 °C 온도에서 2분간 원심분리기를 사용했습니다 (재료표).
   7. 1.2.5와 1.2.6 단계를 1개의 PBS(재료표)로 두 번 반복합니다.
   8. 신선한 냉동 샘플을 사용하여 농축 프로토콜 1.1.2단계로 진행하세요.
3. FFPE 샘플에서 히스톤 추출 (예상 소요 시간: 8시간)
   참고: 설명된 프로토콜은 약 20-60 mg의 조직에 해당하는 두께 10 μm FFPE 4개의 절편을 위해 개발되었습니다. 대부분의 MS 히스톤 변형 분석에서 이 양은 과도하며, 물질이 제한되지 않을 때 안전한 출발점이 됩니다. 그러나 임상 표본 분석 시 이용 가능한 조직량이 적은 점을 고려할 때, 더 적은 시작 물질을 사용할 수도 있습니다. 적은 시작 물질 사용은 가능하지만, 일반적으로 저농도 히스톤 변형(예: H3K27ac 또는 다중 메틸화 H3K27/K36 펩타이드)의 정량 강인성을 감소시키며, 이 효과는 조직 유형과 샘플마다 달라질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리 연구실은 이전에 MS 기반 히스톤 PTM 프로파일링이 유방암 FFPE 샘플의 레이저 미세해리 조직 부위(최대 1,000개 세포에 해당)에서 성공적으로 수행할 수 있음을 보여주었습니다¹⁸.
   1. 약 20-60 mg 조직에 해당하는 두께의 10 μm FFPE 절편 4개를 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
   2. 샘플에 파라핀 용해제를 1mL 첨가하고, 최대 속도로 30초간 소용돌이를 돌려 파라핀이 완전히 녹을 때까지 진행합니다.
      주의: 파라핀 용해 시약은 돌연변이성, 발암성 및 인화성 있으므로 반드시 화학 후드 아래에서 사용해야 합니다.
      참고: 파라핀 용해는 육안으로 파라핀 조각이 보이지 않고, 파라핀 용해제가 흰색을 띠고 균질한 색을 띠면 발생합니다.
   3. 벤치탑 원심분리기에서 16,000 x g 3분간 RT 검사 후 상청액을 버립니다. 상원액 제거 시 원치 않는 샘플 흡인을 방지하기 위해 진공 펌프/피펫은 더 작은 팁(예: p200, p10 팁)으로 덮을 수 있습니다.
   4. 1.3.2와 1.3.3 단계를 추가로 세 번(총 4회) 반복하여 완전한 파라핀 제거를 보장합니다. 또는 완전히 탈파라핀된 샘플을 무게로 재어 처리된 조직량을 표시할 수 있습니다.
   5. 95% EtOH 용액 1mL를 추가하고 최대 속도로 30초간 소용돌이를 사용하여 완전한 조직 부현탁을 보장합니다.
   6. 벤치탑 원심분리기에서 16,000 x g 3분간 RT 검사 후 상청액을 버립니다. 또는 건조한 샘플을 무게로 재어 처리된 건조 조직의 양을 나타내는 지표로 삼을 수도 있습니다.
   7. 1.3.5 및 1.3.6 단계를 70%, 50%, 20% EtOH와 ddH_2O로 반복하여 샘플을 재수화합니다.
   8. 추출 버퍼 200 μL을 추가합니다(표 1).
      참고: 큰 조직 조각이 있다면 가위로 작은 조각으로 잘라주세요. 조직의 양에 따라 샘플 용해를 위해 추출 완충제의 양을 더 적게 또는 더 많이 추가할 수 있습니다. 특히 작은 펠릿을 100 μL 미만의 추출 버퍼 부피에 재현탁하는 경우, 초음파 장치는 초음파 장치(재료표)를 사용해 수행할 수 있습니다(30초 ON/30초 OFF: 높음, 10 사이클).
   9. 3mm 마이크로팁을 사용한 디지털 소니파이어(재료표)를 이용해 소닉 검사(>15 사이클, 5초 켜짐/2분 꺼짐, 출력 15-30%)를 사용하여 추출 버퍼 내 조직을 균질화합니다.
      참고: 샘플은 용액 내에 조직 입자가 보이지 않고 추출 완충제가 균일하고 탁하지 않은 색상을 보일 때 적절히 균질화된 것으로 간주될 수 있습니다. 초음파 사이클 동안 샘플을 RT에 보관하세요. 얼음은 추출 완충제 내 SDS 침전을 유발하여 조직 균질화를 저해할 수 있습니다. 완전한 조직 용해와 단백질 추출을 위해서는 적절한 초음파 검사가 매우 중요합니다. 마이크로팁을 샘플 튜브 내에서 올바른 높이에 놓으세요(튜브 바닥에 닿지 않아 플라스틱 입자가 방출되거나, 공기 추출 완충 인터페이스에 위치해 거품과 기포가 생기지 않도록 해야 합니다).
   10. 균질화 후에는 샘플을 95°C에서 45분간 열믹서에서 배양합니다. 15분마다 튜브 뚜껑을 열어 포름알데히드가 증발하도록 하세요.
   11. 샘플을 65°C에서 4시간 동안 열믹서에서 배양합니다. 20-60분마다 뚜껑을 열어 포름알데히드가 증발하도록 하세요.
   12. 16,000 x g 원심분리기를 벤치 상판 원심분리기에서 RT로 1분간 돌려 넣고 상원액을 새 튜브로 옮깁니다.
       참고: 이 시점에서 샘플은 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.

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2. SDS-PAGE와 겔 내 소화를 통한 히스톤 해소

1. SDS-PAGE (그림 1B; 예상 소요 시간: 2시간)
   1. 히스톤 순도를 평가하고 그 양을 추정하기 위해, 히스톤 추출물의 1/10을 17% 폴리아크릴아마이드 젤(SDS-PAGE; 표 1) 그림 1B에 나타난 것처럼 알려진 양의 재조합 히스톤과 함께.
      참고: 히스톤 추출물의 1/10 대신 고농도의 세제를 견딜 수 있는 분석법(예: 비신코닉산(BCA) 단백질^{분석법 19} 을 로딩할 수 있습니다. 다만, 전체 단백질에 대한 히스톤 풍부도는 신선 냉동, OCT 냉동, FFPE 샘플 간에 크게 다를 수 있으며, 히스톤 양의 정량은 SDS-PAGE에만 기반할 수 있습니다. 재조합 히스톤 H3.1(재료표)의 1, 0.5, 0.25 μg를 참조로 적재하여 히스톤 양을 보다 정확히 정량화할 수 있습니다.
   2. 샘플을 리튬 도데실 황산염(LDS) 로딩 버퍼와 혼합하거나, SDS-PAGE용 동등한 로딩 버퍼(예: Laemmli 버퍼)와 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 혼합합니다. 재료표) 최종 농도는 10 mM입니다.
   3. 변성 샘플을 95°C에서 5분간 열믹서에서 가열합니다.
   4. SDS-PAGE에서 단백질 분리가 완료된 후, 젤에 Coomassie 염색법(재료표)을 사용해 염색합니다.
   5. 임상 샘플에서 히스톤 밴드를 시각 또는 소프트웨어 지원으로²⁰ 개 시각 정량으로 추정하며, 알려진 양에 로딩된 재조합 히스톤 H3와 비교합니다.
2. 히스톤 내 젤 소화 (그림 2; 예상 기간: 2일)
   참고: ArgC 유사 소화는 MS PTM에 사용되는데, 이는 표준 트립신 소화가 라이신과 아르기닌 아미노산의 빈도가 높아 펩타이드 검출과 PTM 식별에 방해가 되기 때문에 과도하게 짧은 펩타이드를 생성하기 때문입니다. 라이신을 화학적으로 변형함으로써 이 부위의 트립틱 절단이 방지되어, 아르기닌의 C-말단에서만 절단이 발생하며, 서열 내에 변형된 라이신을 포함하는 더 긴 펩타이드(4-15개의 아미노산)를 생성합니다; 전반적으로 이 프로토콜은 MS의 변형 히스톤 펩타이드의 검출 및 측정을 용이하게 하며, 수많은 논문에서 상세히 설명되었습니다^8,17,21.
   선택 사항: 내부 표준(예: 무거운 표지된 스파이크인, 합성 표지된 펩타이드²²MS에서 보다 정확한 펩타이드 정량을 위해 히스톤 샘플과 1:1 비율로 혼합할 수 있습니다(그림 2B).
   1. Step 2.1.5에서 수행된 추정 히스톤 정량에 따라 17% 폴리아크릴아마이드 겔에 3-5 μg의 히스톤 샘플을 투여합니다(그림 2B).
   2. SDS-PAGE 후에는 Coomassie 염색으로 젤을 염색하여 단백질을 시각화합니다.
      참고: LC-MS/MS 분석에 영향을 줄 수 있는 오염을 방지하기 위해, 케라틴이 강한 MS 오염물질이므로 케라틴이 없는 환경, 예를 들어 전용 후드에서 다음 단계를 수행하는 것이 권장됩니다.
   3. 핵심 히스톤 단백질의 분자량에 해당하는 젤 밴드(겔 밴드는 10에서 18 kDa 사이, 각 핵심 히스톤별 분자량은 다음과 같습니다: H3 약 17 kDa, H2A-H2B 약 14 kDa, H4 약 11 kDa)를 사용하여 메스(재료표)를 사용하고, 약 1 mm³ 단위로 밴드를 절단합니다.
   4. 메스의 도움을 받아 젤 조각을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 겔 조각을 완전히 덮으려면, 아래에 표시된 부피를 증가시켜 시약의 화학양론을 유지할 수 있습니다.
   5. 겔 조각을 염색하기 위해 ddH₂O에 50% 아세토니트릴(ACN) 용액을 첨가하여 탈색합니다(표 1). 1,400rpm으로 설정된 열믹서에 10분간 RT한 후 상원액을 버립니다.
   6. 2.2.5 단계를 반복하여 젤 조각이 완전히 탈색될 때까지 반복합니다.
   7. 젤 조각을 100% ACN을 첨가해 탈수하세요 (재료표). 1,400rpm에서 혼합 상태로 10분간 RT로 인큐베이팅한 후 상상액을 버리세요.
   8. 2.2.7 단계를 반복하여 젤 조각이 하얗고 단단해 완전히 탈수될 때까지 반복합니다.
   9. 젤 조각을 진공 원심분리기에서 RT로 5분간 건조하세요(재료표).
      참고: 시스테인에서는 히스톤이 적으며(히스톤 H3의 96, 110 위치에는 두 개의 시스테인만 발견됩니다(UniprotKB ID P68431), 히스톤 H2B의 154 위치에는 단 한 개의 시스테인만 발견됩니다(UniprotKB ID B4DR52)). 또한, 이 시스테인들은 하향식 MS에서 ArgC 유사 소화로 검출되지 않는 펩타이드 내에 존재하여, 티올 그룹²³ 의 화학적 부가상물이 MS 히스톤 분석에서 인위물이 되지 않으며, 설명된 프로토콜에서는 시스테인 환원 및 알킬화 단계가 수행되지 않습니다.
   10. 각 튜브에 7.7 M 프로피온 무수물(PRO) 용액 15 μL (재료표)와 1M 중탄산암모늄 탄산염(AmBic) 26 μL (재료표)를 추가하고, 350 rpm으로 설정된 열믹서에서 37 °C에서 10분간 배양합니다.
       참고: 반응성 버퍼에 용해된 무수물은 증발하기 쉽므로, PRO와 AmBic의 마스터 믹스를 준비하지 말고, 각 샘플에 개별적으로 첨가하여 각 튜브 내 PRO의 적절한 농도를 일정하게 유지하세요.
   11. 겔 조각을 1M AmBic(권장 용량: 80 μL)을 추가하여 완전히 덮고, 37°C에서 1,400 rpm에서 4시간 동안 혼합하여 열믹서에서 샘플을 배양합니다. 그 후에는 모든 액체를 제거하세요.
       참고: 1 M AmVic은 기본 pH를 유지하기 위해 첨가되며, 이는 PRO에 의해 변형되지 않은 단일메틸화된 라이신의 프로피오닐화 촉매에 이상적입니다.
   12. ddH_2O로 세 번 세척하고, 그 사이에 샘플을 RT에서 10분간 배양시키면서 1,400rpm의 열믹서를 섞습니다. 세척 후에는 액체를 버리세요.
   13. ACN 50%를 추가하고 1,400rpm에서 열믹서에서 15분간 RT에서 배양하고, 액체는 버리세요.
   14. 젤 조각을 완전히 탈수시키고 100% ACN을 첨가한 후 1,400rpm에서 15분간 RT 온도에서 열믹서에서 배양하세요. 그 후 액체는 버리세요.
   15. 2.2.14 단계를 반복하여 젤 조각이 하얗고 마른 상태가 될 때까지 반복합니다.
   16. 진공 원심분리기에 5분간 RT에서 건조 젤 조각을 만지세요.
   17. 각 샘플에 트립신 용액 4 μL(표 1)과 소화 완충액 20 μL(표 1)을 추가하고, 얼음에서 10분간 배양하여 트립신이 젤 조각에 흡수되도록 합니다.
       참고: 이 배양은 농축된 트립신 용액과 소화 완충제(50 mM AmBic in ddH₂O, 트립신 절단에 이상적인 기본 pH 생성)를 사용하여 수행되며, 효소가 37°C에서 활성화되기 전에 젤 조각에 흡수되도록 합니다.
   18. 농축된 트립신이 완전히 흡수되면, 젤 조각을 추가 소화 완충제(기준 용량: 80 μL)로 완전히 덮고, 37°C에서 열믹서에서 하룻밤 배양합니다.
   19. 젤 조각에서 소화된 펩타이드를 추출하려면, 100% ACN 100 μL을 추가한 후 1,400 rpm에서 20분간 열믹서에서 RT 배양합니다.
   20. 상청액을 채취하여 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   21. 겔 조각에 100% ACN 80 μL을 첨가한 후 1,400rpm에서 열믹서에서 10분간 RT 배양합니다.
   22. 상원액을 수집하여 2.2.20단계에서 수집한 것과 함께 모은 후, 진공 원심분리기에서 펩타이드를 1에서 5 μL 사이의 부피로 농축합니다.
       참고: 진공 원심분리기를 사용하면 유기 용매(ACN)가 증발할 수 있습니다. 하지만 이 단계에서 샘플을 완전히 건조시키지 않는 것이 권장되며, 이는 다음 유도 단계에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 샘플이 마르면 ddH_2O에 다시 담근 후 5분간 물욕에서 초음파 처리하세요.
   23. 각 샘플에 ddH_2O를 첨가하여 최종 부피 15 μL로 만들고, 그 다음 1 μL 1M 트리에틸암모늄 중탄산염 2 μL 및 페닐 아이소시아네이트(PIC) 용액 3 μL(표 1)을 추가하여 350 rpm에서 37 °C에서 90분간 배양합니다.
       주의: PIC는 돌연변이 유발 및 발암성이므로 화학적 보호막 아래에서 다루는 것이 권장됩니다. PIC는 매우 반응성이 높고 휘발성이 높기 때문에 트리에틸암모늄 중탄산염과 PIC의 마스터 믹스를 준비하는 것은 피하는 것이 권장되지만, 정확한 PIC 농도의 존재를 위해 각 시약을 개별적으로 첨가하는 것이 권장됩니다.
   24. 각 튜브에 1% 트리플루오로아세트산(TFA) 8μL 첨가; 재료표) PIC로 인한 파생화를 막기 위해서입니다.
   25. 각 샘플을 100 μL의 버퍼 A(표 1)로 희석한 후, C18 스테이지 팁(²⁴ 에 설명된 대로 준비하거나 여러 공급업체에서 구매)에 적재합니다.
   26. 샘플을 2,100 x g 크기에서 4°C, 스윙 로터 원심분리기에서 10분간 돌려 히스톤 펩타이드가 C18 수지에 결합하도록 합니다.
       참고: 샘플은 스테이지 팁에 4°C에서 몇 달간 보관할 수 있습니다.
   27. C18 단계 팁에 30 μL의 용출 버퍼(표 1)를 추가하고, 팁을 새로운 1.5 mL 튜브에 삽입합니다. 1,000 x g 에서 4°C의 벤치 위 원심분리기에서 10분간 스핀하여 히스톤 펩타이드를 용출합니다.
   28. 진공 원심분리기를 사용해 샘플을 1에서 3 μL 사이의 부피로 농축한 후 1% TFA를 첨가하여 최종 6 μL의 부피를 만듭니다.
   29. MS 분석을 위해 96웰 마이크로플레이트에 5 μL 펩타이드 용액을 적재하고 밀봉 매트로 밀봉합니다(재료표).

3. HPLC-MS/MS 및 데이터 분석 (그림 3)

참고: 여기서 설명한 매개변수는 EASY 스프레이 컬럼을 통해 Q Exactive Plus Orbitrap 질량분석기(재료표)와 연결된 ESAY-nLC 1200 액상 크로마토그래피 시스템에 적합하지만, 유사하거나 동등한 기기를 임시 매개변수로 사용할 수도 있습니다.

1. HPLC-MS/MS (추정 소요 시간: 샘플당 90분)
   1. 2.2.29단계의 5μL 히스톤 펩타이드 중 3μL(SDS-PAGE의 히스톤 정량 기준 약 0.25-0.8 μg에 해당)를 C18 나노컬럼(재료표)에 500 nl/min의 일정 유량으로 버퍼 A에 주입합니다.
   2. 10%-45% 버퍼 B를 250 nL/분의 유량으로 55분 선형 구배하여 펩타이드를 분리합니다.
   3. 데이터 의존 모드(DDA)에서 MS/MS 데이터를 획득하여 전용 소프트웨어 패키지(Table of Materials)를 사용해 MS1과 MS2 사이를 자동으로 전환합니다.
      참고: 획득 및 일반 설정에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
2. RAW MS 데이터 분석
   참고: 이 프로토콜에서는 히스톤 PTM의 정량화가 EpiProfile이라는 개방형 스크립트(https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family)를 사용하여 수행되며, 사용자 친화적이며 H3 및 H4 라이신 메틸화 및 아세틸화 분석과 같은 표준 분석에 적합합니다. 그러나 EpiProfile은 경험 많은 사용자가 덜 표준화된 변형이나 다양한 샘플 준비 프로토콜에 대한 분석을 수행하도록 맞춤화할 수 있습니다. EpiProfile은²⁵ 번을 실행하려면 MATLAB 라이선스가 필요합니다.
   1. 획득한 RAW 데이터를 EpiProfile 2.0 소프트웨어(PRO-PIC 버전)²⁵ (재료표)로 분석하고, histone_normal 무라벨 분석, SUPER-SILAC 스파이크인 시 histone_SILAC 옵션을 선택하여 히스톤 펩타이드를 정량화합니다. ndebug = 0을 설정하세요.
   2. 모든 히스톤 펩타이드(예: H3_3-8)에 대해, EpiProfile이 계산한 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 해당 펩타이드에 대해 계산한 모든 XIC의 합으로 나누어 각 수정된 펩티도폼(예: H3_3-8 unmod, me1, me2, me3)의 상대 풍부도(%RA)를 계산합니다.
      참고: 선택적으로, EpiProfile에서 계산된 XIC는 MS 스펙트럼 검사와^18,26에 설명된 전용 스펙트럼 레이아웃을 이용한 히스톤 펩타이드의 수동 정량을 통해 검증할 수 있습니다.
   3. 각 펩티도폼에 대해, 각 천연 경펩타이드의 %RA를 SUPER-SILAC 혼합물에서 유래한 해당 무거운 펩타이드의 %RA로 나누어 경량 대 중량(L/H) 비율을 계산합니다.
   4. L/H 비율을 로그 척도로 변환하세요. 샘플 간 펩티도폼 풍부도의 유의미한 차이를 강조하기 위해 통계 분석을 수행할 수 있으며, 모든 샘플의 L/H 비율을 그림 4처럼 히트맵과 산점도로 시각적으로 표현할 수 있습니다.

표 2: 이 프로토콜에서 사용되는 시스템에서 LC-MS/MS에 사용되는 획득 설정 및 일반 설정 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

우리는 앞서 언급한 프로토콜에 따라 신선 냉동 및 OCT 냉동 유방암 샘플과 FFPE 수막종 샘플에서 히스톤 추출을 수행했습니다. 그림 1A에 나타난 것처럼, 냉동 시료의 경우 OCT가 있을 때 제거하고, 순한 세제(0.1% Triton step 1.1)가 포함된 핵 분리 버퍼에서 샘플을 균질화하여 핵 분리를 가능하게 했습니다. 다음으로 0.1% SDS를 첨가하여 히스톤을 추출했습니다; 대신 FFPE 표본의 경우, 샘플을 파라핀 제거, 재수화, 교차 분리 처리하고, 매우 변성적인 조건에서 단백질을 추출했습니다(추출 버퍼는 2% SDS; step1.3). 히스톤 양과 품질을 평가하기 위해, 두 개의 유방암 신선 냉동 및 OCT 냉동 샘플에 대한 핵추출물의 1/10과 수막종 FFPE 샘플 두 개의 총 단백질 추출물의 1/10을 17% 폴리아크릴아마이드 SDS-PAGE 겔에 적재하여 분리하고, 로딩 기준으로 1, 0.5,...

토론

여기서 설명한 방법은 신선 냉동, OCT 냉동, FFPE 생검으로 저장된 임상 샘플에서 히스톤을 효율적으로 분리하여 MS 분석을 통해 변형 지형을 프로파일링하는 간단하고 견고한 작업 흐름을 제공합니다. 이후 SDS-PAGE 분리와 PRO-PIC 인겔 소화를 통한 샘플 준비 프로토콜은 세제, 염 및 기타 MS^{오염물질의} 효과적인 제거를 보장하며, 히스톤 라이신 아세틸화 및 메틸화의 정확하고 견고한 정량을 달성합니다. 중요하게도, 페닐 이소시아네이트(PIC)에 의한 N-말단 유도화는 H4_20-23 펩타이드와 H3_3-8 펩타이드¹⁷과 같은 짧은 히스톤 펩타이드의 MS 검출을 개선하며, 라이신 포밀화, 크로토니화, 석시닐화, 말로니화, 하이드록시이소부티릴화, 글루타릴화, 락틸화와 같은 덜 드문 아실화 분석에도 사용할 수 있습니다³⁴. 여기서는 히스...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강>화학
조직학을 위한 Histolemon RS	카를로 에르바	454912	2.5L
아세토니트릴 (ACN)	카를로 에르바	412341	1L
탄산암모늄 (AmBic)	시그마 올드리치	A6141	500g
과황산암모늄(APS)	WDR	1.012.010.500	500g
아프로티닌 프로테아제 억제제	시그마 올드리치	A1153	5mg
벤조나제 뉴클레아제	메르크	E1014	25 KU
비사크릴아미드 30% 37.5 M	AppliChem	APA36261000	1 L
버퍼 A 0.1% 개미산 함유 dtH2O 내	써모피셔 사이언티브	10229884	500 mL
버퍼 B 0.1% 개산/80% 아세토니트릴, ddH2O	써모피셔 사이언티브	15431423	500 mL
C18 수지	머 크	66883-U	직경 47 mm
쿠매시 인스턴트 블루	앱캠	AB119211	1 L
디티오트레이톨(DTT)	WDR	441496P	25g
에탄올	카를로 에르바	414608	2.5L
Leupeptin  프로테아제 억제제	시그마-올드리치	L8511	5mg
N,N,N′,N′-테트라메틸 에틸렌디아민 (TEMED)	시그마 올드리치	1.107.320100	100 mL
NuPAGE LDS 샘플 버퍼	인비트로젠	NP0007	4배
PBS - 인산염 완충 식염수	마이크로젬	TL1006	500 mL
페닐 이소시아네이트 (PIC)	시그마 올드리치	185353	100g
페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 프로테아제 억제제	시그마 올드리치	P7626	1 g
프로피온 무수물 (PRO)	시그마 올드리치	240311	50g
재조합 히스톤 H3.1 인간	뉴잉글랜드 바이오랩스	M2503	1 & 마이크로; g/µ L
시퀀싱 등급 트립신	프로메가	V5113	100 ug
부티르산나트륨(NaBut) 히스톤 탈아세틸라제 억제제	머 크	B5887	5g
도데실황산나트륨(SDS)	시그마 올드리치	L3771	100g
트리에틸암모늄 중탄산염	시그마 올드리치	T7408	100 mL
트리플루오로아세트산 (TFA)	써모피셔 사이언티브	28904	1x10mL
트리스-HCl	시그마 올드리치	T3253	100g
트리톤 X-100 세제	시그마-올드리치	X100RS	5g
<강>키트/장비/소프트웨어
96웰 마이크로플레이트	코 닝	PCR-96-FS-C	비열성, RNASE/Dnase 없는 성분
저울	컨	19024
벤치탑 원심분리기	하레우스 바이오퓨지 연구소	피코, 23396
바이오럽터 초음파 장치	디아게노드
브랜슨 디지털 소니파이어 250	에머슨
셀 스트레너 100 및 마이크로; m	송골매	352360
컨센트레이터 플러스	에펜도르프	5305000509
Dounce 균질화 장치(예: g  도우스, 휘튼...)	도운스, 휘튼		1 mL 조직 분쇄기
EASY-nLC 1200 액체 크로마토그래피	써모피셔 사이언티브
EASY-Spray HPLC C18 컬럼	써모피셔 사이언티브	ES902	2 & 마이크로; m, 100  & Aring;, 75 µ m x 25cm
EpiProfile2.0 스크립트	https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
피지 소프트웨어	https://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLAB	https://www.mathworks.com
맥스콴트 검색 엔진	https://maxquant.net/maxquant/
페스텔 A (루스)	도운스, 휘튼
페스텔 B (타이트)	도운스, 휘튼
Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS 시스템	써모피셔 사이언티브
회전 바퀴	써모피셔 사이언티브	11496548
메스	키아토	13010
가위	써모피셔 사이언티브	15207266
실링 매트	코 닝	AM-96-PCR-RD	자동화 호환
스윙아웃 로터 원심분리기	벡만 쿨터	알레그라 X-15R
열믹서 콤팩트	에펜도르프	5350
소용돌이	PBI	바이브로믹스
엑스칼리버 소프트웨어	써모피셔 사이언티브	옵톤-30965