LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

요약

이 프로토콜은 광유전학 도구를 통해 핵세포질 수송을 추적하여 얻은 살아있는 세포 이미징 데이터의 자동 분석을 효율적으로 설정하고 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

핵세포질 수송(NCT)은 세포 항상성을 유지하는 데 필수적이며, 그 붕괴는 신경퇴행성 질환 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다. 이는 NCT를 모니터링하고 정량화할 수 있는 도구를 개발해야 할 필요성을 강조합니다. 이러한 도구 중 빠르고 가역적인 광유전학 프로브인 LECY(광 유도성 핵 수출 시스템) 및 LINuS(광 유도성 핵 국소화 신호)를 사용하면 살아있는 세포에서 NCT 역학을 측정할 수 있습니다.

기존 간행물에서는 라이브 셀 이미징에서 LEXY 및 LINuS 구조체의 transfection 시 핵 및 세포질의 형광 프로브 신호의 수동 분할 및 정량화에 대해 설명합니다. 그러나 transfection과 manual segmentation은 모두 분석할 수 있는 세포의 수를 제한하며 잠재적인 사용자 종속 오류로 인해 부정확성이 떨어질 수 있습니다. 광유전학이 제공하는 빠른 속도와 가역성은 원칙적으로 NCT 역학의 변화를 감지하는 데 높은 감도를 허용해야 하지만, 이는 충분한 수의 세포에 대한 수집 매개변수와 분석에 달려 있습니다.

따라서 안정적인 세포주를 생성하기 위해 LEXY 및 LINuS를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 구축하고, 라이브 이미징 마커 및 제어 조건을 테스트하고, 수백 개의 세포를 분석할 수 있는 반자동 이미지 분석 파이프라인을 구현했습니다. 이 분석 방법은 개방형 액세스 소프트웨어인 FIJI를 사용하며, 생물정보학 초보자도 액세스할 수 있으며, 고급 컴퓨터 설정이 필요하지 않습니다. 여기에서는 샘플 준비에서 라이브 셀 이미징 획득 및 자동 분석에 이르기까지 핵 수출을 모니터링하기 위한 이러한 광유전학 도구의 예로 LEXY를 설정하는 단계별 프로토콜을 제공하는 동시에 모든 실험실의 다른 조건, 제어 또는 모델에 맞게 프로토콜을 조정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 플라스미드와 세포주는 과학계에서 사용할 수 있게 되어 이 방법의 접근성을 더욱 높일 것입니다.

서론

주요 세포 경로를 조절하고 세포 항상성을 유지하기 위한 핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport, NCT)의 중요성은 지난 몇 년 동안 잘 연구되어 왔습니다¹. 그 결과, NCT의 역학 ^2,3,4를 연구하기 위한 몇 가지 도구가 생성되었습니다. 이러한 도구 중 2014년과 2016년에 각각 발표된 LINuS⁵ 및 LEXY⁶ 광유전학 프로브는 살아있는 세포에서 NCT를 모니터링할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 형광 리포터의 유도 가능한 내보내기(LEXY) 또는 가져오기(LINuS)를 따르도록 설계된 이러한 도구는 청색광 노출에 의해 유도되고 가역적입니다.

요컨대,이 두 개의 작은 프로브는 식물 Avena sativa⁷의 단백질 광 트로핀 -1에서 LOV2 도메인의 특성을 사용합니다. 청색광이 없을 때 LOV2 영역의 Jα 나선은 광경화되어 단백질 코어에 내장됩니다. Jα 나선은 빛 자극에 반응할 수 있기 때문에 청색광에 의한 조명은 구조적 변화를 유도하고 이후 LOV2 영역에서 Jα 나선의 도킹 해제를 유도합니다. LEXY 및 LINuS의 저자는 이 광 감도를 사용하여 LINuS 및 LEXY에 대해 각각 NLS(Nuclear Localization Signal) 또는 NES(Nuclear Export Signal)를 Jα 나선에 융합했습니다(그림 1). 그 결과 생성된 도구는 청색광 조명에서 핵(LINuS) 또는 세포질(LEXY)로 전위되는 프로브입니다.

형광 이미징으로 프로브를 추적하기 위해 mCherry 형광 리포터도 구조물에 추가되었습니다. 마지막으로, 약한 NES(LINuS의 경우) 또는 NLS(LEXY의 경우)를 시스템에 추가하여 프로브가 핵과 세포질 사이의 LEXY 또는 LINuS 전좌를 관찰하지 못하게 하는 청색광 조명 전에 최종 국소화에 있지 않도록 했습니다.

그림 1: LEXY 및 LINuS 프로브의 표현. 두 프로브 모두 빛에 민감한 LOV2 도메인에 융합된 mCherry 단백질로 구성됩니다. 두 툴의 차이점은 Jα-helix에 의해 숨겨진 신호 시퀀스, 즉 LEXY용 NES와 LINuS용 NLS에 있습니다. 또한 두 프로브 모두 초기 국소화를 제어하기 위해 약한 신호 시퀀스를 가지고 있습니다: LEXY의 경우 약한 NLS이고 LINuS의 경우 약한 NES입니다. 따라서 청색광 조명에 의한 시스템 활성화는 LEXY에 대한 수출 또는 LINuS에 대한 수입을 유도하여 사용자가 핵 수출 또는 수입을 모니터링 할 수 있도록합니다. 약어: LEXY = 광 유도성 원자력 수출 시스템; LINuS = 광 유도 핵 국소화 신호; NLS = 핵 국소화 신호; NES = 핵 수출 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

mCherry 형광의 국소화는 핵과 세포질 사이의 LEXY 및 LINuS 프로브의 셔틀을 보고하므로 라이브 셀 이미징에서 추적할 수 있으므로 사용자가 NCT를 모니터링할 수 있습니다. LEXY 및 LINuS는 간단한 프로브로 사용되는 것 외에도 in vitro ^5,6,8,9 또는 in vivo^10,11의 국소화를 제어하고 관심 단백질을 연구하도록 설계할 수 있습니다.

LEXY 및 LINuS 간행물에서 제안된 정량화 방법은 프로브의 상대적인 핵 강도를 보여줍니다. 제안된 분석은 수동으로 수행되며 핵과 세포질의 관심 영역(ROI) 측정에 의존합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 프로브의 신호를 잘 표현하지만, 특히 실험과 조건이 반복되는 경우 매우 길고 지루합니다. 중요한 것은 이 방법은 설계된 구획의 작은 부분만 표시되기 때문에 정확도가 부족하다는 것입니다.

여기에서는 LEXY 및 LINuS 형광 신호 정량화를 위한 새로운 프로토콜을 제안합니다. 우리는 분석을 용이하게 하고 더 높은 정확도를 제공하는 자동화된 기술을 구현했습니다. 이렇게 하면 이러한 도구의 새 사용자를 위한 프로세스가 쉬워지고 처리량을 늘리는 데 도움이 됩니다. 당사의 정량화 프로토콜은 FIJI의 오픈 소스 TrackMate¹² 플러그인이라는 하나의 인터페이스만 사용합니다. 특히, 정량화의 신뢰성을 개선하기 위해 실시간 이미징 호환 가능한 원적외선 DNA 마커를 사용하여 TrackMate¹²를 사용하여 프로브의 형광 신호 추적 및 측정과 결합된 훈련된 컨볼루션 신경망인 StarDist¹³으로 전체 핵 분할을 수행했습니다.

그런 다음 얻은 데이터를 즉시 사용할 수 있는 제공된 스프레드시트(보충 표 S1)로 쉽게 내보내 식별된 각 핵의 상대적 핵 강도를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 Yoo 및 Mitchison¹⁴ 에서와 같이 얻은 시간 경과 곡선을 단일 지수 모델에 피팅하여 얻은 값을 그래프에 풀링하는 방법과 테스트된 다양한 조건에 대한 전송 속도를 계산하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜과 분석을 위해 제공된 스프레드시트를 통해 사용자는 제한된 생물정보학 기술로도 살아있는 세포 이미징 데이터를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 다음 프로토콜은 LEXY의 프로브로 핵 수출을 모니터링하기 위해 설명됩니다. LINuS를 조정하기 위한 설정에 대한 자세한 내용은 섹션 5에 나와 있습니다.

1. 세포 배양

참고: 이 섹션의 절차는 조직 배양 등급 후드에서 수행해야 합니다. 아래에 설명된 단계는 DMEM(또는 표시된 경우 페놀 레드가 없는 DMEM)을 사용하여 NIH/3T3 마우스 섬유아세포¹⁵ 세포주에 최적화되었으며, 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 배지로 보충했습니다( 재료 표 참조). 그러나 사용자는 다른 세포 유형에 맞게 절차를 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 transfection된 세포 또는 안정적인 세포주에 적합합니다. 그러나 논의 섹션에서 언급한 바와 같이 안정적인 세포주를 만드는 것이 좋습니다.

1. 멸균 1x PBS에 23μg/mL 콜라겐과 2μg/mL 피브로넥틴이 함유된 코팅 용액을 준비합니다. 각 라이브 이미징 접시에 코팅 용액 800μL를 추가하고( 재료 표 참조) 인큐베이터에 90분 동안 보관합니다.
2. 코팅 혼합물을 멸균 1x PBS로 세척하고 다음 날 획득할 수 있도록 배지의 라이브 이미징 접시에 60,000개의 세포를 시딩합니다.
3. 필요한 경우, 사용된 세포 유형에 가장 적합한 transfection 방법에 따라 LEXY plasmid로 세포를 transfection합니다. 이 프로토콜을 따르려면 빈 벡터와 프로브의 동시 트랜스펙션을 수행하여 LEXY:empty 벡터에 대해 1:5의 비율로 효율성을 높입니다. 어두운 상자나 알루미늄 호일로 빛으로부터 세포를 보호하고 하루 동안 자라게 하십시오.
4. 획득하기 전에 페놀 레드가 없는 배지에서 살아있는 세포 이미징과 호환되는 원적외선 DNA 마커로 세포를 염색하고 획득할 때까지 빛으로부터 완전히 보호되는지 확인합니다.
   참고: 우리의 경우 1μM에서 SiR-DNA¹⁶ 을 사용하며 획득 전에 최소 1시간 동안 배양합니다.
5. 수출을 통제하기 위해 핵 수출 억제제 Leptomycin B¹⁷ 을 0.5 nM (가벼운 수출 억제) 및 1 nM (강한 수출 금지)에서 획득 1 시간 전에 세포에 적용하십시오.

2. 이미징

참고: 선택한 획득 패턴과 박동성 458nm 레이저 조명을 생성할 수 있는 기능이 있는 라이브 이미징 호환 컨포칼 현미경을 사용하여 획득할 수 있습니다. 이미징은 공진 스캐닝을 사용하는 컨포칼 현미경의 37°C 챔버(5% CO₂ 포함)의 어둠 속에서 수행되었습니다. 이 설정은 20x 대물렌즈로 최적화되어 있으므로 동일한 시야에서 여러 세포를 동시에 이미징할 수 있습니다. 이미징 시퀀스는 그림 2와 같이 세 단계로 구성됩니다.

1. 안정 단계
   1. 15초마다 mCherry(LEXY, 561nm 레이저) 및 원적외선(SiR-DNA, 633nm 레이저) 신호를 한 번 획득하고 총 150초 동안 10회 반복합니다. 이 시점에서 LEXY의 세포질로의 표백 또는 전좌가 관찰되지 않는지 확인하십시오.
      주의: 이 단계에서 청색광으로 시스템을 조명하면 LEXY가 활성화되어 즉시 세포질로 내보내기를 유도합니다.
2. 조명 단계
   참고: 이 단계는 15회 반복되는 3단계로 구성됩니다.
   1. 총 ~5초 동안 36ms 펄스가 150번 반복되어 청색광(458nm 레이저)으로 박동 조명을 수행합니다.
   2. mCherry(LEXY, 561nm 레이저) 및 원적외선(SiR-DNA, 633nm 레이저) 형광 신호를 한 번 획득합니다.
   3. 15초 동안 일시 중지합니다.
3. 복구 단계
   1. 15초마다 mCherry(LEXY, 561nm 레이저) 및 원적외선(SiR-DNA, 633nm 레이저) 신호를 한 번 획득하고 총 375초 동안 25회 반복합니다.
      참고: 이 단계는 선택 사항이며 사용자가 복구가 아닌 프로브 내보내기만 관찰하려는 경우 제거할 수 있습니다.

그림 2: LEXY의 3단계 구성. LEXY로 핵 수출을 모니터링하려면 현미경 소프트웨어에서 3단계를 설정해야 합니다. 상단 부분은 LEXY의 라이브 셀 이미징 획득에 사용할 구성을 나타냅니다. 이 구성은 신호가 핵에서 안정적인지 확인하기 위한 안정 위상, 핵에서 세포질로의 LEXY 전좌를 유도하기 위한 조명 위상, LEXY가 핵으로 다시 돌아오는 것을 관찰하기 위한 회수 단계로 구성됩니다. 그림의 아래쪽 부분은 살아있는 세포 이미징에서 예상되는 결과를 나타냅니다. 빨간색으로 표시된 mCherry는 LEXY의 현지화를 나타냅니다. 회색으로 표시된 SiR-DNA는 세포핵을 염색합니다. 스케일 바 = 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. LEXY 분석

참고: 전체 세분화 및 추적 분석은 오픈 소스 Fiji 플러그인인 TrackMate¹²( 필요한 버전은 재료 표에 자세히 설명되어 있음)와 함께 FIJI를 사용하여 이루어집니다.

1. FIJI를 설치한 다음 StarDist¹³ 및 TrackMate 플러그인을 다운로드합니다. 플러그인을 설치하려면 도움말 | 업데이트 ... | 업데이트 사이트를 관리하고 CSBDeep, StarDist 및 Trackmate-StarDist를 선택한 다음 변경 사항 적용을 클릭합니다. 피지를 다시 시작합니다.
2. 일부 현미경은 각 획득 단계(Stable-Illumination-Recovery)를 함께 사용할 수 있지만 다른 현미경(예: 참조된 컨포칼 현미경)은 별도로 저장할 수 있습니다. 따라서 이 구성을 사용하는 경우 추가 단계는 단계를 함께 연결하는 것입니다: 세 시퀀스의 이미지를 열고 concatenate 함수를 실행하여 세 개의 타임랩스 단계를 단일 파일로 컴파일합니다. 스택 | 도구 | 연결....
3. 안정 위상을 Image1로, 조명 위상을 Image2로, 복구 위상을 Image3으로 선택합니다. 결과 이미지는 mCherry(채널 1) 및 SiR-DNA(채널 2) 채널이 병합된 3상의 타임 랩스에 대한 단일 이미지입니다.
4. 나중에 segmentation 단계를 위해 얻은 이미지를 보관하고 저장하십시오 : File(파일) 로 이동 | 다른 이름으로 저장 | 티프....
5. 다음 분석을 위해 mCherry 채널만 분할합니다: Image | 색상 | 채널을 분할 하고 저장하십시오 : 파일 | 다른 이름으로 저장 | 티프....
6. 획득 중 최종 백화 현상을 확인하려면 mCherry 채널에서 Plot Z-axis Profile 명령을 실행합니다. Image(이미지)로 이동 | 스택 | Z축 프로파일을 플롯합니다. 생성된 테이블에서 Data(데이터) | 1st 데이터 세트를 복사하여 이 프로토콜과 함께 제공되는 즉시 사용 가능한 스프레드시트(보충 표 S1)의 Z축 프로필 셀 아래에 붙여넣습니다.
7. 핵의 평균 크기의 원형 관심 영역(ROI)을 그리고 저장: 분석으로 이동 | 도구 | ROI 관리자.... ROI를 추가하고 저장하십시오: 더보기 | 구해내다...
   참고: 분석된 모든 조건의 배경을 측정하는 데 동일한 ROI를 사용해야 합니다.
8. 전체 타임 랩스 동안 저장된 ROI를 셀이 없는 영역에 배치하고 ROI 인터페이스 기능을 사용하여 이 ROI 내의 평균 강도를 측정합니다. 먼저 Analyze(분석) | 측정값을 설정합니다. 그런 다음 더보기 | 다중 측정. Measure 50 slices all and one raw per slice를 선택하고 ok를 클릭합니다.
9. 제공된 스프레드시트(보충 표 S1)에 표시된 모든 값을 "ROI 배경" 셀 아래에 복사하여 붙여넣습니다.
10. 피지에서는 mCherry 채널만 있는 이미지를 닫고 mCherry 및 SiR-DNA 채널이 병합된 이전에 저장된 이미지를 선택합니다.
11. TrackMate 플러그인 열기: 플러그인으로 이동 | 추적 | 트랙메이트.
12. 시점 수가 올바른지 확인하고(제안된 단계를 따랐다면 0 에서 49 까지) 다음을 클릭합니다.
13. StarDist 감지기를 선택하고 다음을 클릭합니다.
14. 핵을 분할할 채널 2(SiR-DNA) 를 선택하고 Next를 클릭합니다. 세분화 프로세스가 완료될 때까지 몇 초간 기다립니다. 얻어진 분할이 핵의 경계에 해당하는지 육안으로 검사하고 Next 를 클릭합니다(그림 3). 부정확한 분할의 경우 해당 핵 식별자(SpotID)를 기록하여 3.26단계의 추가 분석에서 제외합니다.
15. 기본 매개변수를 그대로 두고 초기 임계값 설정 창에서 Next(다음)를 클릭합니다. 이 창은 50개의 시점 중에서 분절된 반점(핵)의 수를 제공합니다.
16. 스폿에 필터 설정: 필터 생성 및 설정:
    1. 분석을 왜곡할 수 있는 너무 강하거나 너무 약한 신호를 가진 핵을 제거하기 위해 평균 강도 ch1 을 매개변수로 사용하는 두 개의 필터를 만듭니다. 한 필터는 정의된 임계값 이상의 값을 선택하고 다른 필터는 임계값 미만의 값을 선택합니다. 매우 낮거나 포화된 신호만 제거하도록 값을 정의합니다.
       참고: 안정적인 세포주를 사용하는 경우 이러한 필터가 필요하지 않을 수 있습니다. 이러한 값은 모든 조건에 대해 다시 적용해야 하므로 기록해 둡니다.
    2. 두 개의 필터 영역을 생성하여 해석에서 원치 않는 객체(파편, 죽어가거나 분열하는 세포)를 제거합니다. 한 필터는 정의된 임계값보다 높은 값을 선택하고 다른 필터는 임계값 미만의 값을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
       참고: 모든 조건에 대해 이 값을 다시 적용합니다.
17. 트래커 선택: Simple LAP tracker 를 선택하고 Next( 다음)를 클릭합니다.
18. 추적에 대한 매개변수를 선택합니다. 링크 최대 거리 (여기서는 30μm)-프레임 사이의 개체에 연결할 수 있는 최대 거리를 조정합니다. 갭 닫기 최대 거리 (여기서는 15μm) 및 갭 닫기 최대 프레임 갭 (여기서는 3)을 사용하여 동일한 트랙을 제외하지 않고 생략할 수 있는 단일 트랙의 스폿 수를 정의합니다. Next( 다음 )를 클릭합니다(그림 3).
    참고: 이러한 제안된 매개변수는 시행착오 접근 방식을 사용하여 설정 및 셀룰러 모델에 맞게 최적화되었으며 실험적으로 조정해야 할 수도 있습니다.
    특히 세포가 많이 움직이는 경우 한 핵에서 다른 핵으로의 잘못된 추적을 방지하기 위해 최대 연결 거리를 조정해야 합니다.
19. 계산 후 다음을 클릭하고 트랙에 필터를 설정합니다. 전체 시간 경과(제안된 염기서열이 있는 50개의 시점) 동안 추적된 핵만 선택하려면, 추적에서 가장 높은 수의 스폿을 선택합니다(제안된 염기서열에 대해 49개 이상 에 커서를 놓음). 다음을 클릭합니다.
    참고: 이렇게 하면 분석이 용이해지지만 전체 시간 과정 동안 충분한 핵이 추적된 경우에만 가능하며, 그렇지 않은 경우 토론을 참조하십시오.
20. 디스플레이 옵션: 추가 분석에서 각 핵을 다시 추적할 수 있도록 Display spot names(스폿 이름 표시 )를 선택합니다. 사용자의 기본 설정에 따라 표시된 기능을 사용자 지정합니다.
21. 페이지 하단에서 Tracks(트랙) | CSV로 내보내 모든 측정값이 포함된 테이블을 저장합니다. 테이블을 닫고 다음을 클릭합니다.
22. 선택적으로, T(시간)를 X축으로 사용하고 ch1의 평균 명암을 Y축으로 사용하여 추적 피쳐를 플로팅합니다. 플롯 피처를 클릭합니다. 그래프를 닫고 Next(다음)를 클릭합니다.
    참고: 이렇게 하면 사용자에게 내보내기의 일반적인 경향에 대한 아이디어를 얻을 수 있습니다. 이 시점에서는 배경 및 초기 강도로 정규화되지 않습니다.
23. Capture overlay as action(오버레이를 작업으로 캡처)을 클릭하고 Execute(실행) | 확인. 생성된 이미지는 정량화된 핵을 식별하는 데 사용됩니다. 저장: 파일로 이동 | 다른 이름으로 저장 | 티프....
24. 스프레드시트 파일에서 TrackMate로 얻은 CSV 파일을 가져옵니다.데이터 탭의 데이터 가져오기 및 변환 그룹에서 텍스트/CSV에서 및 가져오기를 클릭합니다.
25. 해당 문자를 클릭하여 다음 4개 열 전체를 선택하고 제공된 스프레드시트(보충 표 S1)의 맨 위, A에서 D열까지 배경과 함께 복사하여 붙여넣습니다: Spot ID(B), Track ID(C), Frame(I), Mean intensity ch1 (M).
    참고: 붙여넣은 측정값의 시작이 보충 표 S1의 6행에서 시작하는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 측정값이 하나 이상의 셀에서 이동되어 부정확할 수 있습니다. 보충 표 S2 의 스프레드시트를 참조하여 예상되는 배치의 예를 확인하십시오.
26. B5 셀의 화살표를 클릭하여 TrackID(개별 핵)를 기준으로 결과를 알파벳순으로 정렬하고 C5 셀의 화살표를 클릭하여 프레임(시점)을 정렬합니다.
27. 배경 소음을 제거하려면 Mean intensity ch1에서 얻은 각 값에서 3.8단계에서 얻은 값을 뺍니다(제공된 스프레드시트에서 미리 계산됨, 보충 표 S1 참조).
28. LEXY의 신호를 정규화하려면 안정 위상(프레임 0에서 9까지)에서 mCherry 형광 신호의 평균 강도를 계산합니다. 그런 다음 Mean intensity ch1에서 얻은 모든 결과를 안정상의 평균 강도로 나눕니다(제공된 스프레드시트에서 미리 계산됨, 보충 표 S1 참조).
    참고: 얻은 숫자는 LEXY의 평균 핵 형광 강도입니다. 모든 측정값은 이미 L열의 핵으로 표시되며 그래프로 표시할 수 있습니다.

그림 3: FIJI를 사용한 TrackMate 분석. 상단에는 TrackMate 분석의 개략도가 표시되고, 하단에는 FIJI 분석에서 얻은 이미지가 표시됩니다. 왼쪽의 첫 번째 표현은 핵의 마커인 분할되지 않은 SiR-DNA 염색을 회색으로 보여줍니다. 두 번째 패널은 Stardist가 SiR-DNA 채널로 수행한 자동 분할을 나타냅니다. 핵은 시각화와 최종 단계를 용이하게 하기 위해 mCherry 채널의 강도에 따라 색상이 지정됩니다. 세 번째 패널은 전체 살아있는 세포 이미징 염기서열의 시점에서 SiR-DNA 염색을 추적하여 얻은 트랙을 보여줍니다. 오른쪽의 마지막 패널은 분할에 의해 정의된 영역에서 LEXY의 형광 신호를 빨간색으로 표시하며, 이는 각 시점에 대해 측정됩니다. 스케일 바 = 50 μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 수송 속도, 통계 및 수치

1. 상대 핵 강도 그래프를 플로팅합니다.
   1. GraphPadPrism을 열고 시트 만들기: 새 테이블로 데이터 입력 또는 가져오기를 클릭하고 옵션에서 X에 대한 경과 시간과 Y에 대한 나란히 있는 하위 열의 복제 값에 대한 분절된 핵의 최대 수를 선택합니다. Create를 클릭하고 가져온 데이터를 테이블에 붙여넣습니다.
   2. X 값(시간)의 경우 획득 매개변수가 제안된 대로 유지된 경우 제공된 스프레드시트의 '시간' 아래에 있는 열을 복사하여 붙여넣습니다. 그렇지 않으면 사용된 매개변수에 따라 값을 조정하십시오.
   3. 상대적 핵 강도의 그래프를 만들려면 Graphs 섹션으로 이동합니다. XY를 그래프 패밀리로 선택하고, 포인트 및 오차 막대가 있는 연결선을 그래프 유형으로 선택합니다.
   4. 플롯 섹션에서 Mean, Error 및 SEM을 선택하고 OK를 클릭하여 그래프를 확인합니다. 선택한 매개변수에 따라 스케일과 비주얼을 변경합니다.
2. 상대적 핵 강도를 단지수 모델에 맞춥니다.
   1. Data Table(데이터 테이블) 섹션에서 New Data Table(새 데이터 테이블)을 클릭합니다.
      1. Enter X values as X(X 값을 X로 입력)를 선택하고 각 점에 대한 단일 Y 값을 Y로 플롯하고 Create(생성)를 클릭합니다.
      2. X 열에서 안정 및 조명 단계에 대해서만 소수로 시간을 보고합니다. 제안된 획득 매개변수가 유지된 경우 제공된 스프레드시트 Supplemental Table S1의 'Decimal Time' 아래에 있는 열을 복사하여 붙여넣습니다.
      3. 상대적 핵 강도로 얻은 값을 테이블에 붙여넣되 안정 및 조명 위상에 대해서만 붙여넣습니다.
      4. 결과 섹션에서 다음 분석을 선택합니다. XY 분석 | 지수 | Nonlinear Regression (Curve Fit)을 선택하고 OK를 클릭합니다.
      5. 매개변수에서 Plateau(고원)를 선택한 다음 1상 감소를 Model(모델)로 선택하고, 제약 매개변수에서 2.25와 동일한 상수를 X0(조명 시작 시간)으로, 1과 동일한 상수를 Y0(조명 시작 시 상대 핵 강도), 고원(Plateau)에 대해 0과 동일한 상수(상대 핵 강도가 기댈 수 있는 값)를 선택합니다. K(내보내기 속도)가 0보다 커야 함을 나타냅니다. 다른 매개변수는 기본적으로 둡니다. 확인을 클릭합니다.
      6. 결과 섹션에서 K 행은 테스트된 조건의 핵에 대한 모든 내보내기 속도를 나타냅니다.
      7. 필요한 경우 다른 조건에 대해 4.2.1에서 4.2.1.5까지의 단계를 반복합니다.
3. 내보내기 속도 그래프를 만듭니다.
   1. 새 테이블 만들기: X 값을 X로 입력을 선택하고 각 점에 대해 단일 Y 값을 Y로 입력하고 플롯한 다음 만들기를 클릭합니다.
   2. 각 조건(열)에 대해 이전 단계에서 얻은 K 값을 붙여넣고 바꿉니다.
   3. 내보내기 속도의 그래프를 만들려면 그래프 섹션으로 이동하여 column 을 그래프 패밀리로 선택하고 Box and violin 섹션에서 Violin plot 을 사용하여 Violin plot 을 그래프 유형으로 선택합니다. 모든 점을 플롯으로 표시합니다. 확인을 클릭하여 그래프를 확인합니다. 필요한 경우 데이터를 표현하는 방법을 사용자 지정합니다.
   4. 내보내기 비율에 대한 통계 테스트를 실행하려면 다음 단계에 따라 Yoo 및 Mitchison¹⁴에 설명된 대로 양측 Welch의 t 테스트를 수행합니다.
      1. 모든 조건의 내보내기 속도가 포함된 테이블에서 Analyze(분석)를 클릭합니다 . 그룹 비교 | T-검정(및 비모수 검정)을 선택하고 테스트할 조건을 선택하고 확인을 클릭합니다. Tick Unpaired, Yes는 파라메트릭 테스트를 사용하고, Welch의 보정과 함께 Unpaired t 테스트를 사용합니다. 동일한 SD를 가정하지 말고 확인을 클릭하십시오.
   5. Results 섹션의 테이블에서 분석 결과를 관찰하고 필요한 경우 내보내기 속도 그래프에 보고합니다.

5. LINuS에 대한 적응

참고: 위에서 설명한 프로토콜은 다음 변경 사항을 적용하여 LINuS를 사용하여 핵 가져오기를 모니터링하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

1. 세포 배양
   1. 1.5단계에서 Leptomycin B 대신 importazole¹⁸ 을 핵 억제제로 사용하며, 획득 전 1시간 동안 10μM 농도로 사용합니다.
2. 이미징
   1. 시스템을 최적으로 가져오려면 2.2.1단계에서 458nm 레이저로 36ms 펄스의 조명 150회 반복을 총 ~9초 동안 250회 반복으로 교체합니다.
      참고: 시퀀스 타이밍은 셀 유형에 따라 달라질 수 있으며, 시스템은 셀 유형별^19,20인 NLS 및 NES의 인식에 의존하기 때문에 두 프로브의 매개변수를 최적으로 조정해야 할 수 있습니다.
3. 수송 속도, 통계 및 수치
   1. 4.2.1.5단계에서 곡선을 고원에 맞춘 후 1상 감소를 수행하는 대신 고원을 선택한 다음 1상 연관 분석을 선택합니다.
   2. X0을 2.25로, Y0을 1로, K(LINuS의 경우 가져오기 속도)를 0보다 크게 제한합니다.
      참고: TrackMate를 사용한 LINuS의 분석은 LEXY의 분석과 동일합니다. 상대적인 핵 강도는 여전히 측정되고 분석된 값이지만, 프로브의 내보내기로 인한 감소를 관찰하는 대신 청색광 조명 후 핵에서 형광 신호의 농축을 관찰해야 합니다.

결과

위에서 언급한 프로토콜은 사용자가 라이브 셀 이미징에서 획득하는 동안 프로브의 위치 파악 및 전좌를 시각화할 수 있도록 해야 합니다. LEXY를 사용한 핵 수출을 시각화하기 위해 획득한 예상 이미지의 예가 그림 4에 나와 있습니다. 핵에서 나오는 신호의 급격한 감소와 세포질의 농축은 청색광 조명을 두 차례 실시한 후에 관찰되어야 합니다. 프로브 신호의 점진적 복구는 조명 주기를 중지한 후에 볼 수 있습니다. 시스템을 제어하기 위해 내보내기 억제제인 Leptomycin B는 청색광 조명에서 LEXY가 내보내지는 것을 방지하기 때문에 분석을 통해 내보내기 변화를 시각화할 수 있음을 증명합니다(그림 4).

그림 4: 시간 경과에 따른 LEXY 신호의 시각화. 안정 단계, 조명 및 회복 단계의 대표적인 시점을 라이브 셀 이미징으로 획득하여 캡처합니다. 메탄올 조건은 제어 조건을 나타냅니다. 펄사타일 청색광 조명(빨간색)을 받으면 LEXY의 위치를 알려주는 mCherry 형광 신호가 핵에서 세포질로 전위됩니다. 조명을 멈춘 후 신호는 핵에서 복구됩니다. 수출 억제제인 렙토마이신 B를 1 nM 또는 0.5 nM으로 처리하면 수출이 차단되었을 때 LEXY의 수출이 부재 또는 감소하는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 30μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분석과 관련하여, 안정 단계 동안 상대 핵 강도 곡선의 값은 약 1이어야 하지만, 청색광 활성화 후에는 조명 단계가 끝날 때 고원에 도달할 때까지 천천히 감소해야 합니다(그림 5A). 감소가 너무 빠르거나 너무 느리면 획득 매개변수를 최적화할 수 있습니다(논의 참조). 충분한 농도의 렙토마이신 B 처리는 또한 분석 및 기술이 핵 수출이 완전히 차단되었음을 보여줄 만큼 충분히 민감하다는 것을 확인할 수 있으며, 전체 실험에 대해 상대 핵 강도 값이 약 1로 안정적임을 확인할 수 있습니다. 그러나 중간 렙토마이신 B 농도는 가벼운 핵 수출을 나타내야 합니다(그림 5A). 이러한 육안 관찰은 수출 속도의 관찰을 통해 정량적으로 확인해야 합니다(그림 5B).

그림 5: LEXY의 예상되는 상대적 핵 강도 및 수송 속도. (A) 그래프는 시간 경과에 따른 LEXY 형광 신호의 상대적 핵 강도를 나타내며, 안정상의 mCherry 평균 강도로 정규화되었습니다. 메탄올(대조군, 빨간색) 상태의 상대적 핵 강도는 0.5nM(연한 파란색) 또는 1nM(진한 파란색)의 농도에서 수출 억제제 Leptomycin B로 처리된 세포와 대조적으로 조명 후 절반으로 감소합니다. 오차 막대: SEM. (B) 곡선을 단일 지수 모델에 피팅하여 얻은 제어 및 Leptomycin B 조건의 내보내기 속도. 내보내기가 렙토마이신 B에 의해 차단될 때 얻은 값은 제어 조건보다 현저히 낮습니다. N = 메탄올(빨간색)의 경우 18개 세포, 렙토마이신 B 0.5nM(연한 파란색)의 경우 19개 세포, 렙토마이신 B 1nM(진한 파란색)의 경우 15개 세포. P 값은 양측 Welch의 t 검정에 의해 계산되었습니다. : P < 1×¹⁰⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 미리 정의된 계산이 있는 스프레드시트. 이 스프레드시트는 분석을 용이하게 하기 위해 제공됩니다. TrackMate로 얻은 강도 값을 스프레드시트에 직접 복사하여 붙여넣어 정규화된 상대 핵 강도 값을 얻을 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: LEXY 분석의 제어 조건에 대한 예상 결과의 예. 스프레드시트는 LEXY의 안정 세포주의 제어 조건에 대해 얻은 값의 예를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜에서 언급했듯이 안정적인 세포주를 생성하면 분석 품질이 크게 향상됩니다. 첫째, 프로브를 발현하는 세포의 100%가 있으면 추적 및 분석되는 핵의 수가 증가하여 분석의 견고성이 강화됩니다. 둘째, 프로브의 과발현과 사용된 형질주입 시약의 독성으로 인해 유발되는 세포 사멸을 줄입니다. 마지막으로, 세포 간 형광 신호의 강한 이질성을 줄입니다. 이 매개변수는 포화 신호로 인해 조명 후 강도 변화를 적절하게 감지할 수 없기 때문에 중요합니다. 약한 신호에 대해서도 동일한 결론이 적용되며, 이는 표백제나 차이의 정량화를 허용하지 않을 수 있습니다. 따라서 먼저 transfection을 통해 프로브를 테스트하여 프로브가 제대로 작동하는지 확인하고, 획득 파라미터를 설정한 다음, 안정적인 세포주를 신속하게 생성하는 것이 좋습니다. 당사는 LEXY 및 LINuS 프로브를 위한 렌티바이러스 벡터를 만들었으며, 이는 요청 시 공유할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 렌티바이러스로 생성된 NIH/3T3 LEXY 또는 LINuS 안정 라인도 만들었습니다.

프로브가 transfection되거나 세포가 희박한 경우 제안된 매개변수로 인해 검출된 추적 수가 줄어들 수 있으며 분석의 견고성이 떨어질 수 있습니다. 이 경우 사용자는 추적의 스팟 수 필터를 줄여 추적에서 생략된 스팟에 대해 더 관대할 수 있습니다(50개 스팟 중 45개 이상을 유지하는 것이 좋습니다). 주의: 이 필터를 줄이면, 제공된 엑셀 파일(보충 표 S1)을 수동으로 조정해야 합니다: 실제로, 가져온 CSV에서 붙여넣은 값에는 간격이 고려되지 않습니다. 사용자는 누락된 지점이 TrackID 번호와 함께 있는 위치를 찾고 이를 핵 번호와 연관시켜야 하며, 이는 일반적으로 몇 번의 복사-붙여넣기 라운드가 필요합니다.

실험의 성공을 보장하는 중요한 매개변수는 세포를 어두운 곳에 유지하는 것입니다. 프로브가 청색광에 반응하기 때문에 사용자는 획득하기 전에 최소 30분 동안 어둠 속에서 세포를 운반해야 합니다. 닫힌 작은 상자 또는 알루미늄을 사용하여 접시를 덮는 것으로 충분합니다. 마찬가지로, 블루라이트를 사용한 조명이 세포를 활성화하기 때문에 현미경에서 세포를 검색할 때만 mCherry 라이트를 사용하는 것은 매우 주의해야 합니다. 현미경 아래에서 최종 조명이 발생하면 획득을 위해 다른 먼 필드를 검색합니다. 3.6단계에서 Z축 프로파일을 플로팅하면 셀이 조명의 영향을 받았는지, 곡선이 고원이 아닌 감소하고 있는지 확인하는 데 도움이 됩니다.

이미징 시퀀스는 세 단계로 구성되도록 설정됩니다. 첫째, 잠재적인 백화 현상을 평가하고 LEXY의 국소화가 활성화 없이 안정적으로 유지되는지 확인하기 위한 안정 단계입니다(1). 둘째, 핵에서 세포질로 LEXY의 전좌를 유도하기 위한 펄사틸 청색광 조명의 라운드로 구성된 활성화 단계(2). 마지막으로, 신호가 핵의 초기 위치로 점진적으로 되돌아가는 선택적 복구 단계입니다(3).

획득을 위해 설명된 서열은 세포 유형에 특이적일 수 있습니다^19,20. 첫 번째 실험에서 사용자는 레이저 출력과 타이밍을 테스트하고 수정하여 시스템이 핵과 세포질 사이에서 점진적으로 전위되는 것을 확인해야 합니다. 중요한 것은 일시 중지가 너무 짧기 때문에 레이저 출력이 너무 강하면 점진적 전좌를 볼 수 없게 될 수 있으며, 대신 조명 후 mCherry 강도(사용된 프로브에 따라 다름)의 잔인한 강하/농축이 발생할 수 있습니다.

염기서열의 최적화로 문제가 해결되지 않으면 NES 및/또는 NLS가 사용된 셀 유형에 적합하지 않을 수 있습니다. 사용자는 LINuS 방법 문서⁸ 을 참조하여 프로브를 엔지니어링하고 수정할 수 있습니다. 사용자는 epifluorescence microscope를 사용한 LINuS 이미징에 대해 이 문서를 참조할 수도 있습니다.

핵 분할은 분석의 중요한 단계입니다. 프로브의 라이브 셀 이미징을 위해 견고하고 신뢰할 수 있는 핵 마커를 사용해야 합니다. 청색광을 사용한 조명은 프로브의 전좌를 활성화하고 프로브는 mCherry 형광 단백질로 모니터링되기 때문에 이 마커는 원적외선 스펙트럼 또는 근접에서 볼 수 있어야 합니다. 우리의 경우 배양 1시간에서 ~24시간 동안 세포를 염색하는 SiR-DNA를 사용하지만 SPY-DNA 650을 사용하는 것도 옵션입니다(참고는 재료 표 참조).

마지막으로, TrackMate의 필터링된 추적과 결합된 StarDist를 사용한 세분화가 효율성을 입증하는 경우 사용자는 항상 세분화 및 정량화 결과를 육안으로 확인해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 분열하거나 죽어가는 세포는 정량화에 포함될 수 있지만 포함되어서는 안 됩니다. 이러한 이벤트의 분석 위험을 줄이기 위해 제공된 Excel 시트는 상대적인 핵 강도(파란색 = 낮은 값, 빨간색 = 높은 값)에 색상 코드를 부여합니다. GraphPad Prism에서 값을 플로팅하기 전에 색상을 검사하면 사용자는 비정상적인 값을 알아차릴 수 있어야 합니다. 예를 들어, LEXY의 상대적 핵 강도는 안정 단계 동안 높은 (빨간색, 핵 내 프로브의 강한 양)에서 낮은 (파란색, 핵 내 프로브의 양 감소)까지 변화해야하며, 회복 단계 ( 보충 표 S2에 표시된 바와 같이)에서 높은 값 (빨간색)으로 돌아 오기 전에 조명 단계가 끝나야합니다.

이 프로토콜은 이전에 제안된 방법 ^5,6에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 반자동 파이프라인은 LEXY 및 LINuS 핵세포질 수송의 분석을 용이하게 하며 이전에 제안된 수동 정량화 ^5,6보다 더 높은 정확도를 제공합니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 이 분야의 초보자가 효율적인 분석을 수행할 수 있을 뿐만 아니라 핵세포질 수송의 반자동 분석을 수행하는 데 단 하나의 개방형 액세스 인터페이스만 필요한 숙련된 사용자를 위한 새로운 도구를 제공할 수 있습니다.

이 방법은 NIH3T3 세포주에서 글로벌 핵세포질 수송 속도에 대한 연구보다 더 많은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 실제로, 몇 가지 최적화 단계를 통해 다양한 세포 유형 또는 살아있는 동물에서 프로브의 수송 속도를 연구하도록 조정할 수 있습니다⁸. 또한, 관심 단백질을 LEXY 또는 LINuS에 융합함으로써 핵 안팎으로 광으로 유도된 전좌(translocation)의 수송 속도 또는 다운스트림 효과를 연구할 수도 있습니다. 예를 들어, LEXY로 세포질의 단백질을 격리하거나 LINuS ^5,6,21,22,23으로 핵으로 강제로 국소화할 수 있습니다. 마지막으로, 설명된 분석은 LEXY 및 LINuS보다 더 많은 응용 분야로 확장되어 분할할 수 있는 세포 내 구획 간에 전위되는 모든 신호를 추적할 수도 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐	시그마-알드리치	08-115
공초점 현미경	라이카	SP8
DMEM	깁코	31966021
뛰어나다	마이크로소프트
FBS	시그마-알드리치	F7524
피브로넥틴	시그마-알드리치	F1141
FIJI 소프트웨어	피지		이미지J 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
불소 요리	두처	FD3510-100 시리즈	대안: Attofluor 챔버(Invitrogen #A7816)
그래프패드 프리즘 10.4.1	그래프패드 소프트웨어, Inc.
수입타졸	시그마-알드리치	SML0341
렙토마이신 B	시그마-알드리치	L2913
LEXY 플라스미드	아드진	72655	pDN122
LINuS 플라스미드	아드진	61347	pDN77
펜실린-스트렙토마이신	깁코	15140-122
페놀 레드 프리 DMEM	깁코	21063-029
SiR-DNA	스피로크롬	SC007 시리즈	대안: SPY-DNA650(스피로크롬 #SC501)
Stardist 2D 플러그인	스타 디스트		StarDist_0.3.0
TrackMate 플러그인	트랙메이트		트랙메이트-7.14.0