해마 p-CREB 및 c-fos 발현을 평가하기 위해 Sevoflurane 마취를 사용한 어린 쥐의 학습 및 기억 연구 방법론

Summary

이 연구는 세보플루란이 어린 쥐의 NMDAR/p-CREB/c-fos 경로를 통해 해마 뉴런에서 기억 유지를 손상시키고 p-CREB 및 c-fos 발현을 감소시키는 방법을 조사합니다. 결과는 세보플루란이 단기 기억 결핍을 유발하고 시냅스 가소성 마커를 하향 조절하며, 투여 빈도와 관계없이 3일 후에 효과를 되돌릴 수 있음을 보여줍니다.

Abstract

뇌 발달 중 인지 장애를 연구하는 것은 신경 발달의 역동적인 특성, 방법론적 제약 및 상황적 장벽으로 인해 어려움에 직면해 있습니다. 이 연구는 어린 쥐의 NMDAR/p-CREB/c-fos 신호 전달 경로를 통해 해마 뉴런의 기억과 p-CREB 및 c-fos 발현을 기반으로 세보플루란으로 인한 발달 중인 뇌의 인지 장애를 연구하기 위한 통합 방법론적 접근 방식을 조사했습니다. 64마리의 21일령 SD 수컷 쥐(체중 <80g)를 정상(n=8), 60%_O2 (n=16), 가짜 훈련(n=8), 단일 용량 세보플루란(n=16) 및 다중 용량 세보플루란(n=16). 두 개의 세보플루란 그룹은 훈련 후 1일(그룹 sev1a 및 sev1b)과 30일(그룹 sev30a 및 sev30b)의 희생으로 하위 그룹화되었습니다(n=8/하위 그룹). 다른 모든 쥐는 훈련 후 1시간 후에 희생되었습니다. Y-미로 테스트는 학습 및 기억 유지를 평가하는 데 사용되었습니다. 면역조직화학을 사용하여 해마 표본에서 p-CREB- 및 c-fos 양성 뉴런의 수를 결정했습니다. 60%_O2 그룹(기억 보유율 86.33% ± 17.52%)과 비교하여 sev1a 및 sev1b 그룹의 쥐의 기억력은 유의한 감소를 보였고(sev1a: 44.29% ± 11.26%; sev1b: 62.42% ± 7.27%, 모두 P<0.05), sev1b 및 sev30b 그룹은 유의한 차이를 보이지 않았습니다(sev30a: 84.41% ± 14.15%, sev30b: 85.21% ± 11.61%, 모두 P>0.05). 60%_O2 그룹(c-fos: 92.83 ± 7.88; p-CREB: 72.22 ± 8.89)과 비교하여 해마 뉴런에서 p-CREB 및 c-fos의 발현은 sev1a군(c-fos: 23.13 ± 3.28; p-CREB: 22.88 ± 5.18) 및 sev30 그룹(c-fos: 23.22 ± 3.13; p-CREB: 25.58 ± 2.26)(모두 P<0.05)에서 감소한 반면, sev30a 및 sev30b 그룹은 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(모두 P>0.05). Sevoflurane은 투여 빈도에 따른 영향 없이 어린 쥐의 기억 유지 능력에 단기적인 부정적인 자극 효과가 있습니다. Sevoflurane은 어린 쥐의 해마 뉴런에서 p-CREB 및 c-fos의 발현을 감소시킵니다.

Introduction

뇌 발달 중 인지 장애를 연구하는 것은 신경 발달의 역동적인 특성, 방법론적 제약 및 상황적 장벽으로 인해 심각한 어려움에 직면해 있습니다. 뇌 발달은 빠르고 비선형적인 변화를 수반하므로 중요한 창 ^1,2 동안 장애 식별을 복잡하게 만듭니다. 자원이 부족한 환경에서는 간병인 문해력, 언어 다양성, 전문 도구(예: MRI)에 대한 제한된 접근과 같은 장벽이 조기 검진을 방해합니다¹. 뇌 성숙의 개인차로 인해 병리학적 편차를 일반적인 발달과 구별하기가 어렵습니다 ^2,3. 다운 증후군과 같은 상태는 변화된 피질 발달을 나타내지만 작은 표본 크기와 부족한 조직학적 데이터로 인해 기계론적 통찰력이 제한됩니다⁴. 신경 발달 장애(예: ASD, ADHD)는 종종 불안이나 우울증과 동시에 발생하여 인지 평가를 혼란스럽게 합니다⁵. 일부 집단의 심각한 의사소통 결함으로 인해 표준화된 시험의 사용이 제한됩니다⁶. 이러한 기능은 몇 가지 연구 설계 문제로 이어집니다. 실제로 대부분의 연구는 단면 설계를 사용하여 시간 경과에 따른 개인 내 변화를 모델링하지 못합니다. 교육받은 서구 인구("WEIRD" 표본)에 지나치게 의존하고 있습니다.⁷. 다운증후군 연구는 사후 뇌 샘플이 적고 연령 일치 대조군이 부적절합니다⁴. 생태학적 순간 평가 도구는 일상적인 인지 능력에 영향을 미치는 상황 변수를 설명하는 데 어려움을 겪습니다⁵.

동물과 인간의 두뇌에서 가장 중요한 기능에는 인간 발달과 전반적인 삶의 중심이 되는 학습과 기억이 포함됩니다⁸. 유아의 뇌는 발달 단계에 있으며 약물 및 마취와 같은 외부 요인에 취약합니다 ^9,10. 마취제로 인한 영아의 기억 기능 손상은 중요한 임상 연구 주제이며 마취를 수행할 수 없기 때문에 소아 환자에 대한 최적의 치료가 지연될 수도 있습니다¹¹. 마취 관련 인지 기능 장애(또는 수술 후 인지 기능 장애, POCD)는 영아에게 장기적인 결과를 초래할 수 있습니다¹². 세보플루란 흡입은 영아의 기억 기능에 영향을 미칠 수 있지만^13,14, 전통적인 마취학에서는 영아의 뇌 손상이 주로 마취 중 뇌 저산소증, 특히 전신 마취¹⁰에서 발생한다고 믿습니다. 따라서 뇌에 단기 또는 장기 저산소증이 없는 한 영아의 중추신경계 손상 위험을 줄여야 합니다¹¹. 그럼에도 불구하고 POCD에 대한 이해는 여전히 차선책입니다. 수술이 필요한 영아는 마취가 필요하며 관련된 경로에 대한 더 나은 지식은 POCD의 위험을 최소화하는 마취 전략을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.

비심장 수술을 받은 노인 환자를 대상으로 한 연구에 따르면 환자의 거의 25%가 수술 후 1주일 이내에 POCD를 경험했으며 3개월 후 그 비율은 10% 미만으로 감소한 반면, 대조군은 3.4%와 2.8%의 POCD 비율을 보였습니다¹⁵. 이 연구는 또한 대부분의 POCD 사례가 가역적이며 소수의 환자만이 장기간 또는 영구적인 POCD를 경험하는 것으로 나타났습니다¹⁵. 중추신경계에서 글루타메이트는 가장 흔한 흥분성 아미노산입니다¹⁶. N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR)는 장기 강화(LTP) 및 장기 우울증(LTD)의 유도 및 유지에 중요합니다¹⁷. 생쥐에 대한 연구에 따르면 흥분성 시냅스 가소성은 뇌 기능 발달에 직접적인 영향을 미치며¹⁸, NMDAR 활성화와 칼슘 유입이 특히 중요합니다^19,20. 향상된 NMDAR 활성은 시냅스 성장 및 가소성 유도에 중요한 영향을 미칩니다^19,20. 따라서 NMDAR 길항제(예: 세보플루란)에 의한 NMDAR 차단 정도가 높을수록 학습 및 기억 능력이 낮아져야 합니다²¹. 세보플루란이 성인 뇌의 학습 및 기억에 미치는 영향은 명확한 결론에 도달하지 못했지만^22,23, 세보플루란은 일반적으로 소아 수술의 마취에 사용됩니다¹⁴. NMDAR의 비경쟁적 길항제인 세보플루란은 뇌의 학습 및 기억 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다 11,13,14,23,24. 그럼에도 불구하고 NMDAR 외에도 다른 경로와 단백질이 학습 및 기억에 관여하고 있으며, 인산화 cAMP 반응 요소 결합 단백질(p-CREB) 및 즉각적인 초기 유전자 c-fos와 관련된 기억 조절 메커니즘이 더 명확해지고 있습니다 25,26,27, 그러나 영유아의 최적 마취 전달을 위해서는 여전히 더 나은 이해가 필요합니다.

이러한 이론적 틀을 바탕으로 본 연구는 어린 쥐의 NMDAR/p-CREB/c-fos 신호 전달 경로를 통해 해마 뉴런의 기억과 p-CREB 및 c-fos 발현을 기반으로 세보플루란으로 인한 발달 중인 뇌의 인지 장애를 연구하는 데 사용할 수 있는 통합 방법론적 접근 방식을 조사했습니다. 결과는 전신 마취 후 POCD 및 기억 장애에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구는 21일 된 쥐를 사용했는데, 이는 그들이 방금 젖을 뗀 상태이고 인간의 청소년기 초기에 해당하는 매우 균일한 체중과 생리적 상태를 가지고 있었기 때문입니다. 이 중요한 발달 기간 동안 신경가소성과 취약성이 높아지기 때문에 미성숙한 뇌에 대한 수술이나 마취로 인한 인지 장애를 효율적으로 모델링할 수 있습니다^28,29. 따라서 소아 수술과 관련된 신경인지 위험을 연구하고 잠재적인 개입 전략을 탐색하는 데 특히 적합합니다. Y-미로는 학습 및 기억력을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다³⁰. 면역조직화학은 일반적으로 뉴런과 다양한 뉴런 단백질을 연구하는 데 사용됩니다.

Protocol

이 연구의 모든 프로토콜은 Shanghai Jiao Tong University School of Medicine의 Xinhua 병원 윤리 위원회(승인 번호. XHEC-C-2016-023-2)을 참조하십시오.

1. 동물 및 그룹화의 실험적 개요

1. 64, 21일령 수컷 SD 쥐(체중 80g 미만)를 확보합니다.
2. 쥐를 5개 그룹으로 나눕니다: 정상군(n=8), 60%_O2 그룹(n=16), 가짜 훈련군(n=8), 단일 용량 세보플루란 그룹(n=16) 및 다회 용량 세보플루란 그룹(n = 16)( 표 1 참조).
3. 습도 50%-60%의 자연광이 있는 20-24°C의 동물 시설에 쥐를 수용합니다.
4. 적절한 음식과 물을 제공하십시오.
5. 모든 프로토콜이 윤리 위원회에서 검토되고 승인되었는지 확인하십시오.
6. 흡입 챔버를 준비합니다(섹션 2.1에 자세히 설명된 보충 그림 S1 참조).
7. 일반 그룹
   1. 쥐를 60% 공기에 2시간 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명).
   2. 노출 후 1일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
   3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
8. 60% O₂ 그룹
   1. 쥐를 60% 공기에 2시간 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명).
   2. 노출 후 30일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
   3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
9. 가짜 훈련 그룹
   1. 쥐를 60% 공기에 2시간 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명).
   2. 학습과 기억에 대한 빛과 전기 자극의 영향을 제어하는 데 사용되는 구조화된 훈련(조명 및 충격 영역 위치는 무작위로 다양함) 없이 노출 후 1일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명됨).
   3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
10. 단일 용량 세보플루란 그룹(sev1a 그룹)
    1. 쥐를 60% 공기 + 3% 세보플루란에 2시간 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명).
    2. 노출 후 1일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
    3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
11. 단일 용량 세보플루란군(sev30a 그룹)
    1. 쥐를 60% 공기 + 3% 세보플루란에 2시간 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명).
    2. 노출 후 30일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
    3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
12. 반복 투여 세보플루란 그룹(sev1b 그룹)
    1. 쥐를 60% 공기 + 3% 세보플루란에 하루 2시간 동안 연속 7일 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명됨).
    2. 노출 후 1일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
    3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).
13. 반복 투여 세보플루란군(sev30b 그룹)
    1. 쥐를 60% 공기 + 3% 세보플루란에 하루 2시간 동안 연속 7일 동안 노출시킵니다(섹션 2.2에 자세히 설명됨).
    2. 노출 후 30일 후에 Y-미로 테스트를 수행합니다(섹션 4에 자세히 설명되어 있음).
    3. 행동 테스트 후 조직을 수집합니다(섹션 5에 자세히 설명되어 있음).

2. 세보플루란 흡입

1. 챔버 준비( 보충 그림 S1 참조)
   1. 상자 왼쪽의 구멍을 60% O₂/40% N₂에 연결합니다.
   2. 산소 공급 장치를 sevoflurane 기화기에 연결합니다.
   3. 상자 오른쪽에 있는 구멍을 마취기의 가스 분석기에 연결합니다.
   4. 챔버 상단의 구멍을 가스 폐기물에 연결합니다.
   5. 챔버 바닥의 메쉬 아래에 석회를 놓고 면봉을 추가합니다.
   6. 설정을 흄 후드에 놓습니다.
   7. 챔버 아래에 가열 패드를 놓습니다.
2. 흡입
   1. 산소 공급 장치와 세보플루란 기화기를 켭니다.
   2. 산소 흐름을 2L/min으로 조정합니다.
   3. 세보플루란 농도가 3.0%에 도달하면 30분 동안 흐름을 유지하여 챔버 내 대기를 안정화시킵니다.
   4. 챔버의 면 쪽에 쥐를 놓습니다.
   5. 그룹화에 따라 쥐를 거기에 두십시오(1.2단계 참조).
   6. 피부색, 호흡수, 심박수 및 맥박 산소 측정을 모니터링합니다.
   7. 쥐를 제거하십시오.
   8. 쥐가 자연스럽게 깨어나도록 하십시오.
   9. 쥐를 새장으로 돌려보내십시오.

3. 실험 시약 및 기기

1. 시약 준비
   1. 마취 투여를 위해 시중에서 판매되는 세보플루란 250mL를 준비합니다.
   2. 스톡 항체를 1:350으로 희석하여 p-CREB 항체 작동 용액을 준비합니다.
   3. 스톡 항체를 1:200으로 희석하여 c-fos 항체 작동 용액을 준비합니다.
   4. 면역조직화학적 염색을 위해 키트를 조립합니다.
   5. 4% 파라포름알데히드를 준비합니다.
      1. 유리 용기에 가용성 파라포름알데히드(PFA) 40g을 고순도 물 500mL와 함께 녹이고 유백색 현탁액이 형성될 때까지 60-65°C로 자기적으로 가열하고 저어줍니다.
      2. 용액이 투명해질 때까지(pH = 7.0) 1.0mol/L NaOH를 방울로 추가합니다.
      3. 약 500mL의 PBS를 첨가하고 얼음 수조 또는 냉수 수조에서 완전히 혼합합니다.
      4. pH를 다시 확인하고 여과한 후 최대 1000mL 용량으로 만듭니다.
      5. 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관하십시오.
2. 장비 설정
   1. 행동 테스트 영역에 Y-미로를 배치합니다( 보충 그림 S2 참조).
   2. 조직학적 분석을 위한 통합 이미징 시스템으로 현미경을 교정합니다.
3. 조직 절편을 위해 새 블레이드가 있는 마이크로톰을 설치합니다.
4. 표준 조직 처리 프로토콜로 탈수 기계를 프로그래밍합니다.
5. 기계 제조업체의 지침에 따라 순차적 염색조로 염색기를 준비하십시오.
6. 관류 장치를 설정합니다.
   1. 플라스틱으로 포장된 식염수 병 2개를 사용하여 바닥 구멍에서 식염수를 배출하고 PBS와 4% 파라포름알데히드 고정제로 채웁니다.
   2. 병을 걸고 주입 세트와 연결한 다음 주입 세트의 두꺼운 바늘 끝에 3방향 마개를 부착합니다.

4. Y-미로 및 학습/기억력 테스트

1. Y-미로 조립
   1. 삼각형 접합부로 연결된 I, II 및 III로 표시된 3개의 직사각형 암으로 Y-미로를 설정합니다( 보충 그림 S2 참조).
   2. 미로 바닥에 1cm 간격의 전기 그리드를 놓습니다.
   3. 미로 벽에 얇은 2cm 구리 스트립을 부착하여 위험한 지역을 시뮬레이션하고 자극 신호등을 설치합니다.
2. 위험하고 안전한 영역 정의
   1. 위험 영역을 나타내기 위해 영역 I, II 및 III을 16,000V/m로 통전시킵니다(전기가 통되면 신호등이 켜짐).
   2. 안전한 지역을 나타내기 위해 전기가 통하지 않는 지역을 빨간색 표시등으로 표시합니다.
   3. 팔 사이의 접합부를 쥐가 감전될 수 있는 안전하지 않은 영역으로 정의하십시오.
3. 교육 절차
   1. 실험 시작 시 쥐가 위치한 지역을 안전 지역으로 고려하십시오.
   2. 2-4분 후 안전 구역에 전기를 공급하여 쥐가 안전 구역으로 이동하도록 유도합니다.
   3. 쥐가 안전 구역에서 위험 구역으로 이동하면 감전된 상태에서 안전 구역으로 돌아가 수동적 회피 반응을 보입니다.
4. 능동적 회피 대응 개발
   1. 여러 번의 교육 세션 후에는 감전하지 않고 안전한 장소의 조명을 켜십시오.
   2. 조명이 켜진 안전 구역을 향한 쥐의 움직임을 관찰하여 명암 차별 조건 반사(능동적 회피 반응)를 형성합니다.
5. 외부 방해 요소를 최소화하기 위해 Y-미로를 조명이 어둡고 조용한 곳에 배치하십시오.
6. 매일 오전 9:00-11:00과 오후 2:00-4:00 사이에 훈련을 실시합니다.
7. 쥐가 미로 환경에 적응할 수 있도록 실험 전 5분 동안 미로 내에서 자유롭게 움직이도록 합니다.
8. 자극 매개변수 조정
   1. 자극 볼륨을 조정하십시오.tage(16,000V/m) 테스트 중 쥐가 감전을 받은 후 10초 이내에 탈출할 수 있도록 합니다.
   2. 안전 구역 신호등을 15초 동안 켜두었다가 끕니다.
   3. 45초 간격 후에 다음 충격 실험을 시작합니다.
9. 신호등 시퀀스 및 올바른 응답
   1. I → II → III → I로 신호등이 켜지는 순서를 주기적으로 설정합니다.
   2. 쥐가 감전을 받은 후 10초 이내에 시작 구역에서 조명이 켜진 안전 지대로 직접 탈출하는 것으로 올바른 반응을 정의합니다.
10. 쥐가 10번의 연속 시도 중 8번에서 올바른 탈출 반응을 한 경우 학습 표준에 도달했다고 생각하십시오.
11. 빛이 없는 팔로 탈출하는 것을 잘못된 반응으로 기록하십시오.
12. 여러 교육 및 테스트 세션
    1. 학습 및 기억력을 평가하기 위해 여러 교육 및 테스트 세션을 수행합니다.
    2. 고정된 횟수의 시도 동안 정답과 오답의 수를 기록합니다.
    3. 시작 영역을 변경하여 작업 복잡성을 증가시킵니다.
13. 쥐의 기억 유지 능력을 평가하기 위해 간격(예: 훈련 후 24시간 또는 48시간)에 기억 유지를 평가합니다.

5. 면역조직화학

1. 쥐를 마취하십시오
   1. 쥐를 마취하기 위해 훈련 1시간 후 10% 클로랄 수화물(0.4mL/100g)을 복강내 주사합니다. 클로랄 수화물 용액은 현지 규정에 따라 폐기하십시오.
   2. 심장을 완전히 노출시키기 위해 개흉술을 시행합니다³¹.
2. 마취된 쥐에게 생리학적 용액을 관류하십시오.
   1. PBS가 함유된 바늘을 대동맥 방향으로 좌심실에 삽입하고 지혈 겸자로 바늘을 고정한 후 즉시 마우스의 우쪽 귓바퀴를 잘라 정맥혈을 방출합니다.
   2. 폐수가 맑아지고 간과 폐가 하얗게 보일 때까지 PBS를 빠르게 주입합니다.
   3. 그런 다음 동물의 몸이 뻣뻣해질 때까지 10% 포르말린 용액 500mL를 빠르고 천천히 주입하여 포르말린 고정을 달성합니다.
   4. 포르말린 용액은 현지 규정에 따라 폐기하십시오.
3. 뇌를 제거하세요
   1. 두개골을 빠르게 엽니다³².
   2. 반구를 손상시키지 않고 두개골에서 부드럽게 들어 올리고 기저부에서 혈관과 척수를 절단하여 뇌 전체를 제거합니다( 보충 그림 S3 참조).
4. 해마 해부
   1. 양측 해마를 해부합니다.
      1. 쥐의 후두공에서 가위로 뇌 전체를 절단합니다.
      2. 가위를 대각선으로 대두공에 조심스럽게 삽입하여 정수리골을 자릅니다.
      3. 지혈 겸자로 두정골의 양쪽을 들어 올립니다.
      4. 가위를 사용하여 한쪽 시신경을 자르고 두개골 기저부까지 조사합니다.
   2. 해마를 10% 포르말린 용액에 12시간 동안 넣습니다.
   3. 자당(10%, 20%, 30%)의 구배를 함유한 포르말린에 검체를 담그십시오.
   4. 표본 조직이 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
5. 시편을 매립하고 절편합니다.
   1. 표본을 파라핀에 삽입합니다. 포르말린 용액은 현지 규정에 따라 폐기하십시오.
   2. 내장된 시편을 4μm로 단면합니다.
6. 절편을 탈파라핀 및 재수화
   1. 탈파라핀화를 위해 절편을 50mL의 자일렌에 3회 담가두고, 매번 15분 동안 담가둡니다.
   2. 100%, 90%, 70% 및 50% 에탄올 50mL에 각각 10분 동안 순차적으로 담급니다.
   3. 50mL의 0.01mM PBS로 각각 3분 동안 3회 헹굽니다.
7. 항원 검색
   1. 절편을 50mL의 구연산염 완충액(PBS, pH 6.0)에 넣습니다.
   2. 스테인리스 스틸 압력솥에서 섹션을 120°C로 가열합니다. 섹션을 버퍼에 완전히 담근 랙에 놓습니다. 밥솥을 밀봉하고 가열한 후 고압에서 3분 동안 유지합니다.
   3. 밥솥을 불에서 내리고 실온에서 자연식힌 후 뚜껑을 엽니다.
   4. PBS(pH 7.2)에서 절편을 2분 동안 헹구고 3회 반복합니다.
   5. 약 100-200μL의 3% H₂O₂ 를 도포하여 슬라이드의 세포를 덮고 실온에서 5-10분 동안 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 제거합니다.
   6. PBS로 2분, 3회 헹굽니다.
8. 1차 항체 배양
   1. 200 μL의 1차 항체(0.01 mol/L PBS에서 1:150로 희석)를 절편에 추가합니다.
   2. 4°C에서 밤새 배양합니다.
9. 2차 항체 배양
   1. PBS에서 절편을 3분, 3회 헹굽니다.
   2. 약 100-200μL의 Polymer Helper와 함께 절편을 배양하여 슬라이드의 절편을 덮고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 0.1 mol/L PBS에서 절편을 2분, 3회 헹굽니다.
   4. 약 100-200μL의 폴리퍼옥시다아제-항마우스/토끼 IgG를 첨가하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
   5. PBS에서 절편을 3분, 3회 헹굽니다.
10. 발색
    1. 발색을 위해 약 100-200μL의 디아미노벤지딘(DAB) 용액(슬라이드의 섹션을 덮기에 충분함)을 첨가합니다.
    2. 약 3분 동안 반응시킵니다.
11. 카운터 스테인팅 및 장착
    1. 각 슬라이드의 섹션을 완전히 덮기 위해 약 100-200μL의 헤마톡실린을 적가하여 대조염색을 수행합니다.
12. 섹션을 탈수 및 장착
    1. 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올 50mL에서 각각 10분 동안 절편을 탈수한 다음 10분 동안 자일렌 50mL를 탈수합니다.
    2. 표준 절차를 사용하여 섹션을 청소하고 장착합니다.
13. 현미경 검사
    1. 각 그룹의 해마에서 p-CREB- 및 c-fos 양성 뉴런의 수를 계산합니다^33,34.
    2. 400배 배율의 현미경으로 절편을 검사합니다.
    3. 겹치지 않고 동물당 3개 섹션의 수를 기준으로 각 슬라이스에서 양성 뉴런의 평균 수를 기록합니다.
       참고: 모든 데이터는 컴퓨터 스프레드시트로 컴파일되었습니다. 모든 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 결과는 평균의 표준 오차± 평균 표준오차(SEM)로 제시되었고 SNK-q 및 Dunnett T3 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다³⁵. SNK-q 테스트는 일반적으로 탐색적 연구에 사용되며 여러 표본 평균 간의 쌍별 비교에 적합합니다. 미리 정의된 가설에 의존하지 않으므로 모든 그룹 평균³⁶을 비교하는 데 이상적입니다. Dunnett T3 테스트는 일반적으로 사전 정의된 가설을 사용한 확증 연구에 사용됩니다. 여러 치료군을 대조군과 비교하거나 특별한 전문적 의미를 갖는 수단을 비교하는 데 적합하다(^35,37). ANOVA 테스트의 P-값이 0.05≤ 때 어떤 그룹이 다른 그룹과 유의하게 다른지 확인하기 위해 쌍별 사후 테스트를 수행했습니다. 양측 P-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

Results

이 연구의 데이터를 예시적인 예로 사용하여 대표적인 면역염색 이미지와 다양한 그룹의 행동 및 분자 데이터를 포함하여 이 방법론적 프레임워크로 생성할 수 있는 결과 유형을 보여주었습니다. 생물학적 중요성에 대한 해석을 제공하기보다는 이 접근 방식에 의해 생성된 전형적이거나 예상되는 결과를 제시하는 데 중점을 둡니다.

쥐 그룹별 학습 및 기억력 테스트 결과
실험군은 60% O₂ 그룹과 비교되었습니다. 단일 용량 세보플루란 그룹(sev1a) 및 다중 용량 세보플루란 그룹(sev1b)에서 쥐의 기억, 즉 실험 후 1시간 동안 희생한 쥐는 유의한 감소를 보였고(모두 P < 0.05), 실험 후 3일 후에 희생한 쥐는 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(모두 P > 0.05)(표 2).

쥐의 해마에서 ...

Discussion

이 연구는 세보플루란이 어린 쥐의 NMDAR/p-CREB/c-fos 신호 전달 경로를 통해 해마 뉴런에서 기억에 영향을 미치고 p-CREB 및 c-fos 발현을 조절하는 방법을 조사했습니다. 결과는 세보플루란이 투여 빈도(단일 용량 또는 7일 동안 7회 용량)에 따른 영향 없이 어린 쥐의 기억 유지 능력에 단기(훈련 후 3일 후가 아님) 부정적인 자극 효과를 가졌음을 시사합니다. Sevoflurane은 훈련 후 1시간 동안 어린 쥐의 해마 뉴런에서 p-CREB 및 c-fos의 발현을 유의하게 감소시켰습니다.

본 연구는 학습과 기억을 연구하기 위한 통합 방법론의 개념 증명으로 세보플루란과 학습 및 기억 유지의 관계를 조사하였다. Ca²⁺는 NMDA 수용체(NMDAR) 또는 전압 의존성 칼슘 채널을 통해 세포에 들어갈 수 있으며, 이후 여러 신호 전달 경로를 통해 c-fos 및 p-CREB와 같은 다양한...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
실험 동물
Sprague-Dawley (SD) 쥐	Charles River Laboratories (중국 베이징)	해당 사항 없음	생후 21일, 수컷
스탠다드 쥐 차우	Keao Xieli Feed(중국 베이징)	해당 사항 없음	표준 실험 동물 사료
<강함>화학 물질 및 시약
클로랄 하이드레이트	Sinopharm 화학 시약(중국 상하이)	80113818	말단 관류용 마취제
구연산염 완충액(10x)	ZSGB-BIO (중국 베이징)	ZLI-9064	항원 회수 용액, pH 6.0
에탄올(100%)	Sinopharm 화학 시약(중국 상하이)	100092683	조직학용 탈수제
헤마톡실린 염색액	Baso Diagnostics Inc.(중국 주하이)	BA-4041 시리즈	IHC용 대조염색
과산화수소(H2O2)	Sinopharm 화학 시약(중국 상하이)	10011218	내인성 과산화효소 차단을 위한 3% 용액
뉴트럴 발삼	Solarbio(중국 베이징)	지8590	슬라이드용 마운팅 매체
질소(N2)	Shanghai Medical Gas Co.(중국 상하이)	해당 사항 없음	고순도, 가스 혼합용
산소(O2)	Shanghai Medical Gas Co.(중국 상하이)	해당 사항 없음	의료용 등급, 가스 혼합물용
파라핀	라이카 바이오시스템즈(독일 누슬로흐)	39601006	조직 포매 배지
파라포름알데히드(PFA)	Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)	158127	조직 관류 및 고정을 위한 고정제
인산염 완충 식염수(PBS)	Gibco(미국 매사추세츠주 월섬)	70011044	10x 원액, pH 7.4
세보플루란	AbbVie Inc.(미국 일리노이주 노스 시카고)	해당 사항 없음	흡입마취제
소다 라임	W. R. Grace and Co.(미국 메릴랜드주 컬럼비아)	22-01-0010	흡입실용 CO2 흡수제
수산화나트륨(NaOH)	Sinopharm 화학 시약(중국 상하이)	10019818	PFA 용액의 pH 조절에 사용
자당	Sangon Biotech (중국 상하이)	A502693	뇌 조직의 냉동 보호에 사용
자일렌	Sinopharm 화학 시약(중국 상하이)	10023418	조직학용 투명제
항체 및 키트
c-Fos 항체	Abcam(영국 케임브리지)	AB190289	토끼 항마우스, 1차 항체
DAB 발색제 키트	ZSGB-BIO (중국 베이징)	ZLI-9018	HRP 발색용 기판
p-CREB (Ser133) 항체	세포 신호 전달 기술 (Danvers, MA, USA)	9198	토끼 항마우스, 1차 항체
폴리머 HRP 검출 키트	ZSGB-BIO (중국 베이징)	PV-9000 시리즈	IHC용 2차 항체 및 검출 시스템
장비
마취기	RWD 생명과학(중국 선전)	500 원이	제어된 가스 혼합물 전달용
자동 티슈 프로세서	라이카 바이오시스템즈(독일 누슬로흐)	ASP6025	자동 탈수 및 청소용
Cryostat/Microtome	라이카 바이오시스템즈(독일 누슬로흐)	CM1950	동결/포매 뇌 조직의 절편용
현미경 시스템	올림푸스(일본 도쿄)	BX53	IHC 슬라이드 이미징용
관류 펌프	Longer Precision Pump Co.(중국 바오딩)	BT100-2J	경심 관류를 위한 연동 펌프
세보플루란 기화기	RWD 생명과학(중국 선전)	R510PS	정밀한 세보플루란 농도 제어를 위해
Y-미로 장치	Med Associates Inc.(미국 버몬트주 세인트 올번스)	MED-VFC-S-Y	능동적인 회피를 위한 전력망과 조명 포함
Software
그래프패드 프리즘	GraphPad 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 샌디에이고)	버전 9	통계 분석 및 데이터 시각화
이미지J	국립보건원(미국 메릴랜드주 베데스다)	버전 1.53	세포 계수를 위한 이미지 분석 소프트웨어
마이크로소프트 엑셀	Microsoft Corporation(미국 워싱턴주 레드몬드)	오피스 365	데이터 컴파일을 위한 스프레드시트 소프트웨어