확장 현미경: 기존 현미경을 이용한 고해상도 형광 영상

요약

여기서는 냉동 고정 및 확장 현미경 기법(Cryo-ExM)을 결합한 상세 프로토콜을 제시하여, 다양한 생물학적 샘플에 적응된 구조 보존과 고해상도 영상을 가능하게 합니다. 생물학적 샘플은 냉동되어 팽창성 폴리머에 삽입되고, 변성, 팽창, 면역표지되어 표준 광학 현미경으로 초해상도 영상을 가능하게 합니다.

초록

확장 현미경(ExM)은 생물 표본을 물리적으로 확대하여 공초점 현미경과 같은 기존 시스템을 사용하여 회절 한계를 넘어 영상을 가능하게 하는 혁신적인 초해상도 형광 현미경 기법입니다. ExM은 샘플을 팽창성 하이드로겔 매트릭스에 삽입함으로써 시료의 등방성 전개를 가능하게 하여 특수 나노스코프 장비 없이도 공간 해상도를 향상시킵니다. 초구조 확장 현미경(U-ExM)과 같은 고급 변형은 세포 소기관과 고분자 집합체 등 미세한 세포 세부 사항을 보존합니다.

특정 세포 구조나 소기관의 관찰은 시료에 적용되는 고정 방식, 특히 알데히드 기반 화학 가교 결합제와 차가운 메탄올로 인한 단백질 침전을 통해 적용되는 방식에 크게 의존합니다. 최근에는 금표준 고정 기법인 냉동 고정법을 U-ExM 방법과 통합하여 배양된 포유류 세포부터 전체 생물체에 이르기까지 거의 원주민 상태의 다양한 생물 샘플을 나노스케일 관찰할 수 있게 되었습니다. 확장 현미경은 분리된 소기관부터 전체 조직에 이르기까지 다양한 규모의 생물학적 구조를 연구하는 강력한 도구입니다. 냉동 고정과 결합할 때, 전통적인 고정 기법과 관련된 인공물을 최소화하면서 세포 구조와 동적 과정에 대한 전례 없는 통찰을 제공합니다. 이러한 발전은 ExM을 고해상도, 거의 네이티브 생물학적 영상을 위한 다목적 프레임워크로 자리매김하게 합니다.

본 연구는 다양한 기원의 샘플을 확장현미경과 결합한 냉동 고정에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 샘플 고정, 폴리머 형성, 팽창, 면역염색, 영상 촬영 등 중요한 단계를 강조하여 이 방법을 어떤 실험실에서든 적용하는 데 필요한 지침을 제공합니다.

서론

현미경은 생물학 연구에서 중요한 역할을 하며, 전체 유기체부터 개별 분자에 이르기까지 전례 없는 규모로 생명체 전반에 걸쳐 초구조와 조직을 시각화할 수 있게 합니다. 현미경 분야는 두 가지 뚜렷한 시스템을 포함합니다: 전자현미경(EM)은 고해상도이지만 특이적 표지 능력이 제한적이며, 다른 하나는 광학 현미경으로, 세포 내 구조를 정밀하고 특이하게 시각화할 수 있으나 빛의 회절 한계로 인해 해상도가 제한적입니다. 초해상도 형광 현미경(SRM)은 세포의 아회절 해상도 형광 영상을 위한 강력한 방법으로 발전했지만, 전체 유기체와 같은 고분자 집합체의 초구조적 세부 정보를 시각화하는 것은 여전히^{도전적입니다.} 더불어, SRM 기술은 10에서 120 nm 해상도를 달성하며 첨단 현미경과 이미지 재구성 알고리즘에 의존하고 전문 지식과 특수 현미경이 필요해 많은 생물학 실험실에서만 접근성이 제한됩니다. 신흥 초해상도 방법인 확장 현미경(ExM)은 이러한 한계를 극복했습니다. 10년 전 에드워드 S. 보이든의 연구실에서 개발된 ExM은 특수 현미경 없이도 영상을 촬영할 수 있는 혁신적인 광자 현미경 기법으로, 현재는 초해상도 현미경으로 간주^됩니다. 정교한 영상 기술에 의존하는 대신, ExM은 등방적으로 팽창하는 팽창성 고분자에 생물 샘플을 삽입하는 방식을 포함합니다. 이 물리적 확장은 샘플 크기를 4배 이상 증가시켜 해상도를 높이고 기존 광학 현미경을 이용한 관찰을 가능하게 합니다. 원래 뇌 절편에서 개발된 ExM 프로토콜은 해상도를 높이고 절차를 단순화하기 위해 진화해 왔습니다. 이 기술은 진핵생물 세포, 단세포 생물, 기생충, 조직, 전체 생물체 등 다양한 생물학적 샘플에 성공적으로 적용되어 그 다재다능함을 입증했습니다 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14^{, 15}.

현재 두 가지 주요 프로토콜 범주가 존재하는데, 전증실 ^2,16과 확장 후^17,18로, 이는 생물학적 샘플 염색 순간(확장 절차 전후)을 의미합니다. 이 글에서는 샘플 변성 및 증폭 후에 면역 표지가 이루어지는 포스트 익스펜션 프로토콜에 대해 구체적으로 초점을 맞춥니다.

이 프로토콜에서는 생물학적 샘플을 냉동 또는 화학적으로 고정하고 화학 물질과 함께 배양하여 단백질이 미래 고분자에 고정될 수 있도록 합니다. 시료는 이후 전기영동 겔에 흔히 사용되는 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드와 아크릴레이트나트륨(팽창 가능)으로 구성된 팽창성 폴리머에 박혀 있습니다. 물을 추가하면 겔 팽창이 촉진되어 젤의 팽창에 비례하여 단백질 간 거리가 증가합니다. 관심 단백질은 특정 항체를 사용해 겔 내에서 직접 표지합니다(그림 1).

전자현미경, 광자 현미경, 초해상도 현미경, ExM 등 앞서 언급한 모든 영상 기법은 생물학적 시료 고정을 필요로 합니다. 알데히드 기반 고정은 단백질 간 가교결합을 만들어 광자 또는 전자현미경 처리 중 세포 조직을 유지합니다. 그러나 고정은 세포 내 인공물과 형태학적 변화를 초래할 수 있는데, 이는 고전 광학 현미경에서는 미묘할 수 있지만 SRM의 발전과 발전으로 점점 더 뚜렷해져 과학자들이 고정 방법의 결과를 재고하게 만듭니다^. 고정 관련 인공물을 우회하는 한 가지 방법은 생체 현미경을 사용하는 것으로, 이는 거의 원래 상태의 세포 구조를 동적으로 시각화할 수 있게 합니다. 하지만 생체 현미경은 여러 단점이 있는데, 특히 전형유전자 발현이 필요하다는 점이 있어 세포 생리학에 영향을 미치고 내인성 현미경에 비해 단백질 행동을 변화시킬 수 있습니다. 또한, 라이브 현미경은 고정 현미경보다 해상도가 낮고 라벨링 옵션이 제한적인데, 형광 태그는 무독성이고 생존 상태에서 안정적이어야 하므로 사용 가능한 마커가 제한됩니다. 전자현미경 분야는 높은 해상도 덕분에 세포 내 또는 고분자 구조를 고정하면서 그 원래 상태를 보존하는 최적의 방법 개발에 크게 기여했습니다. 수십 년 전, Dubochet, Frank, Henderson 연구실에 의해 냉동 고정이 개발되었으며, 이는 유리체 상태수에서 세포를 빠르게 고정하는 방법으로, 천연 초구조를 보존하는 유일한 방법임을 입증했습니다^20,21. 정제된 분자는 냉동전자현미경을 통해 유리 얼음 내에서 직접 관찰할 수 있지만, 관찰 전에 세포를 수지에 삽입하고 절단해야 합니다. 샘플을 최대한 원래의 상태로 안정화하기 위해 냉동 치환 처리를 합니다. 이 과정에서 얼음 분자가 액체 상태로 돌아가면, 즉시 아세톤으로 대체되며, 아세톤은 물보다 확산 계수가 높습니다. 수분을 제거하는 과정에서 관심 있는 분자들이 모여 붕괴할 수 있는데, 이는 화학적 가교 고정과 유사합니다. 이 응집을 제한하기 위해 저온에서 냉동 치환을 수행하여 세포 내 점도를 높여 응집을 줄인^다. 이 제어된 접근법은 대형 응집체 형성을 제한하고 세포 초구조를 원래 상태에 더 가깝게 보존합니다.

2022년, 화학 고정이 인공물을 유발한다는 증거가 늘어나고 팽창 현미경의 발전이 결합되면서, Guichard/Hamel 연구실은 냉동 고정과 팽창 현미경을 통합하는 'Cryo-ExM'23 방법을 개발했습니다. 이 접근법은 생물학적 구조를 최소한의 왜곡으로 보존함으로써 두 기술의 강점을 활용합니다. 샘플은 고압 냉동 또는 수동 침입 방식을 사용하여 냉동되며, 이 두 방법 모두 전자현미경 실험실이나 핵심 시설에서 흔히 볼 수 있는 특수 장비가 필요합니다.

이 논문은 냉동 고정 후 확장현미경을 수행하는 단계별 프로토콜을 개략적으로 제시하며, 인간 배양 세포와 수면병의 원인원인인 단세포 기생충인 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei )라는 두 가지 실험 모델의 대표적인 결과를 제시합니다. 우리는 냉동 고정이 기존 고정 기법에 비해 제공하는 개선점을 강조하고, 이 기법과 관련된 가장 흔한 함정과 고정 인공물을 강조할 것입니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용되는 시약은 재료표에 나열되어 있습니다. 이 프로토콜은 소폭 수정을 거쳐 다양한 생물 샘플(효모^24,25, 톡소플라즈마 곤디²⁶, 근접 동물²⁷종, 녹조류^28,29, 미생물 진핵생물³⁰, 그리고 마우스²³, ^{31, 32, 33}) 등 다양한 생물 샘플에서 다양한 세포 과정을 관찰하도록 조정되었습니다). 이 논문에는 프로토콜을 이러한 다양한 샘플에 맞게 조정하는 내용이 언급되지 않으며, 원본 출판물에서 확인할 수 있습니다. 여기서 RPE1 세포와 트리파노소마 브루세이가 포유류 세포와 기생충의 대리 세포로 사용됩니다. 이 프로토콜은 생물학적 샘플의 고정 및 확장 단계를 강조합니다; 따라서 이 글에는 샘플 배양에 관한 정보가 제공되지 않습니다.

1. 스톡 용액 준비

1. 폴리라이신 용액
   1. 폴리-L 또는 폴리-D-라이신 하이드로브로마이드(재료표)를 물에 재현탁하여 1 mg/mL의 정액 혼합물을 얻습니다. 이 스톡 용액은 -20 °C에 보관한 후 0.2 mg/mL의 물에 더 희석하여 커버슬립 코팅을 합니다(표 1, 재료표).
2. 앵커링 솔루션
   1. 38μL 포름알데히드(36.5%-38%)를 혼합하여 신선한 아크릴아마이드/포름알데히드 용액(화학 후드 아래에서)을 준비합니다. 재료표) 그리고 50 μL 아크릴아마이드(40%, 재료표)를 912 μL PBS에 넣어 1 mL의 용액을 얻었습니다.
3. APS(시작기) 없는 겔레이션 용액
   1. 혼합액을 준비하는데, 38% 아크릴레이트 나트륨 500 μL (최종 19%), 40% 아크릴아마이드 250 μL (최종 10%), 2% 비스-아크릴아마이드 50 μL (최종 0.1%), TEMED 50 μL (최종 0.5%), 그리고 10x PBS 100 μL (최종 1) 를 첨가하여 혼합 용액을 만듭니다. 최대 2개의 젤(80-90 μL) 용량에 적합한 양을 알리코트하여 사용 전 최소 12시간 이상 -20 °C에서 보관하세요(장기 보존은 표 1 참조).
      참고: 젤화 용액 혼합물을 준비하는 데 필요한 부피는 최종 부피 1 mL를 얻기 위해 계산되었으나, 실제 용액의 부피는 950 μL이며, APS는 전체 부피의 1/20을 즉석에서 첨가하기 때문입니다. 겔화 용액¹⁷ 의 원래 보관 시간은 -20°C에서 젤의 고체성이나 팽창 효율을 해치지 않고 최대 1개월간 보존할 수 있다는 점을 관찰한 후 연장되었습니다.
4. TEMED와 APS
   1. APS 10% w/v: APS 분말을 물에 희석하여 분해하여 -20°C에서 보관합니다.
   2. TEMED 10% v/v: TEMED를 물에 희석한 후 알리쿼트하여 -20 °C에서 보관합니다.
5. 아크릴레이트나트륨(SA) 38%
   1. 정제된 SA(AK 사이언티픽 또는 시그마)에서 38% SA를 준비하세요; 재료표)
      1. 아크릴레이트 나트륨 38g을 100mL의 물에 계속 저어주며 재현탁하세요(중요). 골재를 피하기 위해 점진적으로 SA를 첨가하고, 4°C에서 하룻밤 동안 교반하여 완전한 부유를 보장합니다. 용액이 반투명하고 무색이거나 약간 노란색인지 확인하세요. 알리코트를 만들어 4°C에서 최대 1년간 보관하세요.
   2. 아크릴산에서 38% SA를 준비하세요 (시그마; 재료표)
      1. 화학 후드 아래에서 아크릴산을 NaOH로 중화하여 38% 아크릴레이트 나트륨 90mL를 준비합니다.
      2. 저으면서 물 29mL와 아크릴산 25mL를 섞으세요.
         참고: 이 단계부터는 반응이 발열 반응이므로 pH와 온도를 일정하게 조절한 상태로 얼음 위에서 수행되어야 합니다.
      3. 파스퇴르 피펫을 사용해 10 N NaOH를 한 방울 단위로 추가하세요.
         참고: 온도가 25°C를 넘지 않도록 주의하세요(만약 초과되면 NaOH 첨가를 중단하고 온도가 내려갈 때까지 기다리세요).
      4. pH가 7-8에 도달할 때까지 중화를 계속한 후 얼음 위에서 1시간 동안 교반하세요.
         참고: pH가 갑자기 10을 넘으면 아크릴산을 추가해 pH가 7-8까지 떨어지도록 하세요.
      5. 용액은 밀폐된 용기에 하룻밤 보관하세요. 용액이 침전되었다면, 1,000 × g 에서 10분간 원심분리기를 유지하세요. 상원액을 채취해 -20°C에 보관하세요.
6. 변성 해법
   1. TrisBase 1 M: TrisBase 121.14g을 1L의 물에 희석하고, HCl로 pH를 9로 조절한 후 RT에 보관합니다.
   2. 변성 완충제: 200 mM 도데실 설페이트 나트륨(SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase를 물에 혼합합니다. 200 mL 용액의 경우, 124.9 mL ddH₂O에 10 mL Tris-BASE 1 M(pH 9), 57.1 mL SDS(20%/700 mM 스톡)와 8 mL NaCl(5 M 스톡)을 저어 젓습니다. RT에 보관하세요 (표 1).

2. 냉동 고정 및 확장 절차

1. 샘플 준비 및 냉동 고정
   참고: 이 프로토콜은 12mm 커버슬립에서 재배/적재된 샘플에 최적화되어 있습니다. 다른 지원을 위해 해답의 볼륨을 수정해 주세요.
   1. 샘플 준비
      1. 샘플은 생물학적 샘플에 맞게 12mm 커버슬립(포유류 부착 세포) 또는 현탁 상태(T. brucei)에서 직접 배양합니다.
      2. 폴리라이신으로 미리 코팅된 커버슬립(T. brucei) 샘플을 다음과 같이 적재합니다: 잠시 동안 12mm 커버슬립을 폴리라이신(0.2 mg/mL)에 37 °C에서 1시간 배양한 후 빠르게 세척 후 자연 건조합니다.
      3. 기생충을 300g에서 실온(RT)에서 10분간 원심분리합니다. PBS에 재현탁하고 배양지 10%를 보조한 후 냉동 고정 5-10분 전에 커버슬립에 부재합니다.
   2. 플런지 설치 (그림 2A-C)
      주의: 아세톤을 조작할 때는 장갑과 실험복을 착용한 화학 후드 아래에서 작업하세요. 액체 질소와 액체 에탄을 다룰 때는 실험복과 고글을 착용하세요.
      1. 화학 후드 아래에서 주사기와 바늘을 사용해 5mL 튜브(커버슬립/튜브 1개)에 1mL의 초건조 아세톤을 채워 공기 오염을 방지합니다.
         참고: 생물학적 막 보존을 위해 파라포름알데히드(PFA)/글루타르알데히드(GA)(0.1/0.02%)의 첨가가 필요합니다. 커버슬립의 직경에 맞게 튜브를 조정하세요(12mm 커버슬립은 5mL 튜브에 들어가지 않습니다>).
      2. 튜브를 액체 질소에 얼려 냉동시키고, 추운 온도에 강한 플라스틱 또는 금속 선반을 사용해 튜브를 똑바로 세우세요.
      3. 폴리스티렌 박스의 절반(30cm x 30cm / 두꺼운 벽)을 드라이아이스로 채우세요.
      4. Vitrobot 타입 듀어에 액체 질소를 채워 증발이 멈출 때까지 유지하고, 온도가 안정될 때까지 10-15분을 기다립니다. 거미의 사용은 시스템 냉각을 촉진하기 위해 필요합니다(그림 2B, 별표). 필요하면 다시 채워.
      5. 거미를 제거하고 금속 플런싱 챔버에 액체 에탄을 채우세요.
      6. 에탄이 평형이 될 때까지 10분을 기다립니다.
         참고: 실험 중에 필요하다면 플런싱 시스템에 액체 에탄을 다시 채워주세요(이 시점에서는 더 이상 거미를 사용하지 마세요). 기체에서 액체 에탄으로의 전환은 어렵습니다. 적절한 압력 사용은 액체 에탄 형성에 매우 중요합니다. 고압은 금속 챔버 내 지속적인 가스 넘침으로 액체 형성을 방지하며, 저압은 금속 챔버와 충전 튜브 내에서 고체 에탄을 형성합니다. 얼음 형성을 피하는 것이 실험에 필수적입니다. 액체/공기 경계면에 충전 팁을 유지하면 고체 에탄 형성을 방지할 수 있습니다.
   3. 플런지(그림 2A-C)
      주의: 액체 질소와 액체 에탄을 다룰 때는 실험복과 고글을 착용하세요.
      1. 얇은 핀셋이 달린 12mm 커버슬립을 준비하세요.
      2. 과잉 미디엄은 휴지로 흡수하세요.
      3. 핀셋으로 커버슬립을 반쯤 잡고, 클램핑 링을 크라이오 플런저에 맞게 조절하세요.
      4. 커버슬립을 고정하는 핀셋을 냉동 플런저 홀더에 넣으세요. 남은 미디엄은 Whatman 종이로 얼룩지세요.
      5. 크라이오 플런저를 작동시켜 커버슬립을 금속 챔버의 에탄 용액에 담가.
      6. 커버슬립을 얼린 아세톤이 들어있는 튜브(커버슬립 1개/튜브)로 빠르게 옮깁니다.
         참고: 샘플 채취와 플론싱 시 같은 핀셋을 사용하지 말아 배양 배지 오염을 방지하세요. 12mm 커버>슬립을 사용할 때는 특히 조심해야 합니다(15 또는 18mm 직경의 커버슬립은 캐리어에 맞지만 깊게 넣기 어려울 수 있습니다). 이 단계에서 침입 후 커버슬립을 액체 질소에 담가 샘플을 얼린 상태로 유지하면서 에펜도르프로 옮기는 것을 용이하게 할 수 있습니다. 아세톤이 -96 °C에서 얼기 때문에, 냉동 대체를 위해 커버슬립을 얼린 아세톤 위에 올려야 합니다.
   4. 냉동 대체 및 재수화
      주의: 냉동 치환 시 샘플을 조작할 때는 내부에서 작업하세요. 온도가 상승하면 관 내부에 압력이 발생하여 관 폭발을 유발할 수 있습니다.
      1. 튜브를 약 45° 기울인 드라이아이스에 담가세요.
      2. 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 교반하세요. 닫힌 상자를 셰이커에 4°C 또는 RT에서 올려 온도를 -180°C에서 -80°C까지 올리세요.
      3. 상자 안의 드라이아이스 대부분을 꺼내고(바닥에 몇 개만 남겨두고), 튜브를 빠르게 열고 닫아 압력을 방출한 뒤, 궤도 셰이커에서 45분간 계속 저어 온도를 -80°C에서 -20°C까지 계속 올리세요.
      4. 커버슬립을 12웰 플레이트(또는 편리한 용기)에 미리 냉각된 순수 에탄올(100%) 용액으로 옮깁니다. 5분간 인큐베이팅한 후 점진적으로 수분 보충을 진행하세요: EtOH 100% (5분) - EtOH 95% (3분) - EtOH 70% (3분) - EtOH 50% (3분) - EtOH 25% (3분) - H₂O 100%.
      5. 커버슬립을 PBS로 옮기고 현미경 아래(팁으로 표면을 긁어내며) 모두 위를 향하게 하세요.
         참고: EtOH 100%와 95%는 -20°C에서, EtOH 70%와 50%는 4°C에서, EtOH는 25%와 ddH_2O를 RT에서 저장하여 온도를 계속 상승시켜 RT까지 계속 상승시킵니다. 막 표지의 경우, ddH₂O를 제외한 아세톤 및 재수화 용액에서 PFA/GA(0.1%/0.02%)의 첨가가 필요합니다.
2. 확장
   1. 단백질 고정
      1. PBS 1배에 신선한 1.4% 포름알데히드 / 2% 아크릴아마이드(FA/AA) 용액을 준비하세요.
      2. 커버슬립을 0.5/1mL AA/FA가 채워진 4/12 웰 플레이트에 넣습니다.
      3. 교반 없이 37°C에서 3-5시간 배양하세요.
         참고: 포름알데히드는 자유 아민기의 단백질을 아크릴아마이드와 연결합니다. 과도한 아크릴아마이드는 포름알데히드에 의해 정상적으로 유도되는 단백질 가교를 제한하고, 단백질을 미래 확장 폴리머에 고정시키는 역할을 합니다. 생물학적 샘플에 따라 단백질 고정 단계 연장이 필요할 수 있습니다. 어쨌든 더 긴 부화는 다음 단계들에 영향을 미치지 않습니다. 무료 우물에는 물을 채우거나 습한 챔버에 두어 증발을 방지하세요.
   2. 겔화
      1. 젤화 10분 전에 얼음 위에 해동, APS(10%)와 젤화 용액(아크릴레이트 19%, 아크릴아마이드 10%, 비스-아크릴아마이드 0.1%, TEMED 0.5%를 10배 PBS에 희석한 상태)을 얼음 위에 넣었습니다.
      2. 습한 챔버에 얇은 휴지와 파라필름을 덮어 4°C에서 10분간 보관합니다.
      3. 습한 챔버를 얼음 위에 올려놓으세요.
      4. 단백질 고정액에서 커버슬립을 꺼내고, 과잉 용액은 휴지(2장)로 제거하세요.
      5. 최종 농도 0.5%의 APS를 겔레이션 용액에 첨가하고, 2-3초간 소용돌이 상태인 후, 습윤 챔버의 파라필름에 35 μL 2방울 주입합니다.
      6. 각 방울을 커버슬립으로 덮어 젤화 용액을 향한 세포를 사용하세요.
      7. 젤이 잘 침투할 수 있도록 얼음 위에 5분간 배양하세요.
      8. 37°C에서 30-60분간 부양합니다.
   3. 변성
      1. 젤을 생검 펀치 도구(직경 0.4cm, 그림 2D)로 천공한 후, 1mL 변성 완충제를 채운 6웰 플레이트에 10/15분간 저어주어 겔이 커버슬립에서 분리될 때까지 조절합니다.
      2. 겔을 신선한 변성 완충제가 채워진 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
      3. 95°C에서 1시간 30분간 배양하세요.
      4. 젤을 ddH_2O에 10분간 옮기고, 변성 완충제를 제대로 세척하기 위해 3번 반복합니다.
      5. 젤을 밀리미터 용지나 캘리퍼로 측정하여 젤 팽창 인자를 평가하세요.
      6. 젤을 PBS로 옮겨 면역 염색을 합니다.
      7. 또는 젤을 PBS-아지드 0.02% 4°C에서 짧은 기간 보관(표 1), 장기간 보관은 -20°C(표 1)로 보관할 수 있습니다. 장기 보관을 위해서는 젤을 여러 차례 물에 담가야 합니다: 글리세롤 50% 용액에 2-3시간 교반 후 -20°C에서 충분한 용액 부피에 담가야 하며, 젤 크기에 맞게 조절해야 합니다.
         참고: 젤은 원한다면 전체를 유지할 수 있습니다(그림 2D, E)(단계 2.2.3.1). 최대 5개의 펀치(전체 젤에 해당)를 한 튜브에 모을 수 있습니다(단계 2.2.3.2). 변성 온도와 시간은 반드시 존중되어야 합니다(단계 2.2.3.3). 고온은 튜브 개방을 유발하여 변성 버퍼 증발 및/또는 젤의 배출을 유발할 수 있습니다. 안전 잠금관을 사용하거나 꼭 덮으세요. 변성 후 젤을 세척할 때는 증류수에서 해야 하는데, PBS는 SDS 침전을 유발하여 세척 효율에 영향을 미치기 때문입니다. 이 단계는 겔의 약간의 팽창을 유발하지만, 프로토콜의 다음 단계(단계 2.2.3.4)에는 아무런 영향이 없습니다. 글리세롤은 큰 젤의 경우 공간을 절약하기 위해 PBS로 희석할 수 있습니다. 0.4 mm 펀치의 경우, 젤은 이상적으로 3mL의 글리세롤 물을 채운 12웰 플레이트에 보관합니다.

3. 면역염색 및 최종 확장(Final Expansion)

1. PBS 목욕을 15분 정도 더 부화시키세요.
2. 젤 전체를 4개의 같은 조각으로 잘라주세요.
3. 젤 조각/펀치를 적응된 운반체(그림 2D, E)로 옮기고, PBS-BSA 2%에 희석된 1차 항체와 함께 3시간에서 하룻밤 동안 교반 상태로 인큐베이팅합니다(자세한 조건은 표 2와 표 3 참조).
4. 블로우 젤을 PBS+Tween 0.1% 3회 세척해 10분 동안 교반 효과를 발라주세요.
5. 젤을 2차 항체와 Hoechst 2% 내 PBS-BSA 2%에 3시간에서 하룻밤까지 교반하며 배양합니다(자세한 조건은 표 2 와 표 3 참조).
6. PBS+Tween 0.1% 3회 세척 후 10분 동안 교반 효과를 사용하세요.
7. 선택 사항: NHS-에스터와 함께 젤을 PBS에서 1시간 30분간 교반 하에서 적립시키고, 이후 PBS+Tween 0.1%에 3회 세척하여 10분간 전체 프로테옴을 판 라벨링합니다.
8. 겔을 적응된 운반체로 옮기고, 증류수(ddH₂O)에서 배양하여 겔 확장을 진행합니다.
   참고: 항체 세척제에 사용되는 세제의 농도와 종류(Tween, Triton-X100, Saponin)는 생물학적 샘플에 맞게 조정할 수 있습니다. 물을 여러 번 교체하는 것이 염분의 흔적을 제거하여 완전한 팽창을 막는 데 매우 중요합니다.

4. 장착 및 영상

1. 폴리라이신을 코팅할 때(1.1절 참조) 약 200 μL 폴리라이신을 덮고, RT에서 1시간 인큐잉한 뒤, 과도한 폴리라이신을 제거하기 위해 ddH_2O에서 3회 세척합니다. 커버슬립을 건조시킨 후 4°C에서 보관하세요.
2. 확장 젤을 코팅되지 않은 커버슬립에 부착하여 형광 현미경으로 샘플의 방향을 확인합니다.
3. 방향을 잡으면 보풀이 없는 종이에 젤을 건조시켜 과도한 물을 제거하고, 폴리라이신 코팅 커버슬립에 부착합니다(프로토콜은 1.1단계 참조).
4. 역현미경으로 샘플을 관찰하세요.

결과

이 논문은 두 가지 다른 유형의 샘플인 배양된 포유류 세포와 T. brucei 기생충에 대해 냉동 고정과 확장 현미경을 결합한 결과를 강조합니다. 두 샘플 모두 확장과 면역염색 전에 4% PFA에 냉동 고정 또는 화학적으로 고정되었습니다. 다른 화학적 고정법은 특정 소기관(예: 메탄올이나 글루타알데히드)에 더 적합할 수 있으며, 단순화를 위해 냉동 고정과 비교하기 위해 일반적인 화학적 고정법인 PFA만 선택되었습니다.

인간 RPE1(망막색소 상피세포)은 각각 αβ-튜불린, ATP5a, 호에스트를 염색하여 미세소관, 미토콘드리아, 핵을 시각화하였다. 또한, 젤은 확장 전에 형광 NHS-에스터와 함께 배양했는데, 이 염료는 자유 아민기와 반응하여 전체 세포 프로테옴을 염색합니다. 이미 입증된²³번과 같이 냉동 고정이 화학적 고정에 비해 여러 가지 장점을 관찰할 수 있습니다. 가장 두드러진 특징은 냉동 고정이 미토콘드리아 네트워크를 완벽하게 보존했다는 점이며, 이는 NHS-에스터와 ATP 합성효소 소단위 알파(ATP5a)에 대한 특이적 항체를 통해 관찰되었습니다(그림 3A,B). 더불어, ATP5a는 내막에 국한되어 있기 때문에 냉동 고정(cryo-fixation)을 이용해 미토콘드리아 크리스타를 해소할 수 있습니다(그림 3B). 오히려 PFA 고정은 미토콘드리아 네트워크를 보존하지 못해 이 상태에서는 미토콘드리아 크리스테가 보이지 않았다(그림 3C). 또한 두 조건에서 미세소관을 염색하여 냉동 고정이 세포질 또는 별상 미세소관과 같은 동적 미세소관을 더 잘 보존함을 입증했습니다(그림 3B-E). 그러나 중심립과 섬모, 즉 9겹 미세관 삼중항/이중선으로 구성된 비막성 소기관과 같은 안정적인 미세소관은 PFA 고정 세포에서 냉동 고정 세포보다 동등하거나 오히려 더 잘 보존되었다(그림 3B',C'). 세포 단백질의 일체성을 보존하는 냉동 고정은 중심립/섬모와 같은 매우 밀도가 높은 구조에는 덜 적용될 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 관찰은 핵 기공과 같은 강체 구조에서도 이루어졌으며, 화학적 고정이 세포질 단백질의 세척을 유발하여 핵 기공 구조를 더 잘 관찰할 수 있게 했습니다^23,32. 마지막으로, 냉동 고정이 화학 고정의 가교 효과를 우회하는데, 이는 유모분열 방추에서 PFA에 비해 거의 2배 더 팽창된 유사분열 방추에서 나타나는 것처럼 확장 능력에 부정적인 영향을 미친다는 점도 입증할 수 있습니다(그림 3D, E).

트리파노소마 브루세이 세포는 고유한 미토콘드리아를 시각화하기 위해 TDH³⁴(그림 4A-D)와 소포체를 강조하기 위해 BiP³⁵(그림 4E,F)를 염색하였다. 또한 젤은 형광 NHS-에스터로 염색되었습니다. 인간 세포에서 관찰된 바와 같이, 냉동 고정과 확장이 PFA 고정보다 전체 세포 구조를 더 잘 보존합니다(그림 4B,E), 특히 이 두 막 구조가 PFA 고정(그림 4C,D,F). T. brucei의 미세소관 세포골격은 인간 세포보다 더 단단하고 안정적입니다; 따라서 PFA와 냉동 고정 사이에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 더욱이, U-ExM 기법의 해상도 한계 때문에 개별 미세소관을 구별할 수 없다(표시 미 전).

전반적으로 냉동 고정은 막성 소기관(미토콘드리아, 소포체)과 동적 세포골격 요소(세포질 또는 별체 미세소관)의 보존과 같은 고전적 화학적 고정의 한계를 해결합니다. 또한, 냉동 고정은 단백질 간에 가교 결합을 생성하지 않기 때문에, 특히 단단하고 밀집된 구조에서 팽창 능력을 완전히 보존합니다.

냉동 고정과 증식의 품질을 제어하는 것은 생물학적 샘플의 세포 초구조를 보존하는 데 필수적입니다. 여러 가지 실수는 고정 부정으로 이어져 생물학적 샘플 내에 아티팩트를 만들 수 있습니다. 여기서는 냉동 고정의 가장 흔한 단점과 부정 고정의 결과를 강조합니다. 냉동 고정에서 가장 뚜렷하게 나타나는 인공물은 생물학적 샘플 내부에 균열이 나타나는 현상으로(그림 5A), 이는 냉동전자현미경에서도 흔히 볼 수 있습니다. 이러한 균열은 미토콘드리아와 미세소관에 대한 그림 5A (삽입)에서 보듯이 소기관의 고유한 초구조를 변화시키지는 않지만, 이러한 균열의 생물학적 관련성을 오해할 수 있으므로 신중하게 고려되어야 합니다. 조작 문제와 이러한 균열의 출현 및 풍부성 사이에는 특별한 상관관계가 없습니다.

고정 불편을 나타내는 구체적인 특징 중 하나는 세포질 내에 '거품 같은 구조'가 나타나는 것으로, 이는 얼음 결정의 존재를 나타냅니다. 이러한 구조물들은 특히 NHS 에스터 염색에서 두드러집니다(그림 5B). 이들은 보통 물결 모양의 미세소관(그림 5B)과 같은 세포골격 요소의 제한적 보존과 막성 소기관( 그림 5B의 미토콘드리아)의 보존이 매우 미흡한 상태를 동반합니다. 이러한 특징들은 고정의 중요한 문제를 보여주는데, 이는 (i) 부적절한 에탄 부피 및/또는 온도(프로토콜 2.2.4-2.2.6단계), (ii) 생물학적 샘플의 점진적이지 않은 예열(프로토콜 2.3 및 2.4단계), (iii) 동결 치환 용액 내 불순물 존재(프로토콜 2.2.1단계) 등이 원인일 수 있습니다. 38% 아크릴레이트가 사용 가능(무색 반투명 [1]) 또는 약간 노란색이고 반투명[2]), 팽창에 사용할 수 없는 상태(노란색/주황색 및 흐림 [3])의 기대 특성을 강조하는 아크릴레이트 나트륨 용액의 대표 이미지가 그림 5C에 나와 있습니다.

그림 1 Cryo-ExM 워크플로우. (A) 살아있는 세포(인간 세포 또는 T. brucei)는 -180 °C의 액체 에탄에 담근 후 드라이아이스 위의 얼린 아세톤에서 배양하여 냉동 고정합니다. 냉동 치환은 드라이아이스에서 배양하여 -180°C에서 -80°C까지 온도를 일정하고 천천히 상승시켜 아세톤 액화(-96°C)를 유발하고, 그 후 -80°C에서 -20°C까지 건조 아이스 없이 배양하여 온도를 상승시키는 방식으로 수행됩니다. 재수화는 에탄올과 초승달 농도의 증류수를 혼합한 연속적인 목욕과 -20°C에서 실온까지 온도를 지속적으로 올리는 방식으로 수행됩니다. (B) 재수화된 샘플은 다음과 같이 증식을 진행합니다: 샘플은 아크릴아마이드와 포름알데히드(AA/FA) 혼합물에 37 °C에서 배양하여 단백질이 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드, 그리고 아크릴레이트(AA/BIS/SA)로 이루어진 팽창성 폴리머에 고정되도록 하며, 후자가 젤에 팽창 특성을 부여합니다. 샘플은 95 °C에서 NaCl/SDS에서 배양되어 단백질-단백질 상호작용 불안정화 및 부드러운 변성(denaturation)을 수행합니다. 이 단계는 등방성 확장에 필수적입니다. 샘플은 일반 1차 및 2차 항체로 면역 염색을 한 후 증류수에서 증식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 냉동 속수와 확장 세팅. (A) 크라이오 플런저가 작동 위치(상단 패널)와 아래쪽 위치(하단 패널)에 장착됨. 화살표는 플런지를 활성화하는 PUSH 버튼을 나타냅니다. (B) 드와르 주변 폼 높이로 냉동 고정에 적합한 액체 질소 농도(N₂)를 표시하는 냉동 침입 준비 완료(빨간 화살촉). 제거 가능한 거미는 별표로 표시됩니다. (C) 커버슬립을 잡는 상태에서의 냉동 침입 주요 단계(왼쪽 위), 액체 에탄 듀어에서의 커버슬립 위치(왼쪽 아래), 그리고 동결 대체를 위한 수집관(오른쪽)의 일러스트. (D) 인간 샘플에서 면역염색을 위한 '젤 펀칭' 방법 설명. 커버슬립(1)에 붙인 중합 젤은 특정 생검 펀치(P)로 절단하여 직경 0.4cm의 젤 펀치(2)를 만들고, 실리콘 판(오른쪽 패널)에 염색하여 항체 양을 줄일 수 있습니다. (E) 인간 및 T. brucei 샘플에서 면역염색을 위한 '젤 절단' 방법 설명. 중합 및 변성 젤(1)은 4개의 동일한 조각(2)으로 잘라내어 항체와 함께 12웰 플레이트에서 배양할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. 인간 세포에서 냉동 고정과 PFA 고정의 비교. (A) αβ-튜불린(청록색), 미토콘드리아 ATP 합성효소 5a(ATP5a, 노란색), NHS-에스터(빨강/회색)를 염색한 냉동 고정 및 확장된 RPE1 세포의 회전 디스크 이미지로, 막 기반 소기관과 중심리얼 및 섬모(화살촉)를 포함한 세포골격 요소의 우수한 보존을 보여줌. 스케일 바: 10 μm. (B, C) 냉동 고정(B) 및 PFA 고정(C) RPE1 세포의 회전 디스크 이미지로, αβ-튜불린(시안), 미토콘드리아 ATP5a(노란색), 호에스트(마젠타)가 염색되어 1차 섬모(화살표, B', C')와 미토콘드리아(B", C")를 강조함. 냉동 고정과 PFA 고정이 중심립과 1차 섬모를 동일하게 보존한다면, 냉동 고정은 미토콘드리아 구조 보존 측면에서 PFA를 훨씬 능가합니다(B", C"- 빨간 화살촉은 냉동 고정 상태에서만 미토콘드리아 크리스타를 나타냅니다). 스케일 바: 각각 1, 1, 2.5 μm. (D, E) 냉동 고정(D) 및 PFA 고정(E) 유사분열 RPE1 세포의 회전 디스크 이미지(αβ-튜불린 노란색/회색 염색), 미토콘드리아 ATP5a(마젠타), Hoechst(BOP 블루)는 냉동 고정이 유사분열 방추의 더 나은 확장(빨간 화살촉)과 유사분열 방추 미세소관(빨간 화살표)을 더 잘 보존할 수 있음을 보여줍니다. 유사분열 스핀들 길이 측정: 냉동 고정 시 각각 12 μm, PFA 고정 시 7 μm. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 4. 트리파노소마 브루세이에서 냉동 고정과 PFA 고정 비교. (A, B) 미토콘드리아 트레오닌 탈수소효소(TDH, 노란색)와 NHS-에스터(빨강/회색)를 염색한 냉동 고정 및 확장된 T. brucei 전원순환 세포의 공초점 이미지로, 독특한 미토콘드리아의 우수한 보존과 세포의 전반적인 구조를 보여줍니다. 스케일 바: 5 μm. (C, D) PFA 고정 및 확장된 T. brucei 프로사이클 세포의 공초점 이미지로, TDH(노란색)와 NHS-에스터(적색/회색)가 염색됨. 미토콘드리아 구조 보존과 네트워크 비교 결과, 냉동 고정이 PFA 고정보다 더 우수한 성능을 보입니다. 스케일 바: 5 μm. (E, F) 냉동 고정(E) 및 PFA 고정(F) 및 확장된 T. brucei 프로사이클 세포의 초점 이미지로, 소포체 마커 BiP와 NHS-에스터(회색)를 염색하여 냉동 고정이 소포체의 확장과 보존을 더 잘 가능하게 함을 보여줍니다. 스케일 바: 5 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5. 냉동 고정 문제. (A,B) 냉동 고정 및 확장된 RPE1의 회전 디스크 이미지로, αβ-튜불린(청록색), 미토콘드리아 ATP 합성효소 소단위 5a(ATP5a, 노란색), NHS-에스터(빨간색)로 염색되어 냉동 고정의 고전적 효과인 균열(A, 화살표)과 기포(B, 화살표)를 보여준다. 균열은 소기관 초구조(A)에는 영향을 미치지 않지만, 세포질 내 기포(B)의 존재는 고정이 불량을 나타내며, 세포 내 소기관(미토콘드리아 및 미세소관, 소관)의 보존을 크게 변화시킵니다. 스케일 바: 5 μm 및 2 μm (인셋). (C) 38% 아크릴레이트나트륨이 사용 가능한 38%의 예상 특성을 강조하는 다양한 아크릴레이트 용액을 보여주는 사진(무색 반투명(1) 또는 약간 노란색과 반투명(2), 팽창에 사용할 수 없음(노란색/주황색 및 흐림 (3)). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 용액 저장 상태 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

표 2: 항체 목록 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

표 3: 면역염색 상태 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

본 논문에서는 냉동 고정과 확장 현미경(Cryo-ExM)을 통합한 상세한 프로토콜을 제시하여, 구조 왜곡이나 항원 손실과 같은 화학적 고정과 관련된 흔한 인공물을 피하면서 세포 내 구획을 강력하게 시각화할 수 있는 접근법을 제공합니다. 세포 구조를 거의 원래의 상태로 보존함으로써, Cryo-ExM은 광범위한 고정 최적화가 필요 없게 되어 단백질 위치를 더 정확하게 할 수 있게 합니다.

프로토콜은 대체로 간단하지만, 성공적인 결과를 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에 특히 주의가 필요합니다. 크라이오 플런싱 단계는 특히 민감한 작업으로, 특정 재료( 재료표 참조)와 특히 액체 에탄 충전을 다룰 때 숙련도를 요구하는데, 이는 잠재적 함정이 될 수 있습니다. 냉동 고정 기술에 대한 사전 지식은 유리하며; 이 방법을 처음 도입할 때는 냉동전자기학 전문가나 전자현미경 시설 관리자와 상담할 것을 권장합니다. 팽창 단계에서는 변성 조건을 엄격히 준수하는 것이 필수적이며, 편차는 샘플 보존과 팽창 효율 모두에 영향을 줄 수 있습니다. 마지막으로, 모든 시약에 대한 적절한 보관 조건을 유지하는 것이 재현성과 일관된 영상 품질을 보장하는 데 매우 중요합니다( 표 1 참조).

이 논문은 Cryo-ExM 프로토콜의 여러 주요 장점을 강조합니다. 특히, 냉동 고정은 기존 고정 방법에서 흔히 발생하는 한계인 용해성 단백질 손실을 최소화하고, 막의 무결성을 더 잘 보존하여 세포 영상의 정밀도를 향상시킵니다. 이 기술의 주요 강점은 표준 광각각 현미경과 공초점 현미경과의 호환성에 있습니다. 특수하고 종종 고가의 장비가 필요한 많은 다른 초해상도 방법과 달리, ExM은 기존 형광 현미경을 사용하여 구현할 수 있습니다. ExM의 또 다른 중요한 장점은 그 다재다능함입니다. 이 기술은 개별 세포부터 복잡한 조직에 이르기까지 다양한 생물학적 샘플에 성공적으로 적용되어 다양한 연구 분야에서 폭넓은 적용 가능성을 입증했습니다. 이 논문은 특히 이 프로토콜이 두 가지 매우 다른 모델 시스템인 T. brucei와 인간 세포와의 호환성을 강조하지만, 더 크거나 복잡한 샘플은 수동 침입만으로는 전체 샘플을 보존하기에 충분하지 않으므로 고압 냉동 고정이 필요하다는 점을 유념하세요^{24, 25, 30}. 팽창 현미경은 이전에는 해석하기 어렵거나 불가능했던 나노 규모 세포 구조를 시각화하는 능력을 혁신하여 세포 생물학, 발생생물학, 신경과학 등 분야에서 돌파구를 마련^{했습니다.} 특히 이 방법은 기생충학 분야에서 혁신적이었는데, 기존의 광학 현미경이 종종 부족한 분야입니다. 많은 기생충에게 초구조 확장 현미경(U-ExM)은 게임 체인저로 입증되어 아피코플라스트, 코노이드, 세포골격 요소와 같은 복잡한 소기관을 전례 없는 선^{명도로 고}해상도 영상화할 수 있게 되었습니다 ^6,37,38. 이러한 진전은 U-ExM이 이전에 접근할 수 없었던 구조적 세부사항을 밝혀내는 힘을 보여주며, 세포생물학, 신경과학, 기생충생물학 분야에서 새로운 발견의 길을 열고, 잠재적 치료 표적 탐색을 돕고 있습니다. 더불어, ExM은 일반적으로 사용되는 면역형광 항체와 호환되어 기존 워크플로우에 통합되기 쉽습니다. 대부분의 경우, 형광 현미경이나 웨스턴 블롯팅에 일상적으로 사용되는 항체는 확장된 샘플에서 효과적으로 작용하여 특수 시약이 필요 없습니다. 이러한 접근성은 Cryo-ExM을 많은 생물학 연구소에서 매력적인 선택지로 만들며, 고급 영상 시스템에서 일반적으로 수반되는 비용이나 복잡성 없이 고해상도 영상을 제공합니다.

장점에도 불구하고, ExM에는 몇 가지 한계가 있습니다. 주요 단점은 항체의 상당한 소비량으로, 특히 제한된 양으로 제공되는 자작 항체의 경우 비용이 많이 들거나 문제가 될 수 있습니다. 면역염색에 사용되는 항체의 양을 줄이기 위해 이 프로토콜 전략을 제안하는 이유는 다음과 같습니다(그림 2D, E). 확장 과정은 또한 시료의 두께를 증가시키는데, 이는 표준 현미경 대물렌즈의 작업 거리 제한으로 인해 더 깊은 구조를 시각화하는 데 영향을 줄 수 있습니다. 이 한계는 특히 더 크고 두꺼운 샘플을 연구할 때 도전적일 수 있으며, 이때 더 깊은 영역은 기존 현미경으로는 효과적으로 영상화할 수 없습니다. 또한 조직 확장은 때때로 기계적 왜곡을 초래할 수 있어, 정확한 공간 표현을 보장하기 위해 신중한 검증과 보정 작업이 필요합니다. 마지막으로, 고전적 ExM은 생물학적 샘플이나 관찰하는 아세포 구조에 따라 샘플 고정에 엄격히 의존합니다. 중심립과 섬모는 전고정 없이도 확장할 만큼 안정적이지만, 세포 소기관은 PFA, 메탄올, 글루타알데히드 등 다양한 화학적 고정을 필요로 하며, 이로 인해 인공물이 생기고 여러 세포 구조가 함께 관찰되는 것을 방해할 수 있습니다. 마지막으로, ExM은 구조화 조명 현미경(SIM)³⁹, 유도 방출 고갈현미경(STED)⁴⁰, 직접 확률 광학 재구성 현미경(dSTORM)⁴¹ , 그리고 최근에는 광판 현미경⁴²와 같은 다양한 초해상도 영상 방식과 호환되기 때문에, 본 연구에서 설명한 접근법은 세포 구조를 고정밀도로 조사할 수 있는 다목적 도구를 제공합니다. 최근 연구에서는 냉동 고정과 반복 확장 현미경을^{결합하여 해상도}의 한계를 더욱 밀어붙이면서도 세포의 자연 상태를 최대한 보존했습니다.

이러한 첨단 영상 기법이 세포의 원래 상태를 포착할 수 있게 함으로써, Cryo-ExM은 복잡한 세포 과정을 전례 없는 명료성으로 연구하는 미래 연구의 길을 열어줍니다. 이 접근법은 또한 상관광과 전자현미경(CLEM)의 새로운 가능성을 열어주어 다중 모달 이미징 가능성을 더욱 높입니다.

결론적으로, ExM은 다양한 생물학적 샘플에 걸쳐 폭넓게 적용할 수 있는 강력한 초해상도 영상 도구를 제공합니다. 표준 현미경과의 호환성, 시료 유형의 다양성, 그리고 비교적 단순한 구현 덕분에 많은 실험실에서 매력적인 선택지로 자리 잡고 있습니다. 기술의 지속적인 발전에 따라, 해상도, 항체 사용, 샘플 처리 능력이 더욱 향상되어 다양한 생물학적 응용 분야에 더 쉽게 접근할 수 있을 것으로 기대됩니다. 특히 Cryo-ExM은 세포 구조를 뛰어난 세밀함으로 연구하면서도 그 고유한 무결성을 보존할 수 있는 유망한 발전으로 자리 잡고 있으며, 궁극적으로 현대 현미경의 한계를 넓히고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5ml 튜브 금속 홀더	도미니크 뒤처	QB-E5	동결 치환 단계
620 수동 크라이오 플런저	호스트	https://rhost-em.com/	냉동 고정 단계
아세톤 99.8% 아크로실	아크로스 오가닉스	고양이. 번호 67-64-1 & nbsp;	동결 치환 단계
아크릴라마이드 40% (AA)	시그마-올드리치	A4058	확장 절차 & nbsp; (닻 내리기)
아크릴산	시그마-올드리치	8.00181	팽창 절차 (폴리머)
과황산암모늄(APS)	써모피셔	17874	팽창 절차 (폴리머)
생검 펀치	도미니크 뒤처	PUK-40	변성 전에 젤을 절단할 때 필요하며;
BSA	시그마-올드리치	P1379	면역 염색
세포 챔버 아토플루어	인비트로젠	A7816	24mm 커버슬립에 맞게 개조된 영상 챔버
세포 챔버	생애 이매그닝 서비스	10900	18mm 커버슬립에 맞게 개조된 영상 챔버
커버슬립 12mm	도미니크 뒤처	100040	성장 세포 / T. brucei 부착
커버슬립 24mm	도미니크 뒤처	900547	영상 촬영 및 nbsp;
커버슬립 18mm	VWR	631-0153	영상 촬영 및 nbsp;
에탄 가즈	린데 가즈	88888DE	냉동 고정에 필요하다
포름알데히드 36.5– 38% (FA)	시그마-올드리치	그리고 nbsp; F8775	확장 절차 & nbsp; (닻 내리기)
글루타알드헤하이드 25% (조지아)	시그마-올드리치	그리고 nbsp; G5882	동결 치환 단계
글리세롤	유로메덱스	EU3550	장기 젤 저장 및 nbsp;
액체 질소	린데 가즈	2200975	냉동 고정(시스템 냉각)에 필요함
마이크로튜브 클리어락 5ml	도미니크 뒤처	390932A	냉동 대체에 필요하다
니들 18G	도미니크 뒤처	050123B	아세톤 수집이 필요해
N,N-메틸비사크릴아마이드 2% (BIS)	시그마-올드리치	M1533, SIGMA	팽창 절차 (폴리머)
파라포름알데히드 16% (PFA)	응급의료 서비스	고양이. 번호 15710	동결 치환 단계
폴리-D-라이신	시그마-올드리치	P1024	샘플/이미징용 코팅 커버슬립 등;
폴리-L-라이신	시그마-올드리치	P1274	샘플/이미징용 코팅 커버슬립 등;
압력 재조정기와 nbsp;	린데 가즈	CPLH0SJ-린224	에탄 교란을 허용하는 압력 재조정기(냉동 고정)
Seringe Terumo 10ml	도미니크 뒤처	50132	아세톤 수집이 필요해
실리콘 엘라스토머 키트	다우	4001834	실리온 웰 플레이트 준비(면역염색) 키트 및 nbsp;
아크릴레이트 나트륨 97-99% (SA)	시그마-올드리치	408220	팽창 절차 (폴리머)
AK 사이언티픽	R624	팽창 절차 (폴리머)
도데실 황산나트륨	유로메덱스	EU0660	팽창 절차(변성)
테트라메틸레틸렌디아민 (TEMED)	써모피셔	17919	팽창 절차 (폴리머)
튜브 & nbsp;	써모 사이언티픽	8060-0060	에탄 차단(냉동 고정)용 튜빙
트윈-20	유로메덱스	1005-7	면역 염색
핀셋 듀몽 n° 5	파인사이언스툴스	11255-20	커버 슬립 조작 및 nbsp;