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방법 논문

심근손상의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 위한 현미경 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화염법 분석법

845 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68596

⸱

2025년 11월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

현재의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 분석법은 미세한 해상도로 심근 손상을 분석할 수 있는 정교한 TTC 염색 프로토콜을 도입하여, 세포 수준에서 경색 크기와 심근세포 생존성을 정확하고 신뢰할 수 있게 하는 고품질 이미지를 생성합니다.

초록

이 프로토콜에서는 세포 해상도에서 심근경색(MI)을 정확하고 신뢰할 수 있게 분석하기 위한 정제된 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화(TTC) 기반 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 경색된 심장에 대해 24시간 후 시행하는 두 단계의 TTC 염색 절차를 포함합니다: 관류(1% TTC 용액을 대동맥 캐뉼라를 통해 역행적으로 관상동맥 혈관을 관류하는 관류)와 이후 심장을 4°C에서 TTC 용액에 하룻밤 동안 수용하는 침수(imcusion)입니다. 염색 후 심장은 OCT 화합물에 박혀 100μm 간격으로 50μm 두께의 가로로 냉동절개됩니다. 잠보니 고정제로 24시간 고정 과정을 거친 후, 현미경 검사를 통해 생존 가능한 심근(짙은 적색)과 괴사 조직(노란색) 사이의 뚜렷하고 뚜렷한 경계가 구분됩니다. 특히, 이 현미경 TTC 분석은 급성기(심근경 사망 후 24시간)뿐만 아니라 7일 이상의 긴 시간 창에 걸쳐 심근경 심근 검출을 가능하게 합니다. 현미경 TTC 분석법은 심장당 80개의 다층 이미지를 생성하기 때문에, 우리는 대규모 이미지 데이터셋을 빠르고 효율적으로 분석하고 전 지구적 경색 크기를 몇 분 내에 정량화할 수 있는 견고한 색상 기반 반자동 알고리즘을 개발했습니다. 이러한 개선을 통해 현재 접근법은 TTC 염색 과정을 크게 개선하여 심장 허혈 손상을 연구하는 실험실에 널리 적용 가능하고 가치 있는 도구를 제공합니다.

서론

지난 20년간 심장 보호는 심부혈성 손상 이후 심근세포를 보존하는 핵심 전략으로 계속 추구되어 왔습니다1. 실험적 및 임상 환경 모두에서 심근 손상의 최종 범위는 심장 보호 중재의 효율성을 평가하는 데 중요한 지표입니다. 따라서 경색 크기에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 평가는 매우 바람직하고 근본적으로 중요합니다.

설치류 모델에서 사후 경색 크기 평가의 표준 프로토콜은 주로 미토콘드리아 탈수소효소의 활성에 의존했는데, 이 과정은 무색 화합물인 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)를 생존 가능한 세포에서는 붉은 침전물로 전환하는 반면, 괴사 조직에서는 연한 회색을 유지합니다. 임신 유산 염색은 간단하고 비용 효율적이지만, 여러 방법론적 도전과 내재적 한계를 안고 있습니다. 여기에는 TTC 용액에서 축복을 겪는 심장 절편이 포함되며, 이는 조직을 심하게 변형시켜 평평하게 눕히지 못하게 합니다; 샘플 처리 중 고르지 않은 슬라이스 두께; 그리고 경색 경계의 정확한 경계 표시를 방해하는 낮은 화질이 있습니다. 최근 몇 년간 샘플 준비 과정에 여러 기술적 수정이 도입되었는데, 예를 들어 아크릴 심장 매트릭스4 사용이나 심장을 반냉동 상태로 하여 슬라이싱을 용이하게 하는 3. 이러한 수정은 조직 절개의 실용성을 크게 높였지만, 기존 접근법은 두꺼운 심장 절편의 대략적인 영상 촬영에 의존하여 종종 변동적이고 최적이 아닌 이미지 품질을 만듭니다5, 색상 대비가 부족해 경색 측정에 상당한 주관성을 부여할 수 있습니다6. 더불어, 기존 방법은 전심장 조직을 사용해야 하므로, 동일한 조직 샘플에 대해 다중 목적 분석을 방지합니다. 예를 들어, 조절 단백질의 면역 공동 염색을 통해 심장 생존에 관여하는 주요 신호전달 연쇄 신호를 식별하는 식입니다. 그 결과, 다양한 연구 질문을 적절히 해결하기 위해 상당수의 동물이 필요할 때가 많습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 TTC 염색의 현미경 영상 촬영에 적합한 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 '관류 + 침수' 염색 단계와 심장 조직을 광학 현미경 촬영에 최적화된 얇은 조각으로 냉동절개하는 방식을 결합합니다. 이 방법은최근 보고되었지만, 상세한 실험 절차를 제공하는 것이 그 실용성과 접근성을 높인다고 믿습니다. 더불어, 현미경 TTC 방법은 여러 심장 절개 층으로 구성된 고해상도 이미지를 생성하기 때문에, 대규모 이미지 데이터셋 분석의 시간 소모를 해결하기 위해 견고한 색상 기반 반자동 알고리즘을 개발했습니다. 본 방법은 경색 부위를 신속히 발견하고 전 지구적 경색 크기를 몇 분 내에 정량화할 수 있게 합니다.

전반적으로 여기서 제시된 프로토콜은 연구자들이 이 방법을 쉽고 정확하게 효율적으로 구현할 수 있도록 하는 귀중한 도구입니다.

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프로토콜

모든 실험은 독일 노르트라인-베스트팔렌의 LANUV에서 승인되었으며, ARRIVE 지침과 NIH 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 필요한 모든 장비와 화학물질은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 랑겐도르프 역관류 시스템 구축

참고: 이 시스템은 20게이지 둔탁한 바늘로 만든 대동맥 캐뉼라와 두 개의 주입 포트(세척용(인산 완충 생리식염수(PBS) 포트, TTC 주입용(TTC 포트))으로 연결된 2개의 갱 3방향 스톱콕으로 구성되어 있습니다. 삼방향 스톱콕의 방향을 번갈아 가동하여 투입물을 심장에 교환적으로 전달할 수 있습니다.

  1. 장치를 접착 테이프로 150mm 페트리 접시에 수평으로 고정하여 이후 단계에서 원치 않는 움직임을 방지합니다.
  2. 캐뉼라 끝을 하단보다 1mm 높이로 조절하여 심장이 평평하게 놓일 때 대동맥근의 높이와 일치하도록 하세요.
  3. 10mL 주사기로 PBS 포트를 통해 얼음처럼 차가운 PBS를 미리 채웁니다.
  4. 신선한 염색액(1% TTC이 PBS에 용해됨)을 준비합니다; 각 심장마다 최소 6mL의 부피가 필요합니다.
    주의: 임신 시도는 일반적으로 위험한 것으로 간주되며, 경미한 피부 자극, 심각한 눈 자극, 흡입 시 해로울 수 있으므로 주의 깊게 다뤄야 합니다. 폐기물 및 잔류물은 지방 당국의 요구사항에 따라 처리됩니다.
  5. 3mL 주사기로 TTC 포트에 염색 용액을 미리 채우세요.
  6. 시스템 내에 의도치 않은 공기 방울이 생기지 않도록 주의하세요. 공기 색전이 생겨 이후 염색에 방해가 될 수 있습니다. 대부분의 경우, 시스템 내에 공기 방울이 보이지만; 존재할 경우, PBS를 빼냈다가 다시 채우면서 세우는 캐뉼라 위치에서 3방향 스톱콕을 부드럽게 두드려 제거하세요.
  7. 6-0 실크 봉합사를 사용해 느슨한 반 사각형 매듭을 만들어 캐뉼라의 원위 끝에 대동맥근 고정을 위해 놓으세요.

2. 심장 샘플 준비

참고: 이 연구에는 C57BL/6J 마우스(20-25g)가 사용되었습니다. 실험적 심근경색(MI)은 아래에 설명된 대로 좌전하행동맥(LAD)을 30-60분간 외과적으로 결찰하여 유도하였습니다. 심근근모 유도 방법론은 이전에8 번 보고되었으나 이 원고에는 자세히 나와 있지 않습니다. 특별한 언급이 없는 한, 심장 샘플은 심근경색 발생 후 24시간 후에 채취되었다.

  1. 심근경색 쥐를 우리에서 꺼내 깊은 이소플루란 마취(3% v/v) 하에 경추 탈구로 안락사시킨다.
    참고: 모든 안락사 절차는 현지 규정에 따라 안락사 이유와 사용된 방법을 포함하여 적절히 문서화되고 보고되어야 합니다.
  2. 안락사된 동물을 수술대로 옮기고 네 팔다리를 접착 테이프로 고정하세요.
  3. 미세 해부용 겸자와 가위를 사용해 복부 중간에서 앞발 중간까지 가죽을 제거합니다.
  4. 복부 근육벽, 횡격막 바로 아래에 2cm 횡절개를 하여 이후 흉강절개를 가능하게 합니다.
  5. 가위로 횡격막을 벌려 심장을 노출한 후, 피부, 근육, 갈비뼈를 양쪽으로 절개해 흉강을 열어줍니다.
  6. 횡격막을 양쪽으로 잘라내고 흉골을 들어 올려 심장을 완전히 노출시킵니다.
  7. 즉시 심장 표면에 얼음처럼 차가운 PBS 20mL를 부어 심장 박동을 멈추게 하세요.
  8. 심장과 주변 조직(폐와 식도)을 절제하고, 조직 덩어리를 50mL 비커에 넣어 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 약 1분간 옮겨 심장 박동이 가라앉도록 하세요.
  9. 심장을 150mm 페트리 접시에 옮기고, 양안 현미경으로 미세한 겸자와 가위를 사용해 대동맥 근부의 결합 조직을 제거합니다.
  10. 흉선을 부드럽게 제거하고 상행 대동맥을 노출시키세요.
  11. 대동맥 근을 결합 조직을 해리하여 다듬으세요.
  12. 가는 핀셋으로 대동맥 절단 부위를 집어 이미 PBS와 TTC 염색액이 미리 채워진 관류 장치에 연결된 캐뉼라 위에 장착하세요. 삽입 시 대동맥 근벽을 안정시키기 위해 가는 핀셋을 사용하세요.
  13. 캐뉼라에 미리 형성된 느슨한 매듭으로 대동맥을 고정하세요. PBS를 역관류하는 동안 캐뉼라와 심장을 꼼꼼히 점검하세요. 심장 충전은 PBS가 심장으로 들어오는 양이 증가함에 따라 심실이 돌출하는 것을 통해 시각적으로 확인할 수 있습니다.
  14. 심장이 자연스럽고 적절한 위치에 있도록 심장 외 조직(폐와 식도)은 그대로 두세요.

3. TTC 염색

  1. 캐논레이션이 고정되면 젖은 휴지로 심장을 덮으세요.
  2. 미리 연결된 10mL 주사기와 얼음 차가운 PBS를 2-3 mL/분 속도로 3분간 심장을 헹구기 시작하며, 심장 용액이 깨끗해질 때까지 계속하세요. 이로 인해 심장과 관상동맥에 남는 혈액은 최소한만 유지됩니다. 이 단계에서는 관류 중 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하세요. 이는 마막한 심실 파열로 이어질 수 있습니다.
  3. 쌍안현미경으로 심장을 검사하여 대동맥근에 누출이 없는지, 관류압 하에서 적절히 부풀어 오르는지 확인하세요.
  4. 삼방향 스톱콕을 TTC 용액 쪽으로 돌리고, 30초 동안 TTC 포트를 통해 1mL의 염색액을 천천히 주입합니다.
  5. 5분 후에 1mL TTC 용액을 다시 주입하고, 첫 번째 TTC 주입 후 10분 후 5분 후에 이 과정을 반복합니다. 총 3mL의 TTC 용액이 15분 동안 3회 주입에 필요합니다.
  6. 양안 현미경으로 심장 표면을 검사하세요. 이 시점에서 생존 가능한 심근(짙은 적색)과 괴사 조직(연한 회색)의 명확한 구분이 이미 보여야 합니다.
  7. 가위로 모든 비심장 조직을 제거하고, 염색된 심장을 3mL TTC 용액이 들어 있는 15mL 원뿔관에 옮깁니다.
  8. 원뿔 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 두어 두 번째 침지 염색을 합니다.

4. 조직 차단 준비

  1. 원뿔 튜브에서 심장을 꺼내 조심스럽게 휴지로 말리세요. 이 시점에서 생존 가능한 심근의 염색이 더 뚜렷해지고, 관류되지 않은 심근(심외부와 심내막 부위)에서도 연한 붉은 염색이 나타납니다.
  2. 1mL 주사기를 사용해 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 채운 무딘 곡선 20게이지 캐뉼라를 채웁니다.
  3. 가위로 삼첨판을 절제하고 캐뉼라를 우심실에 삽입하세요.
  4. 공동을 OCT 화합물(약 50-80 μL)으로 채우고, 역류가 관찰되면 주입을 중단합니다.
  5. 승모판을 노출시키고 캐뉼라를 좌심방을 통해 삽입하고, 승모판을 좌심실로 삽입합니다.
  6. OCT 화합물(약 80 μL)을 부드럽게 주입하고, 대동맥에서 유출이 관찰되면 주입을 중단합니다.
  7. 알루미늄 호일로 만든 작은 원통형 캡슐(직경 1cm)을 준비하고 300 μL OCT 화합물을 채웁니다.
  8. 심장을 캡슐 안의 꼭대기 아래로 아래로 조심스럽게 넣고 수직 방향으로 조정하세요. 위에서 아래로 보면, 꼭대기는 어느 쪽 쪽으로 지나치게 돌출되어서는 안 됩니다.
  9. 캡슐을 -30°C에서 -40°C까지 미리 냉각한 2-메틸부탄 용액에 담가둡니다.
  10. 샘플을 용액 내에 5-10분 정도 두어 고체화한 후 조직 블록을 형성하세요.
  11. 조직 블록에 표지하여 -80°C에 보관하여 추가 조직학적 분석을 수행하세요.

5. 냉동 절부 및 고정

  1. 조직 블록을 OCT 화합물을 사용해 크라이오스탯 척에 장착하세요.
  2. 척을 냉동조절기에 넣고 온도를 약 -24°C로 설정하세요.
  3. 조직 블록을 끝이 보이도록 절단하세요.
  4. 단면 두께를 50 μm로 설정하고 두 번째 단면마다 채취하면 단면 간격이 100 μm가 됩니다.
    참고: 냉동절부 중 조직 접힘은 피하세요. 빈 심실강을 OCT 화합물로 채우면 이 현상은 대부분 최소화됩니다(4.4-4.6 단계 참조).
  5. 유리 현미경 슬라이드에 조각을 순차적으로 정렬하여 슬라이드당 8조각을 배치하세요. 총 80개의 섹션, 즉 10개의 슬라이드가 심장당 예상된다.
  6. 헤어드라이어로 가장 낮은 설정으로 실온 공기 흐름을 사용해 약 10분간 말리세요(가열은 필요 없습니다).
  7. 슬라이드를 잠보니 용액(2% 파라포름알데히드와 0.4% 피크린산을 함유한 고정제)으로 채운 염색 챔버에 담가둡니다.
    주의: 잠보니 고정제는 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있으며 유전적 결함과 발암 가능성을 유발할 수 있습니다. 폐기물 및 잔류물은 지방 당국 규정에 따라 처리됩니다.
  8. 심장 조직을 하룻밤 4°C에서 고정하세요. 이 장기 고정은 고정 과정에서 생긴 공기 방울이 심장 조직 표면에 없도록 보장합니다.
  9. 고정 후에는 고정제에서 슬라이드를 빼서 PBS로 세 번 헹구세요.
  10. 슬라이드를 마운팅 매체로 장착하고 섹션을 커버슬립으로 덮으세요. 이 단계가 끝나면 하트 슬라이드는 이미지 획득을 위한 준비가 됩니다.
  11. 샘플을 실온의 슬라이드 박스에 보관하세요.
    참고: 포마잔 침전물은 물에 불용성이기 때문에, 염색은 강도 손실 없이 수년간 보존할 수 있습니다.

6. 영상 및 처리

  1. 1.25배 대물렌즈를 사용하는 광학 현미경을 설치하고 CellSens 소프트웨어를 실행해 영상을 촬영하세요.
  2. 심장 부위를 시야 중앙에 위치시키세요.
  3. 필요에 따라 노출 시간, 초점, 화이트 밸런스를 조정하세요.
  4. 각 섹션의 이미지를 촬영하고 같은 하트의 모든 이미지를 전용 폴더에 저장하세요.
  5. R 스크립트(보조 파일 1)를 RStudio 플랫폼에 복사하고 R 기반 자동화 알고리즘을 실행하여 MI를 평가합니다. 이 알고리즘은 각 절편에 대해 평면적 경색 크기를 계산하고 심장 전체의 총 경색 부피를 계산합니다.
  6. 데이터셋을 엑셀 파일로 내보내고 필요에 따라 데이터를 분석하세요.
  7. 각 하트의 모든 이미지를 ImageJ 플랫폼에 불러와 이후 3D 재구성을 진행하세요.
  8. ImageJ 플랫폼의 팝업 메뉴를 사용해 모든 이미지를 일관되고 순차적으로 쌓으세요.
  9. 표면 플롯 함수를 사용해 3D 구조물을 만듭니다.
  10. 볼륨 뷰어 창을 열고 3D 투영을 위한 모든 매개변수를 조정하세요.
    참고: 면역조직화학9 방법론과 기존 TTC 염색 4,5 영상은 이전에 보고되었으며 이 원고에는 포함되지 않았습니다.

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결과

현미경 TTC 염색을 수행하는 데 필요한 주요 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 두 차례 TTC 염색 후, 심장 표면에 뚜렷한 펀치 무늬가 나타났습니다. 전체 심장을 100μm 간격으로 연속 절단하여 약 80개의 조직 절편을 얻었고, 결찰 부위는 약 60번째 절편 부위에 위치했습니다. 각 절편에서 생존 가능한 심근세포(viaCM)의 짙은 붉은 염색은 피크린산으로 표지된 노란 괴사 조직(necCM)과 명확히 구별되어 뚜렷한 경계선을 보였다(그림 2A). 모든 절편의 3D 재구성을 통해 심장 내 viaCM과 necCM의 공간적 분포와 부피가 추가로 시각화되었습니다(그림 2B). 기존 염색 프로토콜과 이미지 품질을 직접 비교해 보면, 현미...

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토론

장기간 심근경혈증으로 인한 심근경색(MI)은 허혈성 손상이 효과적인 혈액 순환에 필요한 심장의 수축 기능을 자주 저해하기 때문에 전 세계적으로 중요한 보건 문제로 남아 있습니다. 지난 수십 년간 허혈성 스트레스에 대한 심장 저항력을 높이는 중재나 화합물을 규명하는 데 상당한 노력이 기울여져 왔습니다. 효소 방출11, 허혈 후 기능 회복, 또는 배양된 세포의 세포 생존 지수 등 대체 대리 종말 지표가 탐구되었으나, 조직 괴사의 직접적인 정량화만이 항경색 중재의 효능을 확실히 확인할 수 있습니다. 따라서 중성된 심장에서 심근세포의 생존성과 심근경색을 신뢰할 수 있고 조기에 검출하는 방법은이 분야 연구를 진전시키는 데 필...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 FoKo 23/2013과 뒤셀도르프 심혈관 연구소(CARID)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.25배 목표올림포스플랜아포 1.25X/0.04영상
10 mL 주사기B. 브라움4617100V역관류
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드밀리포어1.08380.0100화학물질
20G 캐뉼라BD305895역관류
3  mL 주사기B. 브라움4617022V역관류
3방향 스톱콕B. 브라움16494C역관류
아쿠아마운트 BDH362262H사이로섹션
밸런스오하우스해당 없음화학물질 무게 측정
쌍안경 마이크로스코프라이카MZ6캐뷸레이션
C57BL/6J장비에해당 없음동물
카메라올림포스UC30영상
표지 슬립에프레디아BB02400500A113MN20사이로섹션
크라이오스탯라이카M850사이로섹션
더블 디스틸드 워터밀리포어해당 없음용해 화학물질
미세한 해부 가위에스큘럽BC702R외과 기구
미세 해리 겸자;에스큘럽FM001R외과 기구
유리 현미경 슬라이드엥겔브레히트11102사이로섹션
이미지JNIH1.54g영상 처리
이소플루란피라말14150097146754화학물질
이소프로판올로스그리고 nbsp; 0733.1화학물질
광학 현미경올림포스BX61영상
미세 박리 겸자;F.S.T.11152-10외과 기구
OCT 복합물사쿠라4583화학물질
페트리 접시테르노 사이언티픽172931역관류
인산염 완충 식염수로스9143.1화학물질
Rstudio포싯 소프트웨어2024.09.0영상 처리
실크 봉합F.S.T.18020-60역관류
소프트웨어올림포스셀센스 V3.2영상
스테인리스 해부 가위에스큘럽BC257R외과 기구
잠보니 해법모르피스토12773.0050화학물질

참고문헌

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