심근손상의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 위한 현미경 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화염법 분석법

Zheheng Ding; Hui Zhang; Pascal Bouvain; Zhaoping Ding; Ulrich Flögel

doi:10.3791/68596

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방법 논문

심근손상의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 위한 현미경 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화염법 분석법

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DOI:

10.3791/68596

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2025년 11월 28일

Zheheng Ding^*¹ , Hui Zhang^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Pascal Bouvain¹ , Zhaoping Ding¹ , Ulrich Flögel¹

¹Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, ²Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, ³Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, ⁴Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, ⁵Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

현재의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 분석법은 미세한 해상도로 심근 손상을 분석할 수 있는 정교한 TTC 염색 프로토콜을 도입하여, 세포 수준에서 경색 크기와 심근세포 생존성을 정확하고 신뢰할 수 있게 하는 고품질 이미지를 생성합니다.

초록

이 프로토콜에서는 세포 해상도에서 심근경색(MI)을 정확하고 신뢰할 수 있게 분석하기 위한 정제된 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화(TTC) 기반 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 경색된 심장에 대해 24시간 후 시행하는 두 단계의 TTC 염색 절차를 포함합니다: 관류(1% TTC 용액을 대동맥 캐뉼라를 통해 역행적으로 관상동맥 혈관을 관류하는 관류)와 이후 심장을 4°C에서 TTC 용액에 하룻밤 동안 수용하는 침수(imcusion)입니다. 염색 후 심장은 OCT 화합물에 박혀 100μm 간격으로 50μm 두께의 가로로 냉동절개됩니다. 잠보니 고정제로 24시간 고정 과정을 거친 후, 현미경 검사를 통해 생존 가능한 심근(짙은 적색)과 괴사 조직(노란색) 사이의 뚜렷하고 뚜렷한 경계가 구분됩니다. 특히, 이 현미경 TTC 분석은 급성기(심근경 사망 후 24시간)뿐만 아니라 7일 이상의 긴 시간 창에 걸쳐 심근경 심근 검출을 가능하게 합니다. 현미경 TTC 분석법은 심장당 80개의 다층 이미지를 생성하기 때문에, 우리는 대규모 이미지 데이터셋을 빠르고 효율적으로 분석하고 전 지구적 경색 크기를 몇 분 내에 정량화할 수 있는 견고한 색상 기반 반자동 알고리즘을 개발했습니다. 이러한 개선을 통해 현재 접근법은 TTC 염색 과정을 크게 개선하여 심장 허혈 손상을 연구하는 실험실에 널리 적용 가능하고 가치 있는 도구를 제공합니다.

서론

지난 20년간 심장 보호는 심부혈성 손상 이후 심근세포를 보존하는 핵심 전략으로 계속 추구되어 왔습니다^1. 실험적 및 임상 환경 모두에서 심근 손상의 최종 범위는 심장 보호 중재의 효율성을 평가하는 데 중요한 지표입니다^. 따라서 경색 크기에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 평가는 매우 바람직하고 근본적으로 중요합니다.

설치류 모델에서 사후 경색 크기 평가의 표준 프로토콜은 주로 미토콘드리아 탈수소효소의 활성에 의존했는데, 이 과정은 무색 화합물인 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)를 생존 가능한 세포에서는 붉은 침전물로 전환하는 반면, 괴^{사 조직에서는} 연한 회색을 유지합니다. 임신 유산 염색은 간단하고 비용 효율적이지만, 여러 방법론적 도전과 내재적 한계를 안고 있습니다. 여기에는 TTC 용액에서 축복을 겪는 심장 절편이 포함되며, 이는 조직을 심하게 변형시켜 평평하게 눕히지 못하게 합니다; 샘플 처리 중 고르지 않은 슬라이스 두께; 그리고 경색 경계의 정확한 경계 표시를 방해하는 낮은 화질이 있습니다. 최근 몇 년간 샘플 준비 과정에 여러 기술적....