방법 논문

질량분석법 기반 락틸롬 및 락틸화 단백질의 확인

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DOI:

10.3791/68597

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2026년 4월 24일

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1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 식도 편평세포암 세포주를 이용한 단백질 락틸화 분석 방법을 설명합니다. 이 과정은 세포 배양에서 단백질 락틸화를 분석하여 후보 확인을 포함하며, 락틸화 기반 질량분석법 분석과 면역침전법 확인을 포함합니다.

초록

2019년에 처음 확인된 락틸화는 라이신 잔기의 새로운 번역 후 변형(PTM)으로, 이후 여러 병리와 생리학적 맥락에서 관심을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 이 물질은 두 가지 이성질체(L-락틸화와 D-락틸화)를 가지고 있으며, 복합체 형성, 세포 위치 또는 표적 단백질의 안정성을 변화시키는 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 TE11 식도 편평세포암 세포주를 예로 들어 세포 배양에서 락틸화를 분석하여 잠재적 락틸화 표적의 확인을 수행하는 방법을 설명합니다. 다음 프로토콜은 질량분석(MS) 분석을 위한 L-락틸리신(KL-LA)특이적 면역침전(IP)을 통한 락틸화 단백질 식별에 관한 세부 사항을 제공합니다: (1) 단백질 추출, (2) 단백질 환원, 알킬화 및 소화, (3) 단백질 정제 및 펩타이드 농도, (4) KL-LA 비즈를 이용한 IP, (5) KL-LA 펩타이드 농도. 이 단계에 따라 MS 원시 데이터를 분석하여 락틸화 부위를 식별하고, IP에 의한 이러한 추정 락틸화 단백질의 확인을 기술할 것입니다. 이 방법을 사용하면 100개에서 500개의 펩타이드를 식별할 수 있으며, 관심 있는 락틸화 단백질을 확인할 수 있습니다. 결론적으로, 락틸화 단백질 연구는 정상 및 질병 상태 모두에서 PTM 기반 세포 신호전달에 대한 이해를 향상시킬 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

락틸화는 당화에서 유래한 대사산물을 이용한 라이신 잔기의 번역 후 변형(PTM)입니다. L-락틸-CoA와 락토일글루타치온은 각각 L-락틸화(KL-LA)와 D-락칠화(KD-LA)의 기질입니다 1,2. L-락틸화는 아세틸트랜스퍼라제 3,4와 같은 효소를 포함하는 효소적 과정입니다. 반대로 D-락틸화는 락토일글루타치온과 라이신 잔기 5 사이의 친핵적 치환에 의한 비효소적 과정입니다. 동적 과정으로서 HDAC1-3과 같은 탈아세틸화제는 락틸화6의 지우기 물질로 지워지는 것으로 지목되었습니다. 2019년 발견 이후, 3는 여러 병리와 생리학적 맥락에서 관심을 받는 것으로 밝혀졌습니다2. 이 PTM은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-탠덤 질량분석법(MS/MS) 분석을 통해 72.021 Da의 질량 이동을 관찰하여 히스톤에서 처음 확인되었습니다. 그 이후로 락틸화는 히스톤 이외의 다른 단백질에서도 검출되었으며, 7,8,9,10 맥락에 따라 변형된 단백질의 기능적 다양성, 위치 또는 안정성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.

PTM이 자주 저 존재하며 동적이고 일시적인 과정의 일부이기 때문에, 조사된 PTM의 면역침전(IP)에 의한 농축이 필요하다. 그 다음, MS는 소화된 펩타이드의 PTM 연결 프로테옴(예: 인산화 단백질 또는 유비퀴틴화프로파일링)을 설명하는 데 자주 사용된다. 다른 PTM, 락틸로움 또는 농축 락틸화 펩타이드와 마찬가지로, MS 기반 프로테오믹스는 새로운 락틸화 부위를 식별하는 골드 스탠다드이다.

이 프로토콜은 MS 기반 단백질체학을 통해 KL-LA 풍부화 펩타이드를 확인하고, 면역침전을 통해 락틸화 단백질을 확인하는 과정을 설명합니다. 식도 편평세포암(ESCC) 세포주를 예로 들어, MS 기반 락틸화 표적을 확인하고 IP로 확인하기 위한 락틸화 단백질을 추출하는 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

PTM은 동적이고 일시적인 과정이므로, 유세포분석이나 항KL-LA 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 사용하여 총 락틸화 수준이 최적의 수렴점을 미리 확립하는 것이 중요합니다. 예를 들어, ESCC 세포주에서는 락틸로움 및 IP 실험에서 총 락틸화 수준이 가장 높기 때문에 70%-80%의 합류율이 바람직합니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양

  1. 앞서 언급한 대로 필요한 수율에 도달할 때까지 100mm 페트리 접시에서 세포를 키웁니다.
    참고: 락틸로옴은 0.5-1 mg 단백질, IP(IP)는 2 mg 이상을 얻을 수 있을 만큼 충분한 세포를 배양하세요.
  2. 5mL의 미리 냉각된 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
  3. 500 μL 미리 냉각된 PBS를 추가하고 세포 스크레이퍼로 세포를 채취합니다. 1 mL 저결합 미세관으로 옮깁니다.
  4. 2,000 x g 원심분리기 셀을 실온(RT)에서 5분간 보관한 후 투명한 상원액을 버립니다. 셀 펠릿은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.

2. 락칠롬

참고: 샘플 오염을 방지하기 위해 항상 장갑을 착용하세요. 항상 필터링된 팁, 저결합 마이크로튜브, MS 등급 물을 사용하세요.
참고: 생물학적 복제(저희 경험상 3-5건)는 확인된 변형이 재현 가능하도록 항상 수행해야 합니다.

  1. 단백질 추출
    참고: 얼음 위에서 연습하세요.
    1. 락틸롬 용해 완충제(표 1)를 준비하여 사용 전 4 °C에서 보관하세요. 사용 직전에 프로테아제 억제제를 추가하세요.
    2. 적절한 용해 버퍼 양을 사용해 단백질을 추출합니다.
    3. 얼음 위에서 5초 펄스 + 5초 해제 12회 사이클을 20%-25% 강도로 투여합니다.
    4. 16,000 x g 원심분리기를 4°C에서 10분간 가열합니다. 단백질이 포함된 투명 상청액을 새로운 저결합 마이크로튜브로 옮깁니다.
    5. 제조사의 권장에 따라 비신코닌산(BCA) 키트를 사용해 단백질을 정량하세요.
      참고: BCA 키트는 최대 3M 요소와 호환됩니다. 따라서 샘플은 적절히 희석되어야 합니다.
    6. 단백질 500 μg에서 1 mg을 새로운 저결합 마이크로튜브에 옮깁니다. 각 샘플에 동일한 양의 단백질을 사용합니다. 락틸로옴 용해 버퍼로 모든 샘플의 부피를 최종 부피 일치로 완성합니다.
  2. 환원, 알킬화 및 효소 소화
    1. 최종 농도는 5mM에 디티오트레이톨을 첨가합니다. 95°C에서 2분간 배양합니다.
    2. RT에서 30분간 부양하세요.
    3. 최종 농도는 7.5 mM에 클로로아세트아마이드를 첨가합니다. RT에서 20분간 어둠 속에서 배양합니다.
    4. 2.1.6단계의 샘플 부피인 1 M(NH4)2CO3의 3배를 추가하여 요소를 8 M에서 2 M으로 환원합니다.
      참고: 전체 부피가 마이크로튜브의 용량을 초과하면 두 개의 마이크로튜브로 나누세요.
    5. 단백질 100 μg당 MS 등급 트립신 1μg를 첨가합니다. 30°C에서 하룻밤 배양합니다. 샘플 정제를 진행합니다.
  3. 정제 및 펩타이드 농도
    참고: RT에서 일합니다.
    1. 샘플을 최종 농도인 0.2%로 삼불화아세트산(TFA)을 첨가하여 산성화합니다.
    2. MS 등급의 물에 신선한 용액을 준비하세요: 0.1% TFA, 1% 개미산(FA), 1% FA/50% 아세토니트릴.
    3. 정제 작업을 진행하려면 C18 100mg 컬럼을 사용하세요.
      참고: 이 컬럼을 사용하려면 두 개의 피펫 팁을 사용하세요: 한 개의 피펫 팁을 컬럼에 적재하고 다른 하나의 팁을 잘라서 액체를 컬럼에서 배출하세요. 컬럼이 일정하게 젖어 있도록 하세요. 샘플당 한 개의 컬럼을 사용하세요.
    4. 100% 아세토니트릴(습윤용액) 1mL를 컬럼에 충전한 후 배출합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
    5. 0.1% TFA 1mL를 충전하여 컬럼을 평형으로 만들고 배출합니다. 두 번 반복합니다.
    6. 산성화된 샘플 1mL를 컬럼에 충전합니다. 샘플을 10회 전하/배출 사이클로 진행합니다. 샘플이 남아 있으면 반복합니다.
    7. 0.1% TFA 1mL를 충전하여 컬럼을 세척하고 배출합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
    8. 용출을 위해서는 1% FA/50% 아세토니트릴 750 μL 사용으로 10회 전하/배출 사이클을 진행합니다. 새로운 저결합 마이크로튜브에 수집합니다. 추가로 750 μL 1%/50% 아세토니트릴을 투여하여 총 1.5 mL의 정제 펩타이드를 얻습니다.
      참고: 캡이 아닌 측면에 마이크로튜브를 위치시켜 구멍을 뚫면서 샘플을 오염시키지 않도록 하세요.
    9. 증발을 위해 바늘로 마이크로튜브 캡에 1개에서 3개의 구멍을 뚫으세요.
    10. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 60°C에서 필요한 만큼 농축합니다(최종 부피 1.5mL의 경우 최소 4시간이 소요될 수 있습니다). 그 후 펩타이드의 면역침전을 진행합니다.
  4. KL-LA 비즈를 이용한 면역침전
    1. 워시 버퍼와 락틸롬 IP 버퍼를 준비합니다(표 2).
    2. 얼음 위에 농축된 펩타이드에 200 μL IP 버퍼를 첨가하고, 용해될 때까지 충분히 혼합합니다. 일부 침전물은 여전히 보일 수 있습니다.
    3. 12,000 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거합니다.
      참고: 원심분리 후에는 예를 들어 분광광도계를 사용하여 205nm에서 펩타이드 농도를 정량하여 시료를 투여할 수 있습니다.
    4. 200 μL 얼음 냉각 1x PBS로 2,000 x g에서 4 °C에서 1분간 원심분리하여 KL-LA 아가로스 결합 구슬을 3회 세척하고, 각 세척 후 투명 상환액을 제거합니다.
      참고: 이 프로토콜 시작 시 단백질 1mg을 섭취할 때, 사용 용이성을 위해 이전에 0.5mL 저결합 튜브에 담겨 둔 KL-LA 아가로스 결합 비즈 20 μL을 사용하세요.
    5. 재현탁된 펩타이드가 포함된 투명 상청액을 미리 세척된 구슬이 들어 있는 0.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다. 누출을 막기 위해 튜브를 파라핀 필름으로 밀봉합니다.
    6. 4°C에서 부드럽게 끝에서 끝까지 회전시키며 하룻밤 배양하세요.
      참고: 2.4.7-2.4.12 단계는 모두 4 °C에서 수행됩니다.
    7. 2,000 x g 에서 원심분리하여 1분간 구슬을 알리팅합니다. 투명한 상정액은 버립니다.
    8. 락틸로메 IP 버퍼 200 μL을 추가하고 튜브를 뒤집어 15초간 세척합니다. 2,000 x g 에서 원심분리기를 30초간 사용한 후 투명한 상원액을 버립니다.
    9. 2.4.8 단계를 한 번 반복하세요.
    10. 세척 완충액 200 μL을 추가하고 튜브를 뒤집어 15초간 세척합니다. 2,000 x g 에서 원심분리기를 30초간 사용한 후 투명한 상원액을 버립니다.
    11. 2.4.10 단계를 두 번 반복하세요.
    12. MS 등급 물 200 μL을 추가하고 튜브를 뒤집어 30초간 세척합니다. 2,000 x g 원심분리기에 1분간 넣은 후 투명한 상원액을 버립니다.
      참고: 락틸롬 프로토콜의 나머지 단계는 RT에서 수행됩니다.
    13. 결합된 펩타이드를 100 μL 용출 완충제(0.1% TFA 신선 준비)로 1분간 용출하고, RT에서 부드럽게 끝에서 끝까지 회전시키세요. 원심분리기에서 2 분간 세척 합니다.
    14. 2.4.13 단계를 두 번 더 반복하고 용출물을 합치세요. 샘플 정제를 진행하세요.
  5. KL-LA 펩타이드의 농축 및 정제
    1. MS 등급 담수에서 다음 용액을 준비하세요: 0.1% TFA, 1% FA, 1% FA/50% 아세토니트릴.
      참고: 정제 시작 직전에 적절한 양의 용액을 1.5 mL 마이크로튜브에 준비하세요(2.5.3단계: 100% 아세토니트릴 300 μL, 2.5.4단계: 0.1% TFA 300 μL, 2.5.6단계: 0.1% TFA 300 μL, 2.5.7단계: 1% FA 300 μL / 50%).
    2. 정제를 진행하려면 100 μL C18 팁을 사용하세요.
      참고: 100 μL C18 팁은 전통적인 피펫 팁과 동일한 방식으로 사용됩니다. 엄지손가락을 고정한 채 플런저를 절대 놓지 말아 컬럼을 촉촉하게 유지하고 공기 유입을 방지하세요.
    3. 100% 아세토니트릴(습윤용액) 100 μL을 흡입한 후, 모든 액체를 배출하지 않고 조심스럽게 분사합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
    4. 0.1% TFA 100 μL을 흡입하여 컬럼을 평형으로 만들고 조심스럽게 분배합니다. 두 번 반복합니다.
    5. KL-LA 펩타이드 샘플 100 μL을 컬럼에 충전합니다. 새로운 저결합 마이크로튜브에서 10회의 전하/배출 사이클을 진행합니다. 샘플이 남아 있으면 반복합니다.
    6. 0.1% TFA 100 μL 흡인하여 컬럼을 세척하고 분제합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
    7. 100μL 1% FA/50% 아세토니트릴 용액을 새로운 저결합 마이크로튜브에 사용하여 10회 전하/배출 사이클을 진행합니다. 두 번 반복한 후 용출액을 결합합니다.
      참고: C18 팁에 결합하는 펩타이드는 팁이 한 번에 100 μL씩 흡입하는 것을 막을 수 있습니다. 이 과정을 2.5.7단계에서 마이크로튜브(300 μL)에 더 이상 액체가 없을 때까지 반복합니다.
    8. 증발을 위해 바늘로 마이크로튜브 캡에 1개에서 3개의 구멍을 뚫으세요.
      참고: 구멍을 뚫는 과정에서 샘플을 오염시키지 않도록 튜브 측면에 있는 마이크로튜브를 확인하세요.
    9. 진공 농축기를 사용해 액체가 증발할 때까지 60 °C에서 샘플을 농축합니다(총 300 μL 부피의 경우 최소 2시간이 걸릴 수 있습니다).
    10. 농축된 펩타이드를 1% FA 30 μL 용량에 재현탁합니다.
    11. 질량분석기 가이드라인에 따라 205nm 분광광도계로 펩타이드를 정량하여 농도를 측정하세요.
    12. 유리 바이알에 옮겨 MS 분석이 나올 때까지 4 °C에서 유지하세요.

3. MS 분석 및 생물정보학

참고: 샘플은 셔브룩 대학교 프로테오믹스 코어 시설에서 질량 분석기(MS)를 사용해 분석되었으며, 데이터 의존 획득과 병렬 축적-직렬 단편화(DDA-PASEF) 모드로 작동했습니다.

  1. 질량분석법
    1. 각 샘플마다 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 375 ng의 펩타이드를 주입합니다.
    2. 펩타이드를 분당 4 μL의 일정한 유량으로 트랩 컬럼에 적재합니다.
    3. 분석용 C18 컬럼에서 5%-37% 아세토니트릴의 2시간 구배를 사용해 0.1% FA에서 400 nL/min의 유량으로 펩타이드를 분리합니다.
    4. 다음 설정으로 전기분무 이온화를 수행하세요: 모세관 전압: 1500 V, 건 가스: 분당 3.0 L, 건조 온도: 180 °C, TIMS 압력: 2.6 mBar.
    5. DDA 자동 MS/MS 모드를 사용하여 100-1700 m/z 범위의 질량 스펙트럼을 획득하세요.
      참고: 이 장비는 0에서 5+까지의 전하 상태를 감지하도록 설정되어 있습니다. 이중 트랩 이온 이동성 분광기(TIMS) 구성이 사용되며, 램프 시간은 100ms이며, 획득 사이클당 10회의 병렬 축적-직렬 단편화(PASEF) 스캔이 이루어져 1.17초의 듀티 사이클을 가집니다. 동적 배제는 0.4분으로 설정되어 있습니다.
    6. 충돌 유도 해리(CID) 에너지를 20-59 eV에서 선형 증가시켜 0.6-1.6 Vs/cm²의 이온 이동도 범위를 이용해 파편화를 수행합니다.
      참고: 목표 강도는 20,000으로 설정되어 있으며, 강도 임계값은 2,500입니다. 표준 필터 다각형을 적용하여 대각선 스캔선을 따라 m/z-이온 이동성 평면에서 +2, +3, +4 전하 펩타이드의 전구를 우선시합니다.
  2. 데이터 전처리: MaxQuant 분석
    참고: 다음 단계는 MaxQuant v.2.6.713 소프트웨어를 사용하여 락틸화된 펩타이드를 식별합니다.
    1. 오른쪽 상단 섹션에서 구성 탭을 클릭하고 수정 기능으로 젖질화가 추가되었는지 확인하세요.
    2. 만약 아니라면, Unimod.org 데이터베이스14를 사용하세요. 게스트로 로그인하여 lactylation(accession #2114)을 검색하세요.
    3. Add 버튼을 클릭하세요. Name에 Lactylation (K)을 입력하고, Unimod에 작성된 대로 Change 버튼을 눌러 구성문을 입력하세요.
    4. 얻은 단일동위원소 질량을 확인하세요. 확인을 클릭하세요.
    5. 화면 왼쪽 상단의 파란색 화면에서 변경 사항 저장 버튼을 클릭하세요.
    6. 왼쪽 상단 섹션에서 Raw 데이터를 클릭하세요. 원시 데이터 파일을 불러와서 ' No fractions ' 버튼을 사용해 자동으로 이름을 지정하세요.
    7. 컴퓨터에서 접근 가능한 코어 수를 기준으로 왼쪽 하단에 스레드 수를 설정하세요.
    8. 그룹 특별 탭에서 파란색으로 표시된 수정 항목을 클릭하세요.
    9. 오른쪽 칸에 화살표 버튼을 눌러 가변 수정에 유토화를 추가하세요.
    10. 라벨 없는 정량화를 클릭하세요. LFQ를 입력하고 정규화 유형을 '없음(none)'으로 변경하세요.
    11. 소화를 클릭하세요. 오른쪽 칸에 트립신/P가 추가되었는지 확인하세요.
    12. 최대 누락 절단 수를 4 개로 늘리세요. 락틸화가 트립신 소화에 영향을 줄 수 있습니다.
    13. 기기를 클릭하세요. 주요 검색 펩타이드 내성을 20으로 변경하세요. 락틸화는 흔한 PTM이 아니기 때문입니다.
    14. 왼쪽 상단 섹션에서 글로벌 매개변수를 클릭하세요. 해당 종에 대해 이전에 Uniprot 또는 Ensembl에서 다운로드한 Fasta 파일을 추가하세요.
    15. 식별 자 규칙 을 클릭하고 테스트 하여 Fasta 파일이 올바르게 읽힐 수 있는지 확인하세요.
    16. 파란색으로 ' 단백질 정량화 '를 클릭하세요. 오른쪽 사각형에 락틸화를 추가하세요.
    17. 파란색 으로 식별 을 클릭하세요. FDR 을 0.05로 변경하세요. 두 번째 펩타이드 와 실행 간 일치 를 반드시 확인하세요.
    18. 파란색으로 라벨 없는 정량화 를 클릭하세요. iBAQ와 Top3 박스를 체크하세요.
    19. 오른쪽 상단 섹션에서 'Performance'를 클릭하세요.
    20. 하단 섹션에서 파란색으로 시작(Start )을 클릭하세요.
  3. 락틸화 단백질의 식별
    참고: MaxQuant 실행이 끝나면 다음과 같은 여러 출력 파일이 얻어집니다:
    • 락틸화 (K) 부위: 주요 관심 파일 - 정확한 펩타이드 서열(단백질 확인, 락틸화 위치 확인, 강도, 신뢰 수준)에 따른 락틸화 라이신 잔기의 부위 특이적 정보를 포함합니다.
    • 락틸화 매개변수: MaxQuant 분석 중 사용되는 설정과 임계값에 관한 모든 정보를 포함합니다.
    • 락틸화 펩타이드: 변형 및 변형되지 않은 펩타이드를 확인했습니다.
    • 락틸화 단백질 그룹: 단백질 그룹과 이들이 검출된 락틸화와 연관성을 확인했습니다.
    이 파일들의 사용은 연구 질문에 따라 달라집니다. 다음 단계는 락틸화 부위를 식별하는 방법을 설명합니다.
    1. 엑셀에서 Lactylation (K)Sites 파일을 열어보세요.
    2. 원본 데이터를 유지하려면 하단의 ' 락틸화 (K)Sites' 탭을 복제하세요.
    3. 역 방향과 잠재적 오염물 열을 A에서 Z까지 정렬하세요. 일부 행에 값이 있으면 해당 행을 삭제하세요.
    4. 이 새 탭에서는 다음과 같은 필요한 열만 유지하세요: (1) 단백질: UniProt14 주요 등록 번호, (2) 단백질 내 위치: 후에서 설명한 대로 확인해야 할 것으로 예측되는 락틸화 위치, (3) 단백질 이름, (4) 유전자 이름, (5) 락틸화 횟수(해당 펩타이드에서 검출된 K), (6) 락틸화 (K) 확률(락틸화 위치에서 1의 확률), (7) 강도(해당 펩타이드에 속하는 모든 개별 강도의 합).
    5. 단백질 이름이나 유전자 이름 같은 누락된 값을 완성하세요.
    6. '단백질' 열의 첫 번째 인사이트 번호만 유지하세요. 얻은 표는 검출된 모든 락틸화 펩타이드와 이 펩타이드가 발견될 가능성이 가장 높은 단백질을 나타냅니다.
      참고: 락틸화는 풍부한 PTM이 아니므로, 100개에서 500개 사이의 펩타이드가 옥탈화된 것으로 확인될 것으로 예상됩니다. 검출된 펩타이드는 복제마다 다르기 때문에, 최소 2개의 생물학적 복제에서 검출된 임계값을 설정할 수 있습니다.
    7. 변형된 잔기의 위치를 확인하려면 NIH15 의 BLAST 또는 UniProt16 의 Align과 같은 정렬 웹 도구를 사용하며, 'Lactylation (K) Probabilities' 열의 펩타이드 서열(확률 삭제)과 UniProt데이터베이스 17의 단백질 서열을 사용하세요.
      참고: 단일 단백질 서열에서 여러 락틸화 부위를 식별할 수 있기 때문에, 이들 부위를 동시에 정렬하는 것이 가능합니다. 이는 단백질 서열에서 같은 위치에 있지만 서로 다른 펩타이드에 있을 수 있는 중복 부위를 식별하는 데도 도움이 됩니다.
    8. 데이터 분석은 연구 질문에 따라 다르지만,통계 데이터 분석을 수행하기 전에 정규화, 중심화, 확장, 로그 변환 단계를 반드시 고려해야 합니다.
    9. MS 분석으로 확인된 락틸화 단백질을 확인하기 위해 면역침전 프로토콜을 진행합니다.

4. 면역침전(IP)

  1. 단백질 추출
    참고: 얼음 위에서 연습하세요.
    1. IP 용해/세척 버퍼(표 3)를 준비하여 사용 전 4 °C에서 보관하세요. 사용 직전에 프로테아제 억제제를 첨가하세요.
      참고: 샘플 준비에는 -80 °C에서 보존된 세포 펠릿을 사용할 수 있습니다. 신선한 세포를 다룰 경우 4.1.2 및 4.1.3 단계를 따르십시오. 그렇지 않으면 4.1.2단계에서 명시한 것과 동일한 용량의 IP 용해/세척 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하고 4.1.4단계를 진행하세요.
    2. IP 용해/세척 완충액 1mL를 추가하고 4°C에서 세포를 10분간 배양합니다.
    3. 세포 스크레이퍼를 사용해 세포를 채취하고 용해를 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
    4. 4°C에서 부드럽게 끝에서 끝으로 돌려 30분간 배양하세요.
    5. 16,000 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
    6. 투명한 상청액을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
    7. 제조사 프로토콜에 따라 BCA 키트로 단백질을 정량화하세요.
  2. 비즈 사전 투명화 및 KL-LA 항체 배양
    참고: 얼음 위에서 작업하세요. 각 실험 조건에 대해 대조군 IP 튜브(KL-LA 항체와 같은 종의 IgG)와 KL-LA IP 튜브를 준비하세요.
    1. 단백질 1mg을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다. IP 용해/세척 버퍼를 사용해 모든 샘플을 최종 부피로 동일하게 완성합니다.
      참고: 이 프로토콜은 자기 비드 또는 아가로스 비즈를 사용하여 수행할 수 있습니다. 다음 단계에서는 자기 비드가 사용되었습니다.
    2. 필요한 양의 구슬을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
    3. 비드를 미리 세척하려면 30초 또는 용액이 투명해질 때까지 자화를 가하세요. 투명 상원액을 버립니다. 500 μL IP 용해/세척 버퍼로 비드를 3번 세척합니다. 각 세척 후 투명 상액을 버립니다. 처음 채취한 비드 부피와 같은 양의 IP 버퍼를 추가합니다.
    4. 단백질 샘플을 10-15 μL 미리 세척한 비즈와 함께 4 °C에서 부드러운 끝에서 끝 간 회전시키고 20분간 배큐합니다.
      참고: 단백질 1mg의 경우 10-15 μL 자기 구슬을 사용하세요. 이 단계는 면역침전 프로토콜 중 비특이적 단백질이 구슬에 결합하는 것을 최소화합니다.
    5. 구슬을 30초 또는 용액이 투명해질 때까지 자화시킵니다. 투명한 상원액을 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
    6. 한 튜브에는 1.5 μL 항체 항체,다른 튜브에는 해당 양의 IgG를 추가합니다.
      참고: 이 프로토콜 시작 시 단백질 1mg에 대해서는 항체 1.5 μg를 사용하세요.
    7. 샘플을 4°C에서 밤새 부드러운 양측 회전으로 배양하세요.
  3. KL-LA 면역침전
    참고: 얼음 위에서 연습하세요.
    1. IP 용해/세척 버퍼(표 3)를 준비하여 사용 전 4 °C에서 보관하세요. 사용 직전에 프로테아제 억제제를 첨가하세요.
    2. 4.2.3 단계에 설명된 대로 구슬을 미리 세척하세요.
      참고: 이 프로토콜 시작 시 단백질 1mg에 대해서는 40 μL 자기 구슬을 사용하세요.
    3. 샘플을 40μL 미리 세척된 자기 구슬과 함께 4 °C에서 부드럽게 끝에서 끝까지 회전시키고 4시간 동안 배양합니다.
    4. 구슬을 30초 또는 용액이 투명해질 때까지 자화시킵니다. 첫 번째 투명한 상환액을 수집합니다. 500 μL IP 용해/세척 완충제로 구슬을 3번 세척합니다. 세척 후 투명 상환액을 제거합니다.
      참고: 첫 번째 상청액은 정량화하여 서부 블롯팅(WB)에 사용할 수 있습니다. 면역침전의 효능을 평가하는 데 유용합니다.
    5. 20 μL 2x Laemmli 버퍼와 5% β-머캅토에탄올 버퍼로 구슬을 재현탁합니다.
    6. SDS-PAGE 겔에 적재하기 전에 95°C에서 5분간 인큐베이팅합니다. 또는 변성된 샘플은 -20°C에서 몇 주간 보관할 수 있습니다.
  4. WB 검출
    1. IP 튜브를 자기 스탠드 위에 30초간 올려놓은 후 샘플을 채취하여 SDS-PAGE 겔에 적재합니다.
    2. 관심 단백질에 대한 항체 및/또는 항-KL-La 항체를 사용하여 5% 소 혈청 알부민(BSA)에서 락틸화 단백질의 풀다운을 확인하기 위해 WB를 수행한다. 2차 항체는 5% BSA에서 1:5000 비율로 희석되었다.
    3. HRP 기반 화학발광 검출법을 사용해 밴드를 검출하세요.

결과

예를 들어, 식도 편평세포암 TE11 세포주는 80% 융합률에 도달할 때까지 배양되었습니다. 그림 1 에 나타난 워크플로우와 이 프로토콜에 설명된 MaxQuant 분석을 따라 락틸롬이 결정되었습니다. 이 세포들에서 137개의 펩타이드가 잠재적으로 락틸화된 것으로 확인되었으며, 이는 동일한 단백질 내 여러 부위가 확인된 82개의 고유한 단백질을 나타냅니다(그림 2A). 이는 고유 펩타이드를 고려하지 않는다는 점에 유의하세요. 식도 편평세포암 세포주에서 100개에서 500개 사이의 확인된 펩타이드가 예상됩니다.

확인된 락틸화 단백질은 이미 문헌에서 젖화된 단백질에 풍부하게 포함된 것으로 기술된 크로마틴 재형성 또는 크로마틴 조립과 같은 여러 생물학적 과정과 관련이 있습니다(그림 2B). 최초로 확인된 락틸화 단백질 중 일부는 히스톤으로, 이 데이터에서도 Histone H1.2(표 4)와 같이 찾아볼 수 있습니다. 락틸화는 동일한 단백질에서 여러 다른 라이신 잔기에서 확인될 수 있습니다. 예를 들어, 히스톤 H1.2에서 두 개의 락틸화 부위가 확인되었습니다: 라이신 (K) 168(아마도)과 191입니다. 첫 번째 펩타이드(표 4, 2행)에서는 K168 잔기가 0.733 on 1로 락틸화될 확률이 더 높고, K169는 0.267 확률이 관찰되었습니다. HNRNPA1 올바른 변형 잔기를 결정하기 위해 정렬이 필요한 펩타이드의 좋은 예입니다.

락틸롬 결과를 바탕으로 HNRNPA1의 락칠화를 검증하기 위해(표 4), 이 번역 후 변형을 표적으로 하는 IP 분석이 수행되었습니다. 먼저, 어떤 비드 유형이 항KL-LA항체와 최적의 상호작용을 보이는지 확인하기 위해 G 비드와 A/G 비즈를 비교했습니다. KL-LA 항체로 IP 검사를 수행한 후 KL-LA에 대한 WB를 사용한 후, 두 비드 유형 모두에서 KL-LA 단백질의 눈에 띄는 농축이 관찰되었으며, 이는 예상대로 입력값과 비교되었습니다(그림 3). 이 결과는 락틸화 단백질 농축에 있어 프로토콜의 효율성과 견고함을 보여줍니다. 두 비드 유형 사이에서 유저한 차이는 관찰되지 않았습니다. MS가 확인한 표적을 검증하기 위해 특정 IP를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, MS가 확인한 HNRNPA1의 락틸화(표 4)는 보정되었습니다. KL-LA IP 및 HNRNPA1 WB 이후 HNRNPA1에 해당하는 특정 밴드가 검출되어 HNRNPA1가 락틸화에 의해 변형되었음을 나타냅니다(그림 4). G 및 A/G 구슬 모두 표적 단백질에 성공적으로 면역침전되었으나, A/G 구슬에서는 더 강한 HNRNPA1 신호가 관찰되어 친화력 또는 회복 증가를 시사합니다.

figure-results-1
그림 1: 락틸로옴 분석 워크플로우 개요. 약어: IP = 면역침전; KL-LA = L-락틸리신; LC-MS/MS = 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

figure-results-2
그림 2: TE11 세포의 락틸롬에 대해 얻은 일부 단백질의 대표 결과입니다. (A) 확인된 단백질 및 펩타이드 총 수. 동일한 단백질 내에서 여러 락틸화 부위를 식별할 수 있습니다. (B) STRING 데이터베이스를 통해 얻은 TE11 세포 내 락틸화 단백질에 대한 상위 5가지 생물학적 과정. P값은 Benjamini-Hochberg를 이용한 여러 검사를 통해 보정되었습니다. 각 막대의 숫자는 이 유전자 온톨로지(GO)에서 총 단백질 수 중 락틸화된 것으로 확인된 네트워크 내 단백질 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

figure-results-3
그림 3: G 또는 A/G 비드를 이용한 KL-LA 면역침전과 TE11 세포에서 Pan-KL-LA 의 WB 검출. Pan-KL-LA 검출은 이 PTM의 면역 침전의 효능과 특이성을 확인하는 데 중요한 대조군입니다. 이 실험은 IP 검사가 KL-LA 변형을 보유한 단백질을 성공적으로 농축하도록 보장합니다. (*)는 IP: IgG lanes(대조 IP) (N = 3)에서 명확히 관찰된 항체의 중사슬과 경사슬을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

figure-results-4
그림 4: G 또는 A/G 구슬을 이용한 KL-LA 의 면역침전과 WB에 의한 HNRNPA1 검출. G 또는 A/G 비드를 이용한 KL-LA 특이적 면역침전에서 WB의 HNRNPA1 검출은 TE11 세포 내 젖질화를 확인한다(N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 보시기 바란다.

해결책최종 집중
요소8 M
탄산암모늄1 M
젠장20 mM

표 1: 락틸로옴 용해 버퍼. MS 등급 물에서 준비하고 pH를 8로 조정.

용액 - 락틸롬 워시 버퍼최종 집중
나클100 mM
EDTA1 mM
트리스-HCl20 mM
락틸롬 IP 버퍼 추가하기최종 집중
NP-400.5%

표 2: 락틸롬 워시 버퍼와 IP 버퍼. MS 등급 물에서 준비하고 두 용액 모두에 대해 pH를 8로 조정하는 과정.

해결책최종 집중
염화나트륨100 mM
불화나트륨50 mM
트리스-HCl (pH 7.5)50 mM
β-글리세로인산40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
글리세롤5%
트리톤 X-1001%
신선한 채 넣기:
프로테아제 억제제 칵테일 100X1배
PMSF1 mM
정류반산물0.2 mM

표 3: IP 용해/세척 완충제. 변성제가 없어야 하며, 변성제가 단백질 내 PTM의 존재를 불안정하게 만들 수 있습니다.

단백질 내 위치단백질단백질 명칭유전자 이름락탈화 수(K)락틸화 (K) 확률강도
168P16403히스톤 H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403히스톤 H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0알파-2-매크로글로불린 유사 단백질 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0크로모박스 단백질 상동체 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0크로모박스 단백질 상동체 3CBX31TTLQK(0.828) MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2단백질 JTBJTB2K(0.858) ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651이질적인 핵 리보핵단백질 A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

표 4: TE11 식도 편평세포암 세포주에서 얻은 락틸화 펩타이드의 대표 결과. 이 표는 MaxQuant 분석 후에 얻은 것입니다.

토론

이 프로토콜은 KL-LA 변형 단백질의 면역침전을 MS에서 사용하여 새로운 락틸화 단백질과 그 락틸화 부위를 발견하는 방법을 설명합니다. 이 락틸로옴 프로토콜은 접합 비즈를 사용해 수행되지만, 연구 질문에 따라 KL-LA 항체 또는 KD-LA 항체로도 달성할 수 있습니다. 접합 비드 대신 항체를 사용할 경우, 다클론 항체를 선택하면 여러 에피토프에 결합할 수 있어 더 밀접한 복합체 형성이 촉진됩니다; 하지만 이 방법은 변동성을 초래할 수 있습니다. 접합 비드의 장점 중 하나는 항체가 고체 지지체에서 방출되어 MS 샘플을 오염시킬 수 있는 침출을 방지한다는 점입니다. 또한 접합되지 않은 항체를 사용하는 것보다 시간 효율도 더 높습니다.

더불어, 이 분석에서 확인된 펩타이드의 양은 여러 요인에 의해 영향을 받을 수 있다는 점도 중요합니다. 첫째, 항체 특이성은 올바른 단백질이 포획되도록 하는 데 중요한 역할을 합니다. 아가로스 비드로 사전 투명화 단계를 추가하면 비특이적 상호작용을 제거할 수 있습니다. 반면, 락틸화가 트립신 소화에 영향을 미칠 수 있는지는 알려지지 않았습니다. 락틸화는 아르기닌 잔기의 C-말단 펩타이드를 절단하지만, 가장 중요한 라이신 잔기의 절단을 의미합니다. 만약 그렇다면, 펩타이드 덮개 감소로 이어질 수 있습니다. 따라서 프로테아제에 대한 다른 선택지를 고려할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 한계를 고려하여 '최대 누락 절단' 매개변수를 증가시킵니다. 마지막으로, 샘플 준비 및 취급, 예를 들어 피부에서 나온 케라틴 오염을 방지하기 위한 장갑 착용, 또는 PTM 회전이 동적이고 때로는빠른 공정이므로 변형 안정성도 고려해야 합니다.

저 점유율 PTM과 같은 락틸화의 검출이 낮은 광범위한 MS 접근법과 달리, MS 기반 프로테오믹스를 통한 농축된 KL-LA 펩타이드의 확인은 새롭게 특성화된 락틸화 부위 및 락틸화 단백질 식별과 같은 상세한 PTM 부위 분석을 가능하게합니다. 웨스턴 블롯은 세포 내 락틸화의 일반적인 패턴에 대한 정보를 제공할 수 있지만, 단백질 특이적 락틸화에 대해서는 알 수 없습니다. 따라서 IP는 MS 검출된 PTM20을 확인하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 근접 연결 분석법(PLA)은 프로테오믹스로 확인된 잠재적 표적의 락틸화를 확인하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기법입니다21. 이 기법은 변형 단백질의 위치도 표시할 수 있으나, 특이성은 낮습니다. 락틸화 특이적 IP 접근법은 광범위한 PTM 스크리닝에 적합하지만, 연구 질문에 따라 단백질 특이적 IP를 수행하는 것도 흥미로울 수 있습니다.

전체 단백질 추출물 내 특정 락틸화 단백질의 비율을 정량화할 때, IP만으로는 충분하지 않습니다. KL-LA 비즈를 이용한 IP는 락틸화된 단백질의 포획을 가능하게 하지만, 목표 단백질 농축에 한정되어 정확히 정량화되지는 않습니다. 따라서 질량분석이 필요하며, 이는 락틸화의 정량적 정량 측정을 위한 보다 상세한 분석을 제공합니다. 따라서 항체를 이용해 잠재적으로 락틸화된 단백질을 IP로 분석한 후 질량분석법으로 분석하면 전체 단백질 샘플 내 락틸화 단백질의 비율을 확인할 수 있으며, IP 분석은 MS에 의해 확인된 단백질의 락틸화 비율을 확인하는 효율적인 방법입니다.

비접합 항체를 사용하는 IP에서는 비드와 항체 비율을 최적화하여 락틸화 단백질의 최적 포획을 보장하는 것이 필수적입니다. 실제로 이 두 성분 간의 균형은 IP의 특이성과 효율성에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체가 과도하면 비특이적 결합이 발생해 배경 잡음이 증가하고 전체 검출 정확도가 저하될 수 있습니다. 반대로 표적 단백질 농축이 비효율적이어져 신호가 약해지고 감도가 떨어질 수 있습니다. 이러한 기술적 고려사항은 락틸화 단백질 연구에서 신뢰할 수 있고 정확한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 항상성 조절 후 락틸화 프로필 변화(예: 암 8,10)를 모니터링하는 데 사용될 수 있으며, 이는 약물 관련 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법을 통해 바이오마커 식별도 가능할 수 있습니다. 여러 세포주, 조직 유형, 심지어 환자 생검에도 적용 가능하며, 이 기법은 질병이나 정상 상태에서 PTM 기반 세포 신호전달에 대한 이해를 심화시킬 잠재력을 지니고 있습니다.

공개 사항

이해 충돌은 공개하지 않았습니다.

감사의 글

과학적 논의를 위해 지루 연구실의 모든 구성원에게 진심으로 감사드립니다. 또한 셰르브룩 대학교 의과대학 및 보건과학부의 단백질체 및 질량분석학 플랫폼에 감사드립니다. VG는 캐나다 자연과학 및 공학연구위원회(RJPIN-2019-06185)와 캐나다 보건연구소(178171)의 지원을 받고 있습니다. VG는 위장관 줄기세포 생물학 분야에서 캐나다 연구 의장 2단계(Tier 2)를 보유하고 있습니다. MH는 셰르브룩 대학교 염증 및 종양소화센터, 셰르브룩 재단, CRCHUS, TRaIning A New Generation of Gastroenterology and LivEr(TRIANGLE) 프로그램, 그리고 FRQ로부터 장학금을 받았습니다. FMB는 FRQS 우수 연구 학자(366044)입니다. VG와 FMB는 FRQS가 지원하는 "Centre de Recherche du CHUS"의 회원입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 uL 지퍼 팁 C18 피어스87784
어크레임 PepMap100 C18디오넥스 코퍼레이션1649460.3mm 내경 x 5mm
아세토니트릴 (MS 등급)피셔A955-4
탄산암모늄시그마-올드리치A6141-500
항HNRNPA1 단클론 항체노버스 바이오롤로컬스 NB100-672
항-L-락틸리신(KL-La) 단클론 항체PTM-바이오PTM1401RM
항마우스 IgG, HRP 연관 항체CST7076S
항토끼 IgG, HRP 연관 항체CST7074S
Azure 280생태계AZI280-01
BCA 키트써모피셔 사이언티브P123227
보빈 혈청 알부민 (BSA)와이즌트800-095-EG
캡티브 스프레이 나노ESI 소스브루커 달토닉스
클로로아세트아마이드시그마-올드리치C0267
클래러티 맥스 웨스턴 ECL 기질바이오-래드1705062
디티오트레이톨 (DTT)써모피셔 사이언티브R0861
Dynabeads 면역침전용 단백질 G 비즈써모피셔 사이언티브10004D
EDTA시그마-올드리치E9884
개미산(FA; MS 등급)써모피셔 사이언티브A117-50
글리세롤피셔 사이언티브BP229-1
HEPES (1세 남자)와이즌트330-050-EL
하이퍼셉 C18 100mg 칼럼피셔60108-302
KL-LA 아가로스 공액 비즈PTM-바이오PTM-1404
라엠블리 2X (SDS, 브로모페놀)위즌트, J.T. 베이커800-100-CG, D293-01
저결합 마이크로튜브 0.5 mL사르스테트72.704.600
저결합 마이크로튜브 1.5 mL써모피셔 사이언티브P190410
마이크로튜브 1.7 mL악시겐MCT-175-C
나노엘루트 HPLC 시스템브루커 달토닉스1.9um 입자 크기, 75um 내체 x 25cm
정상 토끼 IgG 다클론 항체밀리포어 시그마12-370
펩셉브루커 달토닉스1811112
인산염 완충 식염수(PBS)와이즌트311-425-CL
PMSF써모피셔 사이언티브36978
프로테아제 억제제 조합 (사진)시그마-올드리치P8340-5
세라-마그 스피드비즈 단백질 A/G 자성 입자써모피셔 사이언티브09-981-920
염화나트륨시그마-올드리치S9888-500
불화나트륨시그마-올드리치S1504
정박나트륨 정박상염시그마-올드리치S6508
TimsTOF 프로 질량분석기 브루커 달토닉스
트리플루오로아세트산 (TFA)써모피셔 사이언티브A116-50
트리스-HCl와이즌트600-125-IK
트리톤 X-100시그마-올드리치X100
트립신(MS 등급)피어스90058
요소써모피셔 사이언티브U15-500
진공 상태 플러스에펜도르프22820168
수도(MS 등급)VWR10803-890A
&베타;-글리세로인산시그마-올드리치G5422
β-머캡토에탄올시그마-올드리치M3148

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