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방법 논문

곤충병원성 진균의 독성 스크리닝을 위한 고추총채벌레(Scirtothrips dorsalis Hood) 사육 시스템 구축

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/68600

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2025년 7월 18일

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

이 논문에서

요약

한천이 함유된 유리 용기에서 변형된 분리엽 방법을 사용하여 고추 총채벌레를 대량 사육하기 위한 분리잎 생물학적 분석 프로토콜이 확립되어 높은 생존율과 동기화된 발달을 보장했습니다. 이 시스템은2nd instar 유충에 대한 곤충병원성 곰팡이 독성을 효율적으로 스크리닝할 수 있으며 실험실, 온실 및 현장 평가를 위한 신뢰할 수 있는 총채벌레 공급을 제공합니다.

초록

고추 총채벌레(Scirtothrips dorsalis Hood)는 대만에서 관상용 및 식용 작물의 경제적으로 중요한 해충입니다. 곤충병원성 곰팡이(EPF)는 총채벌레 관리를 위한 친환경 생물학적 방제제로 작용하고 있습니다. 현장에 적용하기 전에 실험실 조건에서 고추 총채벌레에 대한 EPF 분리물의 독성을 스크리닝하는 것이 중요합니다. 그러나 고추 총채벌레의 사육 방법에 대한 제한된 데이터는 대규모 실험실 스크리닝에 어려움을 제기합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 S. dorsalis의 대량 생산을 위한 수정된 실험실 사육 방법을 개발했습니다.

이 방법은 고추 총채벌레에 대한 EPF를 평가하는 데 적합한 한천 함유 유리 용기를 사용하여 분리된 잎 사육 시스템을 사용합니다. 이 최적화된 분리잎 생물 검정 시스템은 고추 총채벌레에 대한 EPF의 효능을 평가하는 데 적합합니다. 이 시스템은 독성 스크리닝을 위해 동일한 발달 단계에서 많은 수의 총채벌레를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 본 검사에 따르면, 동충하초 카테니아눌라타 (Cc-NCHU-213) 분리물이 접종 후 7일(d.p.i.)에 고추총채벌레의 2번째 인스타 유충에 대해 가장 높은 독성(53.6%)을 보였다. 또한, 한천이 박힌 잎 원반은 7일 이상 신선하게 유지되어 관찰 기간 동안 총채벌레가 생존(대조군 처리 시 90% 생존율)할 수 있어 사육 시스템의 안정성을 나타냅니다. 이 프로토콜은 대량 생산을 위한 안정적인 사육 시스템을 보여주고 고추 총채벌레에 대한 EPF 분리물의 독성을 평가하기 위한 것이며 다른 총채벌레에 유용할 수 있으므로 현장에서 총채벌레를 방제하기 위한 잠재적인 EPF 분리물을 스크리닝할 수 있습니다.

서론

고추 총채벌레 (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae)는 채소, 관상용 및 과일 작물을 포함한 40개의 서로 다른 식물과에 걸쳐 100종 이상의 식물 종에 감염되는 다식성 해충입니다1. 열대 및 아열대 아시아-동남아시아, 인도, 일본, 대만이 원산지입니다2. 우리가 아는 한, 고추 총채벌레는 대만의 망고, 차, 블루베리, 연꽃을 포함한 농업 및 관상용 작물의 해충입니다. 지난 20년 동안 고추 총채벌레는 세계화의 증가와 개방된 농산물 무역으로 인해 여러 국가에서 중요한 경제적 해충이 되었습니다. 또한, 높은 번식 잠재력과 새로 침입한 지역에 대한 적응력도 이 해충의 확산에 기여했습니다 1,3.

고추총채벌레은 주로 어린 잎, 새싹, 꽃잎 및 미성숙한 과일을 먹으며 괴사와 조직의 사멸을 초래합니다3. 또한 땅콩 새싹 괴사 바이러스(GBNV), 땅콩 엽록색 부채 반점 바이러스(GCFSV), 땅콩 황색 반점 바이러스(GYSV)4 및 담배 줄무늬 바이러스(TSV)5를 포함한 다양한 식물 질병의 매개체 역할을 합니다. 결과적으로, 고추 총채벌레에 의한 사료는 영향을 받는 작물의 수확량과 가치를 크게 감소시킬 수 있습니다. 고추 총채벌레의 성공적인 관리는 문화적, 생물학적, 화학적 방제 전략을 활용하는 통합 해충 관리 계획에 달려 있습니다1. 대만의 유기농 농부들은 일반적으로 협폭 오일과 님 오일과 같은 비화학 물질이나 포식성 진드기와 미세한 해적 벌레(개인적인 관찰에 의해)를 사용하는 것과 같은 생물학적 방제 방법을 사용합니다. 그러나 농부들의 피드백에 따르면 꽃과 결실기에 이러한 오일을 사용하면 수분을 방해하고 꽃가루를 손상시켜 수확량과 경제적 가치를 감소시킬 수 있습니다. 따라서 고추 총채벌레에 대한 효과적인 대체 방제 조치를 개발하는 것은 유기농 농부들에게 매우 중요합니다.

곤충병원성 곰팡이(EPF)는 효과적이고 지속 가능한 해충 관리 기술인 것으로 밝혀진 곤충을 죽이는 곰팡이 그룹입니다 6,7,8. 여러 연구에서 고추 총채벌레에 대한 EPF의 효과를 입증했습니다. 상업용 EPF인 Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) 및 Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC)는 장미 식물에서 고추 총채벌레에 대한 상당한 방제를 보여주었습니다 9,10. 고추 식물의 고추 총채벌레 개체군은 동충하초 자바니카(= Isaria fumosorosea)에 의해 감소시킬 수도 있습니다11. Lecanicillium lecanii 및 Purpureocillium lilacinum과 같은 다른 EPF는 고추 식물 및 차를 포함한 다양한 작물에서 고추 총채벌레에 대해 테스트되었으며 이 해충을 방제하는 데 효과적이었습니다12,13.

온실이나 현장에서 총채벌레 방제를 위한 EPF의 효능을 조사한 일부 이전 연구는 가장 효과적인 EPF 종/균주에 대한 첫 번째 스크리닝 없이 수행되어 효능이 제한되었습니다. EPF를 주의 깊게 선별하면 해충 관리를 크게 향상시킬 수 있습니다. 많은 연구에서 케이지 내의 온전한 식물에 대한 생물학적 분석을 위해 총채벌레를 사육했습니다11,14. 온전한 식물 사육 시스템은 총채벌레에게 보다 자연스러운 환경을 제공하지만, 총채벌레는 각 단계에서 뚜렷한 행동을 보이기 때문에 다양한 발달 단계를 관리하는 데 어려움을 겪습니다. 이러한 가변성은 특정 실험 목적을 위한 표적 단계의 선택을 복잡하게 만들 수 있습니다. 더욱이, 온전한 식물 사육 시스템 내의 토양 조건은 고추 총채벌레의 번식과 번식에 영향을 미칠 수 있으며, 이에 따라 후속 생물 검정에 사용할 수 있는 개체의 수를 감소시킬 수 있습니다15 추가 생물 검정을 위한 자원을 제한합니다. 또한 전체 식물 사육 시스템은 스트레스를 받은 식물이 총채벌레의 행동을 변화시킬 수 있고 더 많은 시간과 자원 집약적일 수 있기 때문에 식물에 대한 더 많은 공간과 지속적인 관리가 필요합니다. 실험실 생물 검정 실험을 위해 무생물 식물 물질(예: 분리된 식물 조직 또는 인공 사료)을 기반으로 한 총채벌레 사육 시스템에 대한 보고는 거의 없지만, 이러한 방법의 세부 사항은 종종 불분명하거나 생략되었습니다12,16.

이 연구는 실험실 조건에서 고추 총채벌레의 간단하고 비용 효율적이며 지속 가능한 대량 사육 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜에서, 잎 디스크 사육 방법(leaf disc rearing method)7은 대량 사육 총채벌레에 대한 보다 효율적이고 통제된 접근법을 제공하기 위해 수정되었으며, 환경 조건에 대한 엄격한 통제를 통해 생물학적 분석을 위한 발달 단계를 정확하게 선택할 수 있도록 했습니다. 또한, 안정적이고 재현 가능한 생물학적 분석 시스템을 개발하여 곤충병원성 진균(EPF) 분리물의 독성을 특정 용량 하에서 추정된 시간을 나타내는 50% 치사 시간(LT50) 및 50% 중간 치사 농도(LC50)로 평가하고 고추 총채벌레의 50% 폐사를 유발하는 데 필요한 진균 현탁액의 농도를 평가하고, 각각. 이 방법의 적용을 통해 현장에서 수집된 총채벌레를 정확하게 식별할 수 있으며, 총채벌레의 안정적인 실험실 군체를 유지하여 더 쉽고 재현 가능한 방법론을 사용하여 다양한 곰팡이 분리물의 효능을 테스트할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 전체 실험 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. Chilli thrips 밭 수집 및 식민지 유지 관리

  1. 고추 총채벌레 수집
    1. 영향을 받은 블루베리 농장의 블루베리 식물에 고추 총채벌레가 감염되었는지 잎의 양면과 꽃 내부를 육안으로 검사합니다.
    2. 각 샘플의 세부 사항(예: 식물의 일부 및 감염의 심각성)을 기록하고 광물유 및 천적의 적용을 포함하여 기존 농업 또는 유기 농업과 같은 생산 관행을 농부와 함께 확인합니다.
    3. 고추 총채벌레가 들끓는 잎과 꽃을 잘라 플라스틱 지퍼 백(재료 표)에 옮긴 다음 지퍼백에 약간의 공기를 넣어 총채벌레를 살려둡니다. 샘플을 3시간 이내에 실험실로 가져옵니다.
      참고: 밭 수집 시간이 3시간 이상일 때 샘플을 쿨러에 넣으십시오.
    4. 유리 사육 용기(높이 35mm, 내경 45mm)를 준비하고 유리 사육 용기 바닥에 원형 종이 타월(직경 40mm)을 3겹으로 깔고 여과수 8-10방울(400-500μL)을 추가합니다(그림 1 및 재료 표).
    5. 망고 밭에서 젊고 빨간 망고 잎을 수집합니다(그림 1). 유리 사육 용기를 준비하기 전에 잎을 씻고 광학 현미경(재료 표)으로 곤충 알 또는 기타 곤충 오염이 있는지 확인하십시오. 가죽 커터(재료 표)로 망고 잎을 원형 디스크(40mm)로 자르고 젖은 종이 타월 위에 올려 놓습니다.
      참고: 망고 잎은 계절에만 자라는 어린 블루베리 잎보다 총채벌레를 먹이기에 더 안정적인 자원입니다.
    6. 광학 현미경으로 10배 배율로 고추 총채벌레를 관찰하고 고추 총채벌레 10마리(수컷 5마리, 암컷 5마리)를 가는 페인팅 브러시(재료 표)를 사용하여 유리 사육 용기에 옮깁니다.
    7. 각 유리 사육 용기를 두 겹의 파라필름(Table of Materials)으로 밀봉하고 환기를 위해 #00 곤충 핀을 사용하여 약 40개의 작은 구멍을 만듭니다(Table of Materials).
    8. 유리 사육 용기를 인큐베이터에 25 ± 1 °C, ~70% 상대 습도와 광주기로 light:dark(L:D) = 12h: 12h(재료 표)로 유지합니다.
    9. 48 시간 후에 페인트 브러시를 사용하여 성인을 제거하십시오.
      참고: 우리의 관찰에 따르면 암컷 총채벌레는 유리 사육 용기로 옮겨진 후 ~2일 후에 알을 낳습니다.
    10. 산란을 추가로 확인하기 위해 실체현미경으로 알이 있는 잎 조직을 관찰합니다(그림 1 및 재료 표). 신선한 망고 잎 디스크를 달걀과 함께 잎에 놓고 종이 타월에 여과된 물 8-10방울을 떨어뜨려 습도를 유지합니다.
  2. 고추 총채벌레 개체군의 유지
    참고: 알은 ~5-7일 후에1st instar 유충으로 부화합니다.
    1. 1st instar 유충이 들어있는 잎을 새 유리 사육 용기에 직접 옮깁니다.
      알림: 페인트 브러시를 사용하여 1stinstar 유충을 새 유리 사육 용기에 부드럽게 옮겨 망고 잎의 썩고 예상치 못한 곰팡이 성장으로 인한 오염을 방지합니다. 우리의 관찰에 따르면 성인 암컷은 하루에 평균 6개의 알을 낳습니다.
    2. 고추 총채벌레를 매일 관찰하십시오. 종이 타월에 8-10일마다 여과된 물 4방울을 추가합니다. 오래된 잎이 마르기 전에 4일마다 용기 안에 신선한 망고 잎 디스크를 추가합니다.
      참고: 1stinstar 유충은 온도 및 습도와 같은 환경 요인에 따라 ~7-10일 안에 성인으로 나옵니다.
    3. 총채벌레이 성체로 성장할 때까지 매일 고추 총채벌레 개체군을 관찰하고 장기적인 개체군 유지를 위해 1.1.4단계의 단계를 반복합니다.
  3. 고추 총채벌레의 대량 사육
    1. 유지 된 개체군에서 암컷 성인을 수집하고 위의 단계에 따라 유리 사육 용기를 준비합니다.
    2. 성인 암컷 10명을 용기에 옮기고 1.1.4단계부터 1.1.10단계까지 단계를 따라 알이 있는 잎을 얻습니다.
      참고: 성인 암컷은 하루 평균 6개의 알을 낳습니다.
    3. 페인트 브러시를 사용하여 ~120 1st instar 유충을 새 유리 사육 용기에 부드럽게 옮깁니다.
    4. 고추 총채벌레를 매일 관찰하십시오. 4일마다 종이 타월에 여과된 물 8-10방울을 떨어뜨립니다. 오래된 잎이 마르기 전에 4일마다 신선한 망고 잎 디스크를 용기에 추가합니다.
    5. 알을 낳은 후 5-7 일에 1st instar 유충을 수집하십시오. 7-10일 후에 2개의 Instar 유충을 수집합니다. 생물학적 분석을 위해 ~14일 후에 성인을 수집합니다(그림 2).
      참고: 추가 실험을 위해 고추 총채벌레의 여러 단계를 구별하기 위해 형태학을 관찰합니다(그림 2).

2. 고추 총채벌레의 분자 식별

참고: 밭에서 수집된 총채벌레는 고추 총채벌레17,18에 일반적으로 사용되는 마커인 미토콘드리아 사이토크롬 산화효소 I(COI) 유전자 단편을 사용하여 분자 식별을 통해 종 수준까지 식별해야 합니다.

  1. 고추 총채벌레 게놈 DNA 추출
    1. 1.5mL 원심분리 튜브에 성체 고추 총채벌레 1개를 수집합니다(재료 표).
    2. 펠릿 유봉을 사용하여 고추 총채벌레를 균질화한 다음 제조업체의 프로토콜(Table of Materials)에 따라 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 분리합니다.
  2. PCR 증폭 및 DNA 염기서열분석
    1. COI 프라이머 쌍, 정방향 프라이머 LCO 1490 및 역방향 프라이머 HCO 2198과 함께 PCR Master Mix(2x)를 사용하여 부분 미토콘드리아 COI 유전자를 증폭하여 예상되는 고추 총채벌레 DNA 단편을 증폭합니다(Table of Materials).
      1. 2 μL의 thrip genomic DNA template, 각 1 μL의 정방향 및 역방향 프라이머, 10 μL의 2x PCR 마스터 믹스 및 6 μL의 ddH2O를 포함하는 20 μL PCR 혼합물을 준비합니다(재료 표).
      2. 94°C에서 2분 동안 초기 변성, 94°C에서 30초 동안 35회 변성, 52°C에서 1분 동안, 72°C에서 1분 동안 최종 확장, 10분 동안 72°C의 최종 확장(재료 표)과 같은 사이클링 조건에서 Thermal Cycler로 PCR을 수행합니다.
    2. 증폭 결과를 확인하기 위해 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 PCR 앰플리콘을 확인합니다(그림 3).
    3. 표적 밴드를 절제하고(예상 앰플리콘 크기는 658bp임) 제조업체의 프로토콜에 따라 Gel/PCR 정제 키트를 사용하여 고추 총채벌레의 COI PCR 앰플리콘을 정제합니다. 시퀀싱을 위해 정제된 제품을 상용 시퀀싱 서비스를 통해 보냅니다. (재료 테이블).
  3. 염기서열 분석
    1. 참조된 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 염기서열 품질을 평가합니다.
    2. FASTA 또는 TXT 파일을 열고 원하지 않는 시퀀스를 삭제하여 5' 및 3' 말단 모두에서 저품질 염기를 수동으로 트리밍합니다.
    3. 기본 매개변수를 사용하여 NCBI 데이터베이스(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 BLAST 검색을 수행하여 종 식별을 확인합니다.

3. 곤충병원성 진균의 제조

참고: 이 연구에 사용된 EPF 분리물은 표 1에 나열되어 있습니다.

  1. fungal resource library에서 fungal isolates의 회수
    1. 보존된 곰팡이 분생포자 육수(30% 글리세린에 현탁된 분생포자)를 -80°C 냉동고에서 해동합니다.
    2. 약 10μL의 분생포자 현탁액을 전달하고 층류 후드의 세포 스프레더를 사용하여 5.5cm 1/4 Sabouraud 포도당 한천(SDA) 플레이트에 고르게 펴 놓습니다. 배지는 0.75g의 Sabouraud 포도당 육수와 1.5g의 한천을 100mL의 이중 증류수 (ddH2O)에 혼합하여 제조됩니다 (재료 표).
    3. 페트리 접시를 파라필름(Table of Materials)으로 밀봉하고 플레이트를 25°C의 다크니스 인큐베이터에 10-14일 동안 옮깁니다.
    4. 새로운 1/4 Sabouraud 포도당 한천(SDA) 플레이트에 줄무늬를 만들어 활발하게 성장하는 곰팡이 균사체를 하위 배양합니다. 수확 전에 원추형 발달을 허용하기 위해 25 ° C에서 10-14 일 동안 곰팡이를 어둠 속으로 배양합니다.
      참고: 후속 생물학적 분석을 위해 약 10일 된 곰팡이 배양액을 사용하십시오. 14일 이상 된 배양액은 원생포자 생존율이 감소할 수 있으므로 독성 검사에 권장되지 않습니다.
  2. 분생포자 현탁액의 준비
    1. 1/4 SDA에서 10-14일 된 곰팡이 배양 표면에 0.03% Tween 80 2-3mL를 추가합니다. 멸균 루프를 사용하여 분생포자를 부드럽게 긁습니다(Table of Materials).
    2. 곰팡이 현탁액을 깨끗한 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    3. 최대 속도로 와류를 일으켜 서스펜션을 균질화하고 여과지를 통해 여과하여 균사 파편을 제거하고 순수한 분생포 현탁액을 얻습니다.
    4. 혈구계(Table of Materials)를 사용하여 광학 현미경으로 분생포자 수를 확인하고 현탁액을 108 conidia/mL로 희석합니다.
    5. 후속 생물 검정 적용을 위해 원생뿔 현탁액을 UV 광으로 멸균된 마이크로 분무기로 옮깁니다.
      알림: 침전을 방지하기 위해 각 이송 전에 원추형 서스펜션이 완전히 와류되었는지 확인하십시오. 사용하기 전에 마이크로 분무기를 층류 후드 내부에서 30분 동안 자외선에 노출시켜 살균하십시오.

4. 고추 총채벌레에 대한 독성 검사

  1. 2nd instar 유충의 준비
    1. 다음 실험을 위해 1.3.1-1.3.5 단계에 따라 2번째 instar 유충을 수집합니다.
      참고: 2번째 instar 유충은 첫 번째 instar 유충과 비교하여 노란색 몸 색깔과 넓은 복부로 구별합니다(그림 2).
  2. 접종 용기의 준비
    참고: 고추 총채벌레의 대상 작물에 따라 잎 종을 선택하십시오. 이 연구에서는 감염된 블루베리 'Biloxi'(V. corymbosum L. × V. darrowii Camp) 잎에서 고추 총채벌레를 수집했습니다. 따라서 고추 총채벌레에 대한 EPF의 생물학적 분석은 블루베리 잎에서 수행됩니다.
    1. 블루베리 농장에서 어린 블루베리 잎을 모아 블루베리 잎을 씻어 표면 먼지와 다른 절지동물(있는 경우)을 제거합니다.
    2. 나뭇잎을 자연 건조하거나 종이 타월을 사용하여 물을 닦아냅니다. 그런 다음 실체 현미경으로 블루베리 잎 표면에 다른 절지동물이나 알이 있는지 확인합니다. 절지동물이 있는 경우 제거합니다.
    3. 가죽 커터(재료 표)를 사용하여 직경 2.8cm의 잎 디스크를 자르고 1% 표백제(차아염소산나트륨 용액)를 사용하여 잎을 소독한 다음 멸균수로 2번 헹구어 잎에 남아 있는 표백제를 제거합니다.
      알림: 잎 디스크가 물 한천에 제대로 삽입될 수 있도록 한천 응고 전에 잎 디스크를 준비하십시오.
    4. 살균을 위해 2.5% 물 한천 용액(ddH2O 100mL당 2.5g 한천)을 고압멸균합니다.
    5. 한천이 응고되기 전에 층류 후드 내부의 작은 유리 용기(높이 35mm, 내경 30mm)에 2.5% 물 한천 3mL를 붓습니다. 한천이 반고체 상태가 될 때까지 약 40°C로 냉각시킵니다.
    6. 잎 디스크(인접 쪽이 위로 향하게)를 한천에 부드럽게 놓고 한천 표면 위에 최소한의 노출로 약간 끼웁니다. 물 한천이 완전히 응고되면 유리 용기는 생물학적 분석을 위한 준비가 된 것입니다.
  3. EPF 접종 및 관찰
    1. 적용하기 전에 원뿔형 현탁액을 철저히 와류에 넣으십시오. 마이크로 분무기를 사용하여 유리 용기 내에서 약 10cm 거리에서 각 잎 디스크의 표면에 0.1mL의 현탁액(3.2.4단계에서 준비)을 고르게 도포합니다.
      알림: 실험 전에 스프레이 영역을 테스트하십시오. 스프레이가 얇은 층으로 전체 잎 디스크를 고르게 덮는지 확인하십시오. 잎에 고인 물에 물방울이 쌓이면 과도한 습윤을 방지하기 위해 접종량을 줄이십시오.
    2. 멸균 조건(예: 층류 후드)에서 잎의 분생포자 현탁액을 30분 동안 자연 건조합니다.
    3. 고운 페인트 브러시를 사용하여 2nd instar 유충 10 개를 각 용기에 옮기고 각 유리 사육 용기를 두 겹의 파라 필름으로 밀봉합니다.
    4. 환기를 위해 #00 곤충 핀(재료 표)을 사용하여 ~30개의 작은 구멍을 만듭니다.
    5. 25 ± °C 인큐베이터에서 ~70% 상대 습도와 L:D = 12시간: 12시간의 광주기로 용기를 접종합니다.
    6. 7일 동안 매일 10배 배율로 실체현미경으로 고추총채벌레의 폐사율을 관찰하고 기록하십시오.
    7. EPF 감염을 확인하기 위해 진균증 관찰을 위해 죽은 유충을 유리 용기 안에 보관하십시오.

5. 선택된 EPF 분리물의 생물학적 검정

참고: 가장 독성이 높은 EPF 분리물 또는 독성이 높은 여러 분리물을 고추 총채벌레에 대한 용량 의존적 생물학적 분석을 위해 선택할 수 있습니다. 106에서 108 conidia/mL에 이르는 세 가지 다른 원뿔 농도를 사용하여 용량과 병원성 사이의 관계를 평가했습니다.

  1. 분생포자 현탁액의 준비
    1. 3.1단계에 따라 선택한 EPF 분리체를 복구합니다.
    2. 3.2단계에 설명된 대로 3가지 농도의 분생자리 현탁액(106, 107 및 108 conidia/mL)을 준비합니다.
  2. 2nd instar 유충의 준비
    1. 4.1단계에 따라 두 번째 instar 유충을 수집하여 새로 출현한 성충을 얻습니다.
  3. 접종 용기의 준비
    1. 4.2단계를 따릅니다. 물 한천에 박힌 블루베리 잎 디스크를 포함하는 접종 용기를 준비합니다.
  4. EPF 접종 및 관찰
    1. 4.3단계에서 설명한 대로 3가지 농도의 분생포자 현탁액으로 EPF 접종을 수행합니다.

6. 통계 분석

  1. 사망률 계산
    1. 진균 처리 간의 차이를 평가하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하기 전에 Arcsin 변환으로 각 진균 균주의 사망률 데이터를 변환합니다(유의 수준은 p < 0.05로 설정됨).
    2. Tukey의 HSD(Honest Significant Difference) 검정을 사용하여 치료 수단의 사후 비교를 수행합니다.
  2. 치사 시간 중앙값(LT50) 및 치사 농도 중앙값(LC50) 계산
    1. 프로빗 회귀 분석을 사용하여 치사 시간 중앙값(LT50)과 치사 농도 중앙값(LC50) 값을 계산합니다.
    2. 소프트웨어 인터페이스에서 관측된 데이터를 사용하여 "총계", "반응" 및 "기간"(LT50의 경우) 또는 "농도"(LC50의 경우)라는 변수를 생성하고 채웁니다.
      참고: 관찰 기간 내에 누적 폐사율이 50%를 초과하지 않는 경우 LT50 및/또는 LC50 값을 안정적으로 추정할 수 없습니다.
    3. Analyze(분석) | 회귀 분석 | 프로빗. "total"을 테스트한 곤충의 총 수로, "response"를 죽은 곤충의 수로, "duration" 또는 "concentration"을 공변량으로 설정합니다. 옵션을 눌러 이질성 계수의 유의 수준을 0.05로 설정하고 이질성 계수 사용에 대한 유의 수준을 0.05로 설정합니다.

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결과

이 연구에서 제시된 실험적 흐름도는 현장 수집부터 EPF 분리물의 독성 스크리닝에 이르기까지 고추 총채벌레의 안정적인 사육 시스템이 확립될 수 있음을 보여주었습니다(그림 1). 형태학적 관찰을 통해 고추 총채벌레를 다른 꽃 총채벌레와 구별할 수 있지만, PCR 앰플리콘 크기 및 COI 염기서열 분석을 포함한 부분 COI 염기서열을 분자 마커로 사용하면 현장에서 채취한 총채벌레를 고추총채벌레로 식별하는 것을 추가로 확인할 수 있습니다(그림 3). 분리된 잎 사육 시스템은 총채벌레가 자손을 번식시킬 수 있는 더 나은 제어 환경(즉, 온도 및 습도)과 충분한 먹이 공급원을 제공합니다. 따라서 사육 용기에서 안정적인 고추 총채벌레 식민지를 보장합니다. 독성 스크리닝 생물 검정(그림 4)에서 대조군 처리에서 총채벌레의 생...

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토론

고추 총채벌레는 옥수수, 땅콩, 후추, 콩, 딸기, 고구마 및 토마토와 같은 경제적으로 중요한 수많은 작물에 영향을 미치는 세계적으로 중요한 해충입니다 1,11,19. 현재의 방제 전략은 천적, 선충류 및 EPF의 사용을 포함한 문화적 관행, 생물학적 방제제 및 화학적 처리를 포함하는 통합 접근 방식에 의존합니다 11,14,20,21. 그러나 EPF 효능을 평가하는 대부분의 연구는 온실 또는 현장 조건에 초점을 맞추기 때문에 독성이 높은 분리물을 선택하는 데 시간이 많이 걸리고...

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공개 사항

저자는 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

블루베리 식물을 제공한 Humi 블루베리 농장(타이중시 우펑 구)의 Lin, Huanf-Jen 씨에게 특별한 감사를 전합니다. 이 연구는 NSTC(National Science and Technology Council)의 113-2313-B-005 -024 -MY3의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#00 곤충 핀엔토스핑크스 DMM0220영국산
1.5 mL 원심분리기 튜브코닝 법인MCT-175-C미국에서 제조
10 & 뮤; L 접종 루프NEST 사이언티픽718201미국에서 제조
100 bp DNA 사다리 III제네에이드엔씨007대만에서 제조되었습니다.
2x SuperRed PCR 마스터 믹스바이오툴TE-SR01 시리즈대만산
6cm 페트리 접시알파 플러스 사이언티픽16021대만산
한천바이오맨 사이언티픽AGR001.1미생물학 등급
아가로스바이오맨 사이언티픽PB1200 시리즈대만산
BioGreen Safe DNA 젤 완충액바이오맨 사이언티픽SDB001T대만산
Easy DNA 고속 추출 조직 키트피셔 바이오텍ET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf(호주제)
포워드 프라이머: LCO 1490유전체학 PO-PR220919G6시퀀스: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow 젤/PCR 키트제네에이드DFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
유리 사육 컨테이너&NBSP;Sunshine Lab 장비 회사크기: 높이 35mm, 내경 45mm. 플라스틱 또는 유리 컵의 모든 유사 크기로 repalce할 수 있습니다.
혈구계폴 마리엔펠트640030독일에서 만든
부 화기하이포인트F740대만산
가죽 커터실제 수제 워크숍https://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp 열 순환기써모 피셔 사이언티픽A37834미국에서 제조
광학 현미경 니콘  Ci-L일본 업체
페인팅 브러쉬Tian Cheng 브러시 회사4716608400352크기 0 또는 1 원형 브러시에 해당하는 끝이 가는 수채화 브러시로 교체할 수 있습니다.
종이 타월5월 꽃BLS007-8대만산
파라필름 M베미스PM-996미국에서 제조
펠렛 유봉바이오맨 사이언티픽GT100R대만산
리버스 프라이머: HCO 2198유전체학 PO-PR220919G6시퀀스: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Sabouraud 포도당 국물하이미디어MH033-500G인도에서 만든
실체현미경솝탑SZN71 시리즈대만산
TAE 버퍼 50X바이오맨 사이언티픽TAE501000대만산
트윈 80PanReac AppliChem142050.1661대만산
지퍼 백웬첸 플라스틱 회사1809000061크기: 너비 12cm, 길이 17cm. (대만제)

참고문헌

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