이 프로토콜은 깨어 있는 마우스에서 척수의 초음파 자극을 위해 특별히 설계된 초음파 변환기 고정 시스템을 설명합니다. 이 방법은 고정 시스템을 사용하여 초음파 변환기의 정확한 위치를 보장하는 동시에 실험 대상자가 자극의 정밀도를 손상시키지 않고 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
집속 초음파(FUS)는 척수 신경 조절에 대한 상당한 잠재력을 보여주는 혁신적인 비침습적 신경 조절 기술로 등장했습니다. 그러나 척추를 따라 안정적인 변환기 고정을 달성하는 것은 주목할만한 기술적 과제를 제시합니다. 기존의 고정 방법은 종종 장기간의 동물 마취가 필요하거나 부적절한 접착 신뢰성을 보여줍니다. 이러한 중요한 제약은 작동 안정성과 생리적 호환성을 모두 보장하는 새로운 고정 패러다임을 개발해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스의 척수 자극을 위한 혁신적인 초음파 변환기 고정 시스템을 도입합니다. 척추에 초음파 변환기를 정밀하게 배치하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 확립하는 것이 신경자극 실험의 핵심입니다. 이 방법은 T13 척추체의 외과적 노출, 가시돌기의 정밀 연삭을 통해 평면 접촉 인터페이스를 생성하고, 의치상 재료와 접착제 혼합물을 사용하여 금속 베이스와 콜리메이터를 척추에 고정하는 세 단계를 통합합니다. 제한 없는 움직임을 통해 자연스러운 운동 행동을 허용하고 세션 간 공간적 변화를 최소화하면서 안정적인 위치를 보장하여 의식이 있는 동물 모델에서 초음파 매개 척수 개입 조사를 용이하게 합니다. 이는 척추 손상 복구, 혈액-척수 장벽 조절 및 만성 통증 메커니즘에 대한 행동 평가가 필요한 연구와 특히 관련이 있습니다. 깨어 있는 동물 신경조절 연구에서 중요한 기술적 과제를 해결함으로써 이 프로토콜은 움직임 제한 없이 안정적인 변환기-척추 인터페이스를 제공하여 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 실험 결과를 위한 길을 열어줍니다.
서론
척수는 중추신경계와 말초신경계 사이의 정보를 통합하는 중요한 허브로, 통증 신호 전달, 운동 신경망 재구성, 신경가소성 조절 등의 분야의 임상 연구에 유용합니다. 새로운 비침습적 신경조절 기술인 집속초음파(FUS)는 척수 신경 조절의 중요한 수단이 되었습니다. 심부 조직 침투, 밀리미터 수준의 공간 해상도 및 제어 가능한 에너지 출력 매개변수의 물리적 특성을 통해 그 적용은 기초 신경 메커니즘 연구에서 다양한 척수 병리학적 모델의 전임상 번역 연구까지 확장됩니다.
연구에 따르면 FUS는 척수 신경 회로를 억제하거나 열 및 기계적 효과를 통해 활성화하는 두 가지 방법으로 조절할 수 있습니다. 또한 조직에 대한 시간적 가역성과 안전성이 특징입니다 1,2,3. 척수 손상 모델 연구에서 FUS는 염증 반응을 조절하고 신경 복구를 촉진함으로써 쥐의 운동 능력을 향상시켰습니다 4,5,6. 또한, FUS는 미세기포 매개 캐비테이션 효과를 통해 혈액-척수 장벽을 열고 국소 약물 전달 효율을 향상시키는 것으로 나타났습니다 7,8. 신경병성 통증 분야에서, Liaoet al. FUS가 KCC2 발현을 조절하고 CaMKIV KCC2 경로를 억제함으로써 쥐의 신경병성 통증 증상을 효과적으로 완화한다는 것을 확인했습니다9. 송 et al. 요추 척수에 적용된 저강도 tsFUS가 쥐 만성 수축 손상 모델에서 기계적 이질통을 유의하게 감소시키고 미세아교세포 활성화를 억제한다는 것을 입증했습니다10. FUS로 정밀한 척수 조절을 달성하는 것은 초음파 에너지 전달 시스템의 공간적 안정성에 달려 있습니다. 현재의 고정 전략은 크게 두 가지 범주로 나뉩니다. 1) 강성 고정 방법 : 정위 프레임을 사용하여 정확한 위치 지정을 달성하지만 지속적인 마취가 필요하여 실험 대상자의 신경 활동을 억제하고 행동 평가의 타당성에 영향을 미칩니다 1,2,3,4,10 ; 2) 유연한 고정 방법 : 탄성 벨트 장치를 사용하여 의식이 있는 피험자에 대한 연구가 가능하지만 척추의 이동성이 크기 때문에 변위 오류 및 변환기 박리가 있습니다 6,8,9. 또한, 척추 박판의 기하학적 이질성은 초음파 에너지의 상당한 감쇠로 이어져 신경 변조의 효율성을 감소시킵니다 7,8.
이 연구는 의식이 있고 자유롭게 움직이는 마우스의 척수 신경 조절 연구를 위한 이식형 집속 초음파 변환기 고정 방식을 혁신적으로 제안합니다. 이 프로토콜은 최소 침습적 수술 접근법을 사용하여 금속 베이스, 콜리메이터 및 척추를 통합하고, 초음파 변환기의 반복 착용을 지원하고, 초음파 표적의 일관성을 보장하고, 박판을 통한 초음파 에너지 감쇠를 허용 가능한 범위 내로 유지합니다. 개발된 방법론은 기존 접근 방식의 중요한 한계를 해결하여 깨어 있고 행동하는 동물에서 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 척수 신경조절 실험을 가능하게 합니다. 주요 매개변수에는 T13에서 2.5cm 정중선 절개, 스테인리스 스틸 금속 베이스 고정, 의치상 재료와 시아노아크릴레이트 접착제의 부피 비율 3:1이 포함됩니다. 한계에는 중간 정도의 외과적 침습성과 뼈 표면 준비의 시술자 의존적 정밀도가 포함됩니다.
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프로토콜
본 연구에 설명된 모든 동물 절차는 Shenzhen Institutes of Advanced Technology의 동물 실험 기관 윤리 위원회(인증서 번호: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 수컷 C57BL/6J 마우스(8주령)를 사용했습니다. 수술 당시 마우스의 무게는 18-22g이었습니다.
1. 마취유도 및 유지(5± 1분)
- 마취 회로를 5분 동안 사전 충전합니다.
- 의료용 공기에 4% 이소플루란을 2L/min의 유속으로 전달하도록 유도 챔버를 설정합니다.
- 교정 반사를 상실한 후 안면 마스크 환기로 전환하십시오.
- 기화기를 조정하여 1.5-2% 이소플루란의 농도를 유지합니다.
- 보온 담요를 사용하여 마우스 체온을 37°C로 유지하고 마취 기간 동안 목표 범위는 36-38°C입니다.
- 테라마이신 안과용 연고를 바르십시오.
2. 포지셔닝(1± 1분)
- 마우스에 조정 가능한 정위 어댑터를 사용하십시오.
- 척추 생리적 곡률을 유지하기 위해 척추 정렬로 마우스를 엎드린 자세로 배치합니다.
- 이어바를 사용하여 마우스 머리를 고정합니다.
- 팔다리를 대칭으로 배치합니다.
3. 수술 현장 준비(1± 1분)
- 전기 이발기(칼날 간격 0.1mm)를 사용하여 수술 부위의 모발을 제거합니다.
- 제모 부위가 약 3cm× 1cm인지 확인하십시오.
- 모발 성장의 반대 방향으로 클리핑을 세 번 수행합니다.
4. 절개 및 접근(2± 1분)
- 요오도포로 해당 부위를 3회(30초 간격) 닦습니다.
- 마지막 갈비뼈(마우스의 T13 척추에 부착됨)를 촉진하여 다음과 같이 사용합니다.
주요 랜드마크. T13 척추 수준에서 2.5cm 절개를 만듭니다.
메스를 사용하는 등쪽 정중선. - 피하 근막을 순차적으로 해부합니다.
- 해부학적 평면을 통해 척추주위 근육을 노출시킵니다.
5. 척추주위 근육 해부(5± 1분)
- 척추주위 근육과 척추 구조를 최적으로 시각화하기 위해 수술용 현미경 배율을 5배로 설정합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 척추주위 근육을 날카롭게 해부합니다.
- 복부 근육층을 보존하면서 등쪽 및 외측 척추주위 근육을 완전히 절제합니다.
- 흡수성 지혈 거즈로 출혈을 관리합니다.
6. 금속 베이스 설치(1± 1분)
- 고정 막대(플라스틱)를 정위 어댑터에 장착합니다.
- 로드의 말단 끝에 맞춤형 금속 베이스(스테인리스 스틸, 0.28g)를 장착합니다(그림 1A).
- 맞춤형 금속 베이스를 T13 척추 횡돌기에 양측으로 배치합니다.
- 커플링 안정성을 확인합니다.
7. 뼈 인터페이스 준비(2± 1분)
- 수술용 현미경으로 박판과 극돌기에서 잔여 근육 조직을 제거합니다.
- 멸균 코튼 플레제트 압박으로 완전한 지혈을 달성하십시오.
- 연속 식염수 관개와 함께 정밀 뼈 드릴을 사용하여 평면 접촉면을 만듭니다. 열 발생을 최소화하기 위해 5,000-10,000rpm의 속도로 드릴을 작동하십시오. 드릴링 중에는 보안경과 마스크를 착용하십시오.
- 식염수에 적신 면봉으로 뼈가루를 제거하십시오.
8. 고정 시스템 밀봉(3± 1분)
- 의치상 재료와 시아노아크릴레이트 접착제(502 접착제)를 3:1 부피 비율로 혼합합니다. 피부/눈에 닿지 않도록 니트릴 장갑과 보안경을 착용하십시오.
- 접착제 혼합물을 사용하여 초음파 콜리메이터(플라스틱, 0.6g, 그림 1B)와 금속 베이스를 척추에 부착합니다(그림 1C).
- 접착제 혼합물이 제어된 주변 조건(24 ± 1°C, 40-60% 상대 습도)에서 경화되도록 합니다. 완전한 응고(표면 광택 손실 및 단단한 계면 형성)가 육안으로 확인될 때까지 60초 동안 정적 위치를 유지합니다.
- 플라스틱 고정 막대에서 금속 베이스를 분리합니다.
- 고정 안정성 확인: 수평면의 금속 베이스에 부드러운 회전력을 가합니다. 모든 변위(<0.1mm 공차)에 대해 5배 배율에서 콜리메이터-척추 인터페이스를 관찰합니다. 움직임이 허용 오차를 초과하면 접착제 혼합물을 다시 도포하고(8.2단계) 경화를 반복합니다(8.3단계).
9. 상처 봉합(1± 1분)
- 감긴 가장자리를 정렬하여 금속 베이스를 완전히 캡슐화합니다.
- 4-0 실크 봉합사로 단속 봉합을 수행합니다.
- 요오도포어로 절개 부위를 닦습니다.
- 콜리메이터의 층류 노출 부위 내에 남아 있는 혈액/뼈 파편을 제거하고 밀봉 및 지혈을 위해 멸균 면으로 포장합니다.
10. 수술 후 관리
- 체온 조절: 보행이 완전히 회복될 때까지(일반적으로 마취 후 2-3시간) 마우스를 온난화 담요(37°C) 위에 유지합니다.
- 수술 후 항생제 예방: 수술 직후 등쪽 목 부위에 피하 주사를 통해 세파졸린 나트륨(50mg/kg, 0.9% 식염수에 용해하여 농도 50mg/mL)을 투여합니다.
- 상처 위생을 유지하십시오. 처음 3일 동안은 식염수에 적신 면봉을 사용하여 상처를 청소하고 감염, 열개 또는 염증의 징후가 있는지 수술 부위를 매일 검사합니다.
- 수술 후 진통: 수술 후 3일 동안 12시간마다 카프로펜(5mg/kg, 피하) 투여11.
참고: 그림 1D 는 회복 후 살아있는 마우스에 이식된 고정 시스템을 보여줍니다.
11. 유해폐기물 처리
- 허가된 의료 폐기물 처리 시설로 옮기기 위해 "Biohazard" 기호가 표시된 누출 방지 생물학적 위험 백에 뼈 가루와 혈액으로 오염된 물질을 수집합니다.
- 경화되지 않은 의치상 재료와 502개의 접착제 잔여물을 "화학 폐기물"이라고 표시된 밀봉된 내화학성 용기에 넣고 화학 폐기물 관리 프로토콜을 통해 폐기할 수 있도록 지정된 환기 캐비닛에 보관합니다.
- 바늘, 메스날, 뼈 드릴은 "Biohazard" 라벨이 표시된 펑크 방지 날카로운 용기에 버리십시오.
12. 안전 경고
- 의치상 재료를 취급할 때는 니트릴 장갑과 보안경을 착용하여 직접적인 피부 접촉을 피하고, 휘발성 단량체의 흡입을 최소화하기 위해 통풍이 잘 되는 흄 후드에서 혼합 및 경화를 수행하십시오.
- 잔여 물질은 기관 지침에 따라 화학 폐기물로 폐기합니다. 502 시아노아크릴레이트 접착제의 경우 피부나 눈에 닿지 않도록 하고 노출이 발생하면 즉시 15분 동안 물로 헹구고 의사의 도움을 받으십시오. 통풍이 잘되는 곳에서 사용하고, 발화원에서 멀리 떨어진 서늘하고 건조한 곳에 보관하고, 면이나 양모 직물과의 접촉을 피하십시오.
- 정밀 드릴을 사용할 때는 핸드피스를 고정하고 안면 보호대와 수술용 마스크를 착용하고 드릴링 부위에 식염수로 세척하여 열 부상을 방지하십시오.
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결과
오픈 필드 테스트
개방 필드 테스트는 수술 후 마우스의 잠재적인 행동 변화를 평가하기 위해 설계되었습니다(그림 2A). 40cm × 40cm의 표준 개방 필드 챔버를 사용하여 상대적으로 일관된 환경 조건을 유지하고 외부 간섭을 최소화하면서 마우스를 위한 충분한 활동 공간을 보장했습니다. 실험은 수술 전과 수술 후 7일의 두 단계로 구성되었습니다. 각 단계에서 마우스의 행동을 문서화하기 위해 10분 분량의 비디오 녹화가 이루어졌습니다. SMART 소프트웨어를 사용하여 수집된 비디오를 분석하고 마우스가 이동한 총 거리를 정확하게 측정하여 활동 수준을 정량화했습니다. 총 6마리의 마우스가 실험에 참여했으며, 각 마우스에 대해 수술 전후 데이터를 기록하고 후속 통계 분석을 위해 짝을 이었다.
Wilcoxon 부호 순위 테스트는 수술 전후 단계 사이에 이동한 총 거리에 유의미한 차이가 있는지 확인하기...
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토론
이 연구는 깨어 있고 자유롭게 행동하는 마우스에서 척수의 정확한 초음파 신경 조절을 촉진하는 새로운 척추 결합 프로토콜을 제시합니다. 기존의 고정 접근법과 달리 이 방법론은 기존 고정 접근법의 한계를 극복합니다. 지속적인 마취가 필요한 단단한 정위 프레임(신경 활동을 억제하고 행동 평가를 복잡하게 함10) 및 척추 움직임으로 인한 변위 오류가 발생하기 쉬운 탄성 벨트와 달리 9, 이 방법론은 기능 연구에 중요한 자연스러운 운동 행동을 보존합니다. 척추 뼈에 직접 설치하기 때문에 장치의 변위 가능성이 줄어듭니다. 이 시스템은 Von Frey 필라멘트 테스트 및 냉각판 분석과 같은 행동 평가를 포함하여 하지 신경병성 통증의 마우스 모델에서 치료 효능에 대한 예비 탐색을 위해 특별히 검증되었습니다. 향후 연구는 더 넓은 연구 영역으로 적용을 확장할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 보조금 HKUSZH202207003에 따라 홍콩 대학교-심천 병원의 고위급 인재 과학 연구 스타트업 프로젝트의 지원을 부분적으로 받았습니다. 프로토콜 최적화 및 동물 관리에 도움을 주신 모든 실험실 구성원과 중국 과학원 선전 첨단 기술 연구소(SIAT)의 제도적 지원에 진심으로 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취 유도 챔버 | 심천 RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| 시아노아크릴레이트 접착제(502 접착제) | 베이징 화학 공장 | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=true& 아이디=736 869038961& ltk2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| 의치상 재료 | 뉴 센추리 치과 | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| 고정봉 | 관습 | ||
| 이소플루란 | 심천 RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| 금속 베이스 | 관습 | ||
| 마이크로 기기 | 심천 Zongshi 과학 기기 Co., Ltd. | ||
| 정밀 드릴 | 심천 RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| 소동물 다중 채널 마취 시스템 | 심천 RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| 생쥐 및 어린 쥐를 위한 정위 어댑터 | 창사 마웨 | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =참& 아이디=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobao검색 | |
| 수술용 현미경 | 심천 Zongshi 과학 기기 Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| 수술용 봉합사(Prolene) | Ethicon(Johnson & 존슨) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =참& 아이디=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& 쿼리=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.호버I | |
| 테라마이신 안과용 연고 | 화 이자 | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| 초음파 콜리메이터 | 관습 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
