방법 논문

저입력 1차 마우스 담관세포에서 염색질 상태 전이를 프로파일링하기 위한 다중 오믹스 기법

DOI:

10.3791/68606

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 히스톤 변형을 프로파일링하기 위한 저입력 ChIP-seq와 소량의 일차 마우스 담관세포에서 염색질 접근성을 평가하기 위한 ATAC-seq에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다낭성 간질환(PLD)은 담관세포에서 유래한 액체로 채워진 낭종이 형성되는 것을 특징으로 하는 유전 질환으로, 질병이 진행되고 환자의 삶의 질이 크게 저하됩니다. PLD에 대한 현재의 치료법은 부적절하여 새로운 치료 전략의 필요성을 강조합니다. PLD 진행에서 후성유전학적 조절의 역할, 특히 염색질 접근성 및 히스톤 변형은 아직 연구되지 않았습니다. ChIP-seq 및 DNase-seq와 같은 전통적인 후성유전학적 프로파일링 기술은 원발성 담관세포에서 얻기 어려운 많은 수의 세포를 필요로 합니다. 이 문제를 해결하기 위해 적은 수의 원발성 담관세포에 대해 저입력 ChIP-seq 및 ATAC-seq 프로토콜을 최적화했습니다. 이러한 접근 방식을 사용하면 최소한의 세포 입력으로 히스톤 변형 및 염색질 접근성을 분석할 수 있습니다. 저입력 ChIP-seq는 DNA 단편화를 위해 미세코ccal nuclease(MNase)를 사용하는 반면, ATAC-seq는 Tn5 transposase를 사용하여 열린 염색질 영역을 캡처합니다. 이러한 다중 오믹스 기술은 PLD 및 기타 담도 질환에서 담관세포 운명 전환 중 염색질 상태 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 중요한 것은 최적화된 프로토콜이 다른 저입력 1차 세포에 자신 있게 적용할 수 있어 다양한 세포 맥락에서 후성유전학적 메커니즘을 탐색할 수 있다는 것입니다. 이 연구는 염색질 상태 변화를 연구하기 위한 체계적인 접근 방식을 제시하여 PLD 및 관련 질병에 대한 후성유전학 기반 치료 전략 개발에 기여합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD는 담관세포에서 유래한 여러 개의 액체로 채워진 낭종의 발달을 특징으로 하는 유전 질환입니다. 이러한 낭종은 점진적으로 확장됨에 따라 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다 1,2. PLD에 대한 기존의 치료 전략은 부적절하며, 높은 재발률과 합병증을 유발하는 경우가 많을 뿐 효과만 제한적이다 3,4. 따라서 PLD 치료에서 해결되지 않은 임상적 문제를 해결하기 위해 보다 안전하고 효과적인 치료 접근법이 시급히 필요합니다.

정상적인 상태에서는 담관세포가 정지 상태를 유지하는 반면, PLD에서는 과도한 증식을 보이는데, 이는 질병 진행의 주요 원인이다 5,6. 이 낭성 전이의 기저에 있는 분자 메커니즘은 불분명합니다. 염색질 접근성 및 히스톤 변형을 포함한 후성유전학적 조절은 세포 운명 전이에서 중요한 역할을 하지만, 7,8 PLD 진행에서 그 역할은 여전히 연구가 부족합니다. 그러나 많은 후성유전학적 프로파일링 기술에는 많은 수의 세포가 필요합니다. DNase-seq 및 MNase-seq와 같은 염색질 접근성 분석뿐만 아니라 초음파 처리에 의한 염색질 단편화에 의존하는 기존의 ChIP-seq는 일반적으로 106 개 이상의 세포를 필요로하며, 이는 1 차 담관 세포에서 얻을 수있는 수를 훨씬 초과합니다.

이 원고는 히스톤 변형을 프로파일링하기 위한 저입력 ChIP-seq 9,10,11과 적은 수의 원발성 담관세포에서 염색질 접근성을 평가하기 위한 ATAC-seq 11,12,13에 대한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 저입력 ChIP-seq는 MNase를 사용하여 DNA9를 단편화하는 반면, ATAC-seq는 Tn5 transposase12를 사용하여 열린 염색질 영역에서 DNA 단편을 캡처합니다. 이러한 접근 방식을 활용한 다중 오믹스 분석은 PLD 및 기타 담도 질환에서 담관세포 운명 전환 중 염색질 상태 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 후성유전학 표적 치료의 개발을 촉진합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ATAC-seq를 위한 용액 및 담관세포의 제조

  1. ATAC-seq 실험 최소 1일 전에 표 1에 나열된 시약을 사용하여 ATAC 용해 버퍼를 준비합니다.
    참고: ATAC 용해 버퍼는 최소 1개월 동안 어두운 곳에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 새로 분리된 1차 담관세포14의 경우, 분리 직후 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 ATAC-seq 실험을 진행한다.
    참고: 빠르면 빠를수록 세포 생존력에 미치는 영향을 최소화하는 것이 좋습니다. 그러나 얼음 위에 보관하면 일반적으로 2시간 이내에 진행하는 것은 문제가 되지 않습니다.

2. ATAC-seq

참고: ATAC-seq에 대해 100,000개의 담관세포를 사용합니다. 샘플과 용액을 얼음 위에 보관하십시오. ATAC-seq 실험의 경우 전체 절차는 약 2일이 소요됩니다.

  1. 500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기.
  2. 상등액을 버리고 프로테아제 억제제가 함유된 ATAC 용해 완충액 200μL를 첨가한 후 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 후 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 처음 10분 동안은 부드럽게 피펫으로 섞습니다.
  3. 1,500 × g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리기.
  4. ATAC DNA Library Prep Kit의 Enzyme Mix 3μL, ATAC DNA Library Prep Kit의 5x Buffer 10μL 및 Nuclease-free water 37μL를 혼합하여 전치 반응 완충액(50μL)을 준비합니다. 철저히 섞는다.
  5. 상층액을 조심스럽게 버리고 수집된 핵 펠릿을 얼음 위에 놓고 즉시 50μL의 전위 반응 완충액을 첨가합니다. 부드럽게 재현탁하고 37°C에서 60분 동안 배양하고 10분마다 튜브 바닥을 튕겨 혼합합니다.
    참고: 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 상등액을 버리기 전에 전위 반응 버퍼를 준비합니다.
  6. 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다.
    참고: 담관세포 분리 과정14 의 잔류 단백질 G 비드는 이 단계에서 제거할 수 있습니다. DNA 샘플은 장기 보존을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 ATAC DNA Library Prep Kit를 사용하여 라이브러리 구축을 수행합니다.
    알림: 모든 s를 보관하십시오.amp달리 명시되지 않는 한 얼음 위에 용액과 용액. 절차는 다른 키트 브랜드마다 다를 수 있지만 모두 당사의 프로토콜과 호환됩니다.
    1. PCR 농축: DNA 시료 10μL(단계 2.6), 뉴클레아제가 없는 물 14μL, 5x TAB 10μL, PPM 5μL, TAE 1μL, P5 프라이머 5μL 및 P7 프라이머 5μL의 성분을 지정된 순서로 혼합하여 PCR 튜브에서 PCR 농축 혼합물(50μL)을 준비합니다. 부드럽게 피펫으로 섞습니다.
    2. 튜브를 PCR 기기로 옮기고 (72°C 3분 동안) x 1 사이클, (98 °C 30초 동안) x 1 사이클, (98 °C 15초 동안 30 °C, 72 °C 3분 동안) x 15 사이클 및 (72 °C 5분 동안) x 1 사이클을 실행하고 4 °C에서 유지합니다.
    3. 정제: 사용하기 전에 DNA Clean 비드를 30분 동안 실온에 두고, 2단계 마그네틱 비드 정제를 수행합니다.
      1. 첫 번째 라운드: PCR 산물에 30μL의 DNA Clean beads를 추가하고(단계 2.7.2에서), 부드럽게 피펫으로 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브를 자기 분리기에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고 DNA 클린 비드를 버립니다.
      2. 두 번째 라운드: 수집된 상등액에 7.5μL의 DNA Clean beads를 추가하고(단계 2.7.3.1에서), 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 자기 분리기에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    4. 튜브를 자기 분리기에 유지하고 실온에서 갓 준비한 80% 에탄올 200μL로 DNA 클린 비드를 2 x 30초 동안 헹굽니다. 헹굴 때마다 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브를 자기 분리기에 연결한 상태에서 튜브 뚜껑을 열고 비드를 10분 동안 자연 건조합니다. 마지막으로 22μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 DNA를 용리합니다.
      참고: DNA 샘플은 장기 보존을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  8. 표준 차세대 시퀀서를 사용하여 라이브러리를 시퀀싱합니다.
    참고: 최소 5천만 개의 쌍 끝 읽기를 얻는 것이 좋습니다.

3. 저투입 ChIP-seq를 위한 용액 및 담관세포 준비

  1. 저투량 ChIP-seq 실험 최소 1일 전에 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에 나열된 시약을 사용하여 ChIP Lysis Buffer, ChIP MNase Buffer, ChIP Stop Buffer, ChIP 2x RIPA Buffer, ChIP RIPA Buffer 및 ChIP LiCl Buffer를 준비합니다.
    알림: 위의 용액은 4°C에서 최소 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 새로 분리된 1차 담관세포14의 경우, 분리 직후 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 저입력 ChIP-seq 실험을 진행합니다.
    참고: 빠르면 빠를수록 세포 생존력에 미치는 영향을 최소화하는 것이 좋습니다. 그러나 얼음 위에 보관하면 일반적으로 2시간 이내에 진행하는 것은 문제가 되지 않습니다.

4. Low-input ChIP-seq 1일차: 세포 용해, MNase 분해 및 항체 배양

참고: 저입력 ChIP-seq 실험의 경우 전체 절차는 약 3일이 소요됩니다.

  1. 담관세포를 튜브당 100,000개 세포의 분취량으로 나누고 샘플과 용액을 얼음 위에 보관합니다.
    참고: 다중 히스톤 변형에 대해 저입력 ChIP-seq 실험을 수행하는 경우 히스톤 변형 항체를 추가하기 전에 비례적으로 부피를 확대하는 것이 허용됩니다. 다음 단계의 시약 부피는 1 × 105 세포를 포함하는 하나의 튜브를 기준으로 합니다.
  2. 2,000 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
  3. 상등액을 버리고 프로테아제 억제제가 함유된 ChIP 용해 완충액 19μL를 첨가한 후 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 후 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 거품을 생성하지 마십시오.
  4. 19 μL의 ChIP MNase Buffer를 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
  5. 2 μL의 MNase(0.01 U/μL)를 넣고 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오.
    참고: 배양 시간은 매우 중요합니다. MNase의 최종 농도는 0.0005 U/μL입니다. MNase의 최적 농도는 세포 유형 및 수에 따라 결정할 수 있습니다.
  6. 즉시 샘플을 얼음 위에 놓고 5μL의 ChIP STOP Buffer를 추가하여 분해를 종결한 다음 부드럽게 피펫으로 혼합합니다.
  7. 프로테아제 억제제가 함유된 ChIP 2x RIPA Buffer 45μL를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 얼음에서 10분 동안 추가로 배양합니다.
  8. 20,000 × g 에서 4 °C에서 15분 동안 원심분리기. 상등액을 새 튜브로 천천히 옮깁니다.
    참고: 담관세포 분리 과정14 의 잔류 단백질 G 비드는 이 단계에서 제거할 수 있습니다.
  9. 40μL의 ChIP RIPA 버퍼를 추가합니다.
  10. 면역침전(IP) 샘플의 경우, 샘플당 1μg의 항체를 추가하고 4°C의 회전기(20rpm)에서 하룻밤 동안 현탁액을 배양합니다.
  11. 입력 샘플의 경우 항체를 추가하지 말고 4°C의 회전기(20rpm)에서 밤새 현탁액을 배양합니다.

5. 저입력 ChIP-seq 2일차: Immunoprecipitation, Wash and Elution

참고: IP 샘플의 경우 5.1-5.7단계를 수행합니다. 입력 샘플의 경우 5.8-5.12단계를 수행합니다.

  1. Protein G 비드를 얼음처럼 차가운 ChIP RIPA 버퍼 1mL로 사전 세척합니다.
  2. 샘플에 단백질 G 비드 400μg을 추가하고 4°C에서 2시간 동안 회전(20rpm)으로 배양합니다.
  3. 150μL의 얼음처럼 차가운 ChIP RIPA 버퍼를 사용하여 로테이터(20rpm)에서 4°C에서 5분 동안 비드를 5 x 5분 동안 세척합니다. 자기 분리기를 사용하여 상등액을 제거합니다.
  4. 150μL의 얼음처럼 차가운 ChIP LiCl 버퍼로 로테이터(20rpm)에서 4°C에서 5분 동안 비드를 세척합니다. 자기 분리기를 사용하여 상등액을 제거합니다.
  5. 30μL의 ChIP 용리 완충액(29μL의 뉴클레아제가 없는 물 및 1μL의 단백질분해효소 K)을 추가하여 비드를 재현탁시키고 900rpm, 55°C, 90분 동안 흔듭니다. 비드가 서스펜션 상태를 유지하기 위해 주기적으로 튜브를 부드럽게 튕깁니다.
  6. 자기 분리기를 사용하여 상등액을 수집하고 천천히 새 튜브로 옮깁니다. 72°C에서 40분 동안 배양하여 Proteinase K를 비활성화합니다.
  7. 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
    참고: DNA 샘플은 장기 보존을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  8. 입력 샘플의 경우 1μL의 Proteinase K를 추가하고 900rpm, 55°C에서 90분 동안 흔듭니다.
  9. 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 DNA를 정제합니다. 130μL의 DNA 추출 시약을 추가하고 용액이 분홍색으로 변할 때까지 격렬하게 소용돌이칩니다. 20,000 × g 에서 5분 동안 원심분리기.
  10. 상등액을 새 튜브로 옮기고 130μL의 얼음처럼 차가운 이소프로판올을 첨가한 다음 1μL의 글리코겐과 6.5μL 3M NaAc를 추가합니다. 20,000 × g 에서 15분 동안 원심분리기.
  11. 상층액을 버리고 70% 에탄올 1mL로 한 번 세척한 후 20,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 건조시키고 30μL의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁합니다.
  12. 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
    참고: DNA 샘플은 장기 보존을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

6. 저입력 ChIP-seq 3일차: 라이브러리 구축 및 염기서열분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 ChIP DNA Library Prep Kit를 사용하여 라이브러리 구축을 수행합니다.
    참고: 단계에는 End Preparation, Adapter Ligation 및 Library Amplification이 포함됩니다. 라이브러리 구성을 위한 5ng의 ChIP 샘플(입력 및 IP 샘플)을 피펫으로 뺍니다. 모든 s를 보관하십시오.amp달리 명시되지 않는 한 얼음 위에 용액과 용액을 보관하십시오. 절차는 다른 키트 브랜드마다 다를 수 있지만 모두 당사의 프로토콜과 호환됩니다.
  2. 최종 준비: DNA 샘플 5ng(단계 5.6 또는 단계 5.11), 최종 준비 믹스 4 15μL, Tris EDTA 6.5μL 및 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 65μL로 혼합하여 PCR 튜브에 말단 준비 반응 완충액(65μL)을 준비합니다. 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 튜브를 PCR 기기로 옮기고 20°C에서 15분 동안, 65°C에서 15분 동안 다음 프로그램을 실행하고 4°C(뜨거운 뚜껑: 105°C)에서 유지합니다.
  3. 어댑터 결찰: DNA 어댑터 S를 1:100의 비율로 희석합니다. 65 μL의 말단 준비 산물(단계 6.2), 25 μL의 Rapid Ligation buffer 2, 5 μL의 Rapid DNA ligase 및 5 μL의 희석된 DNA Adapter S를 혼합하여 PCR 튜브에 어댑터 결찰 반응 완충액(100 μL)을 준비합니다. 튜브를 PCR 기기로 옮기고 다음 프로그램을 실행합니다: 20°C에서 15분 동안 수행한 다음 4°C에서 유지합니다(핫 리드: 105°C).
  4. 정화:
    1. 사용하기 전에 DNA Clean beads를 실온에 30분 동안 두십시오. 60 μL의 DNA Clean 비드를 Adapter Ligation 산물에 추가합니다(6.3단계). 부드럽게 피펫으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    2. PCR 튜브를 자기 분리기에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    3. 튜브를 자기 분리기에 보관하십시오. DNA 클린 비드를 실온에서 갓 준비한 80% 에탄올 200μL로 2 x 30초 동안 헹굽니다. 헹굴 때마다 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    4. 튜브를 자기 분리기에 고정한 상태에서 튜브 뚜껑을 열고 비드를 5분 동안 자연 건조합니다. 마지막으로 22.5μL의 10mM Tris-HCL(PH 8.0)을 첨가하여 DNA를 용리합니다.
  5. 라이브러리 증폭: 20 μL의 정제 산물(단계 6.4), 2.5 μL의 i5 PCR 프라이머, 2.5 μL의 i7 PCR 프라이머 및 25 μL의 증폭 혼합물을 혼합하여 PCR 튜브에 라이브러리 증폭 반응 완충액(50 μL)을 준비합니다. 부드럽게 피펫으로 섞습니다. 튜브를 PCR 기기로 옮기고 (95°C 3분) x 1사이클, (98°C 20초, 60°C 15초, 72°C 30초) x 18사이클, (72°C 5분) x 1사이클, 4°C에서 유지 프로그램을 실행합니다.
  6. 정제: 사용하기 전에 DNA Clean 비드를 30분 동안 실온에 두고, 2단계 마그네틱 비드 정제를 수행합니다.
    1. 첫 번째 라운드: 30μL의 DNA Clean bead를 라이브러리 증폭 산물에 추가합니다(6.5단계). 부드럽게 피펫으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브를 자기 분리기에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고 DNA 클린 비드를 버립니다.
    2. 두 번째 라운드: 수집된 상층액에 7.5μL의 DNA Clean 비드를 추가합니다. 부드럽게 피펫으로 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 자기 분리기에 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브를 자기 분리기에 보관하십시오. DNA 클린 비드를 실온에서 갓 준비한 80% 에탄올 200μL로 2 x 30초 동안 헹굽니다. 헹굴 때마다 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브를 자기 분리기에 연결한 상태에서 튜브 뚜껑을 열고 비드를 10분 동안 자연 건조합니다. 마지막으로 22.5μL의 10mM Tris-HCl(PH 8.0)을 첨가하여 DNA를 용리합니다.
      참고: DNA 샘플은 장기 보존을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  7. 표준 차세대 시퀀서에서 라이브러리를 시퀀싱합니다.
    참고: 최소 10-2,000만 쌍의 엔드 읽기를 얻는 것이 좋습니다.

7. ATAC-seq 및 Low-input ChIP-seq의 데이터 분석

  1. 해석 가상 환경 준비(miniconda)
    1. 다음 명령을 사용하여 웹 사이트에서 Miniconda3를 다운로드하고 Miniconda의 설치 지침을 따릅니다.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. ATAC-seq 및 ChIP-seq 모두의 분석 파이프라인을 위한 가상 환경을 만듭니다.
      conda 생성 -n NGSpipeline
      conda 활성화 NGSpipeline
      conda 설치 bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
    3. 참조 게놈 염기서열 파일을 다운로드하고 bowtie2 정렬을 위한 정렬 인덱스를 만듭니다.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. FastQC를 사용하여 ATAC-seq 판독 및 ChIP-seq 판독의 품질 관리를 수행하고 MultiQC를 사용하여 품질 관리 보고서를 요약하여 염기서열분석 결과의 GC 바이어스와 다운스트림 분석을 위한 충분한 라이브러리 복잡성을 보장합니다. 품질 관리 결과가 크게 다른 염기서열 라이브러리를 폐기합니다.
    fastqc -o <출력 디렉토리> ......
    multiqc     <출력 디렉토리>
  3. 다양한 trim을 사용한 trim 염기서열분석 어댑터.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. 기본 매개변수를 사용하여 Bowtie2를 사용하여 트리밍된 판독값을 mm10 참조 게놈 어셈블리에 매핑하고, ATAC-seq 단편의 넓은 길이 분포로 인해 ATAC-seq에 대한 추가 매개변수(--very-sensitive -X 2000)를 bowtie2에 전달합니다.
    1. ATAC-seq의 경우:
      bowtie2 -p <스레드 번호> --very-sensitive -X 2000 -x <7.1.3 단계의 게놈 인덱스> -1 4.2 read 1에서 -2 <4.2 read 2에서 fastq 파일 정리> | samtools view -S -O BAM -@ <스레드 번호> -o
    2. ChIP-seq의 경우:
      bowtie2 -p <스레드 번호> -x <7.1.3 단계의 게놈 인덱스> -1 <4.2 읽기 1에서 fastq 파일을 정리> -2 < 4.2 읽기 2에서 fastq 파일을 정리했습니다> | samtools view -S -O BAM -@ <스레드 번호> -o
  5. 정렬 점수(q30)가 낮은 판독과 미토콘드리아 게놈 및 비표준 염색체에 정렬된 판독을 제거합니다.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 <입력 bam 파일> | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <필터링된 bam 파일 출력>
  6. Picard MarkDuplicates 명령을 사용하여 PCR 중복 읽기를 제거합니다.
    picard MarkDuplicates I = < 입력 필터링 된 bam 파일> O = < 출력 중복 bam 파일 제거> M = < 중복 보고서 파일 제거> REMOVE_DUPLICATES = true
  7. 매개 변수 -f BAMPE -g mm -B -q 0.01과 함께 MACS2 callpeak 명령을 사용하여 피크를 호출합니다.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t < 중복 bam 파일 제거 > -g mm -n <출력 접두사> -B -q 0.01
  8. Deeptools BamCoverage 명령을 사용하여 BigWig 파일을 생성합니다.
    samtools index <중복 bam 파일 제거> -@ 4
    bamCoverage -b     <중복 bam 파일 제거> -o < BigWig 파일 출력> -bs 50 -p <스레드 번호> --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeRPGC -e -ignoreDuplicates 사용
  9. IGV 게놈 브라우저를 사용하여 macs2의 narrowPeak 파일과 Deeptools BamCoverage의 BigWig 파일을 볼 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원발성 담관세포의 염색질 지형을 생성하기 위해 원발성 담관세포의 낮은 수(~100,000)에 대해 저입력 ChIP-seq 및 ATAC-seq 프로토콜을 최적화했습니다. 1차 담관세포에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과는 1× 105 개의 1차 담관세포에 대해 37°C에서 5분 동안 0.02U MNase가 모노뉴클레오솜을 생성하도록 유도했으며, 이는 최적의 농도로 확인되었습니다(그림 1).

WT 또는 PLD 마우스의 담관세포에 대한 ATAC-seq 및 H3K9ac/H3K9me3 저입력 ChIP-seq 분석 개요
WT 및 PLD 담관세포의 염색질 접근성 수준에 대한 게놈 전체 분석을 통해 고품질 ATAC-seq 및 ChIP-seq 데이터가 밝혀졌습니다. ATAC-seq 및 저입력 ChIP-seq를 포함한 모든 염기서열분석 실험은 재현성을 보장하기 위해 두 가지 생물학적 복제물로...

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토론

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낭포성 담관세포의 상태 전이의 기저에 있는 염색질 상태 역학을 체계적이고 포괄적으로 매핑하기 위해 제한된 수의 원발성 담관세포에 대해 저입력 ChIP-seq 및 ATAC-seq를 성공적으로 최적화했습니다. 이 연구는 일차 담관세포에 초점을 맞추었지만, 우리는 이 프로토콜이 가용성이 제한된 다른 생존율이 높은 일차 세포에도 적용될 수 있다고 확신합니다. 마찬가지로, 본 연구는 H3K9ac 및 H3K9me3의 ChIP-seq 분석 결과만 제시하지만, 이 프로토콜은 H3K9me3, H3K4me3, H3K9ac 및 H3K27ac와 같은 활성화 마크와 H3K9me3, H3K27me3 및 H3K36me3와 같은 억제 마크를 포함한 다른 히스톤 변형에도 동일하게 적용할 수 있습니다. 실험의 성공적인 실행을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필수적입니다.

첫 번째 중요한 단계는 원발성 담관세포 분리의 높은 생존력을 보장하는 것입니다. ...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82402166 to R.J.)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH = 7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH = 8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
아가로스 겔BiosharpBS081
ATAC DNA 라이브러리 준비 키트VazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M 스톡
ChIP DNA 라이브러리 준비 키트VazymeND607
DNA 클린 비드VazymeN411
DNA 추출 시약SolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) 스톡
형광 측정기InvitrogenQ33226
글리코겐Thermo ScientificR0561
혈구계QIUJINGXB. 케이 25.
Igepal CA-630SigmaI889610% 재고
자기 분리기PromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M 재고
MNaseSigmaN37550.01 U/µ L 스톡
NaClSangon BiotechA6104765 M 스톡
NP40SolarbioN8030
뉴클레아제 프리 워터라이프 테크놀로지AM9937
PCR 기기Applied Biosystems4484073
PCR 정제 키트QIAGEN28106
프로테아제 억제제Roche04693132001
프로틴 G 비즈Invitrogen10004D
프로테이나제 KTransGenGE201-01
로테이터Kylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010%  재고
나트륨 데옥시콜레이트SigmaS1827
써모믹서 컴포트Eppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation(PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools27079975 3.4.3 https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
미니콘다나콘다4.7.12.1 https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
트림 풍부0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
스 아

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

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