설치류 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 매핑을 위한 초음파 국소화 현미경

요약

초음파 국소화 현미경(ULM)은 생체 내 미세혈관 구조를 이미징할 때 전례 없는 수준의 해상도를 가능하게 하는 최근 개발된 기술입니다. 이 작업에서 우리는 전임상 연구를 위해 설계된 표준화된 기능적 초음파 이미징 플랫폼을 사용하여 설치류의 뇌 미세혈관 구조의 초해상도 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

초록

초음파 국소화 현미경(ULM)은 기존 초음파의 회절 한계를 뛰어넘는 뇌의 미세혈관 구조를 생체 내에서 시각화할 수 있는 초고해상도 이미징 기술입니다. ULM은 정맥 주입된 미세 기포가 대뇌 혈관을 순환할 때 감지하고 추적함으로써 혈관 밀도, 유속 및 후방 산란 신호 진폭의 고해상도 맵을 5-10μm의 공간 규모로 생성합니다. 이 프로토콜은 전용 기능성 초음파 플랫폼을 사용하여 동물 준비, 프로브 위치 지정, 이미지 획득, 미세 기포 주입 및 데이터 처리를 포함하여 설치류에서 ULM 이미징을 수행하기 위한 완전한 워크플로를 제공합니다. 마우스(경두개) 및 쥐(두개골 창 포함)에 적합한 두 가지 준비 방법이 설명된 다음 통합 뇌 아틀라스를 사용하여 프로브 정렬 및 해부학적 표적화에 대한 자세한 지침이 이어집니다. 획득하는 동안 초고속 초음파 시퀀스는 동적 흐름 데이터를 캡처하기 위해 미세 기포의 볼루스 주입과 동기화됩니다. 후속 재구성 단계에는 클러터 필터링, 이미지 보간, 마이크로버블 감지, 하위 픽셀 위치 파악 및 궤적 추적이 포함됩니다. 출력에는 선박 점유를 반영하는 밀도 맵, 흐름 패턴과 방향성을 보여주는 속도 맵, 구조적 해석을 위한 추가 대비를 제공하는 진폭 맵이 포함됩니다. 대표적인 결과는 전체 관상면에 걸쳐 성공적인 획득을 보여주며 열악한 주입 품질, 모션 아티팩트 및 두개골 유발 수차와 같은 일반적인 함정을 강조합니다. 이 프로토콜은 단면 및 종단 연구 모두와 호환되며 특히 노화, 뇌졸중, 동맥류 및 신경퇴행성 질환 모델에서 뇌혈관 변화를 조사하는 데 적합합니다. 깊이 침투, 높은 시공간 분해능 및 라벨 없는 혈관 이미징을 결합함으로써 ULM은 전임상 모델에서 비침습적 뇌 미세순환 분석을 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

뇌는 신체 질량의 2%에 불과하지만^{신경 활동을 유지}하기 위해 산소와 포도당의 약 20%를 소비합니다1. 이러한 높은 대사 요구는 신경혈관 결합을 통해 조절되는 큰 동맥과 정맥에서 세동맥, 세정맥 및 모세혈관과 같은 미세혈관에 이르기까지 복잡한 혈관 네트워크에 의해 충족됩니다². 이 미세하게 조정된 과정의 중단은 광범위한 신경 장애와 관련이 있습니다. 예를 들어, 신경혈관 분리는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 질병의 초기 병리학적 특징으로, 종종 아밀로이드-베타 및 타우 병리와 같은 신경변성의 고전적인 특징보다 선행합니다 3,4,5,6. 따라서 생체 내에서 뇌의 복잡한 특성을 이미징하는 것은 생리적 과정을 이해해야 하는 증가하는 필요성을 해결하기 위한 주요 관심사였습니다. 기술 발전으로 뇌 기능과 활동을 직간접적으로 조사할 수 있는 고유한 기능이 제공되었으며, 정밀도, 해상도 및 접근성이 향상되었습니다.

도플러 초음파는 혈류를 사용하여 뇌 활동을 기능적으로 측정하기 위한 강력한 도구로 등장했습니다⁷. 특히, 적혈구(RBC)의 움직임을 감지하도록 설계된 파워 도플러 영상은 반복되는 초음파 펄스를 혈관으로 전송하고 이동 적혈구에 의해 후방 산란된 초음파 에코의 진폭을 기록합니다⁸. 초고속 초음파 영상, 특히 기능적 초음파(fUS)의 출현은 이전의 한계를 극복하는 데 중추적인 지점이 되었습니다. 실제로, 기존의 초음파는 뇌의 미세혈관 구조의 전형적인 느린 혈류를 감지할 수 없기 때문에 주요 대뇌 동맥에 적용을 제한하는 순차적 접근 방식인 조직을 라인별로 스캔합니다⁹. 보다 최근의 fUS 기술은 다중 평면파 전송을 사용하여 초당 수천 프레임을 획득하여 시간 해상도와 신호 대 잡음비(SNR)를 모두 획기적으로 향상시킵니다. 결정적으로, fUS는 1mm/s의 낮은 속도로 매우 작은 혈관의 혈역학적 변화를 감지할 수 있어 세동맥^수준까지 뇌 활동의 실시간 기능적 이미징을 지원합니다8.

초고속 도플러 방법은 미세혈관 영상을 크게 개선했지만 여전히 초음파의 회절 제한 해상도에 의해 제한됩니다¹⁰. fUS와 함께 초음파 국소화 현미경(ULM)은 이러한 장애물을 극복하여 조영제와 고정밀 국소화 알고리즘을 활용하여 모세혈관 수준에서 미세혈관 구조를 시각화할 수 있습니다¹¹. 이는 혈관 형태와 기능에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다. 보다 구체적으로, ULM에서는 직경이 약 1-3μm인 안정화된 가스로 채워진 미세 기포로 만들어진 조영제를 혈류에 주입합니다. 그들은 개별 지점 소스로 감지될 수 있는 강력한 음향 산란체 역할을 합니다. 미세 기포가 초음파 파장보다 훨씬 작다는 점을 감안할 때 공간적으로나 시간적으로 분리되어 시스템의 점 확산 함수(PSF)로 나타날 수 있습니다. STORM 및 PALM과 같은 광학 초고해상도 기술에서 영감을 받아 이러한 마이크로버블의 하위 픽셀 위치 파악은 높은 정밀도로 위치를 매핑하는 디콘볼루션 방법을 사용하여 달성됩니다10,12,13,14. 이를 통해 혈관 구조는 기존의 초고속 초음파 파워 도플러 이미징의 회절 한계를 훨씬 초과하는 5-10μm의 공간 해상도로 분해될 수 있습니다.

ULM은 모세관 척도까지 혈관 매핑을 위한 강력하고 효과적인 도구이며 표면층으로 제한되는 많은 광학 방법의 한계를 극복합니다. 살아있는 동물에서 미세혈관 이미징을 수행하여 종단 및 약리학적 연구를 가능하게 하는 능력은 뇌 고정 및 염색이 필요한 다른 기술에 비해 ULM의 또 다른 주요 이점입니다. 추출된 정보는 정적 혈관 지도를 넘어 모세혈관 수준까지 혈류에 대한 정량적 추정치를 제공하여 전임상 및 임상 적용 모두에 유망한 길을 열어줍니다. 재현성을 촉진하기 위해 전임상 연구를 위해 설계된 표준화된 기능적 초음파 이미징 플랫폼을 사용하여 구현된 설치류의 ULM 기반 뇌 이미징을 위한 전체 워크플로를 설명합니다.

프로토콜

이 연구에 설명된 모든 절차는 2010년 9월 22일자 유럽 공동체 이사회 지침(010/63/UE)에 따라 수행되었으며 지역 윤리 위원회(Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', 프로젝트 #2020-16). 실험은 상업적으로 공급되는 성인 수컷 C57BL/6 Rj 마우스(생후 2개월, 20-30g)와 Sprague-Dawley Rj:Han 쥐(200-300g)를 대상으로 수행되었습니다. 동물들은 22°C의 일정한 온도로 12시간의 빛/암흑 주기 하에 케이지당 4마리씩 그룹으로 수용되었으며 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다. 실험을 시작하기 전에 모든 동물은 사육 조건에 대해 최소 1주일의 적응 기간을 거쳤습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 동물 준비

1. 마우스의 마취 및 동물 준비
   1. 마우스를 이소플루란 유도 챔버에 놓고 공기(0.075L/min) 및 산소(0.175L/min 또는 의료용 공기)와 함께 2% 이소플루란을 투여합니다.
   2. 마취 유도 5분 후, 체온을 유지하기 위해 37°C로 설정된 가열 패드 위에 놓인 정위 고정 프레임으로 동물을 옮기고 동일한 농도 및 유속으로 마스크를 통해 지속적인 이소플루란 전달을 보장합니다.
   3. 단단하지만 손상되지 않는 압력을 사용하여 발가락이나 꼬리를 꼬집었을 때 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 반사가 있는 경우 이소플루란 농도를 약간 높이십시오. 계속하기 전에 재평가하십시오.
   4. 백내장 형성을 예방하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
   5. 트리머를 사용하여 마우스 머리를 면도합니다. 제모 크림을 바르고 1-1.5분 동안 그대로 두었다가 따뜻한 물로 헹구고 거즈로 말립니다. 모든 털이 제거될 때까지 필요에 따라 반복합니다. 제모 크림은 피부에 화학적 손상을 줄 수 있으므로 장기간 방치하지 마십시오.
   6. 음향 결합을 보장하기 위해 원심분리된 초음파 젤(기포 없음, 가스 제거)을 헤드에 도포합니다.
2. 쥐의 마취 및 동물 준비
   1. 쥐의 무게를 측정한 후, 1mL 주사기를 사용하여 케타민(75mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사합니다. 머리 꼭대기의 털을 면도하고 요오드 용액으로 피부를 청소하십시오.
      참고: 케타민은 많은 국가에서 규제가 엄격한 물질이며 조달 및 사용을 위해 특별 승인이 필요할 수 있습니다. 대체 마취 요법을 사용하여 외과적 수준의 마취를 달성할 수 있습니다.
   2. 체온을 유지하기 위해 37°C로 설정된 가열 패드 위에 놓인 정위 장치 위에 동물을 배치합니다. 건조와 백내장 형성을 방지하기 위해 눈에 안과용 연고를 넉넉하게 바르십시오.
   3. 수술 중 진통을 위해 1mL 주사기를 사용하여 멜록시캄(2mg/kg)을 피하 주사합니다.
   4. 단단하지만 손상을 입히지 않는 압력을 사용하여 발가락 꼬집기 또는 꼬리 꼬리 꼬집기에 대한 반응으로 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다. 반사가 있는 경우 초기 마취 용량의 1/4에 해당하는 추가 용량을 투여합니다. 마취 깊이를 재평가하기 전에 약 5분 정도 기다리십시오. 마취의 수술면이 확인된 후에만 진행하고 20-30분마다 재평가합니다.
   5. 메스를 사용하여 시상 봉합사를 따라 세로 절개를 하여 두개골에 부착된 피부와 결합 조직을 포함할 수 있을 만큼 절단 부위가 충분히 깊은지 확인합니다.
   6. 생리 식염수를 사용하여 수술 내내 주변 조직에 충분한 수분을 공급하십시오.
   7. 회전식 드릴을 사용하여 두개골의 표면층을 표시하여 두개골 구멍의 윤곽을 가볍게 추적합니다. 뇌에 대한 최적의 접근을 위해 창은 두개골 크기에 따라 측면 치수가 약 14mm, 전후 치수가 최소 2mm여야 합니다.
   8. 뼈 저항이 남지 않을 때까지 윤곽선을 따라 밀링을 계속합니다. 드릴링하는 동안 주기적으로 생리 식염수 몇 방울을 떨어뜨려 뼈를 식히고 열 손상을 최소화하십시오. 가늘고 둥근 모서리의 주걱은 힘 없이 틈에 쉽게 삽입해야 합니다.
   9. 짧은 단방향 리밍 스트로크를 사용하여 저항이 거의 감지되지 않을 때까지 뼈의 마지막 층을 얇게 만듭니다.
   10. 두개창의 측면 가장자리에 모서리가 둥근 얇고 약간 구부러진 주걱을 삽입합니다.
   11. 주걱을 중앙으로 천천히 움직여 수막에서 뼈를 부드럽게 분리합니다. 저항이 느껴지지 않으면 분리된 뼈 조각을 들어 올려 완전히 제거합니다.
   12. 원심분리된 초음파 젤을 경막 위에 바릅니다. 실험 설정에 대한 설명은 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1: 설치류의 ULM 뇌 이미징을 위한 실험 설정의 개략도. 이미징 시스템은 전동식 포지셔닝 스테이지 (Motorized Positioning Stage) 에 장착 된 고주파 프로브 (High Frequency Probe) 에 연결된 초음파 획득 장치로 구성됩니다. 생쥐와 쥐 모두 정위 프레임으로 표시됩니다: 마우스는 경두개 영상을 위해 면도된 두피를 특징으로 하는 반면, 쥐는 외과적으로 준비된 두개골 창을 통해 영상을 받습니다. 두 종 모두에서 조영제 주입을 위해 꼬리 정맥 카테터를 배치합니다. 이 설정을 통해 마이크로버블 주입 중에 고해상도 기능적 초음파 데이터를 안정적으로 획득할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 꼬리 정맥 카테터 삽입
   1. 27G × 1/2" 날개 달린 주입 세트를 18" 튜브가 있는 18G × 1/2" 바늘에 연결하십시오. 가능하면 튜브를 줄여 데드 볼륨을 최소화하십시오.
   2. 동물의 꼬리를 부드럽게 90도 돌려 측면 꼬리 정맥을 노출시킵니다( 그림 2 참조). 테이프를 사용하여 꼬리를 제자리에 고정하여 안정성을 보장하고 카테터 삽입 중 불필요한 움직임을 방지합니다.
   3. 말단 끝(꼬리 끝)에서 시작하여 기저부 쪽으로 이동하여 꼬리 정맥을 식별합니다. 이 단계를 용이하게 하기 위해 미지근한 물로 꼬리를 데워 혈관 확장을 촉진하고 정맥 가시성을 향상시킬 수 있습니다.
   4. 손가락을 사용하여 꼬리 밑부분에 부드러운 압력을 가하고 주사 부위 쪽으로 밉니다(즉, 혈류 방향과 반대). 이 조작은 일시적으로 정맥 환류를 방해하여 꼬리 정맥이 팽창하고 더욱 두드러지게 하여 카테터 삽입을 용이하게 합니다.
   5. 날개 달린 주입 세트의 27G × 1/2" 바늘을 정맥과 평행하게 삽입하여 경사가 위를 향하도록 합니다.
   6. 올바른 바늘 배치를 확인하는 혈액 플래시백이 있는지 튜브를 관찰하십시오.
      참고: 후속 주사 중 초기 천자로 인한 누출을 방지하기 위해 원위 꼬리 끝에서 카테터 삽입을 시작합니다. 꼬리 정맥 카테터 삽입이 어렵거나 실패한 것으로 판명되면 대체 중앙 경로를 고려할 수 있습니다. 여기에는 안와 후부비동, 경정맥 또는 복재정맥이 포함됩니다.

그림 2: 카테터 삽입을 위한 혈관 랜드마크를 보여주는 설치류 꼬리의 단면 해부학. 주요 혈관의 상대적 위치를 보여주는 원위 설치류 꼬리를 통과하는 횡단 단면의 개략도. 정중선 근처에는 상부(등쪽) 부위에 위치한 등쪽 꼬리 동맥과 꼬리 단면의 하부(복부) 부분에 위치한 복부 꼬리 동맥의 두 개의 동맥이 존재합니다. 이러한 동맥은 일반적으로 정맥 시술 중에 피합니다. 동맥 측면에는 양쪽에서 대칭으로 흐르고 피부 바로 아래에 있는 꼬리 정맥이 있어 카테터 삽입이나 미세기포 주입을 위한 선호되는 접근 부위입니다. 이 해부학적 개요는 정맥의 정확한 위치 파악에 도움이 되며, 특히 혈관 확장을 촉진하기 위해 온난화로 강화될 때 더욱 그렇습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. IcoScan 소프트웨어를 사용한 프로브 위치 지정
   1. 획득 플랫폼에서 fUS 획득 소프트웨어(예: Iconeus One용 IcoScan)를 시작하고 실험 세션을 생성합니다. 초음파 프로브 위치를 조정합니다.
      알림: 프로브를 동물의 머리 위 약 1mm 위에 놓습니다. 이미징 시퀀스를 시작하기 전에 프로브가 초음파 젤과 접촉하는지 확인하십시오.
   2. 라이브 뷰 획득을 시작하고 실시간 대뇌 혈액량(CBV) 이미징을 사용하여 필요에 따라 프로브 위치를 조정합니다. 뇌는 이미지에 집중되어야 합니다. 대비 및 압축과 같은 이미징 매개변수를 최적화하여 시각화 품질을 향상시킵니다.
   3. 획득 소프트웨어에서 Angio3D 메뉴를 엽니다. 스캔 매개변수(첫 번째 슬라이스, 마지막 슬라이스 및 스텝 크기)를 조정하여 전체 뇌를 덮도록 합니다. 획득을 시작합니다.
      알림: 스캔 매개변수를 설정할 때 스캔이 뇌의 후방 부분, 즉 전체 후동맥을 덮는지 확인하십시오.
   4. 수집 소프트웨어를 열어 두고 데이터 분석 및 시각화를 위해 IcoStudio 소프트웨어를 시작합니다. Angio3D 스캔을 로드합니다.
   5. Brain Registration 패널로 이동하여 완전 자동 또는 수동 등록 모드를 사용하여 Allen Mouse Common Coordinate Framework에 스캔을 등록합니다.
   6. 등록을 .bps 파일로 저장합니다.
   7. 그런 다음 Brain Navigation 메뉴로 이동합니다. 아틀라스 관리자 패널에서 부모/자식 트리 네비게이터 를 사용하여 Allen Mouse Brain Atlas를 탐색합니다. 3보기 패널의 스캔에 중첩될 대상 해부학적 영역을 선택합니다.
   8. 관심 영역과 겹치는 이미징 평면을 선택합니다. 관상 보기에서 두 개의 마커를 수동으로 설정하여 대상 이미징 슬라이스를 정의합니다.
   9. Brain Positioning System(BPS)을 클릭하여 선택한 평면을 이미징하기 위한 프로브 위치에 해당하는 모터 좌표를 추출합니다. Angio3D 스캔에서 계산된 이미지 미리보기를 확인하고 BPS 좌표 복사를 클릭합니다.
   10. IcoScan 소프트웨어로 전환하고 프로브 포지셔닝 패널을 엽니다. BPS 좌표 입력을 클릭하고 1.4.9단계에서 추출한 값을 붙여넣습니다. 프로브는 자동으로 이동하고 선택한 이미징 평면에 정렬됩니다.
   11. 라이브 뷰 획득을 수행하여 현재 이미징 평면이 1.4.8단계에서 예측된 평면과 일치하는지 확인합니다.
       참고: 동일한 공간 마커를 저장하고 재사용함으로써 이미징 평면을 세션 전반에 걸쳐 일관되게 재정의할 수 있으므로 종단 연구를 위한 정확한 프로브 재배치가 가능합니다.

2. ULM 획득

1. 미세 기포 준비
   참고: 시중에서 판매되는 다양한 초음파 조영제를 사용할 수 있습니다. 그러나 가스 조성, 기포 농도, 직경 및 안정성은 사용하는 제품에 따라 다를 수 있습니다. 준비 및 보관에 관한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
   1. 멸균 주사기를 사용하여 격막을 통해 바이알에 0.9% 염화나트륨 용액 5mL를 주입합니다.
      참고: 반복적인 볼루스 투여 또는 연속 주입의 경우, 더 적은 양의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 보다 농축된 마이크로버블 현탁액을 준비할 수 있습니다. 의도한 용도에 따라 희석 계수를 적절하게 조정하십시오.
   2. 바이알을 20초 동안 세게 교반하여 미세 기포를 완전히 재현탁시키고 균일한 분산을 달성합니다.
2. ULM 기록
   1. 초음파 시퀀스, 프레임 속도 및 총 녹화 시간을 포함한 녹화 매개변수를 미리 정의합니다.
      알림: 녹음을 위한 권장 매개변수는 5Hz에서 10-2.5분입니다.
   2. 주입할 미세 기포의 부피를 그리고 획득을 시작합니다. 획득이 시작되면 마이크로버블 주입을 진행합니다. 쥐의 경우 200 μL, 마우스의 경우 100 μL를 적절한 희석으로 주입하는 것이 좋습니다.
   3. 라이브 뷰 이미지에서 대비 향상을 확인합니다. 그 직후, 카테터에 생리액을 주입하여 죽은 부피에 남아 있는 미세 기포를 세척합니다. 마이크로버블 강도 프로파일의 일반적인 예는 그림 3에 나와 있습니다.
   4. 획득이 완료될 때까지 기다렸다가 데이터를 저장합니다.
   5. 획득이 끝나면 사용된 프로토콜에 따라 다음과 같이 진행합니다.
      1. 마우스의 경우(비침습적 프로토콜): 이소플루란 투여를 중단하여 마취를 역전시키고 완전히 깨어날 때까지 따뜻한 환경에서 회복하는 동안 동물을 모니터링합니다.
      2. 쥐의 경우(두개골 창이 있는 침습적 프로토콜): 제도적 및 윤리적 지침에 따라 Euthasol(펜토바르비탈 나트륨, 140mg/kg)의 복강내 주사로 동물을 안락사시킵니다.

그림 3: 시간 경과에 따른 미세 기포 신호 강도. (A) 전체 관상 뇌 절편을 포함하는 신호 추출에 사용되는 관심 영역(ROI)의 그림. (B) 5분 획득 중 마이크로버블 신호 강도의 시간 경과. 마이크로버블 볼루스를 30초 동안 주입하여 신호 진폭의 특징적인 증가를 초래했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. IcoLab 소프트웨어를 사용한 이미지 재구성

1. IcoLab을 열고 화면 맨 왼쪽에 있는 ULM 탭을 클릭하여 ULM으로 이동합니다.
2. Compute ULM Maps를 클릭하여 그림 4에 자세히 설명된 대로 처리 워크플로를 시작합니다.
3. 획득한 데이터가 포함된 소스 폴더를 선택합니다.
4. 처리할 특정 스캔을 선택하고 필요한 경우 처리 시간 경계를 조정합니다.
5. 다음을 클릭하여 보고 단계로 진행합니다. 보고 단계에서 처리된 파일이 저장될 출력 폴더 경로를 구성합니다. PowerPoint 보고서에 포함될 이미지에 대한 시각화 매개 변수를 설정합니다.
6. 최종 화면에 표시된 선택한 옵션의 요약을 검토합니다.
7. 준비가 되면 RUN 을 클릭하여 처리를 시작합니다. 처리가 완료되면 밀도, 속도 및 후방 산란 진폭(BSA)에 대한 래스터화된 TIFF 파일과 함께 국부화된 미세 기포의 모든 좌표가 포함된 .trk 파일이 생성됩니다.
   참고: 5분 동안 획득하려면 몇 시간의 처리가 필요할 수 있습니다. 이 단계는 밤새 또는 전용 워크스테이션에서 수행하는 것이 가장 좋습니다.
   1. 마이크로버블 밀도 맵 생성: 감지된 모든 마이크로버블의 국부적인 위치는 선택한 획득 시간 동안 누적됩니다. 이러한 위치를 고정 해상도 공간 그리드에 매핑합니다.
      참고: 결과 밀도 맵의 각 픽셀은 해당 공간 빈 내에 국한된 미세 기포의 수를 반영합니다. 최종 출력은 픽셀 강도가 혈관 점유에 해당하는 그레이스케일 이미지(TIFF)로, 혈관 네트워크의 고해상도 재구성을 가능하게 합니다.
   2. 속도 맵 생성: 소프트웨어는 연속된 프레임에서 개별 미세 기포를 추적하여 궤적을 형성합니다. 각 궤적에 대해 소프트웨어는 변위를 경과 시간으로 나누어 속도 벡터를 계산합니다(mm/s 단위의 속도 벡터 생성).
      참고: 두 가지 유형의 속도 맵을 생성할 수 있습니다: 각 픽셀이 통과하는 미세 기포의 평균 속도 크기를 저장하는 절대 속도 맵과 선택한 해부학적 축(즉, x 또는 z)을 따라 속도가 분해되고 해당 부호 있는 구성 요소가 저장되는 방향 속도 맵입니다. 이러한 맵은 동일한 공간 그리드에 래스터화되고 개별 TIFF 이미지로 저장됩니다.
   3. BSA 맵 생성: 국부화된 각 미세 기포에 대해 원시 초음파 신호 진폭(후방 산란 강도)이 표시됩니다. 이러한 진폭을 공간 그리드에 투영하여 각 픽셀에 신호 강도를 누적합니다. 결과 BSA 맵은 미세 기포가 빔의 초점 영역을 통과한 영역을 강조 표시하여 밀도 및 속도 맵⁽¹⁵)을 보완하는 대비를 제공합니다.

그림 4: ULM 맵 재구성을 위한 처리 파이프라인의 순서도. 이 그림은 원시 초음파 데이터에서 ULM 맵을 생성하기 위해 분석 소프트웨어에서 수행되는 순차적 처리 단계를 보여줍니다. 복합 프레임(n = 200)에서 시작하여 1단계에서는 조직 배경에서 마이크로버블(MB) 신호를 분리하기 위해 특이 값 분해(SVD) 클러터 필터링을 적용합니다. 2단계에서 MB 신호는 Lanczos 보간을 거쳐 전처리된 이미지 스택을 생성합니다. 3단계에서는 국소 최대값 검출을 수행하고 이를 시스템의 점 확산 함수(PSF)와 연관시켜 후보 마이크로버블 위치를 식별합니다. 4단계에서는 서브픽셀 국소화(중심 감지) 및 입자 추적을 사용하여 마이크로버블 궤적을 추출하고, 이를 통해 속도 및 후방 산란 진폭 맵이 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. IcoStudio 소프트웨어를 사용한 데이터 시각화

1. IcoStudio에서 .trk 파일을 로드하여 데이터 탐색을 시작합니다.
2. 오른쪽 패널에서 대비, 압축, 컬러맵과 같은 시각화 매개변수를 조정하여 데이터 표현을 구체화합니다.
3. 기본 뷰 하단에 있는 이중 슬라이더를 사용하여 시작 및 종료 프레임을 정의하여 통합 시간을 설정합니다.
4. 밀도 탭을 열어 마이크로버블 발생을 보고 절대 밀도(픽셀당 개수)와 방향 밀도(축 가중치) 중에서 선택합니다.
5. 속도 탭을 사용하여 절대, 방향, 축 및 측면의 여러 모드를 통해 마이크로버블 속도를 mm/s 단위로 표시합니다. 대비, 압축 및 속도 임계값을 조정하여 시각화를 향상시킵니다.
6. BSA 탭을 탐색하여 미세 기포 반사율을 시각화하여 미세혈관 구조와 평면 외 움직임을 강조하는 대체 대비 메커니즘을 제공합니다. 사용자 정의 가능한 픽셀 크기 및 데이터 유형 설정을 사용하여 정량적 분석을 위해 고해상도 PNG 스크린샷을 내보내거나 TIFF 파일을 생성합니다.

결과

그림 5의 대표적인 예는 10μm 분해능으로 200μL의 마이크로버블 볼루스 주입 후 1분 동안 기록된 쥐 뇌의 ULM 데이터의 전형적인 예를 보여줍니다.

그림 5: 단일 마이크로버블 주사 후 개두절개술을 받은 쥐로부터 얻은 대표적인 ULM 출력. 마이크로버블(MB) 밀도(왼쪽), 속도(중앙) 및 후방 산란 진폭(오른쪽)의 예시 맵은 마이크로버블의 200μL 볼루스 주입 후 1분 동안 기록된 전체 관상 뇌 슬라이스에 대해 표시됩니다. 스케일 바: 2mm. 확대된 삽입은 왼쪽 피질 미세혈관 구조(스케일 바: 0.5mm)를 강조 표시합니다. 밀도 맵은 MB 발생의 공간적 분포를 반영하여 혈관망의 구조를 드러냅니다. 속도 맵은 개별 MB의 유속과 방향성을 보여 주므로 용기 유형을 구별할 수 있습니다. 진폭 맵은 MB의 후방 산란 초음파 신호를 보여 혈관 형태 및 평면 외 운동의 시각화를 향상시키는 추가 대비 메커니즘을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과 지도는 대뇌 미세혈관 구조의 세 가지 보완적인 보기인 미세 기포(MB) 밀도(왼쪽), 속도(중앙) 및 후방 산란 진폭(오른쪽)을 보여줍니다. 각 지도는 뇌의 전체 관상 조각에 해당하며, 확대된 삽입은 왼쪽 피질 미세혈관 구조를 강조합니다(축척 막대: 각각 2mm 및 0.5mm).

밀도 맵은 시야 전체에 걸쳐 MB 발생의 공간적 분포를 보여줍니다. 혈관 형태는 회절 한계보다 훨씬 낮게 분해되어 큰 혈관과 미세한 모세관 구조를 모두 드러냅니다. 이러한 유형의 맵을 사용하면 깊은 피질 영역에서도 분기 및 분기 패턴을 포함한 혈관 네트워크 토폴로지를 명확하게 시각화할 수 있습니다.

속도 맵은 축(z) 방향을 따라 투영된 개별 MB의 유속을 표시합니다. 이 투영은 부호 있는 속도 값을 생성하며, 음의 속도는 피질로의 상향 흐름을 반영하고 양수 값은 하향 흐름을 반영합니다. 설치류 대뇌 피질에서 혈관 구조는 매우 고정관념적입니다: 관통 세동맥은 연막 표면에서 피질층으로 내려가는 반면, 세정맥은 피질에서 다시 표면으로 올라가 탈산소화된 혈액을 배출합니다¹⁶. 이러한 일관된 해부학적 배열을 통해 방향 속도 측정을 사용하여 혈관 유형을 구별할 수 있으며, 양의 축 속도는 일반적으로 동맥 흐름을 나타내고 음의 속도는 정맥 배액을 나타냅니다. 전반적으로, ULM으로 측정된 속도 값은 관통 세동맥의 10-20mm/s에서 주요 두개내 동맥의 초당 몇 센티미터에 이르는 문헌^10,17에서 이전에 보고된 범위와 일치합니다. 이러한 발견은 흐르는 미세 기포가 적혈구의 유변학적 거동을 밀접하게 모방한다는 이전 관찰과 일치하며¹⁸, 마이크로 스케일에서 생리학적 혈류 역학을 정량화하기 위한 ULM의 사용을 검증합니다.

후방 산란 진폭(BSA) 맵은 각 MB에서 반환되는 초음파 신호 강도의 공간 표현을 제공합니다. MB가 초점 영역을 통과할 때 후방 산란 에너지가 최대화되기 때문에 이 맵은 고도 위치에 따라 대비를 제공합니다. 특히 더 깊은 깊이나 초점 가장자리 근처에서 평면 밖 운동이나 저진폭 혈관을 식별하여 분할을 개선하는 데 도움이 됩니다. BSA 맵은 깊이 관련 신호 감쇠를 감지하거나 초점 정렬(¹⁵⁾에서 불일치를 식별하는 데에도 유용합니다.

Brain Positioning System을 사용한 평면 표적화의 재현성을 입증하기 위해 그림 6A 는 동일한 관상면을 표적으로 하여 0일(1주차)과 7일(2주차)에 마취 하에 동일한 마우스에서 획득한 ULM 혈관 밀도 맵을 보여줍니다. 두 맵의 오버레이는 혈관 신호의 강력한 공간적 대응을 보여주며, 앞서 살펴본 바와 같이 평면 재배치의 정밀도와 종단 실험의 신뢰성을 확인합니다¹⁹.

정량 분석은 이러한 출력에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 사용자는 강도 임계값 또는 클러스터링 알고리즘을 사용하여 혈관을 분할한 다음 혈관 밀도, 평균 유속 및 혈관 반경, 평균 길이, 분지 수 및 혈관 네트워크의 기타 구조적 설명자를 포함한 형태 측정 매개변수와 같은 지역 통계를 추출할 수 있습니다. 피질 영역 또는 실험군(예: 약물 주사 대 대조군)에 대한 비교는 이러한 맵에서 직접 수행되거나 일반적으로 식별된 혈관에 대한 파생된 파라메트릭 통계를 통해 수행될 수 있습니다^20,21. 이러한 분석의 예로, 우리는 왼쪽 체감각 피질(S1BF, 그림 6B)과 왼쪽 시상(그림 6C)에서 혈관 매개변수의 국소 정량화를 수행했습니다. 밀도 맵은 먼저 이진화되고 스켈레톤화되었으며 유클리드 거리 변환을 사용하여 혈관 반경을 추정했습니다. 유속은 MB 궤적에서 직접 얻었고, 유속은 이전에 자세히 설명한 바와 같이 푸아쇠유의 법칙을 사용하여 용기 반경에서 도출되었습니다²¹. 해당 연구에서 설명한 것과 동일한 방법론이 여기에 적용되었습니다. 수염 플롯은 d0 및 d7에 대한 혈관 반경, 속도 및 유속의 분포를 표시하여 세션 전반에 걸쳐 우수한 재현성을 보여줍니다. 이러한 다중 모드 ULM 출력을 함께 사용하면 뇌의 미세혈관 네트워크에 대한 포괄적인 특성화가 가능해 전례 없는 해상도로 해부학적 통찰력과 동적 통찰력을 모두 제공합니다.

그림 6: 평면 타겟팅의 종단적 재현성 및 Brain Positioning System을 사용한 혈관 정량화의 예. (A) 뇌 포지셔닝 시스템(스케일 바 = 1cm)을 사용하여 동일한 관상면을 표적으로 하는 0일(1주) 및 7일(2주)에 동일한 마취된 마우스로부터 획득한 ULM 혈관 밀도 지도. 두 맵의 오버레이는 혈관 신호의 강력한 공간적 대응을 보여주며, 세션 전반에 걸쳐 평면 위치의 재현성을 보여줍니다. (나,씨) 두 관심 영역에서 추출한 혈관 매개변수의 대표적인 정량화: 왼쪽 체감각 피질(S1BF, B) 및 왼쪽 시상(C). 각 영역에 대해 d0 및 d7에서 혈관 반경(μm), 유속(mm/s) 및 유속(mm³/s)의 분포를 보여주는 수염 플롯과 함께 d0(축척 막대 = 0.5cm)을 표시합니다(중앙값, 25-75번째 백분위수, 수염 = 1.5×IQR, 이상값은 개별적으로 표시됨). 이러한 결과는 ULM 데이터에서 형태 측정 및 혈역학적 지표를 추출하는 파이프라인의 능력을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

초음파 국소화 현미경(ULM)은 초음파 영상의 혁신적인 발전을 나타내며 기존 회절 한계를 넘어 미세혈관 구조의 초고해상도 시각화를 가능하게 합니다. 이 토론에서는 ULM 프로토콜의 중요한 단계를 강조하고, 잠재적인 수정 및 문제 해결 전략을 다루고, 방법의 한계를 탐색하고, 대체 이미징 양식과 비교하여 그 중요성을 평가하고, 생물 의학 연구에서의 중요성과 잠재적 응용 분야를 고려합니다.

ULM 프로토콜의 중요한 단계

ULM의 성공적인 구현에는 몇 가지 단계가 중요하며 그 영향은 그림 7에 나와 있습니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 농도와 전달 품질이 모두 이미징 결과에 직접적인 영향을 미치기 때문에 마이크로버블 투여입니다. 공간 해상도와 감지 가능성의 균형을 맞추려면 최적의 농도가 필요합니다. 카테터 배치 불량 또는 혈관외 유출과 같은 부적절한 전달은 그림 7B와 같이 혈관 신호가 매우 낮고 재건이 불완전할 수 있으며, 여기서 희박한 수의 미세 기포만 혈류에 도달합니다. 일반적으로 킬로헤르츠 범위의 높은 프레임 속도 이미징은 미세 기포의 빠른 움직임을 포착하고 프레임 전반에 걸쳐 안정적인 추적을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 호흡으로 인한 움직임, 고정 불량 또는 불충분한 마취와 같은 획득 중 불안정성은 위치 파악 정확도를 저하시킬 수 있습니다. 이에 대한 예는 그림 7C에 나와 있으며, 획득 중 과도한 움직임으로 인해 밀도 맵이 흐릿하고 사용할 수 없습니다.

마이크로버블 위치 파악 및 추적은 개별 버블을 감지하고, 하위 픽셀 위치 파악을 수행하고, 하위 회절 정밀도로 궤적을 재구성하는 고급 이미지 처리 알고리즘에 의존합니다. 적절한 획득 및 처리를 수행하더라도 두개골로 인한 수차와 같은 해부학적 요인은 여전히 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 경두개 영상, 특히 나이가 많은 마우스에서 두개골이 두꺼워지면 음향 왜곡이 발생할 수 있습니다. 이로 인해 그림 7D에 표시된 것처럼 미세 기포가 감지되지 않는 시상 봉합사 아래에 특징적인 그림자 인공물이 발생합니다. 이러한 수차는 신호 대 잡음비를 감소시키고 적응형 필터링이나 프로브 배치를 개선하여 수정하지 않는 한 혈관 구조를 모호하게 만들 수 있습니다.

모든 단계가 성공적으로 수행되면 그림 7A와 같이 고품질 ULM 맵을 얻을 수 있으며, 여기서 조밀하고 잘 해결된 혈관 네트워크는 경두개 접근법을 통해 재구성됩니다.

그림 7: 마우스의 ULM 이미징 품질에 대한 참조 및 문제 해결 예. 패널 (A)은 젊은 성인 마우스에서 획득한 고품질 경두개 ULM 마이크로버블(MB) 밀도 맵을 보여주며, 전체 관상면에 걸쳐 성공적인 혈관 매핑을 보여줍니다. 패널 (B)는 미세 기포 유출 또는 불충분한 정맥 접근으로 인해 혈관 신호가 불량하여 MB 검출이 희박한 예를 보여줍니다. 패널 (C)은 과도한 동물 움직임의 영향을 받아 흐릿하고 해석할 수 없는 밀도 맵을 생성하는 획득을 보여줍니다. 패널(D)은 신호 대 잡음비 감소로 인해 MB가 감지되지 않는 시상 봉합사 아래의 그림자 원뿔로 보이는 노령 마우스에서 일반적으로 관찰되는 두개골 유발 음향 수차를 강조합니다. 이러한 예는 ULM 이미징에서 일반적인 실험 아티팩트를 식별하고 해결하기 위한 시각적 참조 역할을 합니다. 스케일 바: 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

방법의 한계

많은 장점에도 불구하고 ULM에는 적용 가능성에 영향을 미치는 고유한 한계가 있습니다. 평면 외 혈관 편향은 이미징 평면 외부로 확장되는 혈관이 적절하게 재구성되지 않아 불완전한 혈관 지도로 이어지기 때문에 2D 이미징에서 중요한 문제입니다. 이러한 한계는 체적(3D) 이미징 접근 방식²²로 전환함으로써 완화될 수 있지만 이는 계산 복잡성을 증가시킵니다. 정맥 카테터 삽입 문제도 장애물이 되며, 특히 일관된 미세 기포 전달을 달성하는 것이 기술적으로 까다로울 수 있는 작은 동물 모델에서 더욱 그렇습니다. 마이크로버블 안정성도 제한 요소이며, 특히 장시간 이미징 세션 중에 더욱 그렇습니다. 순환 반감기가 짧기 때문에 마이크로버블은 획득 기간 동안 적절한 조영을 유지하기 위해 반복적인 볼루스 주입 또는 지속적인 주입 프로토콜이 필요할 수 있습니다. 모션 아티팩트는 특히 작은 비자발적 움직임이라도 초고해상도 이미징을 저하시킬 수 있는 깨어 있는 피험자의 경우 여전히 중요한 문제로 남아 있습니다. 마지막으로, ULM의 깊이 침투는 본질적으로 초음파 감쇠에 의해 제한됩니다. 이는 일반적으로 고주파(예: 15MHz)에서 설치류 이미징에는 문제가 되지 않지만 돼지나 인간이 아닌 영장류와 같은 더 큰 동물에서는 더 어려워집니다. 이러한 경우 충분한 이미징 깊이를 달성하기 위해 저주파 프로브가 필요할 수 있지만 이는 공간 해상도가 감소하는 대가를 치르며 ULM을 더 큰 전임상 모델로 변환할 때 고려해야 하는 깊이와 세부 사항 간의 주요 절충안을 강조합니다.

기존 방법과 비교한 ULM의 중요성

초음파 국소화 현미경(ULM)은 특히 미세혈관 영상의 맥락에서 기존 영상 기법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 가장 주목할만한 강점 중 하나는 기존 초음파의 회절 한계를 뛰어넘어 2광자 현미경과 같은 광학 기술에 필적하는 공간 규모에서 회절 이하 이미징을 달성하는 능력입니다. 그러나 이러한 광학 방법과 달리 ULM은 더 깊은 조직 침투를 제공하여 비침습적으로 시각화하기 어려운 뇌 영역에 접근할 수 있습니다.

ULM은 또한 기능적 이미징 기능을 제공하여 혈류 속도, 관류 역학 및 혈관 리모델링을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이러한 특징으로 인해 신경혈관 네트워크의 생리학적 과정과 병리학적 변화를 모두 조사하는 데 매우 적합합니다. MRI 및 PET에 비해 ULM은 비용 효율적이고 무거운 인프라가 필요하지 않으며 독성 위험이 알려진 조영제의 사용을 피하고 대신 유리한 안전성 프로필을 가진 가스로 채워진 미세 기포에 의존합니다.

높은 공간 및 시간 분해능의 조합으로 인해 ULM은 다양한 연구 응용 분야에 특히 유용합니다. 이는 전통적인 양식이 종종 부족한 미세혈관 구조와 심부 뇌핵을 대상으로 하는 연구에서 특히 강력합니다. 또한 조직 고정 및 염색이 필요한 조직학적 접근법과 달리 ULM은 살아있는 동물의 실시간 이미징을 가능하게 하여 약리학적 문제와 같은 종단 설계 및 동적 개입을 지원합니다.

정적 혈관 매핑 외에도 ULM은 탁월한 공간적, 시간적 정밀도로 대뇌 혈류 역학을 캡처하여 고해상도 기능 이미징을 가능하게 합니다. 최근의 발전은 설치류의 전뇌 기능적 신경영상에 대한 타당성을 입증했으며, 분산된 뇌 네트워크를 가로지르는 모세혈관 수준에서 혈류의 자극 유발 및 자발적인 활동 의존적 변화를 밝혔습니다². 이를 통해 ULM은 기능 연구를 위한 강력한 도구로 자리매김하여 메조스케일 혈역학 이미징과 신경 활동 매핑 사이의 격차를 효과적으로 해소합니다.

유용성, 효율성 및 재현성 고려 사항

이 프로토콜에 설명된 ULM 워크플로는 다양한 실험 설정에서 구현의 용이성과 재현성을 위해 최적화되었습니다. FDA 및 EMA 승인 미세 기포 및 표준 설치류 마취 절차를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 사용하면 광범위한 접근성이 보장됩니다. 또한 전용 소프트웨어(IcoLab) 내에 전체 처리 파이프라인을 통합하여 마이크로버블 위치 파악, 궤적 재구성 및 지도 생성과 같은 복잡한 단계를 자동화하여 사용성을 크게 향상시킵니다. 이 간소화된 인터페이스는 사용자 정의 코드의 필요성을 줄이고 사용자 개입을 최소화하여 사용자와 실험 전반에 걸쳐 일관된 결과를 지원합니다. 고해상도 ULM 프로세싱은 특히 긴 수집 또는 체적 데이터의 경우 계산 집약적이지만 배치 처리 도구 및 GPU 가속은 분석 시간을 크게 단축합니다. 이 프로토콜의 모듈식 설계는 또한 재현성을 지원하며, 이를 통해 연구원들은 강력한 분석 프레임워크를 유지하면서 획득 및 처리 매개변수를 세밀하게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 IcoScan 및 IcoStudio를 사용한 프로브 포지셔닝에 대한 전용 섹션도 포함되어 있으며, 이를 통해 사용자는 약 100 μm의 정확도로 세션 전반에 걸쳐 정확히 동일한 이미징 슬라이스에서 프로브를 안정적으로 재배치할 수 있습니다. 이 기능은 시간 경과에 따른 혈관 변화를 추적하기 위해 정확한 공간적 일관성이 필수적인 종단 연구에 특히 유용합니다. 이러한 기능은 신규 사용자의 진입 장벽을 종합적으로 낮추고 탐색적 및 종단 이미징 연구 모두에서 ULM의 확장 가능한 배포를 지원합니다.

결론

이 프로토콜은 설치류 뇌 영상에서 초음파 국소화 현미경(ULM)을 구현하기 위한 완전한 워크플로를 제시하며, 전임상 연구에 최적화된 표준화된 획득 및 분석 플랫폼을 사용하여 수술 준비, 마이크로버블 투여, 이미지 획득 및 고해상도 혈관 매핑을 포괄합니다. ULM은 생의학 이미징의 주요 발전을 나타내며 전례 없는 세부 사항으로 미세혈관 구조의 생체 내 초고해상도 시각화를 제공합니다. 기존 이미징 기법과 비교하여 ULM은 높은 공간 해상도, 기능적 흐름 정량화 및 접근성의 고유한 조합을 제공하므로 혈관 발달, 신경혈관 결합 및 질병 병태생리학 연구에 특히 적합합니다. 기술이 계속 성숙해짐에 따라 ULM은 전임상 연구와 궁극적으로 임상 신경 영상 응용 분야의 초석이 될 준비가 되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동물 체온 조절기(가열판과 직장 탐침 결합)	물리적 성향	TCAT-2DF
아티파메졸	오리온 파마, 프랑스	안티세단	5 mg/mL 주사용 용액
C57BL/6 마우스	잰비에 랩스	SC-C57J-M	C57BL/6Rj 수컷 쥐, 8주
치과 드릴(Dental drill)	포어돔, 미국	K.1070 고속 회전 마이크로모터 키트
제모 크림	비시	해당 없음
눈 연고	TVM, 영국	오크리겔
헤어 트리머	파이렙	ISIS GT 421 아스쿨랍
IcoLab 처리 소프트웨어 (v 1.2.0.0)	이코네우스, 프랑스	아이코랩
아이코니우스 원 Xpand 구성	이코네우스, 프랑스	아이코네우스 원 엑스판드
IcoPrime 15MHz 프로브	이코네우스, 프랑스	IcoPrime-15MHz 프로브
IcoScan 획득 소프트웨어 (v1.9.0)	이코네우스, 프랑스	아이코스캔
IcoStudio 분석 소프트웨어 (v2.2.0)	이코네우스, 프랑스	아이코스튜디오
요오드 용액	프랑스 마일란	해당 없음
이소플루란 마취소	프랑스 에스테르네 주 미네르브	해당 없음
케타민	비르박, 프랑스	케타민1000	100 mg/mL 주사용 용액
멜록시캄	보링거 잉겔하임	메타캠	0.5 mg/mL 주사 용액
바늘	테루모, 프랑스	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” 8인치 바늘 튜빙
염수	프랑스 약국 길베르 피시오도스 실험실	해당 없음
메스	DREXCO 메디컬, 프랑스	80011
소노뷰 마이크로버블	브라코 이미징	SonoVue 8ul/ml
주걱	프랑스 피메드.	K.1070 고속 회전 마이크로모터 키트
스프래그-도울리 RJ: 한족 쥐	잰비에 랩스	RN-SD-M	RjHan:SD - 스프래그 도울리 수컷 쥐, 200-300g
입체 택시 프레임	데이비드 코프(투중가, 미국)	900-WA	마우스 어댑터를 사용하고; (참고: 922) 및 비파열 귀 봉(참고: 922)
주사기	DREXCO 메디컬, 프랑스	2058
초음파 젤	DREXCO 메디컬, 프랑스	메디젤
윙드 인퓨전 세트	테루모, 프랑스	SV*27EL
자일라진 2%	프랑스 바이엘	롬푼	20 mg/mL 주사용 용액