방법 논문

유도된 만능 및 할구 유사 줄기 세포에 대한 제대혈 전구세포의 정의된 Xenofree 재프로그래밍

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DOI:

10.3791/68613

⸱

2025년 8월 22일

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 제대혈(CB) 골수 전구세포를 기존의 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로 제종 없이(XF), 피더 프리(FF), 에피솜 재프로그래밍에 대해 화학적으로 정의된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 XF/FF CB-hiPSC(XF-hiPSC)는 증강된 분화 및 종간 키메라 잠재력을 소유하는 할구 유사 탄키라아제/PARP1 억제제 조절 나이브 줄기 세포(TIRN-SC)로 효율적으로 되돌릴 수 있습니다.

초록

인간 제대혈(CB) 골수 전구세포를 충실도가 높은 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 상태로 재프로그래밍하는 것은 비통합 에피솜 벡터 및 간질 신호를 사용하여 달성할 수 있습니다. 이러한 기존의 프라이밍된 CB-hiPSC 라인은 이후에 기능적 전능성을 가진 할구 유사 Tankyrase/PARP 억제제 조절 순진한 줄기 세포(TIRN-SC) 상태로 화학적으로 높은 효율로 되돌릴 수 있습니다. PARP 조절 TIRN-SC는 높은 후생유전학적 가소성, 안정적인 후성유전체학 각인을 가지며 기존의 계통 프라이밍 hiPSC보다 더 큰 분화 효능을 갖는 인간 줄기 세포입니다. 여기에서는 CD34+ CD33+ CB 골수 전구세포를 기존 XF/FF hiPSC로 효율적으로 중간엽 간질 활성화 에피솜 재프로그래밍하기 위해 최적화된 XF/FF 방법이 요약됩니다. TIRN 복귀는 XF/FF 기존 hiPSC를 재현 가능하게 강화하여 계통 프라이밍 유전자 발현이 감소한 절단 단계 인간 배아 세포의 전사, 후생유전학 및 기능적 특징을 채택했습니다. 우리는 TIRN 되돌린 CB 유래 XF-hiPSC가 유전적으로 독립적인 배경의 광범위한 레퍼토리에 걸쳐 지시된 다계통 분화(혈액혈관 계통 포함)에서 현저한 개선을 보였음을 검증했습니다. 이러한 방법은 임상 등급 HLA 정의 '범용' 기증자 TIRN-SC(UTIRN-SC) 은행에 대한 cGMP 준수 TIRN-SC 라인을 생성하기 위한 첫 번째 단계 역할을 합니다. CD34+ CD33+ CB 전구세포로부터 향상된 분화 다양성을 갖춘 UTIRN-SC 라인의 유도는 재생 의학에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, UTIRN-SC는 포괄적인 다중 계통 "기성품" 세포 치료법을 위해 HLA 정의, 냉동 보존 심장, 혈관 및 신경 기증자 전구 세포의 조직 은행을 생성할 수 있습니다.

서론

인간 유도만능줄기세포(hiPSC)는 맞춤형 세포 치료에 대한 유망한 기회를 제공하지만, 임상 적용은 종양 형성, 면역원성, 표현형 및 기능적 이질성1을 포함한 주요 과제에 직면해 있으며, 이는 안전성, 효능 및 비용 효율성에 영향을 미칩니다. 또한, 기존의 프라이밍된 hiPSC 계통에서 파생된 계통 헌신 전구세포는 매우 가변적인 계통 간 분화 효율2으로 생성되며 제한된 생체 내 생착 및 기능을 나타냅니다. 그러나, 이러한 한계는 최적화된 재프로그래밍 방법3 또는 대체 줄기 세포 상태(4,5)를 사용하여 극복될 수 있다.

피부 또는 혈액 체세포의 hiPSC로의 비바이러스 에피솜 재프로그래밍 효율은 낮지만(~0.01%-2%)6, CB 전구세포의 고도로 최적화된 4인자 재프로그래밍을 달성할 수 있으며 중간엽 간질 줄기 전구세포(MSC) 활성화 공동 배양 조건에서 최대 50%의 벌크 효율에 도달할 수 있습니다7. 이 시스템에서 CB 골수 전구 세포의 세포 재프로그래밍은 가용성 및 접촉 의존성 간질 신호에 의해 가속화되었습니다. 기질 프라이밍(SP) 에피솜 CB 유래 hiPSC 계통은 기존의 섬유아세포 유래 hiPSC보다 더 높은 효율성을 가진 혈관 전구세포(VP)로 분화되었습니다 3,5. SP-CB-iPSC 유래 VP는 보다 확실한 배아 VP 전사 동일성, 노화 감소 및 DNA 손상에 대한 민감도를 나타냈습니다 3,4. SP-CB-iPSC 유래 VP는 또한 망막 허혈-재관류 손상 성인 면역결핍 마우스의 유리체에 전신 또는 직접 이식한 후 기존의 hiPSC 유래 VP보다 더 강력한 생체 내 생착을 입증했습니다 3,4.

Zimmerlinet al. 프라이밍된 기존의 인간 만능 줄기 세포를 개선된 다계통 분화 가능성이 있는 TIRN-SC 상태로 전환하는 2단계 화학적 재프로그래밍 시스템('LIF-5i -> LIF-3i')을 확립했습니다5. 차별화된 TIRN-SC 유래 혈관 전구세포는 허혈성 망막의 심부 신경층으로 이동하고 혈관을 재형성하는 향상된 능력에서 알 수 있듯이 더 높은 기능, 더 큰 게놈 안정성 및 우수한 생체 내 생착을 나타냈습니다4. TIRN-SC는 종간 키메라 분석에서 높은 기여도를 갖는 기능적 하이브리드 할구 유사 상태를 획득하기 위해 단백질 유전체 재프로그래밍을 거쳤습니다8. TIRN-SC는 DNMT1 발현을 유지했으며 CpG-메틸화 게놈 각인 영역에서 침식으로부터 보호되었습니다. 흥미롭게도 SP-CB-hiPSC는 덜 효율적인 대체 방법을 통해 파생된 hiPSC보다 더 효율적으로 TIRN-SC로 되돌렸습니다 5,9.

따라서 TIRN-SC는 향상된 다계통 분화 능력과 효율적인 키메라 기여도를 갖춘 대체 줄기 세포 상태입니다. 추가 최적화
정의된 cGMP 준수 배양 조건에서 TIRN-SC 재프로그래밍은 치료를 위한 광범위한 기능적이고 이식 가능한 세포 유형 및 조직의 생성을 촉진할 것입니다. 비용 효율적인 치료 전구 세포에 대한 필요성을 해결하기 위해 이러한 방법을 적용하여 HLA 정의 CD34+ 조혈 CB 또는 말초 혈액 전구 세포를 사용하여 '범용 기증자' TIRN-SC(UTIRN-SC)의 cGMP 등급 뱅크를 생산할 수 있습니다. HLA로 정의된 UTIRN-SC 유래 전구세포는 복잡한 조직의 즉각적인 다계통 재생이 필요한 더 많은 환자의 요구를 충족시킬 수 있습니다.

임상 골수 이식(BMT)을 위해 개발된 패러다임은 부분적으로 HLA 일치 또는 국가 기증자 등록부의 HLA-일배체 동일 조혈 줄기 세포에서 UTIRN-SC 뱅크의 개발을 안내할 수 있습니다. 미국을 포함한 18개국의 상위 10개 일배체형에 대한 예측 글로벌 계산 분석은 이러한 hiPSC '일배체은행'10에서 평균 68.4%의 환자 범위를 제공할 것입니다. 정의된 UTIRN-SC 은행은 혈통에 헌신된 전구세포를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 광범위한 유전적 다양성을 가진 집단(예: 미국)에서 이식편 거부반응을 줄이기 위한 내성 유도 조혈 전구세포의 생성을 포함하여 전체 장기 생성11,12을 위해 가축(예: 돼지) 내에서 종간 배반포 보완 시스템의 치료적 TIRN-SC 적용을 지원할 수 있습니다.

TIRN 적합 XF/FF hiPSC 라인을 생성하기 위한 이 수정된 재프로그래밍 프로토콜은 향후 cGMP 준수 UTIRN-SC 뱅크 개발을 위한 첫 번째 단계입니다. 이 프로토콜은 인간 CB 골수 전구세포를 기존 XF-hiPSC 계통으로 단계적으로 간질 프라이밍 재프로그래밍 및 기능적 검증을 간략하게 설명합니다. 이러한 XF-hiPSC는 비 XF 방법과 유사한 효율성으로 TIRN-SC로의 쉬운 복귀를 입증했으며 7 잘 형성된 계통 편향 감소 기형종을 생성하는 향상된 능력을 포함하여 제한되지 않은 기능적 다능성을 달성했습니다(동유전자 프라이밍 XF-hiPSC에 비해) 4,5,9. 또한 혈액혈관 계통에 대한 개선되고 강력한 직접 분화를 위해 TIRN 되돌린 XF-hiPSC를 검증하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

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프로토콜

모든 재프로그래밍 실험은 미국 국립 과학 아카데미(National Academy of Sciences)와 국제 줄기 세포 연구 학회(ISSCR)에서 발표한 지침을 준수했습니다. hiPSC 생성을 위해 기증자 세포 수집 프로토콜 및 기증자 사전 동의는 Johns Hopkins University(JHU) IRB(Institutional Review Board) 감독에 의해 승인되었습니다. 모든 실험은 JHU 기관 줄기 세포 연구 감독(ISCRO)의 범위 하에 수행되었으며 정보에 입각한 동의 및 출처 평가에 관한 기관 표준을 준수합니다. 또한 모든 동물 사용 및 수술 절차는 JHU 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 동물 절차와 관련된 모든 실험(예: NOD의 피하/근육내 주사. 기형종 분석 및 ICR 가성 임신 마우스로의 배반포 이식을 위한 Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOG SCID) 마우스(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)는 JHU IACUC에 의해 검토 및 승인되었습니다. 이러한 검토에는 윤리적 희생, 인도적인 주거, 동물의 불편함을 최소화하기 위한 적절한 조치에 대한 고려 사항이 포함되었습니다.

1. 피더가 없는 이종 없는 hiPSC 에피소말 재프로그래밍

  1. 기증자 조혈 전구 세포 제조
    1. 분만 즉시 냉동 보존된 CD34+ 조혈 줄기/전구 세포(예: 1x106 신생아 CB 세포)를 사용하거나 냉동 바이알을 액체 질소 저장 탱크에 보관하십시오. 운송 및 취급 중에 세포가 지속적으로 냉동 상태로 유지되었는지 확인하십시오.
      참고: 대안적으로, 냉동보존되지 않은 기증자 세포는 승인된 프로토콜을 사용하여 수집 및 CD34 농축 직후에 활용될 수도 있습니다.
    2. 수조에서 세포를 해동하기 전에 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균된 냉동 조기를 부드럽게 열어 바이알 내부에 갇힌 가스를 방출한 다음 바이알을 단단히 닫습니다.
    3. 바이알을 37°C 수조에 1-2분 동안 넣습니다. 얼음이 거의 남지 않을 때까지 바이알을 부드럽게 휘젓습니다. 수조에서 바이알을 꺼내 철저히 멸균합니다(즉, 70% 에탄올 스프레이).
      알림: 모든 단계에는 적절한 무균 기술이 필요하며 멸균 생물학적 안전 후드 캐비닛 내에서 수행됩니다.
    4. 세포를 빈 50mL 멸균 원뿔형 튜브로 부드럽고 천천히 옮깁니다. 1mL의 차가운 이종 없는 조혈 전구 배지(XF-HP) 확장 배지(표 1)로 바이알을 세척하고 세포와 부드럽게 결합(튜브 가장자리를 따라 적가)하여 DMSO 동결 보호제를 희석합니다.
    5. 튜브를 랙에 30초 동안 세워두고 차가운 XF-HP 배지 2mL를 천천히(물방울) 추가합니다. 배지를 첨가하는 동안 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이칩니다. 4, 8 및 4mL의 차가운 XF-HP 배지(최대 총 부피 20mL)를 순차적으로 추가하여 이 단계를 두 번 반복합니다. 희석된 세포를 100 x g으로 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
      참고: 냉동 보호제 용액 및 희석 단계 동안 세포를 위아래로 피펫팅하지 마십시오. DMSO가 최소 10배 희석될 때까지 XP-HP 미디엄을 적금, 천천히 첨가합니다. DMSO 희석은 발열 반응을 일으킬 때 차가운 매체를 사용하십시오.
    6. 생물 안전 캐비닛에서 무세포 상청액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 부드럽게 제거합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 XF-HP 확장 배지 2mL에 재현탁합니다.
    7. 해동된 세포를 초저부착 세포 배양 멀티웰 플레이트로 옮깁니다(예: 2mL의 세포/XF-HP 배지 혼합물을 6웰 플레이트의 1웰로 옮깁니다).
    8. 저산소 상태를 모방하기 위해 접시를 Saran 랩으로 단단히 감쌉니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)로 옮깁니다. 또는 포장되지 않은 플레이트를 O2 대조군(5% O2, 5% CO2, 습한 분위기)이 있는 인큐베이터에 넣습니다.
    9. XF-HP 배지에서 3일 동안 조혈 전구 세포를 배양합니다.
  2. 중간엽 줄기 전구 세포(MSC) 준비
    1. 냉동 보존된 분취량을 37°C 수조에서 1 내지 2분 동안 배양하여 낮은 계대(p2 내지 p3) 인간 중간엽 줄기세포의 분취량(0.75 - 1x106 세포)을 해동합니다. 얼음이 거의 남지 않을 때까지 바이알을 부드럽게 휘젓습니다. 수조에서 바이알을 꺼내 철저히 멸균합니다(즉, 70% 에탄올).
      참고: 저계대(p2) 인간 MSC는 확립된 프로토콜을 사용하여 인간 골수에서 구입하거나 준비할 수 있으며 동결 보존할 수 있습니다. MSC는 약 7-10일 전에 해동할 수 있으며 핵 절제 전날 피더 층으로 조사/도금할 수 있습니다(그림 1).
    2. DMSO 동결 보호제를 최소 10배 희석하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 차가운 무혈종 무혈청 중간엽 줄기 세포(XF-MSC) 배지(표 1)가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 세포를 부드럽고 천천히(튜브의 가장자리를 따라 적가) 옮깁니다(예: 1mL 동결 보존 세포 분취량을 9mL XF-MSC 배지로 옮깁니다).
    3. 1mL 또는 2mL의 차가운 XF-MSC 배지를 사용하여 튜브를 헹구고 원뿔형 튜브에 결합합니다. 희석된 세포를 100 x g으로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 생물 안전 캐비닛에서 무세포 상청액을 흡인합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 세포 펠릿을 XF-MSC 배지 1mL에 부드럽게 재현탁합니다.
    5. 해동된 세포를 조직 처리된 세포 배양 멀티웰 플레이트(예: cm2 당 5,000-6,000개 세포 또는 6웰 플레이트의 1웰에서 약 50,000개 세포)로 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에 넣습니다. 생물안전 캐비닛 내에서 2-3일마다 XF-MSC 배지를 새로 고칩니다.
    6. 핵 접수 전날, 생물 안전 캐비닛에서 무세포 상청액을 흡인합니다. MSC를 PBS(2mL/웰)로 한 번 세척합니다. PBS를 흡인합니다. 1mL/웰의 세포 해리 시약(예: 1X 트립신-EDTA 용액)을 추가합니다. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    7. XF-MSC 배지 1mL(최소 2배 희석)를 첨가하여 해리 시약을 중화하고 피펫으로 단일 세포 현탁액에 부드럽게 분쇄합니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 100 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    8. 상청액을 흡인합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 세포 펠릿을 XF-MSC 배지 1mL에 재현탁합니다.
    9. XF-MSC 배지에서 G- 또는 X선 조사기를 사용하여 5개 계대 하에서 중간엽 전구세포를 조사하고 플레이트를 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩타이드 코팅 합성 표면 6웰 플레이트(웰당2x10 5 세포)에 조사합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에서 밤새 보관합니다.
  3. Xenofree 에피소좀 재프로그래밍
    1. XF-HP 확장 배지에서 3일 된 CB HP 배양액을 생물 안전 캐비닛의 15mL 원추형 튜브에 수집합니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    2. 생물 안전 캐비닛에서 무세포 상청액을 흡인합니다.  혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 세포 펠릿을 XF-HP 확장 배지 1mL에 부드럽게 재현탁합니다.
    3. 1x106 개의 확장된 HP 세포를 100μL의 인간 CD34+ 세포 핵펙트 용액(인간 CD34+ 세포 핵펙터 키트)과 결합합니다. 정제된 농축 에피좀(<5μL) 6μg을 첨가하고 뉴클레오펙션 키트의 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 뉴클레오펙터 큐벳으로 조심스럽게 이송합니다. 거품을 피하십시오. 큐벳을 핵 장치 장치에 넣고 프로그램 U-008을 사용합니다.
      참고: TOP10 대장균에서 일상적인 형질전환에 의해 에피솜 EBNA 기반 pCEP4 벡터 pEP4 EO2S EM2K(OCT4, SOX2, MYC, KLF4)의 스톡을 준비하고 플라스미드 Maxi-prep 키트를 사용하여 정제합니다. 핵접시당일, PCR 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 세척하고 농축합니다 7.
    4. 핵 접합 직후, 예열된 XF-HP 확장 배지 500 μL를 큐벳에 추가하고 멸균 전사 피펫을 사용하여 XF-HP 배지 1mL의 세포를 초저부착 세포 배양 6웰 플레이트 1웰에 옮깁니다.
      참고: 핵 접합 세포는 매우 취약하며 일반 1mL 피펫 팁의 전단 응력을 견디지 못합니다. 초저부착 배양 플레이트로 옮기는 것은 RGD 코팅 플레이트에 최종 부착되기 전에 핵박동 후 세포 회복을 촉진하는 단계입니다.
    5. 저산소 상태를 모방하기 위해 플레이트를 플라스틱 랩으로 단단히 감쌉니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에 넣습니다. 또는 포장되지 않은 플레이트를 O2 대조군(5% O2, 5% CO2, 습한 분위기)이 있는 인큐베이터에 넣습니다. 4-6시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계를 통해 핵 접각된 HP 세포는 MSC 단층으로 전달되기 전에 회복될 수 있습니다.
    6. 세포를 생물 안전 캐비닛의 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 생물 안전 캐비닛 내에서 상청액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 1mL의 XF-HP 확장 배지에 재현탁합니다. ROCK 억제제 Y-27632(최종 농도 10μM)가 보충된 XF-HP 확장 배지(2mL/웰)의 RGD 코팅 플레이트에서cm2 당 약 17,500개의 밀도로 조사된 MSC에 핵 접합된 HP 세포를 플레이트링합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에 넣습니다.
    8. 핵접합 2일 후, 생물안전 캐비닛 내의 각 웰에 2mL(동일한 부피)의 E8 배지를 추가합니다.
    9. 격일로 배양 배지 부피의 절반을 E8 배지로 교체하십시오. 부유 세포를 15mL 원추형 튜브에 모으고 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 회수된 세포를 배양에 다시 추가합니다.
    10. 21일째에 비트로넥틴 코팅 조직 배양 처리된 6웰 플레이트를 준비합니다. 희석된 비트로넥틴 용액 1mL(예: Vitronectin-XF의 경우 40mL/mL)를 6웰 플레이트의 1웰에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    11. 생물안전 캐비닛 내에서 도립 현미경을 사용하여 개별 XF-hiPSC 콜로니를 수동으로 선택합니다. 피펫으로 분쇄하고 ROCK 억제제 Y-27632(최종 농도 5μM)가 보충된 E8 배지의 비트로넥틴 코팅 플레이트에 단일 콜로니를 옮깁니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에 넣습니다.
    12. 다음날, 배지를 ROCK 억제제 보충제가 없는 E8 배지로 조심스럽게 교체하십시오. 그 후 생물안전 캐비닛에서 매일 E8 배지(2mL/웰)를 교체합니다.

2. 일상적인 hiPSC 배양 및 유지 관리

  1. 콜로니가 5-6일 후에 커지면(즉, 직경 0.5-1mm 또는 약 80% 합류) 생물 안전 캐비닛에서 배지를 흡인합니다.
  2. 2mL/웰 PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인합니다. 1mL EDTA 기반 세포 해리 용액을 첨가합니다. CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에서 5분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 느슨하게 부착되어 있는지 확인하십시오(예: 반짝이는 둥근 세포이지만 여전히 플레이트에 부착되어 있음).
  3. 세포를 방해하지 않고 생물안전 캐비닛 내에서 해리 용액을 부드럽게 흡인합니다.
  4. 세포 덩어리를 유지하기 위해 비활성 피펫팅으로 ROCK 억제제 Y-27632(최종 농도 5μM)가 보충된 E8 배지 1-2mL에 세포를 수집합니다. 세포 덩어리를 비트로넥틴 코팅(섹션 1.3.11 참조) 6웰 세포 배양 처리된 플레이트(웰당 10개 콜로니 또는 1:10 분할에 해당)로 옮깁니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에 넣습니다.
  5. 5-7일마다 EDTA 기반 세포 해리 용액을 사용하여 계대배양을 계속합니다.
    참고: SP-CB-hiPSC 재프로그래밍에는 일반적으로 추가 하위 클로닝 또는 수동 콜로니 피킹이 필요하지 않지만, hiPSC 클론에 비정상적인 형태(예: 섬유아세포 또는 배아체 형성과 같은 자발적 분화, 비정상적인 비평평한 콜로니의 출현)를 가진 콜로니가 포함된 경우, 생물안전 캐비닛 내에서 마이크로 피펫과 현미경을 사용하여 콜로니를 수동으로 선택하거나 비정상적인 클론을 폐기합니다. hiPSC의 비효율적이고 불안정한 재프로그래밍은 TIRN-SC 복귀와 호환되지 않습니다.

3. XF-hiPSC 클론의 표현형 검증

  1. 장기 동결 보존 및 기능 연구에 적용하기 전에 섹션 2에 설명된 대로 초기 검증(그림 2)을 위해 최소 5-7개의 계대에 대해 XF-hiPSC 클론을 확장합니다. 각 냉동 보존 바이알의 통과 수를 기록합니다.
    참고: 저계대 XF-hiPSC 클론의 초기 특성화는 아칼린 포스파타제 활성 및 TRA-1 항원 또는 NANOG 면역검출과 같은 여러 분석에 의해 확인할 수 있습니다.
  2. 알칼리성 포스파타제 염색으로 XF-hiPSC 검증 및 계수를 수행합니다(그림 2A,B).
    참고: 대량 배양의 재프로그래밍 효율은 3일 7,13일에 도금된 단일 입력 세포당 완전히 재프로그래밍된 콜로니의 수를 열거하여 에피솜 핵펙션 후 P0 3-5주에 결정할 수 있습니다.
    1. 생물안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인합니다.
    2. PBS(웰당 2mL)로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인합니다. 2% 파라포름알데히드/PBS 용액을 첨가하여 세포를 고정합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 화학 폐기물 안전 지침에 따라 파라포름알데히드/PBS 용액을 제거하고 폐기하십시오.
    4. PBS(웰당 2mL)로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인합니다. 1-2mL의 알칼리성 포스파타제 기질을 첨가하고 천천히 교반하면서 실온에서 10-15분 동안 배양합니다.
    5. 반응을 멈추기 위해 PBS로 3회 세척합니다. 현미경 사진 및 열거.
      알림: 위양성 염색을 초래할 수 있으므로 과도한 배양 시간이나 온도를 피하십시오.
  3. TRA-1 항원 면역염색을 사용하여 XF-hiPSC 염색 검증 및 계수를 수행합니다(그림 2C).
    참고: 에피소말 재프로그래밍의 경우, 초기 계대 동안 형질전환 발현 및 EBNA1 벡터 백본의 검출은 공개된 프로토콜7을 사용하여 수행되어야 합니다. 일상적인 검증에는 G-밴딩(그림 2D)에 의한 핵형 분석 또는 전체 게놈 어레이 기반 커버리지 분석이 포함됩니다. 기본 기능적 다능성은 기형종 분화 프로토콜(그림 2E) 또는 비지향성 배아체 분화의 정량적 다중 유전자 발현 스코어카드를 사용하여 분석할 수도 있습니다14.
    1. 생물 안전 캐비닛에서 면역염색은 형광색소 접합 생염색 항체를 적절한 농도의 E8 배지에 추가하여 30분 동안 TRA-1-60 또는 TRA-1-81 항원에 대한 웰을 복제합니다.
    2. 배양 배지를 흡인합니다. E8 배지(웰당 2mL)로 두 번 세척합니다.
    3. 현미경 사진 촬영 및 E8 배지 또는 페놀 레드 프리 배지에서 열거합니다.
      참고: 또는 실온에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드/PBS 용액을 사용하고 표준 항체를 사용하여 TRA-1 항원에 대한 면역염색을 사용하여 세포를 고정합니다.
  4. 유세포 분석을 통해 XF-hiPSC 면역 표현형을 검증합니다.
    1. 생물 안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인합니다.
    2. PBS에서 세포를 세척합니다(웰당 2mL). PBS를 흡인합니다. 효소 해리 시약(예: Accutase, 웰당 1mL)을 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(5% CO2, 습한 분위기)에서 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 같은 부피의 배양 배지를 첨가하여 세포를 수집하고 세포 여과기(40-70μm 필터)를 통과합니다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 세포 펠릿을 5% FBS(웰 등가물당 1mL)와 함께 PBS에 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. FACS 분석당 둥근 바닥 튜브에 약 100,000-200,000개의 세포를 분배합니다(분석당 부피를 약 100μL로 유지).
    5. 세포외 염색의 경우, 순수한 마우스 혈청을 사용한 선택적 차단 단계(분석당 5μL 추가, 실온에서 5분) 후 제조업체의 지침에 따라 형광색소 접합 항체(예: TRA-1-81 PE, SSEA4 APC)와 함께 배양합니다. 3mL PBS로 세척합니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. FACS 완충액(예: 5% FBS가 포함된 PBS)에 재현탁하고 FACS 기기를 사용하여 획득합니다.
      참고: 항상 적절한 이소형 대조군을 사용하고 평행 샘플을 염색하여 면역 검출 단백질의 특이성을 검증합니다.
    6. 세포내 염색(예: NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE)의 경우 고정/투과화 단계에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 형광색소 접합 항체 또는 일치하는 이소형 대조군과 함께 배양합니다. FACS 기기를 사용하여 획득합니다.

4. XF-hiPSC 클론의 냉동 보존 및 해동

  1. 장기 동결 보존 및 기능 연구에 적용하기 전에 초기 검증(그림 2)을 수행하기 위해 최소 5-7개의 계대에 대해 XF-hiPSC 클론을 확장합니다. 각 냉동 보존 바이알의 통과 수를 기록합니다.
    1. 생물안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인합니다.
    2. PBS(웰당 2mL)로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인합니다.  EDTA 기반 세포 박리 용액(웰당 1mL)을 첨가하여 XF-hiPSC 콜로니를 세포 덩어리로 해리시킵니다. CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에서 플레이트를 5분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 느슨하게 부착되어 있는지 확인하십시오(예: 반짝이는 둥근 세포).
    3. 세포 단층 콜로니를 방해하지 않고 해리 용액을 부드럽게 흡인하고 세포 덩어리(덩어리당 10-50개 세포)를 유지하기 위해 비격렬한 피펫팅으로 1-2mL E8 배지에 세포를 수집합니다. XF-hiPSC를 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 생물 안전 캐비닛에서 상청액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 동결 용액에 재현탁합니다(표 2, mL당 ~ 1웰 등가).
    5. 세포를 장기 보관 극저온 튜브로 옮깁니다. 튜브를 서서 냉동하는 용기에 넣고 샘플을 -80°C 냉동실에서 밤새 얼립니다. 다음날 냉동 바이알을 액체 질소 냉동고에 넣어 장기간 보관합니다.
  2. 해동을 위해 비트로넥틴으로 사전 코팅하여 플레이트를 준비합니다(섹션 1.3.11 참조).
    1. 냉동 바이알을 37°C 수조에 넣고 세포를 ~1-2분 동안 해동합니다. 멸균(즉, 에탄올 스프레이).
    2. XF-hiPSC를 9mL의 해동 배지(표 2)가 들어 있는 멸균 15mL 원뿔형 튜브로 천천히 옮겨 멸균 생물학적 안전 후드 캐비닛 내에서 세포를 천천히 10배 희석합니다.
      알림: 세게 피펫팅하지 마십시오.
    3. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 생물안전 캐비닛에서 무세포 상청액을 흡인합니다. ROCK 억제제(최종 농도 5mM)가 보충된 E8 배지(1-2mL)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
      참고: Y-27632를 제외하면 해동 후 회복 효율이 떨어집니다.
    5. 해동된 세포를 6웰 플레이트의 1개 또는 2개의 비트로넥틴 코팅 웰로 옮깁니다. 다음날, 세포 증식을 위해 ROCK 억제제가 없는 일반 E8 배지로 배지를 교체합니다.

5. XF-hiPSC의 이종 없는 혈액혈관 분화

  1. 최적화된 이종 없는 혈액-혈관 분화 프로토콜을 사용하여 XF-hiPSC를 구별합니다(그림 3)4.
    참고: 이 프로토콜은15에서 수정되었습니다.
    1. ~40-50% 합류(계대 후 1-3일)에서 XF-hiPSC를 준비합니다.
    2. 배양 배지를 흡인하고 생물 안전 캐비닛에 2mL 중배엽 측정 배지(표 2)를 추가합니다.
    3. 2일 후, 배지를 흡인하고 생물안전 캐비닛에 2mL/웰의 혈관 분화 배지(표 2)를 추가합니다. 이 단계에서 많은 죽은 세포 또는 부유 세포가 보이면 2mL PBS로 한 번 세척하십시오.
    4. 11일까지 생물안전 캐비닛에서 격일로 혈관 분화 배지를 교체합니다.
      참고: 높은 세포 밀도와 낮은 pH로 인해 배지가 노랗게 변하면 신선한 배지 1mL를 추가하거나 매일 교체하십시오.
  2. 혈관 분화 배지에서 7-10일 배양 후, 마그네틱 비드 세포 분류 방법으로 부착 단층에서 CD31+ 또는 CD34+ 혈관 세포를 정제합니다.
    참고: 각 개별 클론은 뚜렷한 분화 동역학을 나타낼 수 있습니다. FACS 분석을 통해 CD31/CD34 발현의 피크 시점을 결정합니다(그림 4A). 자기 비드 농축 전후 농축 FACS 분석이 필요합니다. 조혈 전구 세포(HP)는 이 단계에서 상청액에서 회수되고 CD34 마이크로비드를 사용하여 농축될 수 있습니다. CD34+ XF-hiPSC 유래 HP는 메틸셀룰로오스 분석을 사용하여 추가로 검증될 수 있습니다(그림 4B-C)16.
    1. 생물 안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인하고 PBS(웰당 2mL)에서 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 효소 해리 시약(예: Accutase, 웰당 1mL)을 추가하여 hiPSC 콜로니를 단일 세포로 해리합니다. CO2 인큐베이터(5% CO2, 습한 분위기)에서 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
    2. 생물 안전 캐비닛에서 동일한 양의 배양 배지를 추가하여 세포를 수집합니다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    3. 혈관 분화 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다(표 2). 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 직접 접합된 항-CD31 또는 항-CD34 항체를 사용한 사전 자성 비드 농축 FACS 분석을 위해 약 50,000-100,000개의 세포를 따로 보관합니다.
    4. 나머지 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 생물안전 캐비닛의 마그네틱 비드 농축 완충액(PBS pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM EDTA)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    5. 세포를 세포 여과기(40-70μm 필터)에 통과시킵니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 60μL 마그네틱 비드 농축 완충액에 재현탁합니다.
    6. 20 μL FcR 차단 시약을 첨가한 다음 20 μL CD31 또는 CD34 마이크로비드를 첨가하고 4°C에서 15-20분 동안 배양합니다.
    7. 생물안전 캐비닛 및 원심분리기(300 x g, 5분)에서 2mL 마그네틱 비드 농축 완충액으로 세포를 세척합니다.
    8. 생물 안전 캐비닛의 1mL 마그네틱 비드 농축 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    9. 생물 안전 캐비닛 내의 자기 세포 분리기의 자기장에 LS 컬럼을 놓습니다. 3mL 마그네틱 비드 농축 완충액으로 컬럼을 세척합니다.
    10. 열에 셀 적용.  표지되지 않은 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모으십시오. 3mL 마그네틱 비드 농축 완충액으로 컬럼을 3회 세척합니다.
    11. 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 원추형 튜브에 놓습니다.
    12. 3-5mL 내피 성장 배지를 추가하여 자기 표지된 세포를 씻어냅니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    13. 생물안전 캐비닛의 1mL 내피 성장 배지에 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 직접 접합된 항-CD31 또는 항-CD34 항체를 사용한 FACS 분석에 의한 자기 비드 농축 후 분류 순도를 위해 약 50,000개의 세포를 따로 보관합니다.
    14. 분리된 VP는 내피 성장 배지에서 피브로넥틴 코팅(10μg/mL) 조직 배양 처리된 플라스크 플레이트에서 추가로 확장될 수 있습니다.

6. XF-hiPSC의 기능적 검증을 위한 실험 설계 지침

  1. 에피소좀 7,17, 센다이 바이러스18 또는 mRNA19 재프로그래밍과 같은 확립된 비통합 방법을 사용하여 가장 빠른 계대에서 검증된 XF-hiPSC의 스톡을 확립합니다.
    참고: 비재프로그래밍 방법의 효율성과 신뢰성에 대한 비교는 다른 곳에서제공됩니다 6. 에피솜 또는 센다이 바이러스 재프로그래밍 방법에서의 형질전환 물질 제거는 PCR 방법 7,20을 사용하여 초기 계대 동안 검증될 수 있습니다. 이식유전자 보유는 TIRN-SC 생성과 호환되지 않습니다.
  2. G-밴딩 또는 전체 게놈 어레이 기반 커버리지 분석을 통해 XF-hiPSC 클론의 정상 핵형을 검증합니다9.
  3. DNA 메틸화 및 유전자 발현 어레이 또는 시퀀싱 방법 5,11,14를 사용하여 XF-hiPSC 계통의 유전자 발현 및 후성유전체 무결성(즉, 부모 각인, X 활성화)을 검증합니다.
  4. 기형종 분화 프로토콜(그림 2E), RT-PCR 어레이를 사용한 정량적 배아체(EB) 분화 분석(14) 또는 3개의 배아층에 대한 지시된 분화 분석9을 사용하여 기본 기능적 다능성을 검증합니다.
    참고: 현미경에 의한 조직학적 특성화를 사용하는 기형종 분석의 다계통 분화 능력 및 계통 내 증식 지수에 대한 정량적 방법은 다른 곳에서 제공됩니다4. 중배엽 계통 및 혈액-혈관 사양(그림 4A-C)에 대한 지시된 분화를 위한 프로토콜은이전에 상세히 설명되었으며4,5,9 및 최종 내배엽에 대한 지시된 분화 분석(그림 4D)5. 외배엽에 대한 지시성 분화 분석의 예는 다른 곳에 제공됩니다 4,5.

7. XF-hiPSC의 화학적 TIRN 적응

  1. 공개된 프로토콜 9,21에 따라 CF1 또는 CF1 x DR4 하이브리드 E13.5 마우스 배아로부터 사내 저계대 MEF 피더를 구입하거나 준비합니다. TIRN 적응 단계 최소 하루 전에 젤라틴화된(물에 0.1% 젤라틴, 웰당 1mL) 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 웰당 200,000개의 MEF 피더를 플레이트합니다(자세한 TIRN 프로토콜은 다른 곳에서 제공됨 4,5,9).
  2. 피더가 없는 배양 시스템(예: E8 배지, 사내 제형에 대해서는 표 1 참조)에서 검증된 정상 핵형으로 형질전환이 없는 XF-hiPSC 배양을 유지하고 확장합니다.
  3. E8 배지를 LIF-5i 배지(웰당 2mL; 표 1) XF-hiPSC 배양이 생물안전 캐비닛에서 ~50% 합류성(즉, 초기 도금 후 3-5일)에 도달한 후.
  4. 다음날, 배양 배지를 흡인하고 생물 안전 캐비닛에서 PBS(웰당 2mL)로 LIF-5i 적응 XF-hiPSC를 한 번 세척합니다. 상청액을 흡인하고 각 웰에 효소 세포 해리 시약 1mL를 첨가합니다. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  5. 피펫으로 생물 안전 캐비닛의 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 분쇄합니다. LIF-5i 배지(웰당 1mL)로 중화합니다. 세포 현탁액을 멸균 15mL 원추형 튜브에 수집합니다.  200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 생물 안전 캐비닛에서 상청액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 2mL의 LIF-5i 배지에 재현탁합니다.
    참고: 가능하면 세포 계수를 위해 분취량을 취하십시오. 억제제나 성장 인자를 보충하지 않고도 LIF-5i/LIF-3i 배지로 효소 활성을 중화할 수 있습니다.
  7. MEF 플레이트를 PBS(6웰 플레이트에서 웰당 2mL)로 두 번 세척하고 세포(LIF-5i 적응 세포 1웰에 해당하는 1웰을 2mL LIF-5i 배지의 MEF 피더 웰에 추가함).
    참고: 각 개별 XF-hiPSC 라인에 대한 초기 도금 밀도의 최적화는 선택 사항입니다. 이전 단계에서 세포를 계수한 경우 웰당 최소 1x106 개의 세포를 피더에 도금합니다.  플레이트를 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)로 옮깁니다.
  8. CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 습한 분위기)에서 MEF의 LIF-5i에서 3-5일 동안 XF-hiPSC를 배양하고 유지합니다. LIF-5i 배지를 매일 교체하십시오.
  9. 돔 모양의 TIRN-SC 콜로니가 형성되면(피더에서 3-5일 배양 후) 생물 안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인합니다. 각 웰을 2mL의 PBS로 세척합니다.
  10. PBS를 흡인합니다. 각 웰에 1mL의 세포 분리 용액(예: Accutase)을 추가합니다. CO2 인큐베이터(5% CO2, 습한 분위기)에서 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  11. 해리 시약을 중화하기 위해 생물안전 캐비닛의 각 웰에 1mL의 LIF-3i 배지(표 1)를 첨가합니다. 세포를 부드럽게 분쇄하고 15mL 원뿔형 튜브에 모으십시오. 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  12. 생물 안전 캐비닛에서 상청액을 흡인합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 LIF-3i 배지(웰당 1mL)에 재현탁합니다. 웰당 2mL LIF-3i 배지에 ~5 x 105 개의 세포를 생물안전 캐비닛의 젤라틴화된 6웰 플레이트에 조사된 MEF에 플레이트합니다.
    알림: 모든 후속 구절에 대해 7.12 5o 7.16단계를 반복합니다.  초기 LIF-5i 적응 배양 후, LIF-3i 배양을 더 낮은 밀도(2x105 세포/웰)로 플레이트하고 3-4일마다 계대합니다.
  13. 기능 연구 또는 냉동 보존에 사용하기 전에 LIF-3i 배지에서 최소 6-7회 연속 계대에 대한 계대 TIRN 되돌린 XF-hiPSC. 이종 없는 프라이밍 배양 배지(예: E8) 또는 LIF-5i/LIF-3i TIRN 배지에서 계대 수를 기록합니다.
    참고: 높은 계대(예: >p40) XF-hiPSC 라인의 TIRN 복귀는 비효율적이며 권장되지 않습니다. 높은 계통과율 라인에는 효율적인 TIRN 복귀와 호환되지 않는 염색체 또는 염색체 이하 결함이 있는 경우가 많으며 복귀 효율이 낮고 배양 안정성이 제한됩니다. 또한 LIF-3i 배지에서 15회 이상의 계대를 거친 TIRN 배양액의 사용은 기능 연구에 권장되지 않습니다. XF-hiPSC의 TIRN 복귀의 기능적 영향은 LIF-3i 배지에서 7-15개 계대 사이에서 가장 두드러집니다.

8. XF/FF hiPSC 유래 TIRN-SC의 지시성 분화를 위한 실험 설계 지침.

  1. XF/FF hiPSC 유래 TIRN-SC를 "재프라이밍" 단계 없이 확립된 지향성 분화 프로토콜에 직접 활용합니다(즉, 지향성 분화 분석에 사용하기 전에 TIRN 줄기 세포를 기존의 "프라이밍" 조건으로 다시 전환할 필요가 없음).
  2. XF-hiPSC에 대한 TIRN 영향의 기능적 평가를 위해 동등한 계대 수에서 병렬로 형제 동종 배양을 설정합니다. 프라이밍/TIRN 형제 동유전자 XF-hiPSC 배양을 각각의 배지에서 병렬로 유지합니다(예: 비트로넥틴의 E8 대 MEF에 대한 LIF-3i)를 수행하고 동시에 기형종 분석을 수행하거나(그림 5) 동일한 배아체 또는 지시된 분화 프로토콜 및 재료를 사용하여 감별합니다(그림 6).
  3. 가능한 경우 말단 분화 계통의 기능적 평가를 수행합니다. 예를 들어, 혈관 전구세포는 단백질 발현, DiI 접합 아세틸화 저밀도 지단백(LDL) 흡수 분석 및 마트리겔 튜브 분석으로 평가할 수 있습니다(그림 7).
    참고: CB-hiPSC- 및 TIRN-SC 유래 VP에 대한 추가 기능 분석(즉, DiI-Ac-LDL 흡수/노화/증식/이동 분석, 시험관 내 마트리겔 튜브 분석, 동물 마트리겔 플러그 분석, 이종 이식 분석)은 다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다 3,4.
  4. 각 감화 분석에서 각 개별 XF-hiPSC 클론에 대한 초기 도금 밀도 및 동역학(그림 6)을 조정하고 최적화합니다.
    참고: TIRN 되돌린 XF-hiPSC는 프라이밍된 XF-hiPSC보다 지시 분화 분석에서 더 강력한 증식 및 분화 능력을 가지고 있습니다. TIRN 배양은 일반적으로 E8 배양보다 낮은 초기 도금 밀도를 필요로 하며 클론 생존을 향상시키기 위해 항세포사멸 보충제를 사용할 필요가 없습니다.

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결과

이 프로토콜은 에피솜 벡터 및 간질 신호를 사용하여 충실도가 높은 프라이밍된 만능 상태로 효율적인 골수 전구 재프로그래밍을 위해 발표된 방법을 최적화합니다7. 프로토콜(그림 1)은 인간 CB CD34+ 전구세포를 XF-hiPSC로 XF/FF 간질 프라이밍 에피솜 재프로그래밍하기 위해 정의된 방법을 간략하게 설명하고, 지시된 혈액-혈관 사양 을 통해 기능을 검증하는 방법을 지시한 후 LIF-3i/MEF 조건에서 할구 유사 TIRN 줄기 세포로 TIRN 복귀.

이 최적화된 프로토콜을 사용하여 hiPSC 콜로니는 높은(>7%) 빈도로 2-3주 안에 나타났습니다(그림 2A,B). 다른 통합 없는 재프로그래밍 방법6(예: 센다이...

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토론

잠비디스 그룹은 원래 정제된 에피좀 발현 세포에서 최대 50%에 달하는 벌크 효율을 가진 계통에 전념하는 CB 골수 전구세포를 CB-hiPSC로 재프로그래밍하기 위한 고도로 최적화된 4인자 에피솜 방법을 보고했습니다7. 여기에서 우리는 XF/FF 간질 프라이밍 조건에서 원래 인간 CB 전구 에피솜 재프로그래밍 프로토콜의 수정된 버전을 제시했습니다. 이 방법은 가용성 및 접촉 의존성 중간엽 간질 세포 신호에 노출된 후 빠르고 거의 완전한 비통합 재프로그래밍을 달성하기 위해 계통 헌신된 CD33+CD45+CD34− 골수 세포의 증강된 재프로그래밍 능력을 사용했습니다.

재생 접근법을 위한 기존의 hiPSC 라인의 사용은 매우 가변적인 분화 효율과 다운스트림 전구세포의 열악한 생체 내 기능으로 인해 방해를 받습...

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공개 사항

선언할 공개가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NIH/NEI(R01EY032113; ETZ), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금(2023-MSCRFV-5995, 2024-MSCRFV-6248, 2025-MSCRFV-0005, 2025-R2-MSCRFV-0004(ETZ) 및 Lisa Dean Moseley 재단(ETZ).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amaxa Biosystems Nucleofector II론자AAB-1001 시리즈
항-CD143(BB9) 항체, APC 접합 BD 바이오사이언스55792910-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-CD144 항체, PE 접합 BD 바이오사이언스56041010-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-CD146 항체, PE 접합 BD 바이오사이언스55031510-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-CD184/CXCR4 항체, APC 접합 BD 바이오사이언스55597610-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-CD31 항체BD 바이오사이언스550389면역형광 분석을 위해 차단 용액에 1:100으로 희석
항-CD31 항체, APC 접합 e바이오사이언스17-0319-422 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-CD34 항체, APC 접합 BD 바이오사이언스5558245 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-CD45 항체, PE 접합 BD 바이오사이언스55548310-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-NANOG 항체, PE 접합BD 바이오사이언스56048310-20 & 마이크로를 사용하십시오. 분석당 L(FACS)
항-OCT4 항체, PE 접합R& D 시스템IC1759P10 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-SOX17 항체, Alexa488 접합 BD 바이오사이언스5622055 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-SOX2 항체, PE 접합R& D 시스템IC2018P10 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-SSEA-4 항체, APC 접합 R& D 시스템FAB1435A5 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-SSEA-4 GloLIVE 항체, NL493 접합R& D 시스템NLLC1435G1:50 희석으로 사용(살아있는 면역염색 및 고정 면역염색)
안티 TRA-1-60 A488 접합체 키트써모피셔 사이언티픽A25618
항-TRA1-60 항체, PE 접합BD 바이오사이언스56019310 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-TRA-1-60 GloLIVE 항체, NL557 접합 R& D 시스템NLLC4770RAT&NBSP를 사용합니다. 1:50 희석액(생면역염색 및 고정면역염색)
항-TRA-1-60 StainAlive 항체, DyLight 488 접합스템젠트09-00681:100 희석액으로 사용(살아있는 면역염색 및 고정 면역염색)
항-TRA1-81 항체, PE 접합BD 바이오사이언스56016110 & 마이크로 사용; 분석당 L(FACS)
항-TRA-1-81 StainAlive 항체, DyLight 488 접합스템젠트09-00691:100 희석액으로 사용(살아있는 면역염색 및 고정 면역염색)
CD31 MicroBead 키트, 인간밀테니 바이오텍130-091-935
CD34 MicroBead 키트, 인간밀테니 바이오텍130-046-702
CD34+ 혼합 기증자,  제대혈, 100만 세포모든 셀CB, CR, CD34+, 혼합, PS, CS10, 1M세포의 대체 공급원에는 태아 간, 성인 골수 및 동원된 말초 혈액이 포함됩니다.
CF1 마우스찰스 강023
CHIR99021R& D 시스템L5283DMSO에서 100 mM에서 재구성
Corning Costar 조직 배양 처리 6웰 플레이트코 닝3506
Corning Synthemax II-SC 기판, 10 mg 바이알코 닝35355 & mu에서 사용; 코닝 3978의 대체품으로 g/cm2
Corning Synthemax-R 6웰 플레이트코 닝3978단종 및 3535로 교체
Costar 6웰 클리어 플랫 바닥 초저 어태치먼트 6웰 플레이트코 닝3471
백작부인  세포 계수 챔버 슬라이드써모 피셔 사이언티픽C10228
Countess 자동 세포 계수기써모 피셔 사이언티픽AMQAX1000
크라이오스토어 CS10줄기세포 기술100-1061
DII-Ac-LDL써모 피셔 사이언티픽L34845-15 및 마이크로에서 사용; 그램/밀리리터
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 써모 피셔 사이언티픽11995065
DMEM/F-12, 글루타맥스 보충제써모 피셔 사이언티픽10565018
DMEM/F-12, 헤페스써모 피셔 사이언티픽11330032
DMSO(디메틸설폭사이드)시그마 알드리치D2650
DR4 마우스잭슨 연구소3208
에센셜 8(E8) 미디엄줄기세포 기술5940
태아 소 혈청(FBS)써모 피셔 사이언티픽SH30071.03
수정 및 PERM 세포 투과화 키트써모 피셔 사이언티픽가스004
포스콜린스템젠트04-0025DMSO에서 100 mM에서 재구성
젤라틴(돼지)시그마 알드리치G1890-100G물에 재현탁하고 오토클레이브로 멸균합니다.
인간 CD34+ 세포 핵펙터  키트론자VPA-1003
아이소타입 마우스 IgG1 PE 접합BD 바이오사이언스554680
동형마우스 IgG2a PE 접합BD 바이오사이언스558595
아이소타입 쥐 IgG2b PE 접합R& D 시스템IC013P
녹아웃 세럼 교체써모 피셔 사이언티픽10828-028
L-아스코르브산밀리포어 시그마A8960
L-글루타민(100X)써모 피셔 사이언티픽25030-081
LS 열밀테니 바이오텍130-042-401
마트리겔코 닝356237200 & 마이크로를 사용합니다. 48웰 플레이트의 L/웰
MEM 비필수 아미노산(MEM NEAA) (100X)써모 피셔 사이언티픽11140-050
메토컬트 SF H4436줄기세포 기술04436
MidiMACS 구분 기호밀테니 바이오텍130-042-302
mTeSR1 배지줄기세포 기술85850
Nalgene 극저온 바이알써모 피셔 사이언티픽5000-0020
파라포름알데히드 용액, PBS 4%써모 피셔 사이언티픽J19943. 케이2PBS를 사용하여 필요한 농도로 희석
PD0325901시그마 알드리치PZ0162DMSO에서 100 mM에서 재구성
페니실린/스트렙토마이신 (10,000 U/mL)써모 피셔 사이언티픽15140-122
pEP4 E02S EM2K 에피좀아드진20923플라스미드는 TOP10 E.  대장균(Invitrogen) 및 QIAGEN 플라스미드 Maxi 키트로 정제. 
인산염 완충 식염수(PBS)생물 산업02-023-1A
Poietics 인간 중간엽 줄기 세포 론자PT-2501 시리즈2번 통대에서 750,000개의 세포는 사용 전 1-2회 통대에 대한 제조업체의 지침에 따라 해동 및 확장될 수 있습니다.
푸르모르파민스템젠트04-0009DMSO에서 10 mM에서 재구성
재조합 액티빈 A페프로텍120-14EAT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
재조합 인간 FGF2페프로텍100-18BAT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
재조합 인간 FGF-basic(bFGF)페프로텍100-18B100 & micro에서 재조정; PBS의 0.1% 소 혈청/인간 알부민에서 g/mL
재조합 인간 FLT3 리간드R& D 시스템308-FKHB 또는  308E-GMPAT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
재조합 인간 인슐린바이오젬10-365
재조합 인간 키트 리간드R& D 시스템BT-SCF 또는 BT-SCF-GMPAT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
재조합 인간 LIF페프로텍300-05100 & micro에서 재조정; PBS의 0.1% 소/인간 혈청 알부민 중 g/mL
재조합 인간 TGF&베타; 1페프로텍  100-21100 & micro에서 재조정; PBS의 0.1% 소/인간 혈청 알부민 중 g/mL
재조합 인간 트롬보포이에틴&NBSP;R& D 시스템288-TPN 또는 288E-GMPAT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
재조합 인간 트랜스페린밀리포어 시그마T3705
인간 BMP4페프로텍120-05AT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
SB431543셀렉켐에스1067DMSO에서 10 mM에서 재구성
SIGMAFAST, 알칼리성 포스파타제 기질, 발색, 정제밀리포어 시그마B5655정제수 10mL에 1정을 녹입니다
아셀렌산나트륨밀리포어 시그마S5261
용액 내 Stemolecule Y27632스템젠트04-0012-02용액 내 ROCK 억제제(10mM)
StemPro Accutase 세포 해리 시약써모 피셔 사이언티픽A11105-01
스템프로 MSC SFM 제노프리(XF-MSC)써모 피셔 사이언티픽A10675015mL StemPro MSC SFM XenoFree Supplement와 500mL StemPro MSC SFM 기초 배지를 혼합하여 XF-MSC 배지를 준비합니다. 분취된 배지는 -20°C에서 냉동 보존할 수 있습니다.
스템스팬 SFEM줄기세포 기술9600
Thermo Scientific Mr. Frosty 냉동 용기써모 피셔 사이언티픽5100-0001
Ulex Europaeus 응집 I (UEA-1), 바이오 티닐화벡터 연구소B-1065-2형광 분석을 위해 차단 용액에 1:200으로 희석
베지프페프로텍100-20AT&NBSP 재중단; (100 & 마이크로; g/mL) 멸균 PBS, 0.1% 인간 또는 소 혈청 알부민
Versene 솔루션써모 피셔 사이언티픽15040066
비트로넥틴 XF 매트릭스줄기세포 기술718040 & micro로 희석; CellAdhere 희석 완충액의 L/mL
XAV939 시리즈시그마 알드리치엑스3004DMSO에서 100 mM에서 재구성
&베타;-메르캅토에탄올써모 피셔 사이언티픽21985-023빛에 민감한

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