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방법 논문

결막하 주사를 통한 표적 각막 감각 신경 고갈: 박테리아 부착 및 신경면역 상호작용을 조사하기 위한 모델

446 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68614

⸱

2025년 8월 29일

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

이 논문에서

요약

본 연구는 부피바카인을 이용한 각막 감각신경 고갈에 대한 정제된 모델을 구축하여 부피바카인이 각막 신경 및 세균 유착에 미치는 영향을 밝혔습니다. 이 모델은 신경병증 상태를 시뮬레이션하여 안구 감염의 신경면역 상호작용에 대한 통찰력을 제공하고 약물 전달, 신경 보호, 면역 조절 및 유전자 변형 연구에 응용을 제공합니다.

초록

각막 감각 신경은 안구 표면 무결성과 면역 방어 메커니즘을 지원하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이 신경 분포의 상실은 미생물 침입에 대한 취약성 증가와 관련이 있지만 각막의 박테리아 부착에 대한 신경 고갈의 정확한 기여는 여전히 충분히 특성화되지 않았습니다. 여기에서는 지속형 나트륨 채널 차단제인 부피바카인을 사용하여 선택적 각막 감각 신경 억제를 위한 재현 가능하고 시간적으로 제어된 방법을 제시합니다. 결막하 전달 경로와 국소 전달 경로를 결합함으로써 이 이중 적용 전략은 강력하고 지속적인 신경차단을 달성하여 변경된 감각 입력이 박테리아 집락화에 대한 각막 상피 감수성에 어떤 영향을 미치는지 정확하게 조사할 수 있습니다.

이 모델을 사용하여 감각 신경 제거가 뚜렷한 접착 메커니즘을 가진 세 가지 임상적으로 관련된 병원체인 황색포도상구균, 표 피포도상구균 및 녹농 균에 대한 미생물 접착 역학에 어떤 영향을 미치는지 조사합니다. 실험실 물티슈 블로팅 방법을 통한 표준화된 박테리아 접종은 각막 표면에 균일한 침착을 보장한 후 박테리아 부착의 정량적 평가를 보장합니다. 부피바카인 유발 신경 고갈은 각막 신경 밀도 감소 및 박테리아 접착 증가와 상관관계가 있어 감각 고갈과 미생물 감수성 사이의 기능적 연관성을 확인합니다.

당뇨병성 신경병증 및 신경영양성 각막염과 같은 신경병증 상태를 시뮬레이션함으로써 이 접근법은 안구 감염에서 신경면역 상호 작용을 연구하기 위한 새로운 프레임워크를 제공합니다. 감염 모델 외에도 이 결막하 주사 전략은 안구 약물 약동학, 신경 보호 개입 및 면역 조절을 조사하기 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 또한, CRISPR/Cas 구조물 또는 바이러스 벡터의 결막하 전달을 포함한 유전자 변형 연구에 적용될 수 있어 안과 연구 및 치료학에서의 적용 범위가 넓어집니다.

서론

각막 감각 신경 분포는 안구 표면 무결성과 면역 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 각막은 신체에서 가장 조밀하게 신경분포된 조직 중 하나이며 주로 삼차신경의 안과 분열에 의해 공급됩니다1. 이러한 감각 신경은 통각 및 깜박임 반사를 매개할 뿐만 아니라 상피 증식, 상처 치유 및 면역 감시를 조절합니다 2,3. 따라서 감각 분포의 중단은 각막 장벽을 손상시켜 안구 표면 미세 환경을 변화시키고 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킬 수 있습니다.

각막 감각 기능 장애는 당뇨병과 같은 전신 질환과 관련이 있으며 안구건조증, 당뇨병성 각막병증, 신경영양성 각막염 및 수술 후 합병증을 포함한 안구 병리에 기여합니다 3,4,5,6,7,8,9,10 . 감각 신경 손상은 눈물 생성 감소, 상피 얇아짐 및 상처 치유 지연으로 이어지며, 이 모든 것이 박테리아 집락화를 촉진합니다11,12. 그러나 감각 신경 고갈과 박테리아 부착 사이의 정확한 기계론적 연관성은 여전히 충분히 이해되지 않았습니다. 연구에 따르면 각막 탈신경 후 박테리아 부착이 증가하는 것으로 나타났지만 이 관계에 대한 통제된 조사를 가능하게 하는 표준화된 모델이 부족합니다.

이러한 격차를 해소하기 위해 우리는 영구적인 신경 손상을 일으키지 않고 임상 신경병증을 모방하는 지속형 나트륨 채널 차단제인 부피바카인을 사용하여 각막 감각 신경 고갈의 표적 모델을 개발했습니다 13,14,15. 이 약리학적 접근법은 각막 신경 고갈과 안구 표면에 미치는 영향을 연구하기 위한 통제되고 재현 가능한 방법을 제공합니다15. 이 모델을 박테리아 접착 분석과 통합함으로써 우리는 당뇨병성 각막병증 및 신경영양성 각막염의 주요 측면을 모방하여 미생물 집락화에 대한 감각 신경 고갈의 영향을 체계적으로 평가할 수 있습니다.

미생물 부착은 눈물막 구성, 상피 표면 특성 및 숙주 면역 반응의 영향을 받는 각막 감염의 중요한 초기 사건입니다. 안구 표면에 식민지를 형성할 수 있는 다양한 병원체 중에서 S. aureus, S. epidermidis 및 P. aeruginosa는 뚜렷한 접착 메커니즘을 가진 임상적으로 중요한 세 가지 박테리아를 나타냅니다. 독성이 강한 그람 음성 박테리아인 녹농균은 필리, 편모 및 분비된 독성 인자를 활용하여 각막 상피 세포에 빠르게 부착하고 침범하여 종종 심각한 궤양성 각막염을 유발합니다16,17. 대조적으로, 그람 양성 공생 박테리아인 S. epidermidis는 주로 파괴된 상피 표면과 눈물막 변화를 이용하여 생물막을 형성하여 지속적이고 종종 무증상 감염에 기여합니다18,19. 이들 종 간의 접착 전략의 차이는 각막 신경 고갈이 박테리아 집락화를 촉진하기 위해 안구 미세 환경을 어떻게 변화시키는지 이해해야 할 필요성을 강조합니다.

박테리아 접착을 연구하는 주요 과제는 적절한 접종 모델을 선택하는 것입니다. 감염 연구에 자주 사용되는 기존의 스크래치 손상 모델은 박테리아 부착을 촉진하기 위해 상피 결함을 생성합니다. 외상으로 인한 감염을 시뮬레이션하는 데 효과적이기는 하지만, 이 접근법은 과도한 조직 손상 및 과장된 염증 반응을 포함하여 신경병성 각막에서 박테리아 집락화의 초기 단계를 정확하게 나타내지 않는 중요한 교란 변수를 도입합니다. 또한 기계적 손상의 가변성으로 인해 재현 가능한 결과를 얻기가 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해서는 보다 통제되고 생리학적으로 관련성이 높은 박테리아 접종 방법이 필요합니다.

실험실 물티슈 블로팅 기술은 박테리아 침착에 대한 표준화된 접근 방식을 제공하여 상피 장벽을 방해하지 않고 균일한 박테리아 부착을 보장합니다20. 이 방법은 명백한 기계적 외상이 없지만 눈물 구성과 상피 항상성이 변경된 조건에서 박테리아 부착이 발생하는 실제 감수성 시나리오를 밀접하게 모방합니다. 기계적 손상과 관련된 가변성을 제거함으로써 실험실 물티슈 블로팅 방법은 신경병성 각막의 미생물 접착 역학을 보다 정확하게 평가합니다. 또한, 박테리아 집락화에 대한 눈물막 기여도를 제어하여 평가할 수 있으며, 이는 눈물 분비가 손상되는 각막 감각 기능 장애의 경우에 특히 관련이 있습니다.

눈물 생성과 상피 항상성을 조절하는 각막 감각 신경의 중요한 역할을 감안할 때, 미생물 부착에 대한 감각 신경 고갈의 결과를 연구하기 위한 재현 가능한 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 본 연구는 지속형 국소마취제인 부피바카인을 이용한 표적 각막 감각신경 고갈 프로토콜을 개선하여 눈물 분비 및 박테리아 유착에 미치는 영향을 평가하는 것을 목표로 한다. 결막하 및 국소 부피바카인 적용의 조합을 사용함으로써 이 접근법은 최고 효능의 정의된 시점에서 국소적이고 지속적인 감각 고갈을 보장합니다. 이 모델을 사용하여 감각 탈신경이 S. aureus, S. epidermidis 및 P. aeruginosa 의 접착 역학을 어떻게 변화시키는지 조사하여 신경 고갈, 눈물막 변화 및 미생물 감수성 사이의 관계에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이러한 발견은 당뇨병성 각막병증 및 신경영양성 각막염과 같은 신경병성 상태에서 감염 감수성을 이해하는 데 더 광범위한 의미를 갖고 안구 신경면역 상호 작용 및 치료 개입에 대한 향후 연구의 기초를 제공합니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 시력 및 안과 연구 협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 제정한 표준에 따라 수행되었으며 뉴잉글랜드 검안 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 실험 동물의 인도적인 관리 및 사용에 대한 PHS 정책을 준수했습니다. 6주에서 8주 사이의 수컷 및 암컷 C57BL/6J(야생형; 균주 번호 000664) 마우스를 Jackson Laboratory에서 얻었고 마우스를 정상적인 일주기 리듬(12시간의 빛/암주기)으로 사육하고 음식과 물을 제공했습니다. 모든 절차에서 멸균 기술을 유지하십시오.

1. 결막하 주사를 위한 동물 준비

  1. 보정된 기화기를 통해 산소에 2-3% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다. 부드러운 발가락 꼬집기에 대한 반사 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
  2. 심각한 불편함이나 고통의 징후가 있는지 동물을 지속적으로 관찰하십시오.
  3. 고통이 관찰되면 5% 이소플루란으로 깊은 마취를 유도하고 무반응을 확인합니다.
  4. 안락사를 보장하기 위해 자궁경부 탈구를 수행합니다.
  5. 그렇지 않으면 다운스트림 분석을 위해 곡선 적출 겸자를 사용하여 즉시 적출을 수행합니다.

2. 결막하 주사를 이용한 각막 신경 차단

참고: 표적 각막 감각 신경 고갈을 달성하기 위해 결막하 주사 및 부피바카인의 국소 적용을 포함하는 2단계 프로토콜을 구현합니다. 전신 마취제 노출을 최소화하기 위해 15분 이내에 결막하 주사 및 국소 도포를 완료합니다.

  1. 부위 준비 및 절개
    1. 30G 바늘을 사용하여 측두엽 윤부 부위에 작은(~0.5mm) 절개를 만듭니다. 혈관을 피하고 조직 외상을 최소화하십시오. 절개를 사용하여 제어된 약물 전달을 위해 결막하 공간에 접근합니다.
  2. 부피바카인 주사
    1. 멸균 조건에서 0.5% 부피바카인 염산염 용액을 준비합니다.
    2. 5μL의 용액을 33G 소형 허브 무딘 바늘(포인트 스타일 3)이 장착된 Hamilton 10μL 주사기에 넣습니다.
    3. 역류를 최소화하고 균일한 분포를 보장하기 위해 결막하 공간에 15-20° 각도로 용액을 주입합니다.
    4. 주사 부위에서 수포 형성을 관찰하십시오. 5-10초 동안 지속되고 완전히 흡수될 때까지 결막하 주머니 내에 분산되도록 합니다.
  3. 각막 탈감작의 국소 강화
    1. 결막하 주사 직후 중앙 각막에 직접 0.5% 부피바카인 5μL를 추가합니다.
      참고: 이 단계를 사용하여 표면 신경 탈감작을 강화하고 국소 마취 효과를 연장합니다.
  4. 대조군
    1. 대조군 동물의 경우 동일한 시점에서 결막하 주사 및 국소 도포를 통해 5μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 투여합니다. 주입 관련 효과를 설명하기 위해 절차 단계와 볼륨을 일치시킵니다.
  5. 치료 기간 및 종점 분석
    1. 부피바카인 치료를 15일 동안 격일로 투여하여 독성을 최소화하면서 지속적인 감각 신경 고갈을 달성합니다.
    2. 15일째에, 보정된 기화기를 통해 산소 중 5% 이소플루란을 사용하여 최종 부피바카인 치료 후 4시간 후에 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 시킨다.
    3. 면역조직화학을 사용하여 신경 밀도 변화를 평가하기 위해 마우스의 한 그룹(단계 5.5 참조)과 박테리아 접착 분석을 위해 다른 그룹(프로토콜의 그림 1 및 섹션 5 참조)에서 각막을 즉시 수집합니다.

3. 세균 접종을 위한 동물 준비

  1. 복강내 케타민(80-100 mg/kg) 및 덱스메데토미딘(0.25-0.5 mg/kg)을 투여하여 최종 부피바카인 주사 후 4시간 후에 마우스를 마취하고 15일째에 국소 도포합니다.
  2. 발가락 꼬집기에 대한 반사적 반응이 없는지 확인하여 깊은 마취를 확인합니다.
  3. 5μL의 멸균 PBS가 포함된 피펫을 사용하여 안구 표면을 3회 헹구어 잔류 눈물액과 파편을 제거하여 박테리아 접착 연구를 위한 깨끗한 각막 표면을 보장합니다( 그림 1 참조)
  4. 지정된 실험군에서는 보푸라기가 없는 실험실 티슈를 사용하여 표준화된 방식으로 각막 표면을 닦아냅니다.
    1. 티슈 페이퍼를 접어 안전하게 잡습니다.
    2. 마취된 마우스의 각막을 중앙 각막에서 시작하여 주변 영역을 포함하도록 좌우로 회전 운동을 사용하여 4회 부드럽게 닦습니다20.
      알림: 기계적 부상을 방지하기 위해 최소한의 압력을 가하는 동시에 박테리아 부착을 촉진하기 위해 눈물액을 효과적으로 제거하십시오.

4. 세균 접종물 준비 및 각막 접종

  1. 박테리아 배양 및 준비
    1. 트립스성 대두 한천(TSA)에서 S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 및 P. aeruginosa O1을 배양하고 습도를 유지하기 위해 인큐베이터에 놓인 멸균수와 함께 37°C에서 배양합니다.
    2. 개별 콜로니를 수확하고 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁합니다. 현탁액을 5,000 × g 에서 5분 동안 한 번 원심분리하여 죽은 세포와 대사 부산물을 제거합니다.
    3. 박테리아 펠릿을 PBS에 재현탁하고 농도를 ~10¹¹ CFU/mL로 조정하여 접착 연구를 위한 높은 박테리아 부하를 보장합니다.
  2. 각막 접종 프로토콜
    1. 준비된 박테리아 현탁액의 5μL 분취량을 지속적인 마취 하에 4시간 동안 1시간에 한 번씩 각막 표면에 도포합니다.
    2. 유출을 방지하고 접종물에 일관되게 노출되도록 마우스를 약간 기울여 놓습니다.
    3. 임상 감염 시나리오와 관련된 지속적인 박테리아 노출을 모방하기 위해 시간 간격으로 접종을 반복합니다.
  3. 접종 후 안락사 및 세균 접착 평가
    1. 4시간 후 케타민(80-100mg/kg)과 자일라진(5-10mg/kg)을 복강내 주사하여 깊은 마취를 보장합니다.
    2. 생쥐를 인도적으로 안락사시키기 위해 자궁경부 탈구를 시행합니다.
    3. 오염을 방지하기 위해 엄격한 무균 조건을 유지하면서 멸균된 곡선 끝 겸자를 사용하여 눈을 적출합니다.
    4. 페트리 접시에 멸균 PBS 2mL로 안구 표면을 5-6회 헹구어 부드럽게 흔들어 비부착 박테리아를 완전히 제거합니다.
    5. 기계적 조직 균질화기를 사용하여 멸균 PBS 1mL에서 적출된 눈을 균질화하여 일관된 박테리아 회수를 보장하고 오염을 방지하기 위해 무균 상태를 유지합니다.
    6. 멸균 PBS에서 균질액을 연속적으로 6배 희석합니다.
    7. TSA 플레이트에 각 희석액의 분취량을 플레이트하고 콜로니 성장을 허용하기 위해 37°C에서 밤새 배양합니다.
    8. 정량적 비교를 위해 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하고 결과를 각막당 log CFU로 표현합니다.

5. 면역조직화학

  1. 치료 후 15일째에 자궁경부 탈구를 통해 마우스를 안락사시킵니다.
  2. 조심스럽게 눈을 적출하고 실온에서 부드럽게 회전하면서 PBS로 한 번 헹굽니다.
  3. 구조적 무결성을 보존하기 위해 적출된 눈을 2% 파라포름알데히드(PFA)에 1시간 동안 고정합니다.
  4. 고정된 눈을 실온에서 부드럽게 회전시키면서 1mL의 PBS에 3 x 10분 세척합니다.
  5. 이전에 설명한 각막 절제 프로토콜21,22를 따르십시오.
    1. 최소한의 PBS로 채워진 35mm 너비의 페트리 접시 내에서 각막을 해부합니다.
    2. 직선 겸자를 사용하여 적출된 눈을 안정시키고 수술용 가위를 사용하여 지구의 뒤쪽에 작은 절개를 만듭니다.
    3. 작은 절개 지점을 사용하여 후방 360°를 따라 조심스럽게 자릅니다.
    4. 쥐 망막, 시신경, 수정체, 홍채 색소 및 각막이 아닌 추가 조직 구조를 폐기합니다.
    5. 직선 겸자를 사용하거나 각막을 손상 없이 유지하면서 수술용 가위로 조심스럽게 절개하여 여분의 조직을 제거합니다.
    6. 실온에서 부드럽게 회전하면서 미세 원심분리 튜브에 넣은 1mL의 PBS에서 해부된 각막을 3 x 10분 세척합니다.
  6. 각막을 1mL의 차단 용액(PBS의 3% BSA + Triton X-100)에서 실온에서 연속 회전으로 1시간 동안 배양합니다.
  7. 동일한 조건에서 1mL의 20% EDTA에 각막을 추가로 배양하여 조직 투과성을 향상시킵니다.
  8. 각막을 4°C에서 하룻밤 동안 토끼 항-β-튜불린 III 1차 항체와 함께 실온에서 부드럽게 회전시켜 배양합니다.
  9. 다음날, 조직을 Alexa Fluor 488 접합 염소 항-토끼 IgG 2차 항체 및 DAPI와 함께 배양하여 어두운 곳에서 4°C에서 2-3시간 동안 핵 염색을 수행합니다.
  10. 부드럽게 회전하면서 PBS로 각막을 3 x 10분 세척합니다.
  11. 앞서 설명한 각막 평면 장착 프로토콜을 따르십시오21,22
    1. 과도한 체액을 제거하기 위해 슬라이드 가장자리에 각막을 놓아 얼룩진 각막을 유리 슬라이드에 평평하게 장착합니다.
    2. 상피면이 아래를 향하도록 현미경 슬라이드 중앙에 각막을 슬라이드 표면과 접촉시켜 각막을 재배치합니다.
    3. 수술용 깃털 칼날을 사용하여 주변 가장자리에서 중앙을 향해 4개의 직선 절개(길이 1-2mm)를 만들어 반사분면을 만듭니다.
    4. 20μL의 마운트제를 바르고 각막 위에 8mm 유리 커버슬립을 놓습니다.
    5. 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거하고 각막에 주름이 생기는 것을 방지합니다.
    6. 건조를 위해 샘플을 어두운 곳에 실온에 보관하십시오.
    7. 공기 건조를 방지하기 위해 투명한 손톱 보호대로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하고 이미징 준비가 될 때까지 슬라이드를 어둠 속에 보관하십시오.

6. 이미징

  1. 20x/1.00 NA 수침 대물렌즈가 있는 정립 2광자 공초점 현미경을 사용하여 공초점 현미경을 수행합니다.
  2. 평면 장착 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 20x/1.00 NA 수침 대물 렌즈를 설정합니다.
  3. 실내 조명을 어둡게 하고 현미경을 불투명한 검은색 천으로 덮어 이미징 중 외부 빛 간섭을 최소화합니다.
  4. Alexa Fluor 488 nm 레이저 채널을 사용하여 각막 신경을 시각화하고 DAPI 405 nm 레이저 채널을 사용하여 세포핵을 검출합니다.
  5. 프레임 크기를 1,536 x 1,536으로, 핀홀을 1 Airy unit(AU)으로, 스캔 속도를 1.02μs로 설정합니다. 양방향 스캔을 활성화하고 2x 평균을 적용합니다.
  6. 마스터 게인(~750V)을 조정하고 레이저 출력 강도를 최소화하여 광표백 및 광독성을 방지하는 동시에 선명한 이미지 캡처를 보장합니다.
  7. Z-스택 이미징을 수행하여 전체 각막 두께를 캡처합니다. 첫 번째 초점면을 샘플의 가장 앞쪽 측면에, 마지막 초점면을 가장 뒤쪽 측면에 설정합니다.
  8. 0.8 μm 또는 1.0 μm 스텝 간격으로 Z-스택을 획득하여 샘플당 약 60 - 80개의 총 스택을 캡처합니다.
  9. 각막 신경 밀도 평가
    1. Imaris 소프트웨어를 사용하여 각막 신경 밀도를 분석합니다.
    2. 볼륨 치수를 확인하여 전체 이미지 두께를 확인합니다.
    3. 볼륨 렌더링 옵션을 활성화하여 3D 재구성을 생성합니다.
    4. 최대 강도 투영을 생성하여 시각화 및 정량화를 위해 Z-스택을 2D 뷰로 변환합니다.
    5. 객관적인 평가를 보장하기 위해 맹검 평가자가 각막 신경 밀도를 0-10 척도로 등급화합니다.

7. 통계 분석

  1. Shapiro-Wilk 및 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 데이터 분포를 평가합니다.
  2. 대부분의 데이터가 정규 분포를 따르는 경우 결과를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시합니다.
  3. 두 그룹 간의 비교를 위해 Student의 t-테스트를 적용하고 3개 이상의 그룹을 포함하는 분석에 대해 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용합니다.
  4. 통계적으로 유의한 0.05< p-값을 고려합니다.

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결과

달리 명시되지 않는 한, 모든 실험은 그룹당 3-4마리의 마우스를 포함하는 각 반복으로 삼중으로 독립적으로 수행되었습니다.

부피바카인 치료 후 각막 신경 밀도의 현저한 감소
표적 각막 감각 신경 고갈의 영향을 체계적으로 평가하기 위해 면역 표지 및 공초점 현미경을 사용하여 각막 신경 밀도를 평가했습니다. 마우스는 각막 신경 무결성을 조절하는 다양한 전달 경로의 효능을 비교하기 위해 15일 동안 단독으로 또는 국소 적용과 함께 부피바카인을 격일 격일 주사했습니다. 결막하 주사는 출혈, 누출 또는 역류의 증거 없이 내약성이 양호했습니다. 주사 시 일시적인 수포가 관찰되었으며, 이는 쥐 결막하 구획에 성공적인 약물 투여를 나타냅니다. 수포는 일반적으로 10초에서 15초 이내에 소멸되었으며, 이는 실험 모델에서 일관되게 관찰된 바와 같이 이 공간에 도입된 물질이 전 세계에 확산되고 안구 주위 조직 전체에 분포되었음을 확인합니다.

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토론

각막 감각 신경은 안구 표면 무결성을 유지하고 상피 항상성을 조절하며 면역 반응을 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 신경 변성과 염증을 특징으로 하는 각막 신경염은 만성 고혈당증이 각막 신경 손실을 포함한 말초 신경병증에 기여하는 당뇨병과 같은 전신 질환에서 흔히 관찰됩니다. 연구에 따르면 당뇨병성 신경병증은 각막 민감도 감소, 안구 건조증, 상처 치유 장애 및 지속적인 상피 결함 및 미생물 감염에 대한 감수성을 특징으로 하는 상태인 신경영양성 각막병증 8,9,10,24의 위험 증가로 이어집니다25,26.

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5% 부피바카인 염산염 용액 화이자 INC. 미국NDC 00409-1162-01
바늘 30g제조사: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA305106
33G 소형 허브 무딘 바늘 (포인트 스타일 3) & nbsp;Hamilton Company, 미국 네바다주 리노7803-05
4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 이염산염Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬D1306
소 혈청 알부민Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스A7906
C57BL/6J(야생형) 마우스 잭슨 연구소. 000664
Cantrifuge 로테이터The Lab Depot, Inc.(미국 조지아주 도슨빌)R2020
투명 네일 프로텍터젖고 야생해당 사항 없음
해부 현미경(SMZ-160-TLED 스테레오(해부) 현미경(삼안 포트) 포함)Stellar Scientific(미국 메릴랜드주 볼티모어)1.1002E+12
에틸렌디아민테트라아세트산Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스E6511
염소 항토끼 IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬A-11008
해밀턴 10-μ L 주사기Hamilton Company, 미국 네바다주 리노7635-01
고정밀 해부 마이크로 가위Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬08-953-1B
이소플루란Patterson Veterinary, 미국07-890-8115
이소플루란 기화기Kent Scientific, 미국VETFLO1205S
케타민 염산염Dechra Veterinary Products, 오버랜드 파크, 캔자스, 미국DP00050
Kimwipe 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼Kimberly-Clark Professional, 미국 조지아주 로스웰34155
미세 해부 겸자 곡선 전면(적출용)Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스F4142-1개
미세 해부 겸자 직선 전면Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스F4017
페트리 접시 (100 mm)Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬263991
페트리 접시 (35 mm)VWR International(미국 펜실베이니아주 래드너)을 통한 Avantor.25373-041
인산염 완충 식염수 Thomas Scientific, 미국 뉴저지주 스웨데스버러C987D24
ProLong 골드 퇴색 방지 마운팅Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬P36930
토끼 항-&-튜불린 IIISigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국) T2200
라운드 커버 슬립 독일 유리(8mm)Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬50-949-314
메스 손잡이Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국) S2896-1개
슬라이드, 현미경Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국) S8902-1팍
스냅 캡 저보유 마이크로 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬3453
Sorvall Instruments RT6000B 벤치탑 원심분리기Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬3367898
수술용 깃털 칼날World Precision Instruments (미국 플로리다주 새러소타)504169 
트립스 대두 한천Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국) 22091
자일라진 Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스1236-20-8

참고문헌

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