방법 논문

이중 벡터 형질도입 세포의 정제를 위한 류신 지퍼 기반 세포 분류

DOI:

10.3791/68628

⸱

2025년 10월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 공동 형질도입된 T 세포의 혼합물로부터 이중 형질도입된 T 세포를 선택적으로 정제하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 이중 벡터 형질도입 세포의 선택적 면역자기 정제를 가능하게 하는 쌍을 이루는 류신 지퍼 기반 세포 분류 방법론의 한 구성 요소를 각각 암호화하는 두 개의 레트로바이러스 벡터를 결합합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 포함한 입양 T 세포 치료법은 혈액 악성 종양에 대해 인상적인 임상 활성을 입증했으며 고형 종양 악성 종양 치료에 대한 가능성을 보여주고 있습니다. 이러한 성공에도 불구하고 표적 항원의 손실 또는 약한 발현, T 세포 고갈의 발생, 면역억제 종양 미세 환경의 존재를 포함하여 치료 성공을 제한하는 T 세포 면역 요법에 대한 내성의 여러 메커니즘이 확인되었습니다. 이러한 저항 메커니즘을 극복하기 위해 여러 세포 공학 전략이 개발되었습니다. 그러나 여러 내성 메커니즘이 동시에 발생할 수 있으므로 항종양 활성을 최적화하기 위해 여러 엔지니어링 전략의 조합이 필요합니다. 벡터 패키징 제약은 T 세포에 대한 대량의 유전 정보 전달을 제한하고 여러 조작된 구조를 공동 발현하는 데 어려움을 안겨줍니다. 여기에서는 여러 이식유전자를 암호화하기 위해 두 개의 벡터로 T 세포를 공동 형질도입하여 조작된 기능의 수를 증가시키는 프로토콜을 설명합니다. Zip-sort라고 하는 류신 지퍼 기반 세포 분류 방법론을 공동 발현함으로써 두 개의 서로 다른 벡터를 통합한 이중 형질도입 세포의 선택적 면역자기 정제를 지시합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T 세포 요법은 B 세포 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종 치료에 혁명을 일으켰습니다 1,2. CAR T 세포는 고형 종양 악성 종양에 대해서도 조사되고 있습니다3. 그러나 CAR 표적 항원 분자의 발현 불량 또는 손실, T 세포 기능 장애(탈진)의 발생, 종양 미세 환경에 의한 활성 면역 억제, 종양 미세 환경으로의 제한된 T 세포 수송 및 지속을 포함하여 CAR T 세포 요법의 실패에 대한 재발성 메커니즘이 확인되었습니다 3,4,5,6 . 이러한 CAR T 세포 내성 메커니즘 각각을 극복하기 위해 개별 엔지니어링 솔루션이 고안되었지만3, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 시스템의 제한된 유전적 패키징 용량으로 인해 여러 내성 메커니즘을 동시에 극복하기 위해 세포 치료 제품에 여러 조작된 기능을 도입하는 것은 어려운 일입니다7.

벡터 패키징 용량의 한계를 극복하기 위해 여러 벡터를 사용한 T 세포의 공동 형질도입이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 벡터 공동 형질도입은 전임상 연구 8,9,10 및 벡터 패키징 한계를 극복하기 위해 CD19/CD22 이중 CAR T 세포를 평가하는 최근 임상 시험에서 논리 게이트 및 약물 조절 T 세포 공학 전략을 연구하는 데 사용되었습니다11. 그러나, 공동 형질도입은 단일 및 이중 형질도입된 T 세포의 조합을 포함하는 혼합 세포 산물을 생성하며, 이는 두 벡터에 의해 암호화된 성분에 의존하는 경우 산물의 기능을 손상시킬 수 있으며 또한 단일 형질도입된 T 세포 간의 경쟁을 유도할 수 있다12.

이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 이종이량체화 류신 지퍼(각각 두 개의 공동 형질도입 벡터 중 하나에서 발현됨)를 사용하여 이중 형질도입된 세포의 단일 단계 면역자기 정제를 지시하는 Zip-sort라는 방법론을 개발했습니다13. 이 프로토콜에서 우리는 Zip-sort 방법론, 레트로바이러스 상청액 생산 및 농축, T 세포 활성화 및 공동 형질도입, 이중 형질도입 세포의 면역자기 정제(Zip-sort)를 통합한 레트로바이러스 벡터를 구축하는 방법을 설명합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 연구는 COH 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜 #23145에 따라 City of Hope(COH) Parvin Animal Research Laboratory와 MSKCC 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜 #99-07-025에 따라 Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC) 사육관에서 수행되었습니다. 인간 T 세포는 City of Hope 헌혈 센터에서 얻은 백혈구 감소 필터에서 Ficoll-Paque로 정제되고 City of Hope Institutional Review Board의 승인을 받은 프로토콜 #24427에 따라 사용된 비식별 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리되었습니다. 모든 절차는 제도의 생물안전 표준에 따라 수행되었습니다.

1. Zip 정렬 벡터 디자인

  1. 관심 있는 유전자 변형 세포를 위해 선택한 발현 벡터를 선택합니다.
    참고: 지퍼 정렬 방법론은 분비된 지퍼와 캡처 지퍼로 구성되며, 둘 다 서로 다른 벡터에서 발현되고 세포 내에서 쌍을 이루고 세포 표면으로 이동하여 두 벡터를 통합하는 세포의 선택적 정제를 가능하게 합니다(그림 1A-D)13. 분비된 지퍼는 벡터 1에서 발현되며 친화성 태그를 포함합니다. 캡처 지퍼는 벡터 2에서 발현되며 세포 표면에 분비된 지퍼를 유지합니다. 차단 지퍼 변형은 분비된 지퍼의 비특이적 세포외 지퍼 쌍을 차단하는 공유 결합된 제2 지퍼로 구성됩니다. 차단 지퍼 변형은 길쭉한 세포외 도메인(일반적으로 짧은 힌지 도메인보다 큰 세포외 도메인)을 가진 단백질에 캡처 지퍼를 추가할 때 세포외 페어링을 방지하기 위해 필요합니다.
  2. 보충 표 1 및 보충 파일 1에서 분비 및 포획 지퍼 세트를 선택하여 벡터를 테스트하고 구축합니다.
  3. 표준 분자 생물학 기술(13)을 사용하여 지퍼 서열을 쌍을 이루는 발현 벡터로 복제합니다. 13- 두 벡터 각각은 친화성 태그 분비 지퍼 또는 캡처 지퍼를 암호화합니다(그림 1D).
    1. 지퍼 구조 서열에 대해서는 보충 표 1 및 보충 파일 1 을 참조하십시오. 지퍼 서열은 폴리시스트로닉 메시지의 5'(N 말단)에 배치되어 발현을 향상시켜 정렬 수율을 높였습니다. 후속 이식유전자를 자체 절단 2A 펩타이드로 분리한 다운스트림에 배치합니다(그림 1D). 그러나 이전 실험에서는 높은 발현이 유지되는 경우 지퍼를 3' 구성으로 배치하는 데 성공했습니다.

2. 레트로바이러스 생산

  1. 형질감염 1일 전에 Phoenix-Eco 세포(ATCC CRL-3214, 마우스 트로픽 바이러스) 또는 Phoenix-Eco ɑ-V β-3 세포13 (Phoenix-Eco의 접착력을 향상시키도록 설계된 ɑ-V β-3 추가) 또는 293Vec-RD11414 (인간-트로픽 바이러스) 또는 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 세포(293Vec-RD114의 접착력을 향상시키도록 설계된 ɑ-V β-3 추가)를 준비합니다.
    참고: 이 프로토콜은 ɑ-V β-3 인테그린으로 포장 라인을 수정할 필요가 없지만, 이 수정은 조직 배양 플라스크에 대한 이 세포주의 접착력을 향상시키고 레트로바이러스 상청액 수집을 용이하게 합니다.
    1. Phoenix 또는 293Vec-RD114 세포를 함유한 T175 플라스크에서 0.25% 트립신-EDTA와 ~80% 합류하여 세포를 트립신화합니다.
      1. 배지를 제거하고 부착 세포를 10mL의 PBS로 세척하여 세포를 방해하지 않고 유지하여 트립신을 억제하는 혈청 성분을 제거하고, 5mL의 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하고, 세포를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% GlutaMAX(완전 DMEM이라고 함)가 보충된 5mL의 DMEM에서 세포를 해리하고 수집합니다.
      3. 4°C에서 5분 동안 340 x g 으로 원심분리하여 15mL 원추형 튜브에 세포를 펠릿화합니다. 디캔트 미디어.
    2. 원심분리 펠릿 세포를 10mL의 완전 DMEM에 재현탁하고 약 1.5 x 106 Phoenix-Eco 세포, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 세포 또는 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 세포를 혈구계로 계수합니다.
    3. 플레이트를 부드럽게 흔들거나 소용돌이치게 하여 세포를 고르게 분포시키고 세포가 플레이트에 부착되도록 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 약 18-24시간 후, 세포가 60%-70% 합류하고 건강하고 부착된 세포가 수지상 돌출부를 나타내는지 확인합니다.
  3. 아래에 설명된 바와 같이 형질감염 키트(재료 표)를 사용하여 레트로바이러스 LZRS-벡터 구조물(Addgene Plasmid #31601, EBNA-기반 에피솜 안정 형질감염) 또는 PB-벡터 구조물13(piggyBac 트랜스포존 기반 게놈 안정 통합, 보충 파일 1)으로 Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3 세포, 293Vec-RD114 또는 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 세포를 안정적으로 형질감염합니다.
    1. 각 형질감염 반응을 위해 2 μg LZRS 벡터 DNA 또는 PB-벡터 DNA와 16 μL의 인핸서 시약을 300 μL의 EC 완충액에 결합합니다.
    2. PB-벡터 구조의 안정적인 통합을 위해 과잉 활성 piggyBac 전위 효소 벡터 pCMV-hyPBase 15(Sanger Institute)1μg 도 추가합니다.
    3. 5초 동안 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 형질감염 시약 20μL를 첨가하고 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 10분 동안 배양하여 DNA 미셀 복합체를 생성합니다.
    4. 300μL의 완전 DMEM을 튜브에 넣고 여러 번 피펫팅하여 완전히 혼합한 다음 1mL 피펫을 사용하여 도금된 포장 라인 셀에 미셀 현탁액을 적가합니다.
    5. 미셀이 균일하게 침착되도록 부드럽게 소용돌이치십시오. 24시간 후, 형질감염된 세포를 트립신화하고 유세포 분석법에 의해 초기 레트로바이러스 암호화 구조 발현을 평가합니다.
    6. 트립신화된 세포를 20mL의 완전 DMEM이 포함된 T75 플라스크로 옮기고 항생제 내성 유전자에 따라 2μg/mL 퓨로마이신 또는 10μg/mL 블라스살진을 첨가하여 형질감염된 세포를 선택합니다. 세포가 70%-75% 컨플루션에 도달하면 트립신화하고 40mL의 완전 DMEM이 포함된 T175 플라스크로 옮깁니다. 포장 라인을 확장하는 동안 배지에서 항생제 선택을 유지합니다.
    7. 세포가 80%-85% 합류하면 다시 트립신화하고 유세포 분석법으로 구조 발현을 확인합니다. 동결 배지(50% 완전 DMEM, 40% FBS, 10% DMSO)를 사용하여 세포의 분취량을 동결하고 40mL의 완전 DMEM과 함께 2개의 T175 플라스크(1:10-1:12 분할 비율)에 세포를 계대시킵니다.
  4. 세포가 80%-85% 컨플루도에 도달하면 T175 플라스크에서 성장한 완전히 선택된 안정적인 포장 라인에서 레트로바이러스 상청액을 수집하고 농축합니다.
    1. 첫 번째 수확 전에 T175의 배지를 40mL의 신선하고 완전한 DMEM으로 교체하여 첫 번째 수확 전에 배지에서 항생제를 제거합니다.
    2. 주사기 필터(0.45μm, 폴리불화비닐리덴)가 장착된 50mL 주사기를 통해 수집된 상청액을 통과시켜 배지 교체 후 24시간 후에 상청액을 수집하고 여과합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다.
    3. 여과된 상청액 5x, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액 농축액(40%(wt/vol) PEG 8,000MW, 2.4%(wt/vol) NaCl 함유)을 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합합니다(PEG 침전 단계).
    4. 40mL의 완전 DMEM을 원래 수확한 T175 플라스크에 다시 추가하고, 24시간 더 배양하고, 총 연속 2일 동안 매일 바이러스 상청액을 수집합니다.
    5. 4°C에서 1-2일 동안 바이러스를 침전시킵니다. 침전된 바이러스는 응집성, 부유성 또는 침전된 물질로 나타납니다.
    6. PEG 침전 바이러스 현탁액을 4°C에서 15분 동안 2,100 x g으로 원심분리합니다. 침전되지 않은 상층액을 버립니다.
    7. 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 글루타맥스, 1% 피루빈산나트륨, 1% 비필수 아미노산 및 0.1% β-메르캅토에탄올(완전 RPMI라고 함)이 보충된 500μL의 RPMI에 각 PEG 침전 바이러스 펠릿을 재현탁합니다.
    8. 재현탁된 바이러스를 형질도입을 위해 즉시 사용하거나 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관합니다.

3. 0일: 마우스 T 세포 농축 및 활성화

  1. 조직 배양 처리된 6웰 플레이트를 2μg/mL 항-CD3(클론 145-2C11) 및 2μg/mL 항-CD28(클론 37.51)을 포함하는 웰당 1.5mL의 PBS로 코팅합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  2. 기증자 마우스로부터 비장을 수확하고, 40μm 필터를 통해 세포를 해리하고, 완전한 RPMI에서 비장 세포를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 340 x g 로 원심분리하여 비장세포를 펠릿화합니다.
    참고: 6-8주 사이의 암컷 BALB/cJ 마우스를 이 연구에서 기증자 마우스로 사용했습니다.
  3. 상청액을 버리고 펠릿을 부드럽게 소용돌이치고, 적혈구 용해 완충액 1mL를 첨가하고, 피펫을 3x-5x로 혼합하고, 실온에서 1분 동안 배양하고, 10mL의 완전 RPMI로 담금질하고, 4°C에서 5분 동안 340 x g 으로 원심분리하여 세포를 스핀다운합니다.
  4. 상청액을 버리고 0.5% BSA 및 2mM EDTA(MACS 완충액이라고 함)와 함께 PBS 800μL를 첨가하고 마우스-CD19 마이크로비드 200μL를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 혼합하고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
  5. 마우스 비장당 1개의 LD 컬럼을 준비합니다. LD 열을 MACS 구분 기호로 고정합니다. CD19가 고갈된 비장세포를 수집하기 위해 아래에 15mL 원뿔형 튜브를 놓습니다. 2mL의 MACS 완충액으로 컬럼을 적십니다.
  6. CD19 마이크로비드와 함께 배양한 후, 5mL의 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척하고, 4°C에서 5분 동안 340 x g 으로 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 버린다. MACS 완충액 1mL에 재현탁하고 세포를 LD 컬럼에 추가합니다. 현탁액이 통과할 때까지 기다린 후 1mL로 세척한 다음 2mL의 MACS 완충액으로 세척합니다.
  7. 다운스트림에서 사용하기 위해 CD19가 고갈된 비장세포의 흐름을 수집합니다. LD 컬럼을 버리고 4°C에서 5분 동안 340 x g 으로 원심분리하여 CD19 고갈된 비장세포를 스핀다운합니다. 상청액을 버리고 18mL의 완전 RPMI에 재현탁합니다. 재조합 인간 IL-2(rhIL-2)를 최종 농도 50 IU/mL에 첨가합니다.
  8. 항체 코팅된 6웰 플레이트에서 항체 용액을 버립니다. 항체 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 재현탁된 B 세포 고갈된 비장세포 3mL를 추가합니다.

4. 1일차: 마우스 T 세포의 레트로바이러스 형질도입

  1. 2μg/mL 항-CD3(클론 145-2C11), 2μg/mL 항-CD28(클론 37.51) 및 20μg/mL 레트로넥틴을 함유하는 웰당 1.5mL의 PBS로 조직 배양 처리되지 않은 6웰 플레이트를 코팅합니다.
    참고: 제조업체의 권장 사항에 따라 RetroNectin 코팅 중에 비조직 배양 플레이트가 사용됩니다.
  2. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 코팅액을 폐기하거나 재사용을 위해 보관하십시오(한 번 재사용할 수 있음). 웰당 2% BSA가 함유된 PBS 1mL로 플레이트를 차단하고 37°C에서 10분 동안 배양한 후 차단 용액을 버립니다.
  3. 그 동안 PEG 침전된 바이러스 상청액을 37°C 수조에서 해동합니다.
    참고: T175 플라스크에서 생성된 각 공동 형질도입된 PEG 농축 레트로바이러스 500μL는 20%>의 이중 형질도입 효율로 웰당 최대 2 x 106 개의 활성화된 T 세포를 이중 형질도입하기에 충분해야 합니다.
  4. 원하는 조건에 따라 공동 형질도입 바이러스 상청액을 6-웰 플레이트 웰에 추가하고, 완전한 RPMI 및 50 IU/mL rhIL-2로 최종 부피를 최소 2mL까지 가져오고, 2,100 x g 및 32°C에서 1시간 동안 회전시킵니다.
  5. 웰당 0.5-2 x 106 개의 활성화된 T 세포를 추가하고 32°C에서 10분 동안 340 x g 으로 플레이트를 탈수합니다. 세포가 부착되지 않으면 32°C에서 10-20분 동안 340 x g 에서 스핀을 반복합니다. 37°C에서 밤새 배양합니다.

5. 2일차: 벡터 발현 평가 및 선택적 재형질도입

  1. 유세포 분석을 위해 형질도입 플레이트에서 조건당 100-200μL의 부착 세포를 파괴합니다. 사용자는 각 개별 벡터 및 친화성 태그에 대해 유세포 분석 검출 가능한 마커를 식별하고 이를 사용하여 유세포 분석을 사용하여 벡터 단일 벡터 형질도입 효율, 이중 벡터 형질도입 효율 및 친화성 태그 제시를 평가해야 합니다.
  2. 아래에 설명된 대로 공동 형질도입된 세포에 대해 유세포 분석을 수행합니다.
    1. 벡터 1 및 벡터 2에 대한 벡터 리포터를 표시하도록 획득 매개변수 축을 설정합니다(그림 1C).
    2. 4개의 벡터 1 및 벡터 2 발현 사분면 각각에 대한 친화성 태그 지퍼 염색(예: FLAG 또는 CD34)에 대한 히스토그램을 플로팅하여 친화성 태그 염색이 벡터 1 및 벡터 2 형질도입 리포터를 공동 발현하는 세포로 제한되도록 합니다.
  3. 세포가 다운스트림 실험(일반적으로 20% 이상의 이중 형질도입)을 위한 충분한 세포를 보장할 수 있을 만큼 충분히 이중 형질도입된 경우 다음 단계를 수행합니다.
    1. T 세포 자극을 유지하기 위해 2μg/mL의 항-CD3 및 항-CD28 항체를 함유한 PBS로 각 T 세포주를 형질도입하는 데 사용되는 초기 웰의 수를 두 배로 코팅합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    2. 50 IU/mL rhIL-2로 완전한 RPMI가 있는 새로운 웰로 세포를 옮깁니다(T 세포 자극 유지).
  4. 다운스트림 실험(일반적으로 20% 이중 형질도입 <)을 위한 충분한 세포를 보장하기 위해 세포가 충분히 이중 형질도입되지 않은 경우 다음 단계를 수행합니다.
    1. 1일차와 동일한 프로토콜을 사용하여 형질도입을 재전달하되 T 세포 확장을 설명하기 위해 처음에 사용된 웰 수의 두 배로 늘립니다.
    2. 37°C에서 밤새 배양합니다. 24시간 후에 유세포 분석을 반복합니다.
      참고: 친화성 태그 지퍼를 포함한 벡터 인코딩 구조는 초기 형질도입 후 2일 후에 최대 발현을 나타냅니다.

6. 3일차: T 세포 면역자기 선택(Zip-sort)

  1. 동일한 공동 형질도입 조건을 사용하여 생성된 세포의 웰을 15mL 원추형 튜브에 풀링합니다.
  2. 세포를 4°C에서 5분 동안 340 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 4°C에서 30분 동안 1 x 107 세포당 30μL의 마이크로비드(DYKDDDDK(FLAG) 또는 인간 CD34)를 포함하는 500μL의 MACS 완충액에서 세포를 배양합니다.
  3. 배양 후, 5mL의 차가운 MACS 완충액으로 세포를 세척합니다. 세포를 4°C에서 5분 동안 340 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 MACS 완충액 1mL에 재현탁합니다.
  4. 아래에 설명된 대로 LS 컬럼을 사용하여 형질도입된 T 세포를 긍정적으로 선택합니다.
    1. 2mL의 MACS 완충액으로 컬럼을 적십니다. 마그네틱 스탠드의 LS 컬럼에 세포 현탁액을 도포합니다.
    2. MACS 완충액(1mL, 2mL, 3mL)으로 순차적으로 세척합니다. 마그네틱 스탠드에서 컬럼을 제거하고 컬럼에 5mL의 완전 RPMI를 추가한 다음 세포 플런저를 삽입하여 컬럼에서 머무름 세포를 용리합니다.
    3. 15mL 원뿔형 튜브 또는 T25 플라스크에 직접 세포를 포획합니다. 50 IU/mL rhIL-2를 사용하여 완전한 RPMI에서 0.5 x 106 cells/mL로 세포를 평형화합니다.
    4. < 20% 이중 형질도입으로 시작하는 경우 선택적으로 세포를 두 번째 LS 컬럼으로 용리하여 순차적 양성 선택을 통해 분류 후 순도를 높입니다.
  5. T25 또는 T75 플라스크에서 약 0.5 x 106 세포/mL의 완전 RPMI 및 50 IU/mL rhIL-2로 CAR T 세포를 배양합니다.
  6. 선택 사항: T 세포가 생체 내 실험에 사용될 경우, 초기 배양 기간 동안 발생하는 CAR T 세포 강장성 신호 전달 유발 기능 장애를 약화시키기 위해 1μM 다사티닙에서 배양하는 것을 고려하십시오13,16.
  7. 사전 분류 및 사후 분류된 T 세포에 대해 위의 2.1 및 2.2단계에 따라 유세포 분석을 수행하여 Zip 정렬 후 수율 및 순도(% 이중 형질도입)를 평가합니다.
    수율 = 회수된 총 이중 형질도입 세포의 100 x / 사전 분류 집단에 존재하는 총 이중 형질도입 세포)

7. 4일차: 지속적인 T 세포 배양

  1. T 세포 농도를 0.5-1 x 106 cells/mL로 유지하기 위해 전체 배양 부피에 대해 신선한 완전 RPMI 및 50 IU/mL rhIL-2를 추가합니다.
  2. 선택 사항: T 세포를 생체 내 실험에 사용할 경우 신선한 1μM 다사티닙을 추가합니다.

8. 5일차: 지퍼 분류 T 세포의 특성화

  1. 선택 사항: 유세포 분석을 사용하여 Zip-sort 벡터에 의해 암호화된 CAR 또는 기타 단백질 산물을 검출하기 위해 항체로 염색된 조건당 100-200μL의 T 세포 현탁액을 준비합니다.
  2. CAR T 세포로 시험 관 내 또는 생체 내 실험을 수행합니다.
  3. 선택 사항: T 세포를 생체 내 실험에 사용할 경우 세포를 세척하여 다사티닙을 제거합니다. 기관 지침에 따라 안와 후 또는 꼬리 정맥 주사에 필요한 농도로 세포를 재현탁합니다.

9. 0일차: 인간 T 세포의 정제 및 자극

  1. 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 바이알을 수조에서 빠르게 해동합니다(또는 새로 분리된 PBMC 사용). 해동된 PBMC를 5mL의 MACS 완충액이 들어 있는 15mL 원추형 튜브에 첨가하고, 계수를 위해 분취량을 준비하고, 4°C에서 5분 동안 340 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
  2. 상청액을 버리고 MACS 완충액에 세포를 재현탁합니다(총 1 x 107 개 세포당 40μL의 완충액 사용). 제조업체의 지침에 따라 인간용 Pan T 세포 분리 키트를 사용하여 T 세포 분리를 진행합니다.
    1. 간단히 말해서, 총 1 x 107 세포당 10 μL의 Pan T 세포 비오틴-항체 칵테일을 첨가합니다. 4°C에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 총 1 x 107 개 세포당 30μL의 MACS 완충액을 추가합니다. 총 1 x 107 개의 세포당 20μL의 Pan T Cell MicroBead Cocktail을 추가합니다.
    3. 4°C에서 10분 동안 배양합니다. MACS 완충액을 사용하여 세포 현탁액의 부피를 최소 500μL로 채웁니다.
    4. LS 컬럼을 사용하여 자기 세포 분리를 진행하고 농축된(손대지 않은) T 세포를 포함하는 흐름을 수집합니다.
  3. 4°C에서 5분 동안 340 x g 에서 원심분리하여 T 세포 수율 및 펠릿 세포를 계산합니다. 상청액을 버리십시오. 인간 T 세포를 1 x 106 세포/ mL의 완전한 RPMI에 50 IU/mL의 rhIL-2로 재현탁합니다.
  4. 2mL의 PBS가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 T 세포 확장 및 활성화를 위해 필요한 부피의 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(1 x 106 세포당 25μL 비드, 1:1 비드 대 T 세포 비율 사용)을 추가하고 4°C에서 5분 동안 340 x g 으로 스핀다운하여 비드를 세척합니다. 상청액을 버리십시오.
  5. 재현탁된 T 세포를 세척된 비드와 혼합하고 배양을 위해 T25 플라스크로 옮깁니다.

10. 3일차: 인간 T 세포의 레트로바이러스 형질도입

  1. 20μg/mL RetroNectin을 함유한 웰당 1.5mL의 PBS로 비조직 배양 6웰 플레이트를 코팅합니다.
  2. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 코팅액을 폐기하거나 재사용을 위해 보관하십시오(한 번 재사용할 수 있음).
  3. 그 동안 37°C 수조에서 공동 형질도입을 위해 PEG 침전된 바이러스 상청액을 해동합니다.
  4. 원하는 형질도입 조건에 따라 RetroNectin-코팅 6-웰 플레이트의 웰에 공동 형질도입 바이러스 상청액을 추가하고, 원하는 양의 T 세포(일반적으로 0.5 - 2 x 106 T 세포/웰)를 계수하고 추가하고, rhIL-2를 포함하는 완전한 RPMI로 최대 3mL의 부피를 가져오고 32°C에서 340 x g 에서 45분 동안 회전시킵니다.
  5. 24시간 후, 50 IU/mL rhIL-2로 완전한 RPMI에서 T 세포를 1 x 106 cells/mL로 유지합니다.
  6. 원하는 농도를 유지하는 데 필요한 부피가 6웰 플레이트의 부피 용량을 초과하는 경우 6웰 플레이트에서 T25 플라스크로 세포를 옮깁니다.

11. 6일차: 인간 CAR T 세포 지퍼 분류

  1. 친화성 태그 기반 면역자기 정제(Zip-sort) 전에 T 세포에서 Dynabeads를 제거하여 자기 컬럼에서 Dynabead 관련 머무름을 방지하고 유세포 분석에 대한 잠재적 간섭을 피하기 위해 유세포 분석을 피하기 전에 유세포 분석을 제거합니다.
  2. 잠시 소용돌이치기 위해 Dynabeads를 해리하고 T 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 Dynabead Magnet에 삽입합니다. 튜브를 몇 번 뒤집고 Dynabeads가 자석에 결합될 때까지 5분 동안 기다립니다.
  3. 피펫으로 흡인하여 Dynabeads 없이 세포 현탁액을 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 회수된 세포 농도를 계산하고 부피를 사용하여 총 세포 수율을 계산합니다.
  4. 위의 마우스 형질도입 프로토콜에 따라 유세포 분석을 사용하여 CAR 발현을 평가합니다.
  5. 4°C에서 5분 동안 340 x g 에서 원심분리하여 세포를 스핀다운하고 1 x 107 세포당 30μL의 마이크로비드(DYKDDDDK(FLAG) 또는 인간 CD34)를 포함하는 500μL MACS 완충액에서 배양합니다.
  6. 6.3-6.5단계에 따라 Zip 분류된 인간 CAR T 세포를 얻습니다.
  7. 트리판 블루 배제를 사용하여 혈구계 생존율 검사로 분류 후 생존력을 평가합니다. 사전 분류 생존율은 80%> 것으로 예상됩니다. Zip 정렬 후에는 80% 미만으로 떨어질 수 있지만 4-5일 후에 회복됩니다.
  8. 50 IU/mL rhIL-2로 완전한 RPMI에서 인간 T 세포를 증식시키고 T 세포 농도를 약 1 x 106 cells/mL로 유지합니다. 분류 후 T 세포 확장 및 유지 관리는 사용자의 표준 확장 및 사용 프로토콜에 따라 조정할 수 있습니다.
  9. 일반적으로 8일 이후에 사멸 분석, 사이토카인 생산, T 세포를 사용한 생체 내 분석과 같은 다운스트림 실험 테스트를 수행합니다.

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결과

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이 프로토콜에서 우리는 두 개의 별개의 레트로바이러스 벡터(Zip-sort, 그림 1이라고 함)13으로 이중 형질도입된 T 세포의 공동 형질도입 및 단일 단계 면역자기 선택을 시연합니다. 각 벡터는 이중 형질도입된 T 세포의 표면에 선택적으로 표시되는 이종이량체화 류신 지퍼 쌍의 한 부분을 암호화합니다(그림 1A). 친화성 태그 분비 지퍼는 벡터 1에서 발현되고 벡터 2에서 발현된 막 결합 포획 지퍼와 세포 내에서 쌍을 이룹니다. 짧은 힌지 스페이서(그림 1A-B)와 Thy1.1, EGFR, PD-1 및 CD200R과 같은 더 크고 길쭉한 스페이서(그림 1B)가 있는 지퍼 정렬 캡처 지퍼 디자인을 여기에서 평가했습니다. 짧은 힌지 스페이서가 있는...

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토론

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여기서, 우리는 Zip-sort 벡터 세트 생성, 레트로바이러스 생성, 마우스 및 인간 T 세포 공동 형질도입, 이중 형질도입 세포(Zip-sort)를 면역자기적으로 정제하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 위의 프로토콜은 레트로바이러스 벡터와 마우스 및 인간 T 세포에 최적화되었습니다. Zip-sort 방법론은 다른 벡터 시스템과 함께 평가되지 않았지만, 원칙적으로 충분히 높은 표면 발현이 달성된다면 렌티바이러스17, 트랜스포존18 또는 부위 특이적 상동성 지향 복구 템플릿 통합19를 포함한 다른 벡터 시스템은 호환될 가능성이 높습니다. 더 큰 포장 크기를 필요로 하는 사용자는 각벡터 시스템의 보고된 최대 화물 용량에 기초하여 이러한 대체 포장 전략의 사용을 고려할 수 있습니다7. 우리는 Zip-so...

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공개 사항

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A.R., S.C., S.E.J. 및 M.V.D.B.는 Zip-sort 기술과 관련된 특허 출원의 공동 발명가입니다. APB는 Abbvie와 Bristol Myers Squibb에 대한 컨설팅을 제공합니다. MVDB는 Seres Therapeutics로부터 연구 지원을, Seres Therapeutics 및 ThymoFox로부터 스톡 옵션을 받았습니다. 그는 Wolters Kluwer로부터 로열티를 받았습니다. 그는 Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis(배우자), Synthekine(배우자), Beigene(배우자), Kite(배우자), MustangBio(배우자) 및 Cellectar(배우자); 그는 Seres Therapeutics 및 Juno Therapeutics의 IP 라이선스를 보유하고 있습니다. 그는 DKMS(비영리 단체)의 재단 이사회에서 수탁자 역할을 맡고 있습니다. 그리고 그는 Smart Immune의 과학 자문위원회 의장입니다.

감사의 글

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S.C.는 독일 연구 재단(Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG)를 참조하십시오. SEJ는 NCI로부터 경력 개발 상(수상 번호 K08-CA252157)의 지원을 받습니다. SEJ는 또한 미국 임상 종양학회(Young Investigator 상), National Marrow Donor Program(Amy Program 상) 및 Parker Institute for Cancer Immunotherapy(Bridge Scholar 상)의 지원을 받았습니다. van den Brink 연구실의 연구는 국립 암 연구소 상 P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308의 지원을 받습니다. 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 수상 R01-HL164902 및 국립 노화 연구소 수상 P01-AG052359. 이 연구는 Deana and Steve Campbell Chief Physician Executive Distinguished Chair 기부금의 부분적으로 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강함>종양 세포주 관련
C1498ATCCTIB-49
BM185-CD19참조 13
BM185-CD20참조 13
4D-Nucleofector 코어 유닛론자AAF-1003B
4D-Nucleofector X 유닛론자AAF-1003X
Lonza SF 버퍼 키트
바이러스 생산
10cm 조직배양(TC) 처리된 세포배양접시코 닝353003
50mL 원뿔형 튜브써모 사이언티픽339652
이펙틴키아겐301425
pENTR1a 플라스미드아드진17398
LZRS-Rfa아드진31601
PB MMLV puro(마우스 T 세포용 바이러스 벡터)참조 13
PB SFG blastR(인간 T 세포용 바이러스 벡터)참조 13
pCMV-하이PBase생거 연구소
피닉스-에코ATCCCRL-3214
피닉스 에코 알파 V 베타 3참조 13Phoenix-Eco는 더 높은 결합력을 가진 배양 플라스크에 부착되도록 변형되었습니다.
PB-EF1a 인트론 WPRE mCD4 P2A MCS 인테그린 베타 3참조 13배양 플라스크에 대한 포장 라인 셀의 접착력을 강화하기 위한 옵션
PB-EF1a 인트론 WPRE hCD8a 2A 인테그린 알파 V참조 13배양 플라스크에 대한 포장 라인 셀의 접착력을 강화하기 위한 옵션
바이오벡-RD113바이오벡 제약
Biovec-RD113 알파 V 베타 3바이오벡 제약알파 V 베타 3 벡터로 형질감염된 이 연구는
Millex-HV 주사기 필터(0.45 & mu; m)밀리포어SLHVR33RRS
폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG)피셔 사이언티픽BP233-1
소금피셔 사이언티픽S271-500
퓨로마이신산타크루즈 바이오텍SC-108071B
블라스트살해딘산타크루즈 바이오텍SC-204655
T175 TC 처리 플라스크 코 닝353112
트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드깁코25200056
Cell media
2-메르캅토에탄올깁코21985023
RPMI1640깁코11-875-119
DMEM깁코11-965-118
FBS시그마F2442
글루타맥스깁코35050061
MEM 비필수 아미노산깁코11140050
페니실린-스트렙토마이신깁코15140-163
피루브산나트륨깁코11360070
<강>T 세포 자극/형질도입
15 mL 원뿔형 튜브써모 사이언티픽339650
6웰 비TC 플레이트깁코351146
6웰 TC 플레이트깁코353046
항-CD19 마이크로비드 밀테니 바이오텍130-121-301
InVivoMab 항마우스 CD28 (클론 37.51)바이오엑스셀BE0015-1
InVivoPlus 항마우스 CD3&엡실론; (복제 145-2C11)바이오엑스셀BE0001-1
소 혈청 알부민시그마 알드리치A4737-1G
다사티닙케이맨 케미칼11498
Dynabeads 인간 T-활성제 CD3/CD28깁코11131D
EDTA(0.5 M), pH 8.0, RNase 프리인비트로젠AM9260G
HybriMax RBC 용해 완충액시그마R7757-100ML
LD 열밀테니 바이오텍130-042-901
Pan T 세포 분리 키트, 인간밀테니 바이오텍130-096-535
Dynamag-15 자석인비트로젠12301D
인산염 완충 식염수(1X)코 닝21040CV
레트로넥틴타카라T100B
rhIL-2프로루킨(알데스류킨)
T25 세포 배양 플라스크코 닝353109
Zip-sort
µ MACS DYKDDDDK 절연 키트밀테니 바이오텍130-101-591
CD34 MicroBead 키트, 인간밀테니 바이오텍130-046-702
쿼드로맥스밀테니 바이오텍130-090-976
MACS 멀티스탠드밀테니 바이오텍130-042-303
LS 열밀테니 바이오텍130-042-401
유세포 분석 및 세포 모니터링
항-CD90.1 Thy1.1 APC(클론 OX-7)BD 바이오사이언스고양이# 561409; RRID:AB_10683163
Anti-V5 태그 항체, (클론 4C12E11) iFluor 488젠스크립트고양이 # A01803, RRID : AB_2925231
마이크 PE세포 신호 전달 기술카탈로그 # 2233; RRID:AB_823474
마이크 알렉사 647세포 신호 전달 기술카탈로그 # 2233; RRID:AB_823474
APC 안티 DYKDDDK 태그(클론 L5)바이오레전드고양이# 637307; RRID:AB_2561496
마우스 항 CD34 항체, Alexa Fluor 647, (클론 QBEnd/10)노부스 바이오로제스고양이 # NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
스트렙태그 FITC젠스크립트고양이 # A01736; RRID:AB_2622221
인큐사이트 SX5사토리우스
Penteon 유세포 분석기애질런트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

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