방법 논문

마우스에서 최적화된 최소 침습 경공막 망막하 주사 기술

DOI:

10.3791/68631

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2025년 7월 25일

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1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

망막하 주사는 광수용체 및 RPE 질환에 대한 치료제의 전임상 개발에 없어서는 안 될 기술입니다. 우리는 수술 중 성공률을 향상시키고 망막 손상을 최소화하는 마우스에서 최적화된 경공막 망막하 주사 기술을 설명합니다.

초록

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마우스의 망막하 공간으로 물질을 전달하는 기존의 방법은 신경망막의 이중 천공을 포함하며, 이는 광범위한 외과적 손상을 유발합니다. 이로 인해 망막전위도(ERG) 기록 또는 행동 시각 분석과 같은 시각 기능의 후속 결과 측정에 가변성이 발생하여 실험적 치료제의 효능 평가를 혼란스럽게 합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 생쥐에서 경공막 최소 침습 망막하 주사 기술을 최적화했습니다. 이 기술에서는 맞춤형 텅스텐 와이어 눈꺼풀 검경을 사용하여 상원추에 접근하여 결막 회막 절개술 및 건 절개술을 수행합니다. 망막을 관통하지 않고 다이아몬드 칼을 사용하여 미세한 유리 바늘을 얕은 각도로 조심스럽게 삽입하는 정밀 공막 절개술을 합니다. 페이로드는 미세 주입 펌프를 사용하여 망막하 공간으로 전달됩니다. 광간섭단층촬영(OCT)은 주사 직후 망막하 수포의 크기와 위치를 평가하는 데 사용됩니다. 우리는 이 기술의 결과를 33G 바늘 공막 절개술과 함께 스프링 장착 주사기를 사용하여 수행된 기존의 망막 경 방법과 비교했습니다. ERG 기록은 경공막 주사 마우스에서 망막 기능의 우수한 보존을 나타내며, 이는 주사되지 않은 대조군 마우스와 비슷합니다. 대조적으로, 기존에 주입된 코호트에서 상당한 ERG 신호 감소가 관찰되었습니다. 요약하면, 우리는 마우스의 망막하 주사를 위한 최소 침습 기술을 최적화했습니다. 우리는 이 기술이 망막의 해부학적 손상을 최소화하고 망막 기능에 미치는 영향을 최소화하는 유전자 치료 투여를 위한 강력하고 효율적인 방법임을 보여줍니다. 이 방법은 광범위한 망막 및 황반 질환을 치료하기 위해 망막 색소 상피와 광수용체를 모두 표적으로 하는 치료법 개발의 임계값을 낮춥니다.

서론

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망막하 주사는 망막과 망막 색소 상피(RPE) 사이의 잠재적 공간에 물질을 전달하는 안과 수술입니다. 유리체강내 또는 맥락막상 주사와 같은 후안부에 약물을 전달하는 다른 방법과 비교할 때 망막하 주사는 광수용체와 RPE 모두에 가장 즉각적인 접근을 달성합니다. 바이러스 유전자 치료 입자의 전달을 위해 망막하 주사는 훨씬 더 높은 광수용체 및 RPE 형질도입 비율을 달성하여 바이러스 역가를 낮추고 바이러스 독성 위험을 줄일 수 있습니다1. 또한 망막하 공간은 해부학적으로 제한되어 바이러스 입자의 전신 확산을 제한하고 면역 반응의 위험을 낮춥니다2. 인간의 경우 망막하 주사의 안전성 프로파일은 매우 유리하며 망막 구조와 기능은 주사 후 1개월 이내에 기준선 수준으로 회복됩니다 3,4. 망막하 주사는 줄기 세포 이식 및 소분자약물 전달과 같은 다양한 응용 분야에 사용되며2, 가장 일반적인 용도는 망막 질환의 유전자 치료 치료를 위한 바이러스 벡터 전달입니다. 망막하 주사와 관련된 상대적으로 낮은 바이러스 역가, 최소한의 전신 노출, 높은 형질도입 속도 및 특이성으로 인해 망막 분야에서 없어서는 안 될 기술이 되었습니다. 망막하 주사는 색소성 망막염 및 레버 선천성 흑암시를 포함한 유전성 망막 질환 치료를 위해 환자에게 성공적으로 사용됩니다 5,6.

이 분야에 대한 중요성을 고려할 때 마우스에서 망막하 주사를 수행하는 능력은 유전성 망막 질환에 대한 치료법을 조사하는 전임상 연구에 매우 중요합니다. 그러나 마우스 망막하 주사에 대한 현재의 방법은 실패율이 높고 종종 망막에 외과적 손상을 일으켜 기능적 결과 측정의 신뢰성과 일관성을 제한할 수 있습니다. 통상적으로, 설치류의 망막하 주사는 바늘이 망막 전방을 관통하고 수정체를 통과하여 망막의 두 번째 관통의 결과로 망막하 공간으로 들어가도록 망막 경망막으로 수행됩니다 7,8(그림 1A). 상대적으로 수행하기 쉽지만 이 절차는 외과적 손상의 다양한 정도로 인해 실험 결과에 현저한 불일치를 초래합니다. 이는 행동 및 기능적 시력 결과 측정을 활용하는 연구의 경우 특히 제한적입니다. 또한, 결정 수정체는 인간에 비해 생쥐에서 불균형적으로 큽니다. 이것은 경망막 주사 중 수정체 손상 위험을 크게 증가시켜 동물을 기능적 시력 평가에 사용할 수 없게 만듭니다4.

대체 옵션은 바늘이 공막, 맥락막, 브루흐막 및 RPE 4,9를 관통하는 후방 접근법을 사용하여 망막하 공간에 접근하여 이러한 문제를 방지하는 경공막 주사 경로입니다(그림 1B). 이 접근법은 망막 침투를 완전히 방지하여 망막 손상을 최소화합니다. 이는 또한 망막하 공간(10)에서 주입된 물질의 역류 감소와 관련이 있으며, 이는 보다 일관된 결과와 더 작은 실험 코호트를 가능하게 합니다. 마우스의 경공막 망막하 주사 기술은 이전에 문헌에 기술되었지만 성공률을 방해할 수 있는 기술적 어려움으로 인해 광범위한 채택이 제한되어 있습니다4. 여기에서는 경공막 주사 절차에 대한 몇 가지 개선 사항을 설명하여 더 쉽고 빠르게 수행하고, 실험 변동성을 줄이고, 주사 성공률을 향상시킵니다. 이러한 개선에는 마우스 눈꺼풀 검경 개발, 아트로핀의 수술 전 투여, 다이아몬드 나이프를 사용한 정확한 공막 절개술 생성, 바늘 크기 및 주입 접근법의 최적화가 포함됩니다. 이 기술은 ERG로 감지할 수 있는 외과적 영향을 일으키지 않고 광수용체 및 RPE의 우수한 바이러스 형질도입 범위를 달성합니다.

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프로토콜

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모든 실험은 Duke University Institutional Animal Care and Use Committee와 Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 망막하 주사를 수행하기 30분 전에 1mg/kg의 아트로핀(총 부피 50μL)을 복강내 주사합니다. 이 단계는 주사 중 일시적인 안압 상승에 의해 유발되는 잠재적으로 치명적인 안심 및 안호흡 반사를 예방함으로써 성공률을 크게 증가시킵니다11,12.
    참고: 당사의 아트로핀 용량은 C57BL/6 마우스에 최적화되어 있으며 다른 마우스 계통에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다. 우리는 아트로핀 투여량에서 눈에 띄는 성별 또는 연령 차이를 관찰하지 못했습니다.
  2. 전체 절차 동안 동물의 편안함을 극대화하고 차가운 백내장 발병을 줄이기 위해 마우스를 따뜻한 표면에 두십시오.
  3. 누운 자세가 관찰되고 동물이 더 이상 발가락 꼬집기에 반응하지 않을 때까지 산소(2L/min)에서 2% 흡입 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 국소 마취를 위해 0.5% 프로파라카인을 눈에 떨어뜨립니다.
  4. 0.2% 사이클로펜톨레이트와 1% 페닐에프린의 혼합물을 눈에 한 방울을 떨어뜨려 OCT에 의한 망막하 수포의 수술 후 영상화를 위해 동공을 확장합니다. 페닐에프린은 또한 표재성 혈관을 수축시켜 수술 중 출혈을 줄이는 역할을 합니다13.

2. 공막 절개술

  1. 절차를 시작하기 전에 주입할 원하는 양의 용액을 유리 마이크로니들에 넣으십시오. 모세혈관 작용에 대응하기 위해 보상 압력을 5헥토파스칼(hPa)으로 설정하여 바늘을 마이크로인젝터에 부착합니다. 일반적으로 망막하 주사에 1μL 부피를 사용합니다.
  2. 해부 실체 현미경 아래에 마우스를 놓습니다. 2.3-2.6 단계에는 20 배율을 사용하고 2.7-3.5 단계는 50 배율을 사용합니다.
  3. 어린 마우스의 경우 수술 부위에 대한 충분한 접근과 시각화를 제공하기 위해 시술 전에 측면 안각 절개술을 수행합니다.
  4. 맞춤형 소형 와이어 검경을 사용하여 우수한 원추를 노출시킵니다(그림 1C). 핸즈프리로 윗눈꺼풀을 수축할 수 있도록 검경을 고정합니다.
  5. 각진 Vannas 가위를 사용하여 상결막과 테논낭에서 윤부 주위 절개(윤부 뒤쪽 ~1mm)를 수행하여 공막의 상부 3-4시간 시계를 노출시킵니다. 안와 후 정맥동에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 의도한 주사 부위 위에 있는 Tenon 캡슐의 잔여물을 조심스럽지만 철저하게 제거하십시오.
  6. 결막 회막 절개술과 건절개술의 앞쪽 가장자리를 잠금치는 톱니 겸자로 잡고 지구를 부드럽게 하도관하여 상공막을 노출시킵니다. 잠긴 집게를 고정하여 핸즈프리 침식을 허용합니다.
  7. 노출된 공막이 건조되는 것을 방지하기 위해 균형 완충 식염수(BSS)를 즉시 눈에 떨어뜨립니다. 우리는 또한 BSS 물방울에 의해 생성된 광학 배율이 도움이 된다는 것을 발견했습니다.
  8. 다이아몬드 나이프를 사용하여 윤부에서 ~12시 방향과 ~1-2mm 지점에서 정확한 공막 절개술을 합니다. 공막에 대해 접선면에 블레이드를 배치하여 공막 절개술이 가능한 한 작고 얕은지 확인합니다.
    참고: 이것은 두 가지 이유로 수행됩니다: (1) 작은 공막 절개술은 유리 바늘을 단단히 고정시켜 주사 단계 중 역류를 줄이고, (2) 얕은 공막 절개술은 망막 관통을 피하는 데 중요합니다. 공막 절개 부위에 소량의 맥락막 혈액이 나타날 수 있으며, 이는 시술 결과에 부정적인 영향을 미치지 않습니다.

3. 경공막망막하주사

  1. 주사를 준비할 때 수술용 스펀지를 사용하여 눈 표면의 모든 BSS를 부드럽게 제거합니다.
  2. 바늘을 공막에 대해 얕은 각도로 베벨 다운으로 잡고 팁을 천천히 조심스럽게 공막 절개술에 삽입하여 망막하 공간에 접근합니다. 망막을 관통하지 않으려면 비교적 얕은 각도로 공막 절개구부를 0.5-1mm 비울 수 있을 만큼 충분히 깊게 수행하십시오.
    참고: 바늘의 경사는 맥락막 전달 가능성을 최소화하고 전진하는 바늘 끝으로 망막에 구멍을 뚫을 가능성을 줄이기 위해 아래쪽으로 위치합니다.
  3. 바늘을 안정된 위치에 놓은 상태에서 풋 페달을 사용하여 500hPa에서 주입을 시작하고 15초 동안 중단 없는 압력을 유지합니다.
  4. 주사를 마치려면 바늘이 공막 절개술에서 완전히 제거될 때까지 주사 압력을 유지하십시오. 바늘이 망막하 공간에 있는 동안 압력이 조기에 중단되면 주입된 페이로드의 상당 부분이 모세관 작용에 의해 눈을 빠져나와 바늘로 빠르게 빠져나올 수 있습니다.
  5. 바늘을 빼면 공막 절개 부위를 통해 주입된 용액이 부분적으로 역류하는 것을 확인하십시오. 이는 1μL 부피가 성인 마우스에서도 망막하 공간의 용량을 초과한다는 점을 감안할 때 예상됩니다. 역류가 없다는 것은 부주의한 맥락막 또는 유리체강내 전달로 인한 주사 실패를 나타낼 수 있습니다.
  6. 잠금 겸자와 눈꺼풀 검경을 눈에서 제거합니다. 주입된 용액이 더 역류할 수 있으므로 지구본에 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
  7. 주사 직후 눈에 충분한 윤활제 눈 연고를 바르면 OCT14까지 망막하 수포가 시각화될 수 있습니다.
  8. 국소 에리스로마이신 연고를 눈에 바르고 동물에게 일반적인 수술 후 관리를 제공합니다.

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결과

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이 경공막 기술을 사용한 성공적인 주사는 주사 절차 직후 OCT에서 관찰할 수 있는 망막하 수포를 생성합니다(그림 2A). 이 기술의 기술적 과제를 감안할 때 이미징 단계는 성공적으로 주사된 동물을 식별하는 데 필수적입니다. 유전자 치료 실험에 이 기술을 사용할 계획인 연구자의 경우 형광 리포터 유전자를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자로 연습 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 이 기술을 사용하여 전달된 AAV 입자는 RPE(그림 2B), 광수용체(그림 2C,D) 또는 이들의 조합(그림 2E,F)의 매우 큰 형질도입 영역을 달성합니다. 형질도입된 영역은 일반적으로 ora serrata에서 시신경 유두 너머로 아래쪽으로 확장됩니다. 모든 망막하 주사 ...

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토론

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여기에 설명된 기술은 이전에 설명한 경공막 주사 접근법4에 대한 몇 가지 개선 사항을 도입하여 절차의 신뢰성을 향상시키고 눈의 외과적 손상을 더욱 줄입니다. 그러한 개선 사항 중 하나는 검경을 사용하여 위 눈꺼풀을 수축시켜 안정적이고 방해받지 않으며 핸즈프리로 눈에 접근할 수 있게 하는 것입니다. 상업용 검경은 성체 생쥐에게도 최적화되지 않은 경우가 많으며 어린 쥐에게는 완전히 사용할 수 없습니다. 이 장애물을 극복하기 위해 우리는 작은 직경과 놀라운 강성을 고려하여 시중에서 판매되는 미세 텅스텐 와이어를 사용하여 제조하는 맞춤형 검경(그림 1C)을 설계했습니다. 이를 통해 시술 수행이 용이해지고 성공률이 높아지며 주사당 소요되는 시간과 노력이 크게 줄어듭니다. 마찬가지로, 우리는 잠금 톱니 겸자를 사용하여 지구를 삽입하여 안정적이고 핸즈프리 방식으로 주사 부위를 노출시킵니...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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AAV1-Best1-GFP 바이러스를 제공해 주신 John Flannery(University of California, Berkeley)에게 감사드립니다. 받은 자금: NIH R01 EY031748(CBR), NIH P30 EY005722(듀크 대학교); FFB 무료 제품군 AMD 어워드(CBR); 실명 예방을 위한 연구(Duke Eye Center)의 무제한 보조금; FFB 중개 연구 가속화 프로그램 TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP(VA), NIH K08 EY033857(OA); 듀크 대학교 의사-과학자 강력한 스타트 상(OA).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨 주사, USP호스피라PAA130066
1% 아트로핀 황산염 점안액, USP아콘NDC 17478-215-05
30° 다이아몬드 나이프카테나K2-6560
AmScope 6W LED 듀얼 구즈넥 일루미네이터암스코프LED-11CR
각진 Vannas 가위로보즈RS-5618 시리즈
BSS 멸균 관개 용액알콘289010-0902
시클로미드릴 확장 안약알콘0065-0359-020.2% 사이클로펜톨레이트, 1% 페닐에프린
epT.I.P.S. MicroloaderTM 피펫 팁에펜도르프5242 956.003
FemtoJet 4i 마이크로인젝터에펜도르프E5252000021단종된 제품
GenTeal Tears 윤활제 눈 연고알콘16027802
유리 미세 주입 바늘클런베리 사이언티픽B100-58-5030° 베벨. 직경: 50 & 마이크로; m 외부, 29 및 마이크로; M 이너
이소플루란 용액코베트러스29405
영상 유도 OCT가 있는 MICRON IV 망막 영상 현미경불사조해당 사항 없음
실체현미경 SteREO Discovery.V8자이스495015-0001-000
Stern-Castroviejo 잠금 톱니 겸자카테나K5-2552
톱니 겸자로보즈RS-5172
23s 게이지 바늘 용 텅스텐 청소 와이어해밀턴18306
울트라셀 PVA 아이 스피어BVI 의료40400-8
Ultra-Fine2015 인슐린 주사기 BD3284383/10mL, 8mm(5/16인치), 31G

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

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