방법 논문

면역 투과 전자 현미경에 의한 미토콘드리아 시토크롬 C의 전이 강조

DOI:

10.3791/68633

⸱

2025년 8월 15일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 면역 전달 전자 현미경에 의해 뉴런의 미세 형태학적 변화와 미토콘드리아 시토크롬 c의 전이를 연구하는 방법을 설명합니다.

초록

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미세 구조의 단백질 위치 변화는 종종 병리학적 소기관 수준에서 정확한 조절 메커니즘을 나타냅니다. 이 소기관 단백질 전달의 위치를 정확하게 포착하는 방법은 질병의 진단과 치료에 긍정적인 의미와 가치가 있습니다. 미토콘드리아는 괴사와 세포사멸의 내재적 경로에서 중심적인 역할을 합니다. 정상적인 조건에서 시토크롬 c(Cyt c)는 미토콘드리아의 내막과 외막 사이와 핵에만 존재합니다. 세포가 세포사멸을 겪으면 미토콘드리아 내막 투과성이 변경되고 Cyt c가 미토콘드리아에서 세포질로 방출됩니다. 본 연구에서는 뇌 허혈-재관류 손상의 쥐 모델을 확립하고, 세포사멸을 겪는 뉴런의 미세형태학적 변화를 면역투과전자현미경으로 나타냈다. 또한, 뇌허혈-재관류 손상 후 미토콘드리아 기질에서 세포질로의 Cyt c 전달을 면역금 표지하는 비전을 보다 정확하게 보여줍니다. 이 프로토콜에 제시된 면역 전달 전자 현미경 기술은 현미경 수준에서 모든 단백질 위치 전이를 시연하는 데 적합합니다.

서론

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2021년 전 세계 질병 부담 연구에 따르면 뇌졸중은 사망 원인 3위이자 장애 조정 수명 4위 원인이었습니다. 1,190만 건의 새로운 뇌졸중 사건이 있었으며, 그 중 허혈성 뇌졸중이 65.3%(780만 건)를 차지했습니다1. 신경 세포 사멸은 괴사 및 세포사멸을 포함한 뇌 허혈 후에 발생합니다. 가장 심하게 영향을 받은 뇌 조직은 이후 괴사성 세포 사멸을 겪습니다. 허혈성 반음영 또는 경색 주위 영역의 뉴런은 몇 시간 또는 며칠 후에 세포사멸을 겪을 수 있습니다2. 생체 에너지 및 대사 기능 외에도 미토콘드리아는 세포사멸의 내재적 경로에서도 중심적인 역할을 합니다 3,4,5,6.

Cyt C는 핵 유전자에 의해 암호화되는 단백질입니다. 정상적인 조건에서 Cyt C는 미토콘드리아의 내막과 외막 사이와 핵에만 존재합니다. 방출에 의해 매개되는 세포사멸 경로는 Bcl-2 계열 구성원의 조절 제어와 관련이 있습니다. 세포사멸에 의해 자극된 후 Bax/Bak 올리고머가 형성되어 미토콘드리아 외막 기공에 삽입되어 미토콘드리아 삼투압의 변화와 막관통 전위의 손실이 발생합니다. Cyt C는 미토콘드리아에서 세포질로 방출되며, 여기서 세포사멸 활성화제1에 결합하여 세포사멸 복합체를 형성하고 프로-카스파제-9를 활성화합니다. 차례로, 카스파제-3 및 카스파제-7이 활성화되어 카스파제 캐스케이드를 시작하고 세포 사멸을 유도합니다7.

투과전자현미경(TEM)은 세포사멸의 여러 단계에서 세포 구조의 변화를 명확하게 관찰할 수 있습니다. 전자 현미경 형태학적 관찰은 세포사멸을 결정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다8. 그러나 미세구조에서 Cyt C의 변화를 관찰할 수 없습니다. 미세 구조에서 특정 단백질을 검출하는 데는 유세포 분석법, 효소 결합 면역흡착 분석법, 효소 결합 면역흡착 분석법, 분광 광도법 및 웨스턴 블로팅과 같은 여러 기술이 있습니다. 그러나 미세 구조에서 단백질의 위치 변화를 정확하게 포착할 수는 없습니다. 콜로이드 금은 크기가 다른 입자를 가지고 있으며 콜로이드 금의 전자 밀도가 높습니다. Immunogold 기술은 면역 전자 현미경의 단일 또는 다중 라벨 국소화 연구에 특히 적합합니다. 고유한 밝은 붉은색에서 어두운 빨간색으로 인해 콜로이드 금은 광학 현미경으로도 관찰할 수 있습니다. 특정 단백질이 면역금으로 표지되면 세포 내 분해능9에서 TEM을 통해 위치 변화를 시각화할 수 있습니다.

이 프로토콜은 면역 투과 전자 현미경(IEM)에 의한 미토콘드리아 Cyt C의 전이를 강조하는 것을 설명합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 IEM을 사용하여 허혈 유발 세포사멸 동안 Cyt C의 세포하 전좌를 시각화하는 것입니다. IEM의 이론적 근거는 Cyt C를 콜로이드 금으로 라벨링하고 TEM9를 사용하여 세포 내 해상도에서 국소화 변화를 시각화하는 것입니다. IEM은 공간 수준에서 단백질의 동적 변화를 관찰할 수 있어 생리학적 및 병리학적 활동을 설명하는 강력한 수단을 제공합니다10.

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프로토콜

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동물 프로그램은 SLAS 윤리위원회의 승인을 받았습니다(IACUC 문제 번호: SYST-2024-018). 여기서, 병원균이 없는 수컷 SD 쥐 6마리(200-220g)를 독립적인 환기 케이지에서 사육하여 실험실 환경을 22-25°C 및 45%-65% 상대 습도로 유지했습니다. 모든 쥐는 이 기간 동안 무료 물과 식이로 1주일 동안 적응 급식을 받았습니다.

1. 중대뇌동맥폐색(MCAO) 모델 확립

  1. 쥐를 무작위로 MCAO 그룹과 가짜 수술 그룹으로 나누고 각 그룹에 3마리의 쥐를 배치합니다. 실험 순서도는 그림 1 을 참조하십시오.
  2. 그림 2의 목록에 따라 이 프로토콜과 관련된 장비를 확인합니다.
  3. 쥐 허혈-재관류 손상의 MCAO 모델을 확립하려면 관내 봉합 절차를 사용하십시오.
  4. 쥐를 수술 전 12시간 동안 물에 접근할 수 있는 상태로 금식시키십시오.
  5. 0.6 L/min의 공기-산소 혼합물에서 2% 이소플루란( 재료 표 참조)으로 SD 쥐를 마취시킵니다. 겸자로 팔다리의 피부를 잘라 적절한 마취를 확인하십시오. 쥐는 수축이나 다리 반사가 없어야 합니다. 완전히 의식을 잃은 쥐를 수술대에 고정하고 동물 체온 유지제를 사용하여 체온을 37°C로 유지합니다. 건조함을 방지하기 위해 수술 중에 눈을 감는 테이프를 붙입니다.
  6. 전기 면도기로 목 주위의 털을 제거하고 베타딘으로 피부를 소독합니다. 수술용 가위로 1.5cm 정중선 목 절개를 하고( 재료 표 참조), 근육 및 혈관주위 근막에 둔기 절개를 시행하고 기관을 노출시켜 우측 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 찾습니다. 감염을 예방하기 위해 수술 도구는 멸균해야 합니다.
  7. ECA의 원위 끝을 6-0외과용 봉합사로 결찰하고 ECA의 근위 끝 주위에 분기점까지 다른 수술용 봉합사를 느슨하게 배치합니다. 미주 신경에 해를 끼치지 않도록 주의하십시오.
  8. 혈관 클립으로 CCA와 ICA를 클립하고 두 개의 수술용 봉합사 사이에 ECA를 작은 절개합니다.
  9. 모노필라멘트 봉합사를 CCA 쪽으로 ECA 내강에 삽입하고 ECA 그루터기 주위에 수술용 봉합사를 조여 관내 봉합사를 고정하고 출혈을 방지합니다. 모노필라멘트 봉합사가 동물의 체중과 일치하는지 확인하여 손상을 최소화하고 동측 반구에서 40%의 목표 경색 부피를 달성하십시오.
  10. ECA의 나머지 부분을 잘라 그루터기를 제거하고 ECA 그루터기가 ICA와 거의 일치하도록 분기점 아래에 배치합니다.
  11. ICA에서 미세혈관 클립을 제거하고 중대뇌동맥의 폐색을 나타내는 가벼운 저항이 느껴질 때까지 봉합사를 계속 전진시킵니다. 이 길이는 일반적으로 약 2cm입니다. 모노필라멘트 주위에 봉합사를 단단히 묶습니다. CCA에서 다른 미세혈관 클립을 제거합니다.
  12. 수술용 봉합사로 절개 부위를 봉합하고 쥐를 회복 케이지에 넣고 허혈 후 최대 2시간 동안 동물을 돌보십시오.

2. 중대뇌동맥 혈류의 회복

  1. 재마취 전에 Longa Score Scale로 신경 점수를 확인하여 3단계에서 설명한 대로 수술의 성공 여부를 평가합니다.
  2. 위와 같이 쥐를 마취하고 절개 부위를 다시 엽니다. CCA에 미세혈관 클립을 놓고 ICA를 통해 봉합사 끝이 보일 때까지 ICA에서 막힌 봉합사를 중간에 빼냅니다.
  3. 관내 봉합사 위치 위의 ICA에 또 다른 마이크로 클립을 놓고 폐색 봉합사를 완전히 제거한 다음 ECA 그루터기를 묶습니다. 24시간 동안 재관류.
  4. CCA 및 ICA에서 클립을 제거합니다. 수술용 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 부프레노르핀(0.05mg/kg, 재료 표 참조)을 피하 투여합니다.
  5. 쥐를 다시 새장에 넣고 물과 으깬 음식을 제공하고 의식을 되찾을 때까지 돌보십시오. 전체 실험 절차 동안 쥐의 체온을 37± 0.5°C로 유지합니다.

3. 신경점수 평가

  1. Longa ScoreScale 11을 사용하여 수술 후 및 재관류 후 24시간 동안 신경학적 결손 점수: (0) 결손 없음; (1) 왼쪽(마비된) 앞발을 완전히 확장하지 못함; (2) 왼쪽으로 원을 그리는 것(마비된 쪽); (3) 왼쪽으로 넘어짐(마비된 쪽); (4) 자발적인 보행 및 의식 감소가 없습니다. (5) 죽었다.
    참고: 위의 표준에 따라 3명의 운영자가 평가되었습니다.

4. 뇌 조직 수집

  1. 신경학적 결손에 점수를 매기고 평가한 후 재관류 후 24시간 후에 뇌 조직을 수집합니다.
  2. 위에서 설명한 대로 쥐를 마취합니다. 머리와 목을 노출시키도록 피부를 자르고 수술용 가위로 경추에서 경추를 자릅니다( 재료 표 참조).
  3. 목 뒤쪽 근육을 분리하고 제거합니다. 구부러진 집게로 두개골을 조심스럽게 제거합니다( 재료 표 참조). 두개골을 분리할 때 뇌 조직이 긁히지 않도록 경막에 주의하십시오. 뇌 조직을 완전히 제거합니다.
  4. 뇌 조직을 4°C로 예냉된 TEM 및 IEM 고정액에 넣고 4°C의 냉장고에 보관합니다.

5. 가짜 작동

  1. 가짜 연산의 경우 폐색이 수행되지 않은 경우를 제외하고 위와 같은 모든 절차를 수행합니다.

6. 초박형 절편 준비 및 이미징

  1. TEM 초박막 절편 준비
    1. 고정: 견인, 타박상, 압출 등의 기계적 손상을 최소화하기 위해 신선한 조직의 샘플링 부위를 결정하고 조직 두께가 2mm를 초과하지 않도록 합니다. 조직 부피가 1mm x 1mm x 1mm를 초과하지 않는지 확인하십시오.
    2. TEM 고정액으로 4°C에서 24시간 동안 고정합니다. 0.1M 인산염 완충액 PB(pH 7.4, 재료 표 참조)에서 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
    3. 고정 후: 실온(25°C)에서 2시간 동안 1% 오스믹산·0.1M PB( 재료 표 참조)를 첨가합니다.
    4. 탈수: 30% 에탄올에서 10분, 50% 에탄올을 10분, 70% 에탄올을 15분, 90% 에탄올을 15분, 무수 에탄올을 15분, 100% 아세톤으로 15분 동안 연속적으로 탈수합니다.
    5. 잇몸 담그기: 용액 에폭시 수지 SPI-Pon 812: 아세톤=1:3 동안 30분, 용액 SPI-Pon 812: 아세톤 = 1:1 동안 30분 동안 조직을 연속적으로 담그십시오( 재료 표 참조).
    6. 중합 및 포매: 시료를 순수 SPI-Pon 812에 37°C에서 밤새 담그고 신선한 SPI-Pon 812로 8시간 동안 교체한 다음 60°C에서 48시간 동안 중합합니다( 재료 표 참조).
    7. 절편: 다이아몬드 나이프로 내장된 블록을 0.8μm 두께로 반얇게 썰고 25°C에서 5분 동안 아미노톨루엔 블루로 염색합니다. 고배율 관찰을 위해 광학 현미경으로 뉴런이 밀집된 영역을 찾아 선택합니다. 90nm 두께의 마이크로톰으로 초박형 절편을 만듭니다. 샘플을 200-Mesh formvar 코팅 구리 그리드에 놓습니다( 재료 표 참조).
    8. 염색 후: 25°C에서 15분 동안 우라닐 아세테이트에 그리드를 염색한 다음 25°C에서 5분 동안 구연산납에 그리드를 염색합니다.
  2. IEM 초박형 절편 준비
    1. 6.1.1-6.1.4단계를 수행합니다.
    2. 잇몸 담그기: 조직을 용액 L. R. White Resin: 에탄올 = 1:3 동안 2시간, 용액 L. R. White Resin: 에탄올 =1:1 2시간 동안 및 용액 L. R. White Resin: 에탄올 = 3:1 2시간 동안 연속적으로 담그십시오.
    3. 중합 및 포매: 샘플을 순수 L. R. White Resin에 4°C에서 밤새 담그고 25°C에서 4시간 동안 신선한 L. R. White Resin으로 교체한 다음 55°C에서 78시간 동안 중합합니다.
    4. 절편화(6.1.7단계에서 수행됨): 내장된 블록을 0.8μm 두께로 반얇게 슬라이스하고 25°C에서 5분 동안 아미노톨루엔 블루로 염색합니다. 광학 현미경으로 조밀하게 채워진 뉴런이 있는 영역을 찾아 선택합니다. 90nm 두께의 초박형 절편을 만듭니다. 샘플을 구리 그리드에 놓습니다.

7. 면역금 라벨링

  1. PBS로 2회, 글리신 완충액으로 1회를 25°C에서 각각 5분 동안 헹구고 소 혈청 알부민(PBS-BSA)의 2% 인산염 완충액을 첨가하고 30분 동안 배양합니다.
  2. 1차 항체(시토크롬 C에 대한 토끼 다클론 항체) 용액에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 1차 항체는 PBS-BSA로 1:50의 비율로 희석됩니다.
  3. PBS로 25°C에서 각각 5분 동안 5회 헹구십시오. 콜로이드 금 표지 2차 항체(Gold-conjugated Goat anti-rabbit IgG) 용액에서 25°C에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체는 PBS-BSA로 1:20의 비율로 희석됩니다( 재료 표 참조).
  4. PBS로 25°C에서 각각 5분 동안 5회 헹구십시오. 증류수로 25°C에서 각각 5분 동안 5회 헹굽니다( 재료 표 참조).
  5. 염색 후: 25°C에서 우라닐 아세테이트에 그리드를 10분 동안 염색한 다음 구연산납에 2분 동안 구연산납에 그리드를 염색합니다( 재료 표 참조).
  6. 초박형 절편을 이미지화하고 80kV의 투과 전자 현미경으로 사진을 찍습니다.

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결과

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neuroscore 평가는 Longa Score Scale에 따르면 MCAO의 성공을 확인하며, MCAO 그룹의 쥐는 적어도 왼쪽으로 원을 그리며 나타났습니다(neuroscore 2). 가짜 수술군의 쥐는 명백한 신경학적 기능 장애를 나타내지 않았습니다(neuroscore 0). 수술 당일 사망률은 관찰되지 않았습니다. 동물의 신경 점수는 표 1에 나열되어 있습니다.

MCAO 그룹의 IEM 분석은 부분적인 미토콘드리아 구조 파괴를 동반한 축소된 핵과 증가된 세포질 전자 밀도를 가진 뉴런을 보여주었습니다. 결정적으로, 면역금 표지된 Cyt c는 현저한 재분포를 나타냈습니다: 가짜 그룹의 우세한 미토콘드리아 국소화와 비교하여 MCAO 샘플은 풍부한 세포질 및 핵 표지와 함께 미토콘드리아 금 입자의 상당한 감소를 보여주었습니다. 미토콘드리아에서 세포질 및 핵으로의 Cyt c의 이러한 공간적 이동은 미토콘드리아 외막 투과화를 직접 시각화하고 뇌 허혈-재관류...

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토론

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급성 허혈성 뇌졸중에서 재관류 요법의 주요 목적은 허혈 부위에 대한 혈액 관류를 회복하는 것입니다. 이제 우리는 정맥 혈전용해술, 혈관내 치료 및 항혈전 요법을 통해 이 목표를 달성할 수 있습니다. 그러나 혈액 관류의 회복은 허혈-재관류 손상으로 이어지고 신경 괴사 및 세포사멸을 악화시켜 신경학적 손상을 초래합니다. 허혈-재관류 동안 미토콘드리아 전자 전달 사슬에서 전자가 비정상적으로 누출되면 다량의 미토콘드리아 활성 산소종이 생성되어 미토콘드리아 막이 손상되고 Cyt c 및 미토콘드리아 DNA가 방출됩니다13. 연구에 따르면 Bax 채널 억제제와 인슐린은 세포 생존 신호 전달을 활성화하고 Cyt c의 세포사멸 방출을 방지하며 신경 보호 및 항세포사멸 효과를 발휘할 수 있습니다14,15.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 쓰촨성 한의학 관리국의 한의학 특별 과학 연구 프로젝트(2021MS414)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 생리 식염수쓰촨 Kelun 제약 유한 회사H20083400
200 메쉬 formvar 코팅 구리 그리드Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO 모노필라멘트베이징 Cinontech Co., Ltd.A4-243250
절대 에탄올청두  켈롱  화학 Co.,Ltd.2023101201
아세톤청두  켈롱  화학 Co.,Ltd.2023120501
동물 마취 시스템Rayward Life Technology Co., Ltd.R500
동물 체온 유지제Rayward Life Technology Co., Ltd.69020
베이킹 테이블심천 Bangqi Chuangyuan 기술 Co., Ltd.CT-946
뼈 전단정밀 과학 도구16102-11
캡슐 매립 금형Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
원심분리기SCILOGEXD3024R
기존 명시야 광학 현미경Zeiss (독일)Primo Star
곡선 안과 겸자 (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.211001
다이아몬드 나이프규조토(스위스)DU4530
해부 겸자Rayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
해부 겸자Rayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
전기 블라스트 건조 오븐Shanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
전기 면도기Yiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
고정액쓰촨 과학자 생명 공학 CO., Ltd.SC0001
유리 슬라이드Nantong Mevid Life Science Co., Ltd.220518001
금 공액 염소 토끼 방지 lgGSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.D111094
지혈 겸자(12.5cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
지혈 겸자(14cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
이소플루란레이워드 라이프 테크놀로지 Co., Ltd.2024071201
LR 화이트 수지천진 Tainuo 과학 기술 유한 회사AGR1281A
구연산 납SPI (미국)GA10701
바늘 홀더 Jiachi 의료 기술 Co., Ltd.10044036898028
사산화오스뮴TED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
시토크롬 c 에 대한 토끼 다클론 항체;  어피니티 바이오사이언스, Ltd.AF0146
쥐베이징 Huafukang 생명 공학 Co., Ltd.110322241102187881
SPI-Pon 812 매립 수지 키트SPI(US)GS02660
StereomicroscopeSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
직선 가위 (10cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
스트레이트 안과용 겸자(10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.211001
수술용 가위Rayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
투과 전자 현미경Hitachi (Japan), Ltd.HT7800
울트라마이크로톰라이카(독일)UC7
우라늄 아세테이트SPI(미국)GS02624

참고문헌

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