동시 무표지 자가형광 다중 고조파 현미경

Summary

이 프로토콜은 레이저 광원 생성, 조직 샘플 준비, 이미징 수행 및 데이터 분석에 대한 세부 정보를 포함하여 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경 기술에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. SLAM은 조직 미세 환경을 조사하기 위해 4개의 상보적인 무표지 대비를 측정하여 비선형 현미경을 발전시킵니다.

Abstract

비선형 광학 현미경은 초단파 레이저 펄스와 내인성 분자의 비선형 상호 작용에서 발생하는 신호를 감지하여 생물학적 샘플을 이미지화합니다. 이 방법을 사용하면 라벨 또는 태그가 없고 비파괴적인 방식으로 세포 내 분해능에서 화학적 및 구조적 식별을 빠르게 수행할 수 있으므로 세포와 조직을 조사할 수 있는 강력한 접근 방식이 가능합니다. 이러한 독특한 비선형 대비에는 다광자 여기 자가형광 및 고조파 생성이 포함됩니다. 이러한 각 대비는 고유한 장점과 한계를 제공하기 때문에 이들의 조합과 시공간 공동 등록은 비선형 광학 현미경의 분석 기능을 향상시키는 보완적인 대비 팔레트를 제공합니다. 따라서 우리 그룹은 생물학적 표본에서 뚜렷한 형태학적, 대사적, 기능적 특징을 식별하는 것을 목표로 동시에 생성된 4개 이상의 비선형 광학 신호를 측정하는 이미징 기술인 SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경을 개발했습니다. 여기에서는 레이저 소스, 펄스 압축 및 현미경을 포함한 기술의 필수 구성 요소에 초점을 맞춘 조직의 SLAM 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 또한 샘플 준비에 대해 논의하고 SLAM 데이터에 대한 데이터 처리 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 제시된 워크플로는 외인성 라벨에 의존하지 않고 인간과 동물 조직 모두의 대사 상태, 배열, 세포 반응 및 구성을 조사하는 데 적합합니다.

Introduction

비선형 광학 현미경은 강렬한 광학 방사선(3 × 10^3V/cm보다 큰 전기장을 가진 빛)에 대한 표본의 반응을 활용하여 유도된 편광(따라서 생성된 신호)이 입사 강도 ^1,2,3에 비선형적으로 의존하는 이미지 대비를 도출합니다. 이러한 다중 대비는 각각 서로 다른 빛-물질 상호 작용에 의해 매개되기 때문에 비선형 현미경은 표본의 형태 및 화학적 환경 모두에 관한 고유한 정보에 동시에 액세스할 수 있습니다 ^1,2,3. 조명과의 선형 상호 작용을 포함하는 전통적인 현미경 기술도 정량적 이미징을 가능하게 하는 반면, 비선형 현미경은 보다 다중 모드 접근 방식을 허용하여 종종 이미징 깊이와 광학 절편을 개선하는 동시에 샘플에 대한 광손상을 줄입니다⁴. ^조직5,6의 수술 중 조직학과 유사한 평가와 같은 생의학 응용 분야의 맥락에서 이 기술은 천연 생체 분자를 직접 조사할 수 있게 하여 외부 마커나 변형 없이 살아있는 세포의 원활한 조사를 용이하게 합니다. 이 접근법은 태그, 라벨⁷, 외인성 분자, 유전적으로 발현된 형광 단백질 또는 나노입자의 사용을 피하며, 이는 광범위한 노동이 필요할 뿐만 아니라 표본의 고유 생화학을 방해하고 표적 세포 또는 조직에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있습니다 ^8,9,10. 따라서, 비선형 현미경 (nonlinear microscope) 은 표본의 화학적 및 구조적 무결성을 변경하지 않고 미세한 구조의 지속적인 이미징을 제공하는 강력하고 진정한 분석 도구 역할을 합니다. 이 기능은 진단 및 약물 발견에서 세포 신호 전달 및 시스템 생물학에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 열어줍니다.

2광자 자가형광(2PAF), 3광자 자가형광(3PAF), 2차 고조파 생성(SHG) 및 3차 고조파 생성(THG)과 같은 다광자 대비는 각각 샘플 특성화에 분석적 이점을 제공합니다. 2PAF는 내인성 플라빈에 의해 생성되며, 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드(FAD)는 생물학적 시스템에서 가장 풍부합니다¹¹. 3PAF는 근적외선 여기를 활용하여 NAD(P)H와 같은 고유 발색단을 시각화하고 UV 관련 광독성 및 감쇠 문제를 우회하면서 대사 이미징을 가능하게 합니다¹². SHG는 섬유 콜라겐(유형 I, II 및 III) 및 단백질 배열 13,14,15,16,17과 같은 비중심대칭 분자 구조를 구체적으로 밝혀 구조적 통찰력을 제공합니다 1. 마지막으로, 인터페이스와 작은 구조적 특징에 민감한 THG는 지질 분포 및 세포외 소포를 이미징하는 데 탁월합니다 18,19,20,21,22.

이러한 각 조영 신호는 연구 그룹에 의해 독립적으로 탐구되어 생물학적 응용을 위한 신뢰할 수 있고 다재다능한 도구로서 다광자 비선형 현미경의 틈새 시장을 확립했습니다 23,24,25,26. 이러한 노력은 혁신적인 기술을 활용하여 조직 형태, 세포 대사, 심지어 알츠하이머병 및 암과 같은 병리의 형태 기능적 특징에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위해 혁신적인 기술을 활용한 2PAF 현미경 발명가에 의해 주도되었습니다²³. 이들의 연구는 궁극적으로 신경과학 분야의 획기적인 응용을 주도했습니다^27,28. 그 후 몇 년 동안 여러 연구자들은 세포에 구조적 지지를 제공하고 암 발병 과정에서 상당한 변화를 겪는 스캐폴드인 세포외 기질의 변화에 대한 SHG의 민감도를 강조했습니다²⁹. 특히, Campagnola et al.14,24,30,31은 SHG 현미경을 통해 고분자 및 초분자 집합체의 시각화를 가능하게 하여 기존의 형광 기반 기술로는 검출할 수 없는 콜라겐의 배열, 농도 및 유형과 같은 세부 사항을 밝힐 수 있음을 입증했습니다. 이러한 결과는 임상 환경에서 실행 가능한 진단 도구로서 SHG 현미경의 잠재력을 강조했습니다. 마지막으로, THG 현미경을 성공적으로 적용하여 설치류의 망막층을 세포내 해상도²⁵에서 시각화하고, 뇌 구조를 매핑하고(³²) 흑색종 세포 침범의 다중 계면 지형을 캡처했습니다(³³).

비선형 현미경의 이러한 역사적 구현은 일반적으로 비선형 신호를 생성 및 수집하기 위해 높은 개구수(NA) 대물렌즈에 결합된 모드 고정 펨토초(fs) 레이저를 포함했으며, 이는 이색성 거울로 대역 통과 필터로 향하고 광전자 증배관(PMT)³⁴로 수집되었습니다. 유사한 구현에도 불구하고 대부분의 응용 프로그램은 하나 또는 기껏해야 두 개의 대비만 획득하고 나머지는 간과하는 데 중점을 두었습니다. 다광자 현미경의 잠재력을 완전히 실현하기 위해 Boppart et al. 먼저 다중 비선형 대비 21,35,36,37의 순차적 획득을 구현한 다음 동시 검출 ^{4,22,38,39,40,41}을 구현했습니다. SLAM(Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic) 현미경으로 알려진 결과 기술은 단일 샷 여기 및 다중 검출을 통해 비선형 2PAF, 3PAF, SHG 및 THG 신호를 공간적, 시간적으로 공동 등록하여 우수한 분석 성능을 달성합니다. 이 4개 채널의 시공간적 공동 국소화는 높은 순위의 기능이 풍부한 데이터⁴²를 제공하여 모션 아티팩트를 제거하고 향상된 이미지 등록을 보장함으로써 순차적으로 획득된 데이터에 비해 이점을 제공합니다. 결과적으로, SLAM은 대사 특성을 효과적으로 특성화하는 광학 환원-산화 비율과 같은 복합 특징의 생성을 가능하게 합니다 43,44,45. 또한 양식 전반에 걸친 신호의 결합 분석은 채널의 상관 관계 및 공동 국소화를 기반으로 추가 기능의 엔지니어링을 용이하게 합니다. 예를 들어, Shiet al. 의약품 생산에 사용되는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 정확하게 분류하는 데 있어 SLAM 현미경의 공국소화 특징의 중요성을 입증했습니다⁴². 이러한 방식으로 SLAM은 현재 다광자 현미경 분야의 최첨단으로 간주되는 것의 토대를 마련하여 해당 분야의 미래 발전을 위한 길을 열어줍니다⁴⁶.

이 프로토콜에서는 SLAM 현미경의 주요 구성 요소(그림 1)를 간략하게 설명하고 구현을 위한 단계별 방법론을 설명합니다. 여기에는 여기 펄스의 생성 및 형성, 대표적인 조직 표본 준비, 이미징 절차, 처리, 결과 데이터의 표시가 포함됩니다. 기성 기술과 확립된 기술을 활용하여 이 프로토콜은 보편적이고 전송 가능하며 여러 실험실에서 유사한 광학 시스템을 사용하여 쉽게 재현할 수 있습니다.

그림 1: 동시 무표지 자가형광 다중고조파(SLAM) 현미경의 광학 설계. 펨토초 레이저는 10MHz의 반복 속도로 370fs 펄스로 1040nm 빛을 출력합니다. 레이저의 강도와 편광은 광자 결정을 펌핑하여 초연속체를 생성하기 전에 신중하게 제어됩니다. 그런 다음 펄스는 펄스 셰이퍼에 의해 압축되어 맞춤형 레이저 스캐닝 현미경(점선 상자)으로 전달됩니다. 이색성 미러 및 대역 통과 필터는 광전자 증배관(PMT) 또는 하이브리드 광검출기(HPD)와 같은 고감도 광자 검출기로 감지되기 전에 샘플에서 생성된 비선형 신호를 분리합니다. 광학 설계는 앞서 설명한 시스템⁽⁴¹⁾에 기초한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

모든 동물 연구는 일리노이 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜 UIUC#23031에 따라 수행되었으며 모든 관련 지침 및 규정을 엄격히 따랐습니다.

1. 광자 결정 섬유(PCF) 절단 및 정렬

1. 섬유 절단기 또는 와이어 절단기를 사용하여 광자 결정 섬유(PCF, 재료 표)의 일부를 15cm가 약간 초과하는 길이로 자릅니다.
   참고: 최소 1.5cm의 길이는 절단하는 동안 PCF를 단단히 고정하는 데 필요하기 때문에 PCF의 각 끝에서 절단됩니다. 본 연구에 사용된 PCF(12cm)의 최종 길이는 일반화된 비선형 슈뢰딩거 방정식⁴⁷ 과 실증적 테스트를 사용한 이전 시뮬레이션을 기반으로 결정되었습니다. 일반적으로 최상의 PCF 길이는 PCF 유형, 펌프 레이저 입력 및 원하는 초연속체에 따라 달라질 수 있습니다.
   주의 : PCF를 절단하는 동안 실험자의 눈과 피부를 보호하기 위해 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 섬유 스크랩은 즉시 날카로운 물 처리 용기에 버리십시오.
2. 섬유 스트리퍼(재료 표) 또는 면도날을 사용하여 PCF의 양쪽 끝에서 약 3cm의 플라스틱 코팅을 벗겨내고 티슈 페이퍼(재료 표)와 100% 메탄올로 잔여 플라스틱을 청소합니다.
3. PCF의 한쪽 끝을 정밀 광섬유 식칼(재료표)의 홀더에 넣고 블레이드를 PCF 끝에서 1.5cm 정렬합니다. 클램프를 조심스럽게 닫고 절단 버튼을 누릅니다.
   알림: PCF 절단에 대한 특정 지침을 포함하여 섬유 절단기의 사용 설명서를 주의 깊게 따르십시오. 섬유 장력과 같은 설정은 각 유형의 PCF에 대해 일관되고 고품질의 절단을 위해 미세 조정이 필요할 수 있습니다.
4. 유리 섬유 가공 워크스테이션(재료 표)에서 통합 현미경(10× 배율)을 사용하여 PCF의 절단면과 측면을 검사하여 절단의 품질이 양호한지 확인합니다(그림 2A,C). 파편(그림 2D), 긁힘(그림 2E)이 있거나 절단된 표면이 평평하지 않고 PCF 길이에 수직이 아닌 경우(그림 2B)를 다시 절단합니다.
   알림: 이 단계와 후속 단계에서는 손상을 방지하기 위해 PCF의 절단된 끝이 표면에 닿지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다.
5. PCF의 두 번째 끝을 절단하여 원하는 최종 길이를 보장합니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 PCF는 12cm로 절단됩니다.
6. 이전 단계와 마찬가지로 PCF의 새로 절단된 끝을 검사합니다(1.4단계 참조). 절단에 결함이 있거나 일관되지 않은 것으로 나타나면 현재 PCF를 폐기하고 새 PCF로 프로세스를 반복하십시오.
7. 3축 스테이지(재료 표)에서 PCF의 입력 끝을 고정합니다. 임시 포스트 또는 마운트로 PCF의 다른 쪽 끝을 단단히 지지합니다.
   알림: clamp전체 조정 중에 PCF가 파손되지 않도록 아직 출력을 제어하십시오.
   주의 : 레이저 노출의 위험을 줄이려면 출력 끝을 지지하고 충분한 빔 블록으로 주변에 두어야 합니다.
8. 입력 전력을 측정하기 위해 PCF 바로 앞의 빔 경로에 광 파워 미터(재료 표)를 배치합니다. 레이저를 켜기 전에 팜토초 레이저(재료 표)가 셔터 1에 의해 차단되었는지 확인하십시오.
   알림: 레이저 사용과 관련된 위험을 이해하려면 항상 필요한 레이저 안전 교육 프로그램을 완료하십시오.
   주의 : 레이저를 작동할 때 사용 중인 레이저의 파장과 출력에 맞게 특별히 평가된 적절한 레이저 보안경을 착용하십시오. 레이저를 작동하기 전에 위험한 표유 반사를 유발할 수 있는 모든 장신구, 시계 및 기타 반사 품목을 제거하십시오.
9. 레이저를 켜고 레이저의 지정된 "콜드 워밍업 시간" 동안 예열합니다. 셔터 1을 열고 파워 미터가 260mW 이하가 될 때까지 편광 빔 스플리터 직전에 반파판(HWP1)을 사용하여 전력을 조정합니다.
   참고: 정렬을 위해 260mW를 사용하는 것은 IR 뷰어 또는 형광 타겟에서 시각화를 위한 밝은 빔을 제공하면서 PCF 손상을 방지할 수 있을 만큼 충분히 낮은 것으로 경험적으로 결정되었습니다.
10. 셔터 1을 사용하여 레이저를 차단하고 파워 미터를 PCF의 출력 끝으로 이동합니다.
11. 레이저의 차단을 해제하고 3축 스테이지를 사용하여 PCF 입력면의 광축을 조정합니다.tage 파워 미터에 신호가 나타날 때까지 일부 빛이 PCF의 코어, 클래딩 또는 플라스틱 코팅에 결합되었음을 나타냅니다. 빔의 초점에 PCF 입력을 배치하는 것이 3축 스테이지의 범위를 벗어나는 경우 레이저를 차단한 다음 PCF를 조정하고 다시 클램핑합니다.
    참고: 적외선(IR) 뷰어 또는 형광 타겟을 사용하여 빔이 집중되는 위치를 시각화할 수 있습니다.
12. 3축 스테이지를 사용하여 PCF의 광축의 한 차원을 조정하여 빛이 결합되는 범위를 찾고 해당 범위의 중간을 계산한 다음 스테이지를 그곳으로 이동합니다. 두 번째 차원에 대해 이 작업을 반복하여 빔을 PCF의 코어에 대략적으로 중심에 둡니다.
    알림: 3축의 μm 눈금 표시tage는 거리를 측정하고 PCF의 중심을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.
13. 결합 효율을 최적화하여 빔을 PCF의 코어에 정확하게 중심에 두고 초점을 맞추는 동시에 반복 순서로 3축 스테이지의 3차원을 반복적으로 조정합니다.
    알림: 파워 미터로 측정한 최대 결합 효율이 셔터 80을 닫을 때 입력 전력의 1%보다 눈에 띄게 낮으면 PCF를 풀고 손상 여부를 검사합니다. 손상된 경우 1.1단계부터 다시 시작하고, 그렇지 않으면 레이저를 차단하고 PCF를 다시 클램프 한 다음 1.11단계부터 정렬을 다시 시작합니다.
14. 셔터 1로 빔을 차단하고 레이저 출력을 1.6W로 높입니다.
    참고: 1.6W의 사용은 시뮬레이션 및 실증적 테스트를 통해 결정되어 PCF의 손상 임계값 미만을 유지하면서 충분히 넓은 초연속체를 생성했습니다.
15. 셔터 1을 열고 다시 한 번 3축 스테이지를 반복적으로 조정하여 PCF 입력 위치를 조정하여 결합 효율을 최적화합니다.
    참고: 경험적으로 최대 효율은 일반적으로 약 80%입니다.
16. 셔터 1을 닫고 PCF의 출력을 포물선 거울의 초점 거리와 대략 일치시킵니다. 포물선 거울의 출력에 빔 블록을 배치합니다.
17. 레이저 출력을 다시 260mW 이하로 줄입니다.
18. 셔터 1을 열고 포물선 거울의 3축 스테이지를 사용하여 포물선 거울의 광축을 정렬하여 빔의 왜곡을 최소화합니다. 다음으로, 초점을 조정하고 원거리에서 빔을 시준합니다.
    알림: IR 뷰어 또는 형광등 타겟을 사용하여 view 출력 빔.
19. 포물선 거울 뒤의 거울을 조정하여 빔이 광학 시스템의 나머지 부분에 정렬되도록 합니다.
    알림: 이 단계를 재현할 수 있도록 영구 뒤집기 정렬 대상 또는 홍채를 설치하십시오.
20. 셔터 1을 닫고 레이저 출력을 1.6W로 높입니다. 셔터 1을 열고 빔 경로가 변경되지 않았는지 확인합니다.
21. 파워미터를 사용하여 펄스 셰이퍼(재료 표)의 출력 전력을 측정합니다. 펄스 셰이퍼(HWP3) 앞에서 반파장판을 회전시켜 펄스 셰이퍼의 전송 효율을 최적화합니다.

그림 2: 광자 결정 섬유(PCF)의 절단된 끝. (ᅡ, ᄂ) 쪼개진 측면의 이미지. (C-F) 쪼개진 얼굴의 이미지. (A) 잘 절단된 PCF는 평평하고 수직인 면을 가지고 있습니다. (B) 각지고 부서진 면을 가진 잘 절단되지 않은 PCF. (C) 깨끗한 면을 가진 잘 절단된 PCF. (D) 표면에 먼지가 있는 잘못 취급된 PCF. (E) 표면에 긁힌 자국이 있는 제대로 절단되지 않은 PCF. (F) 교체된 오래된 PCF. PCF 중앙의 어두운 점에서 볼 수 있듯이 PCF의 코어에 눈에 띄는 손상이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 펄스 특성화 및 최적화

1. 분광계 또는 광학 스펙트럼 분석기(OSA, Table of Materials)를 사용하여 포물선 거울 뒤의 레이저를 측정하여 PCF의 초연속체 생성을 확인합니다.
2. 편광 빔 스플리터(HWP2) 뒤에 반파판을 회전시켜 초연속체의 폭을 최적화합니다.
3. 현미경 자기상관기(재료표)를 켭니다. 소프트웨어를 사용하여 검출기를 내부 검출기로 설정하고 스캔 범위를 5ps로 설정하여 펄스 자기 상관의 전체 너비가 캡처되도록 합니다.
   참고: 펄스 폭이 더 긴 설정의 경우(예: 긴 PCF의 분산으로 인해) 스캔 범위를 적절하게 늘려야 합니다. 강도 자기 상관 측량기로 측정한 펄스 폭은 실제 펄스 지속 시간은 아니지만 여전히 펄스 압축에 유용한 기준 역할을 할 수 있습니다. 펄스 진폭과 위상의 정확하고 완전한 특성화를 위해서는 FROG(Frequency-Resolved Optical Gating)⁴⁸ 과 같은 스펙트럼 분해 기술을 사용해야 합니다.
4. 레이저의 차단을 해제하고 신호가 나타날 때까지 펄스 셰이퍼를 빠져나가는 빔에 자가상관기를 정렬합니다.
   참고: 임시 미러(자기상관기의 입력에 2개, 출력에 2개)를 배치하면 나머지 광학 시스템에 영향을 주지 않고 빔을 자기상관기에 정렬할 수 있습니다.
5. 셔터 2가 닫혀 있는지 확인하고 대물 렌즈에 적절한 침지 매체(예: 물 또는 기름)를 도포합니다(재료 표). 자가상관기 외부 검출기를 현미경 스테이지(재료 표)에 놓고 스테이지를 조정하여 검출기를 대물렌즈 바로 위에 배치합니다.
   참고: 일반적인 현미경 대물렌즈와 달리 SLAM 현미경에 사용되는 권장 대물렌즈는 THG³⁸의 검출을 개선하기 위해 자외선 투과성입니다.
6. 스캐닝 검류계 미러(재료 표)를 켜서 전압을 0으로 설정합니다. 셔터를 열고 IR 뷰어 또는 형광 타겟을 사용하여 빔이 외부 검출기에 도달하는지 확인합니다.
7. 자가상관 검출기를 외부 검출기로 설정합니다. s를 조정하십시오.tage 신호가 나타날 때까지 위치.
   알림: 감지기가 포화되면 중성 밀도 필터를 사용하여 전력을 낮추십시오.
8. 펄스 셰이퍼의 다항식 계수(분산 차수)를 조정하여 자기상관기에서 측정한 펄스 폭을 반복적으로 최소화합니다. 펄스 폭이 감소함에 따라 자기상관기 스캔 범위를 적절하게 줄여 자기상관 함수의 정확도와 시각화를 개선합니다.
   알림: 가우스 피팅으로 측정한 최적의 펄스 폭은 수십 펨토초(fs)여야 합니다.

3. 샘플 준비

참고: 단순화를 위해 이 프로토콜은 생체 외 조직 이미징을 설명합니다. 그러나 SLAM의 무표지 특성으로 인해 생체 내 이미징 절차는 쉽게 적응됩니다³⁸.

1. CO₂ 질식 또는 기타 IACUC 승인 안락사 방법을 통해 동물을 안락사시킵니다.
2. 사후 10분 이내에 표준 부검 절차⁴⁹ 를 사용하여 관심 있는 장기를 수확하고 미리 냉각된 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구어 혈액을 제거합니다.
   참고: 이 연구에서는 간과 폐를 채취했습니다.
3. 분석에 필요한 방향에 따라 블레이드를 사용하여 장기를 수직 또는 수평으로 해부합니다. 조직 구조의 무결성을 유지하기 위해 해부가 정밀하게 수행되었는지 확인하십시오.
4. 페놀 레드가 없는 완전 세포 배양 배지로 채워진 멸균 조직 배양 접시에 조직 조각을 넣습니다. 이미지를 즉시 수집하지 않는 경우 조직을 4°C에서 냉장 보관합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 세포 배양 배지는 10% 태아 소 혈청(FBS), 4mM 글루타민 및 내피 세포 성장 배지 보충제가 보충된 HEPES 완충-Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)였습니다(재료 표). 이 배지는 이미징 지속 시간 동안 신장 조직 샘플에 상주하는 상피 및 내피 세포의 생리적 생존력을 유지하기 위해 신중하게 선택되었습니다⁵⁰.
5. 형광 교정 표준물질을 준비하려면 정전기 방지 계량 보트의 무게에 대한 정밀 저울을 0으로 설정하고 약 5mg의 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 이나트륨 염(FAD, Table of Materials) 또는 5mg의 환원 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 이나트름 염(NADH, Table of Materials)을 측정합니다.
6. 단일 채널 피펫을 사용하여 사전 계량된 FAD 또는 NADH 분말이 포함된 계량 보트에 적절한 부피의 1M HEPES 완충액을 분주하여 5mM 원액을 준비합니다. 분말을 녹이기 위해 위아래로 반복적으로 피펫팅합니다.
7. 원액에서 HEPES 완충액에 1:5 희석하여 1mM 작업 용액을 준비합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 1mM 작동 농도는 검출기 포화를 피하면서 높은 신호를 생성하도록 경험적으로 결정되었습니다.
8. 스톡 FAD 및 NADH 용액을 4°C의 미세 원심분리기 튜브에 보관합니다.
   참고: 용액 표준물질은 며칠 동안 냉장 보관할 수 있지만 각 실험을 위해 새로운 용액을 준비하는 것이 좋습니다.
9. SLAM 현미경 이미지를 수집하기 직전에 조직 샘플을 35mm 유리 바닥 이미징 접시(재료 표)에 넣습니다. 또는 유리 커버슬립을 사용하십시오. FAD 및 NADH 용액을 동일한 접시 또는 커버슬립에 분취합니다.
   참고: 코팅되지 않은 유리 또는 폴리-D-라이신 코팅 유리는 배경 신호가 감소하기 때문에 적극 권장됩니다. 유리 두께가 사용 중인 현미경 대물렌즈에 적합한지 확인하십시오(이 연구에서는 #0을 사용함).

4. SLAM 설정 및 작동

1. PCF에 대한 레이저 입력이 셔터 1에 의해 차단되었는지 확인하고 레이저를 켭니다. 레이저의 지정된 "콜드 워밍업 시간" 동안 레이저를 예열합니다.
   참고: 이 연구에서 레이저에는 30분의 콜드 워밍업 시간이 사용됩니다.
2. 빔 경로에 장애물이 없는지 확인하고 PCF 바로 앞의 빔 경로에 광 파워 미터를 배치합니다. 셔터 1을 열고 입력 전력을 측정합니다.
3. 셔터 1을 닫고 파워 미터를 포물선 거울 뒤의 PCF 출력으로 이동합니다. 셔터 1을 열고 입력 3축 스테이지를 사용하여 PCF 출력을 최대화합니다.
4. PCF를 10분 동안 예열한 다음 출력 전력을 다시 최대화합니다. PCF의 전송을 기록합니다. 변속기가 50% 미만으로 떨어지면 PCF를 교체하십시오.
   참고: SLAM 현미경의 작동 내내 (다음 단계에서) 일관된 데이터를 보장하기 위해 매시간 PCF의 출력 전력을 측정하는 것이 좋습니다.
5. 중성 밀도(ND) 필터 뒤에 파워 미터를 이동하고 필터를 회전하여 샘플에 도달하는 레이저 출력을 제어합니다.
   알림: 측정된 전력에 나머지 광학 부품의 투과율을 곱합니다. 투과율은 대물 렌즈 뒤에 파워 미터를 배치하여 측정합니다. 이 연구에서는 샘플에서 평균 20mW의 레이저 출력을 사용했습니다. 레이저 출력은 샘플 손상 또는 검출기 비선형성을 피하면서 고품질 이미지를 생성하기 위해 주어진 샘플, 이미징 깊이 및 현미경 시스템에 대해 경험적으로 결정되었습니다. 명확한 표준은 없지만, 전형적인 무표지 다광자 이미징은 수십 내지 수백 밀리와트 7,32,33,51,52로 제한된다.
6. 검류계를 켜고 스테이지를 켜십시오. 획득 소프트웨어를 열고 이미징에 필요한 매개변수를 입력합니다.
   참고: 이 연구는 512 × 512 픽셀과 13.65 μs의 픽셀 체류 시간을 사용하여 360 × 360 μm² 시야를 이미지화했습니다. 0.333Hz에서 촬영한 5개의 프레임을 하나의 고품질 프레임으로 평균화했습니다.
7. 이전에 2.5단계에서 사용된 대로 대물렌즈에 적합한 침지 매체를 사용하여 s를 스테이지에 샘플을 놓습니다.
8. 실내 조명을 끄고 커튼을 닫으십시오.
   알림: 감지기 손상을 방지하려면 감지기가 켜져 있거나 감지기 셔터가 열려 있는 동안 실내 조명을 켜지 마십시오.
9. 검출기 전원 공급 장치 및 ampliifiers.
10. 무대 주변의 라이트 박스를 닫습니다.
11. 전자 제어 스위치를 사용하여 감지기 셔터(S3, S4, S5, S6)를 수동으로 엽니다.
12. 현미경 획득 소프트웨어에서 클릭하여 획득 시작 을 클릭하여 SLAM 이미지 수집을 시작합니다. 현미경의 손잡이를 돌려 현미경의 초점을 조정합니다.tage 컨트롤러(재료 표)s가 초점이 맞출 때까지 샘플.
    참고: 유리 커버슬립은 강력한 THG 신호를 생성하며, 이는 현미경 스테이지 컨트롤러에 표시된 스테이지 위치를 사용하여 이미징의 깊이를 정확하게 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 연구에서 촬영한 용액 표준의 모든 이미지는 커버슬립 위 20μm의 초점면에서 촬영되었습니다.
13. 현미경 스테이지 컨트롤러의 조이스틱을 사용하여 샘플에서 원하는 시야를 찾은 다음 중지 및 재설정을 클릭합니다.
    알림: 이미지가 포화되면 4.5단계로 돌아가서 전원을 낮추십시오. 이미지의 신호 대 잡음비가 10 미만인 경우 대신 전력을 조심스럽게 높일 수 있습니다.
14. 저장 탭에서 데이터 저장을 클릭하여 예로 전환한 다음 클릭하여 획득 시작을 클릭합니다. 계속하기 전에 획득이 완료될 때까지 기다리십시오.
15. 이미징 중에 샘플을 변경하거나 조작하려면 검출기 셔터를 닫고 손전등이나 헤드램프를 사용하여 조명을 비추십시오. 샘플이 수정되면 4.10단계로 돌아갑니다.
    참고: 반복성 및 정량 분석을 가능하게 하려면 FAD 및 NADH 용액 표준의 SLAM 이미지를 수집하십시오. 시야, 이미지 크기 및 여기력이 생물학적 샘플에 사용된 것과 일치하는지 확인하십시오.
16. SLAM 이미지 획득을 종료하려면 실내 조명을 켜기 전에 감지기 셔터를 닫고 감지기를 끄십시오.
17. 셔터 1을 사용하여 레이저를 차단한 다음 레이저를 끕니다.
18. 검류계를 끄고 스테이지. 현미경 획득 소프트웨어를 닫습니다.
19. 티슈를 적절하게 폐기하고 작업장을 청소하십시오.

5. 데이터 시각화

참고: 다음 이미지 분석은 ImageJ⁵³ (Table of Materials)과 같은 이미지 분석 소프트웨어 또는 Python 또는 MATLAB과 같은 이미지 분석 기능이 있는 프로그래밍 언어에서 발생할 수 있습니다. 다음 단계에서는 ImageJ를 사용하여 데이터 시각화를 수행하는 방법을 설명합니다.

1. 각 채널의 이미지가 무손실 이미지 형식(예: TIFF 또는 PNG)인지 확인합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 맞춤형 현미경 제어 소프트웨어는 이미지를 TIFF로 자동 저장했습니다. 이미지를 TIFF로 저장하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 파일 > 다른 이름으로 저장 > Tiff를 선택합니다.
2. 조명 표준 이미지를 생성하려면 FAD 및 NADH 용액의 FAD 및 NAD(P)H 채널 이미지를 각각 ImageJ로 엽니다. 각 이미지에 대해 [ Process > Filters] > [Gaussian Blur...]를 선택하고 [Sigma (Radius)] 를 41로 설정한 다음 [확인]을 클릭합니다.
   참고: 이미지를 충분히 매끄럽게 하기 위해 필요에 따라 가우스 필터의 시그마(반경) 를 조정합니다.
3. 고르지 않은 조명을 보정하고 형광 강도를 정규화하려면 샘플의 FAD 및 NAD(P)H 채널 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 [이미지 계산기> 처리]를 선택하고, [이미지1] 에서 샘플 이미지를 선택하고, [작업] 에서 [나누기]를 선택하고, [이미지2] 에서 샘플 이미지의 채널에 해당하는 조명 표준 이미지를 선택한 다음 [확인]을 클릭합니다.
   참고: 이 단계는 시스템 변동성을 수정하고 광학 산화환원 비율(ORR)과 같은 자가형광의 정량적 평가에서 일관성을 유지하는 데 중요합니다.
4. 더 큰 시야 또는 z-스택을 형성하기 위해 여러 이미지를 촬영하는 경우 이미지를 단일 이미지 또는 이미지 스택으로 연결하거나 결합합니다.
5. ORR 이미지를 생성하려면 먼저 FAD 및 NAD(P)H 이미지를 합산합니다. Process > Image Calculator...를 선택하고 Image1 및 Image2에 대해 각각 FAD 및 NAD(P)H 채널 이미지를 선택하고 Operation 에서 Add를 선택한 다음 OK를 클릭합니다. ORR 이미지를 계산하려면 Process > Image Calculator...를 선택하고, Image1 의 경우 FAD 채널 이미지를 선택하고, Operation 의 경우 Divide를 선택하고, Image2 의 경우 FAD와 NAD(P)H의 합계 결과를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
6. ORR 이미지에 컬러맵을 적용하려면 이미지 > 색상 > LUT 편집...을 선택하고 열기를 클릭한 다음 원하는 조회 테이블(.lut) 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 이미지 > 밝기/대비 조정(Adjust > Brightness/Contrast )을 선택하고 원하는 대로 대비를 조정합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 (반전된) CET-I2^54,55 컬러맵과 같은 등광 컬러맵을 사용하는 것이 좋습니다. 이미지에 적용한 후 ImageJ에서 컬러맵을 반전하려면 이미지 > 색상 > LUT 반전을 선택합니다.
7. ORR 이미지에서 특징의 선명도를 향상시키려면 형광 채널의 강도에 따라 밝기를 조정하십시오. 먼저 FAD와 NAD(P)H의 합 결과를 선택하고 공정 > 대비 향상...을 선택하고 정규화 가 선택되어 있는지 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 편집 > 복사 를 선택하여 이 결과를 클립보드에 복사합니다. 그런 다음 ORR 이미지를 선택하고 이미지 > RGB 색상 유형> 선택한 다음 이미지 > HSB 유형(32비트)> 선택합니다. 이미지 하단의 슬라이더를 오른쪽으로 끝까지 이동하여 밝기 채널을 보고 편집 > 붙여넣기를 선택한 다음 이미지 > 유형 > RGB 색상을 선택합니다.
8. SLAM 이미지를 합성으로 시각화하려면 ImageJ에서 4개의 SLAM 채널을 열고 이미지 > 색상 > 병합 채널... C2(녹색)의 경우 SHG 채널 이미지를 선택하고, C5(청록색) 의 경우 NAD(P)H 채널 이미지를 선택하고, C6(자홍색) 의 경우 THG 채널 이미지를 선택하고, C7(노란색) 의 경우 FAD 채널 이미지를 선택합니다. 컴포지트 생성 이 선택되어 있는지 확인하고 확인을 클릭합니다.

Results

SLAM 현미경의 복잡한 다중 채널, 다중 모드 접근 방식(그림 1)은 새로운 사용자가 문제를 해결하고 결과를 이해하기 어렵게 만들 수 있습니다. 첫째, 잘 절단된 PCF는 PCF의 길이에 수직인 평평한 표면이 있는 깨끗한 면(그림 2C)을 특징으로 합니다(그림 2A). 각지고 부서진 절단면(그림 2B)과 긁힌 자국(그림 2E)은 절단이 불량함을 나타냅니다. 그림 2D 에 표시된 PCF 표면의 먼지 또는 파편은 절단 후 PCF의 절단 불량 또는 부적절한 취급을 나타냅니다. 가장 중요한 것은 공기 구멍의 벌집 패턴으로 둘러싸인 작은 중앙 영역인 PCF의 코어에 성공적인 절단 시 파편이나 긁힘이 없어야 한다는 것입니...

Discussion

성공적인 SLAM 이미징을 위해서는 적절한 초연속체를 생성하는 것이 중요하지만 PCF 설정의 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. PCF의 정밀한 절단과 신중한 취급을 보장하는 것은 효과적인 결합, 초연속체 생성을 방해하고 심지어 PCF의 수명을 단축시킬 수 있는 잔해물, 먼지 또는 긁힘이 없는 깨끗한 표면을 유지하는 데 필수적입니다. PCF는 정기적인 교체가 필요하므로 섬유 절단을 연습하고 식칼 설정을 미세 조정하면 최적의 절단을 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, PCF의 정확한 정렬과 각 사용 전 주기적인 재정렬은 원하는 초연속체가 생성되도록 하는 데 중요합니다. 정렬 불량도 PCF를 손상시킬 수 있습니다. PCF에 의한 초연속체 생성은 SLAM 현미경의 중요한 측면이므로 PCF 코어 크기와 길이의 선택은 중요한 고려 사항입니다. PCF가 길수록 더 넓은 초연속체를 생성할 수 있습니다. 그러나 출력 전력이 감소하고, 분산이 증가하고, 설치가 복잡해지고, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3축 스테이지	토르랩스	MAX316	중단.
35mm 유리 바닥 이미징 접시	매텍	P35G-0-14-C	코팅되지 않은 #0 커버 유리.
DMEM	깁코	21063029	고포도당, HEPES, 페놀 레드 없음.
내피 세포 성장 배지 보충제	프로모셀	C-39210	송아지 태아 정청을 생략합니다.
FemtoTrain 펨토초 레이저	스펙트럼 물리학	1040-5	평균 전력: >5.0W, 펄스 에너지: >500nJ, 파장: 1040nm ± 8 nm, 반복 속도: 10 MHz, 펄스 폭(FWHM): < 220 fs.
태아 소 세럼	사이티바	SH30071.03	HyClone 특성화.
섬유 스트리퍼	토르랩스	T10S13 시리즈
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 이나트륨 염 수화물	시그마-알드리치	F6625
검류계 거울	케임브리지 기술	6215H	중단.
유리 가공 워크스테이션	비트란	GPX3800
이미지J	위스콘신 대학교 매디슨의 Eliceiri 연구실	버전 2.16.0	피지 배포.
킴와이프 티슈 페이퍼	킴벌리-클라크 프로페셔널	34120
L-글루타민	사이티바	SH30034.01
현미경 스테이지	응용 과학 기기	FTP-2050
현미경 스테이지 컨트롤러	응용 과학 기기	MS-2000-500-UDSW
현미경 자가상관기	Angewandte Physik und Elektronik GmbH	카르페
대물 렌즈	올림푸스	XLPLN25XWMP2	침수, 25X 배율, 1.05 NA.
광 파워 미터	뉴포트	919P-003-10	600 - 1700 nm.
광학 스펙트럼 분석기	토르랩스	OSA202C
광자 결정 섬유	NKT 포토닉스	LMA-PM-15 NKT	큰 모드 영역, 편광 유지. 코어 직경: 15 & micro;m.
정밀 광섬유 식칼	후지쿠라	CT-101 시리즈
펄스 셰이퍼	바이오포토닉스 솔루션 Inc.	펨토조크-D	중단.
& 베타 ; - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴 클레오티드, 환원 된 이나트륨 염 수화물	시그마-알드리치	10128023001