이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

2025년 7월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

이 논문에서

요약

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

난자형성(Oogenesis)과 초기 배아 발달은 모계에서 유래한 mRNA와 단백질에 결정적으로 의존합니다. 이러한 모계 요인을 제거하려면 암컷 제브라피시에서 동형접합 돌연변이가 필요하며, 이는 종종 모계 돌연변이 배아의 획득을 방해하는 치명적이거나 불임 표현형을 초래합니다. 이전 연구에서는 난모세포 특이적 게놈 편집을 통해 접합자 치사율을 우회하는 빠른 접근 방식을 도입했습니다. 그러나 이전에 보고된 cas9 전이유전자는 불안정성을 보이며 다음 세대에 걸쳐 점진적인 침묵을 겪습니다. 또한, 이 라인에서 zpc:cas9 카세트 옆에 있는 Tol2 전이 가능한 요소의 존재는 현재 제브라피시에서 가장 효율적인 형질전환 시스템인 Tol2 시스템을 사용한 추가 sgRNA 형질전환 가능성을 방해합니다. 따라서 안정적이고 강력한 난모세포 특이적 Cas9 발현을 보장하는 Tol2가 없는 제브라피시 계통이 절실히 필요합니다. 여기에서는 이 요구 사항을 해결하는 rbm24a 유전자 자리에서 zpccas9 knock-in이 있는 라인을 제시합니다. 이 향상된 도구를 사용하여 우리는 제브라피시 모델 내에서 접합적으로 치명적인 돌연변이 표현형을 가진 유전자의 모계 돌연변이를 빠르게 생성하기 위한 파이프라인을 제공합니다.

서론

척추동물의 초기 배아 발달은 난자 내에 저장된 RNA와 단백질에 크게 의존하며, 이를 통틀어 모계 요인(maternal factor)이라고 합니다. 이러한 모계 산물은 주로 감수 분열 I 1,2,3의 디플로텐 단계에서 합성됩니다. 이들의 기능적 역할을 조사하기 위해서는 난모세포의 동형접합 돌연변이만이 이러한 모계 인자를 완전히 고갈시킬 수 있기 때문에 동형접합 돌연변이 암컷 개체를 생성하는 것이 필수적입니다. 그러나 접합 동형접합 돌연변이가 치사율 또는 불임성을 초래할 때 이러한 동형접합 돌연변이 암컷을 얻는 것은 어려워집니다 4,5. 이것은 접합체, 치명적 또는 불임 유전자에 의해 암호화된 모계 산물의 기능을 밝히는 데 상당한 장벽을 제기합니다. 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 몇 가지 혁신적인 접근 방식이 개발되었습니다 6,7,8. 그럼에도 불구하고 이러한 기술은 종종 실험 일정이 길어지거나 상당한 기술적 문제로 어려움을 겪습니다.

이전 연구에서 우리는 또한 단일 세대 내에서 모계 돌연변이의 생성을 허용하는 조건부 녹아웃 전략을 개발했습니다 9,10. 이 시스템은 Tg(zpczcas9) 형질전환 제브라피시와 3-4개의 sgRNA 발현 카세트를 보유한 I-SceI 형질전환 플라스미드 시스템의 두 가지 핵심 구성 요소로 구성됩니다. 이 시스템을 활용하여 난모세포 9,10에서 모계 인자의 조건부 녹아웃을 성공적으로 달성했지만 여전히 개선의 여지가 있습니다. 첫째, 이전에 보고된 Tg(zpczcas9) 형질전환 계통의 게놈 편집 효율은 Cas9의 형질전환 발현을 유지하는 데 안정적이지 않았습니다. 더욱이, 이 형질전환 라인은 Tol2 전이 시스템을 사용하여 생성되었기 때문에, Tol2 전위는 sgRNA 발현 카세트의 통합에 더 이상 사용될 수 없습니다. 대신, I-SceI-매개 형질전환(transgenesis)이 필요합니다. 그러나 이 접근 방식은 Tol2보다 효율성이 떨어지고 세대 간 침묵에 더 취약합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 강력하고 안정적인 난모세포 특이적 Cas9 발현을 가능하게 하는 knock-in line을 확립하고자 했습니다. 이 라인을 통해 제브라피쉬에서 sgRNA 발현 플라스미드의 고효율 전달을 위해 Tol2 transposon 시스템을 사용할 수 있습니다. 인트론 기반 게놈 편집 전략11을 활용하여 rbm24a 유전자의 마지막 인트론에서 통합 부위와 함께 zpccas9 knock-in line을 성공적으로 생성했습니다(그림 1A, B). 우리는 두 가지 독립적인 관찰을 기반으로 이 유전자 자리를 모계 이식유전자 발현을 위한 후보 게놈 세이프 하버로 선택했습니다. 1) 무해한 통합(harmless integration): 우리의 최근 연구에서12, 이 부위에서 외인성 DNA를 운반하는 동형접합 넉인(homozygous) 넉인 피쉬(knock-in fish)는 완전히 생존 가능하고 생식력이 있는 상태를 유지했다. 2) 강력한 발현: zpccas9 카세트가 동일한 유전자 자리에 삽입되었을 때 Cas9이 높은 수준으로 발현되어 세대에 걸쳐 일관되게 강력한 게놈 편집 효율성을 보여주었습니다(그림 1C). 핵심 생식 플라즘 구성 요소인 RNA 결합 단백질 Rbm24a는 Buc와 협력하여 생식 플라즘 RNA를 생식 과립에 통합합니다. 결과적으로, 모계의 Rbm24a 결핍은 원시 생식세포(PGC)의 완전한 부재로 이어집니다12. 여기서, 최근 연구의 예시로 rbm24a를 표적으로 삼음으로써, 접합체 치사 유전자에 대한 모계 돌연변이를 생성하고 특성화하기 위한 개선된 비디오 프로토콜을 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

실험은 ARRIVE 지침에 따라 수행되었으며 산둥 대학의 기관 동물 관리 위원회(승인 번호)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. SYDWLL-2021-15). 이 프로토콜의 개요는 그림 2에 나와 있습니다.

1. rbm24a-RFP zpc:cas9 knock-in 라인의 생성

  1. knock-in을 위한 sgRNA 스크리닝
    1. knock-in sgRNA 후보 물질 선정 및 합성
      1. rbm24a의 마지막 인트론 염기서열을 CRISPRscan(http://www.crisprscan.org)에 제출하여 높은 CRISPRscan 점수(on-target efficiency 나타남)와 낮은 CFD score(off-target effect 반영)를 모두 나타내는 최적의 sgRNA 후보 물질을 식별합니다. 각 sgRNA(sgRNA oligo)에 대해 긴 올리고를 합성합니다.
        참고: CRISPRscan은 T7 promoter sequence, 20-nucleotide sgRNA target sequence, 16-nucleotide sgRNA scaffold sequence를 포함한 필수 기능 요소를 포함하는 sgRNA oligo를 생성합니다. 여기에서는 5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG 서열을 가진 sgRNA를 선택했습니다.
        GTgttttagagctagaa-3' (T7 프로모터 소문자, 20-nt 가이드 대문자, 부분 스캐폴드 소문자).
      2. sgRNA 합성을 위한 DNA template을 얻으려면 50 μL의 Fill-in PCR 반응을 준비합니다: 2x Taq Master mix 25 μL; sgRNA 프라이머 (10 μM) 2 μL; 범용 프라이머 (10 μM) 2 μL; 탈이온화된 H2O 21 μL.
        참고: 모든 프라이머의 서열은 재료 표에 나와 있습니다.
      3. 완전히 혼합하고 반응 혼합물을 사전 프로그래밍된 열 순환기로 옮기고 다음과 같이 사이클링 매개변수를 사용하여 증폭 프로토콜을 시작합니다: 94°C에서 3분 동안 1사이클, 35사이클(94°C에서 15초, 50°C에서 15초, 72°C에서 30초) 및 72°C에서 5분 동안 1사이클.
      4. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 sgRNA 합성을 위한 반응 혼합물을 준비합니다. 증류수 11 μL, ATP/GTP/CTP/UTP 2 μL(각 10 mM), PCR 산물 10 μL, 10x RNA 중합효소 반응 완충액 4 μL, T7 RNA 중합효소 2 μL, RNase 억제제 1 μL의 순서로 모든 성분을 결합합니다. 총 반응 부피는 40 μL입니다. 가볍게 쳐서 철저히 혼합하고 간단한 원심분리를 수행합니다.
      5. 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다. DNase I 1 μL를 넣고 가볍게 튕겨 혼합한 후 간단히 원심분리합니다. DNA 템플릿을 완전히 제거하기 위해 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
      6. 5μL의 실리카 마그네틱 비드를 추가한 다음 120μL(4배 용량)의 RNA 결합 완충액(Gu-HCl 1 M 9.55g, Tween-20 0.05%, 에탄올 100mL)을 추가합니다. 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 실온에서 1,500rpm으로 10분 동안 써모믹서로 배양합니다.
      7. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
      8. 400μL의 90% 에탄올과 와류를 첨가하여 비드를 재현탁합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액을 버립니다.
      9. 에탄올 세척 단계를 반복하여 총 두 번의 세척 과정을 완료합니다.
      10. 잔류 상층액을 제거하고 열린 튜브를 50°C 가열 블록에서 10분 동안 자연 건조합니다.
      11. 15μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 실온에서 1,500rpm의 온도 혼합기로 5분 동안 배양합니다.
      12. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 용출액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      13. 98 bp sgRNA band를 agarose 전기영동으로 확인합니다. 마이크로 분광 광도계와 아가로스 전기영동으로 RNA 농도를 정량화하고 명확하게 라벨링한 후 -20°C에서 보관합니다.
    2. sgRNA 효율 테스트
      1. sgRNA의 실제 효율을 확인하려면 미세주입을 위해 리보핵단백질(RNP) 복합체를 준비합니다. 각 sgRNA 1 μL(최종 농도 50 ng/μL)와 Cas9 단백질 1 μL(최종 농도 100 ng/μL)를 피펫팅으로 얼음 위에서 혼합합니다. 미세주입을 통해 1세포 단계에서 각 배아에 2 nL의 RNP 복합체를 전달합니다.
      2. 수정 후 24시간(hpf)에 주입된 Cas9 RNP 각각에 대해 10개의 배아를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집하고 여분의 배지를 조심스럽게 제거합니다. 100 μL의 50 mM NaOH(배아당 10 μL)를 첨가하고 가열 블록 또는 열순환기를 사용하여 95 °C에서 15분 동안 배양합니다. 10 μL의 1 M Tris-HCl (pH 7.0)을 첨가하여 용해물을 중화시킵니다.
      3. 중화된 배아 용해물을 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 직접 사용합니다. 양쪽에 ≥100bp 플랭크 서열로 타겟 부위를 포함하는 단편을 증폭하도록 프라이머를 설계합니다. 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물을 확인하고 필요한 경우 겔 추출을 사용하여 정제합니다. 증폭된 산물의 Sanger 염기서열분석을 수행합니다.
      4. CRISPR 편집 효율성 정량화: ICE(Inference of CRISPR Edits) 분석 도구(https://ice.synthego.com/#/)를 사용하여 염기서열분석 크로마토그램을 분석합니다. 웹 사이트에서 권장하는 프로토콜에 따라 주입되지 않은 대조군 샘플에 대한 편집 효율성을 표준화합니다.
  2. knock-in을 위한 donor plasmid의 구축
    1. 확립된 TEDA(T5 엑소뉴클레아제 DNA 어셈블리) 방법론을 사용하여 결찰 반응13을 수행합니다.
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9 넉인 공여체 플라스미드 구축을 위해 3-프래그먼트 Gibson 조립 전략을 사용합니다. 첫 번째 단편은 rbm24a 정지 코돈의 바로 상류에 있는 게놈 영역을 포함하는 1,704bp 5' 상동성 암을 포함합니다. 두 번째는 GFP 코딩 시퀀스입니다. 세 번째는 rbm24a 정지 코돈의 하류에 2,274 bp 3' 상동성 암을 포함하고, 그 다음에는 rbm24a 3'-UTR의 원위부 3' 방향에 위치한 zpccas9 발현 카세트를 포함합니다.
    3. Gibson 어셈블리를 사용하여 세 개의 조각을 pBluescript SK- 벡터의 ApaI 사이트로 조립합니다.
    4. 제한 분해 및 Sanger 염기서열분석을 통해 최종 플라스미드를 검증합니다.
  3. Microinjection 및 early integration을 통한 배아 선택
    1. 뉴클레아제가 없는 물에 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 넉인 공여체 플라스미드 12pg, sgRNA 200pg 및 재조합 Cas9 단백질 600ng을 포함하는 주사 혼합물을 준비합니다. 표준 미세주입 기술을 사용하여 혼합물 1-2 nL를 단세포 단계 배아의 배반구판에 전달합니다. 30hpf에서 rbm24a의 내인성 발현을 모방한 RFP 발현 패턴을 위해 배아를 스크리닝하며, 이는 분열 단계 초기에 donor plasmid의 통합을 나타냅니다. 수정체, 심장, 골격근 및 내이 유모 세포에서 RFP 신호를 보인 번식을 위한 조기 통합이 있는 이러한 배아를 선택합니다(그림 3A, B).
      참고: 주입 전에 페놀-클로로포름 추출로 플라스미드를 정제하여 플라스미드 준비 중에 도입된 잔류 RNase를 제거합니다.
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9 교차에서 유래한 F1 세대 배아에서 모계 Rbm24a-RFP의 발현 패턴을 분석합니다(그림 4A,B).
  4. Cas9 단백질 발현 및 편집 효율 평가
    1. Cas9 편집 효율성을 평가하기 위해 200pg bmp2b sgRNA를 1세포 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 배아에 마이크로주입합니다(그림 1C,D).
    2. Cas9 편집의 안정성을 평가하기 위해 배측화 표현형을 나타내는 배아의 수를 정량화하고 Sanger 염기서열분석 분석을 수행하여 편집 효율성을 평가합니다(그림 5A-D).
      참고: 3세대에 걸쳐 Cas9 발현의 감소를 감지하지 못했지만 이 knock-in line의 모든 세대에서 편집 효율성을 확인하는 것이 좋습니다.

2. rbm24a-RFP KI zpc cas9 라인에서 sgRNA 형질전환

  1. rbm24a knockout을 위한 sgRNA를 선택하고 합성합니다.
    1. step 1.1.1에 설명된 대로 sgRNA candidate를 선택하고 합성합니다.
      참고: 매우 효율적인 기능 손실을 보장하기 위해 코딩 영역의 앞쪽 절반을 표적으로 하는 sgRNA를 선택하는 것이 중요합니다. 또한 C-말단 영역에서 중요한 단백질 도메인이 확인되면 코딩 염기서열의 3' 말단을 표적으로 하는 sgRNA도 허용됩니다. CRISPRscan은 T7 promoter sequence, 20-nucleotide sgRNA target sequence, 16-nucleotide sgRNA scaffold sequence를 포함한 필수 기능 요소를 포함하는 sgRNA oligo를 생성합니다. 효과적인 모계 유전자 knockout을 달성하려면 3-4개의 고효율 sgRNA를 안정적으로 식별할 수 있도록 6-8개의 후보 물질을 설계하는 것이 좋습니다. 자세한 프로토콜은 이전 논문9에서 찾을 수 있습니다.
    2. 1.1.2단계에서 설명한 대로 초기 제브라피시 배아에서 sgRNA 효율을 테스트합니다.
      참고: 편집 효율이 50%를 초과하는 sgRNA가 선호됩니다.
  2. sgRNA 발현 형질전환 플라스미드의 구축
    참고: 편집 효율성을 극대화하려면 각각 최소 36 bp로 분리된 4개의 서로 다른 비중첩 sgRNA를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 sgRNA는 개별적으로 pU6x:sgRNA 벡터(pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4)로 결찰되며, 각 벡터는 3' scaffold와 함께 고유한 U6 promoter를 보유하고 있습니다14. 그 후, 각각 sgRNA 발현 카세트를 포함하는 이 4개의 U6 벡터는 Golden Gate ligation을 통해 pGGDestISceIEB-4sgRNA destination vector로 조립됩니다.
    pU6x:sgRNA 벡터는 순차적으로 선택해야 합니다. 예를 들어, 3개의 sgRNA를 클로닝하는 경우 벡터 #1에서 #3을 사용합니다. 4개의 sgRNA를 클로닝하는 경우 벡터 #1에서 #4를 사용합니다.
    1. sgRNA 타겟 염기서열을 pU6x:sgRNA 벡터로 서브클로닝
      1. 선택된 sgRNA의 순서에 따라 어닐링 프라이머를 합성합니다. 전방 프라이머: TTCGN(19); 리버스 프라이머: AAAC[N(19)]*. 여기서 GN(19)는 sgRNA의 20 nt 타겟 염기서열입니다. [N(19)]*는 3' 방향으로 sgRNA 타겟의 19 nt의 역보체 서열을 나타냅니다.
      2. 프라이머를 어닐링하려면 다음과 같이 혼합물을 준비합니다 : 1 μL의 정방향 프라이머 (100 μM), 1 μL의 역방향 프라이머 (100 μM), 2 μL의 10x 완충액 및 16 μL의 탈 이온화 된 H2O를 사용하여 총 부피 20 μL에 도달합니다.철저히 혼합합니다.
        참고: 모든 프라이머의 서열은 재료 표에 표시되었습니다.
      3. 혼합물을 thermocycler에 두고 다음과 같이 프로그램을 실행하십시오: 15 분 동안 95 °C에 1 주기는, 그 후에 0.1 °C/s의 통제된 램프 비율에 50 °C에 점차적으로 냉각하고, 10 분 동안 이 온도를 유지합니다; 4°C에서 10분 동안 유지합니다.
      4. 어닐링된 sgRNA 타겟 염기서열을 pU6x-sgRNA 벡터로 클로닝하기 위한 반응 혼합물을 다음과 같이 준비합니다: 1 μL의 10x 제한 효소 완충액, 1 μL의 10x T4 리가제 완충액, 0.3 μL의 T4 리가제, 0.3 μL 의 BsmBI, 0.2 μL 의 PstI, 0.2μL의 Sal I, 1 μL의 어닐링된 sgRNA 프라이머, 5 μL의 pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) 및 1 μL의 탈이온화된 H2O, 최종 반응 부피를 10 μL로 조정.
      5. 반응 성분을 철저히 혼합하고 다음 thermocycler 프로그램을 실행하십시오 : 6 사이클 (20 분 동안 37 ° C, 15 분 동안 16 ° C), 10 분 동안 37 ° C에서 1 사이클, 15 분 동안 55 ° C에서 1 사이클, 15 분 동안 80 ° C에서 1 사이클.
      6. 형질전환을 위해 DH5α 수용 세포를 얼음에서 해동하고, 튜브를 튕겨 50μL의 세포를 결찰 혼합물과 부드럽게 혼합한 다음 얼음 위에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 42°C에서 60초 동안 열 충격을 가한 다음 즉시 튜브를 다시 얼음으로 2분 동안 옮깁니다. 형질전환된 세포를 100μg/mL 스펙티노마이신이 함유된 LB 플레이트에 펴고 콜로니 형성을 허용하기 위해 최소 16시간 동안 37°C에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다.
      7. 콜로니 PCR의 경우, 피펫 팁으로 각 박테리아 콜로니를 선택하고 10 μL의 탈이온화된 H2O로 이동합니다. 다운스트림 PCR 분석을 위한 완전한 분산을 보장하기 위해 위아래로 피펫팅하여 콜로니를 철저히 재현탁합니다. 5 μL의 2x Taq Mix, 2 μL의 콜로니 액체, 0.4 μL의 M13 forward primer (10 μM) 및 reverse primer (10 μM) 및 2.2 μL의 deionized H2O를 결합하여 PCR 반응 혼합물을 준비하여 총 반응 부피 10 μL를 산출합니다.
      8. 아래와 같이 프로그램을 실행합니다: 1°C에서 94분간 3사이클, 23사이클(94°C에서 15초, 55°C에서 15초, 72°C에서 30초), 1°C에서 5분 동안 5사이클.
      9. PCR 산물을 전기영동에 적용합니다. 예상 크기가 482bp인 positive colony를 선택합니다(그림 6).
      10. 나머지 콜로니 액체를 100μg/mL 스펙티노마이신이 보충된 3mL의 LB 배지에 접종합니다. 37 ° C에서 200 rpm으로 14 시간 동안 흔들면서 배양하십시오.
      11. 제조업체의 지침에 따라 Plasmid Miniprep Kit를 사용하여 박테리아 배양에서 플라스미드를 추출합니다. 마이크로분광광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 측정합니다.
      12. 추출된 플라스미드를 M13 forward primer를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 실시합니다. sgRNA 타겟의 올바른 삽입을 확인하기 위해 sequencing 결과를 예상되는 U6 벡터 맵에 정렬합니다.
    2. pGGDestEB-4sgRNA 벡터 조립
      참고: 그림 7에서 볼 수 있듯이 4개의 U6 기반 sgRNA 발현 카세트는 Golden Gate 어셈블리를 사용하여 pGGDestEB-4sgRNA 백본 벡터에 효율적으로 연결할 수 있습니다. ligating할 sgRNAs의 수에 따라 벡터의 사용이 결정됩니다. 예를 들어, 4개의 sgRNA 카세트를 조립할 때 pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 및 pGGDestEB-4sgRNA를 사용합니다.
      1. 2 μL의 10× 제한 효소 완충액, 2 μL의 10x T4 DNA 리가제 완충액, 각 pU6x:sgRNA#x 구조체 100ng, pGGDestIEB-4sgRNA 목적지 벡터 50 μL, BsaI 1 μL, T4 DNA 리가제 1 μL 및 탈이온수를 포함하는 20 μL의 Golden Gate 반응 혼합물을 준비하여 최종 부피를 20 μL로 조정합니다.
      2. 37°C에서 20분, 16°C에서 15분씩 3사이클을 통해 Golden Gate 어셈블리 반응을 실행한 다음 효소 불활성화를 위해 80°C에서 최종 15분 배양으로 완료합니다.
      3. 형질전환하려면 반응 혼합물 5μL를 수용 세포로 옮기고 암피실린이 보충된 LB 배지에 플레이트합니다.
      4. 삽입물의 존재를 확인하기 위해 Dest forward 및 Reverse primers( Table of Materials를 참조하십시오)를 사용하여 콜로니를 스크리닝하여 콜로니 PCR을 수행합니다(그림 8).
        참고: 2,415bp의 메인 밴드와 래더링 패턴이 양성 클론에 대해 존재해야 합니다.
      5. positive colony에서 plasmid를 추출하고 각 sgRNA target에 대해 Dest forward 및 Reverse primer를 사용하여 염기서열분석을 수행합니다.
      6. 검증을 위해 Sanger 염기서열분석 결과를 예측된 벡터 염기서열분석(Predicted vector sequence)에 정렬합니다.
  3. 형질전환 설립자의 미세주입 및 사전 심사
    1. 동형접합 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 물고기에 의해 산란된 배아를 수집합니다.
    2. 1 μL의 pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA(12 ng/μL)와 1 μL의 Tol2 transposase mRNA (50 ng/μL)를 결합하여 주입 혼합물을 준비합니다.
      참고: 주입 전에 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 플라스미드를 정제하여 플라스미드 추출 과정에서 유입되었을 수 있는 잔류 RNase를 제거합니다. 플라스미드 및 Tol2 mRNA를 순수에 직접 희석하였다.
    3. 15cm 접시에 유리 커버슬립을 넣습니다. 커버슬립의 가장자리를 따라 배아를 정렬하고 피펫을 사용하여 여분의 물을 조심스럽게 제거합니다. 혼합물 2nL를 각 1 세포 단계 배아의 배반구에 주입합니다. 주사 후 배아를 푸른 물로 부드럽게 헹구고 신선한 접시에 옮깁니다. 마지막으로 접시를 28°C 인큐베이터에 넣어 재배합니다.
      참고: 다음과 같이 메틸렌 블루 작업 용액(블루 워터)을 준비합니다.: 180g의 바다 소금을 증류수 2.7L에 녹이고 살균하여 100x 해수 스톡을 만듭니다. 이 스톡을 멸균 증류수로 200배 희석하여 해수의 1/100배를 얻습니다. 이 1/100x 해수 1L에 5%(m/v) 메틸렌 블루 원액 10μL를 추가하여 최종 작업 용액을 준비합니다.
    4. 24hpf에서 강력하고 유비쿼터스 BFP 발현을 보이는 배아를 선택합니다. 4dpf에서는 강력한 형질전환 형광 신호를 유지하는 신호만 높입니다(그림 9).

3. 이중 형질전환 배아의 특성화

  1. 이중 형질전환 배아(double transgenic embryos) 표현형 분석
    1. 야생형 수컷과 짝짓기를 하는 모자이크 형질전환 설립자 암컷의 배아를 수집합니다.
    2. 형광 입체현미경(steromicroscope)을 통해 단세포 단계에서 BFP 양성(BFP+) 배아를 채취합니다.
    3. BFP+ 배아에서는 나타나지만 BFP- 배아에서는 나타나지 않는 발달 결함을 식별합니다.
    4. 4°C에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 배아를 하룻밤 동안 고정합니다. 필요한 경우 전체 마운트 in situ hybridization, 면역형광 염색 또는 기타 조직학적 분석을 수행합니다.
      참고: GFP 또는 BFP 양성 sgRNA 발현 배아에서만 독점적으로 발생하는 결함 있는 표현형만 신뢰할 수 있습니다. 결론은 신중하게 도출되어야 하며, 모계 돌연변이 표현형은 10개 이상의 사례로 입증되어야 합니다.
  2. 모계 돌연변이 배아의 유전형 분석
    참고: M 식별을 위해rbm24a 배아, 형광 현미경에서 Rbm24a-RFP가 없으면 쉽게 포착할 수 있습니다. 대조적으로, 다른 유전자의 모계 돌연변이를 식별하는 것은 주로 접합 게놈 활성화 이전의 세포 흡인 전략에 의존한 다음, 수집된 세포에서 모계 mRNA의 RT-PCR 분석(그림 10).
    1. 세포 흡인
      1. 1.5% 아가로스 용액을 1/3x Ringer's buffer에 용해시키고 녹을 때까지 끓여서 준비합니다. 용액을 90mm 페트리 접시에 붓고 용융된 아가로스에 몰드(WPI, z-molds)를 삽입합니다. 응고되면 금형을 부드럽게 제거하여 바로 사용할 수 있는 플레이트를 만듭니다.
      2. 유리 모세관과 풀러를 사용하여 용융 밀봉 바늘을 만듭니다. 최적의 세포 흡인 바늘을 위해 두 개의 가벼운 무게와 가열 전력을 Lv1: 60 및 Lv2: 90으로 설정하고 Step2 절차를 선택합니다. 뾰족한 핀셋으로 모세관 팁을 다듬고( 재료 표 참조) 30-40 μm의 개구부 직경을 얻습니다. 그런 다음 마이크로포지를 사용하여 바늘 끝에 스파이크를 만들어 침투를 돕고 배아의 손상을 최소화합니다.
      3. 추정되는 암컷 설립자를 야생형 제브라피시와 짝짓기하고 배아를 수집합니다. 단세포 단계에서 BFP 양성 배아를 분리합니다.
      4. 3 hpf에서 1/3x Ringer's buffer에 1 mg/mL Pronase를 넣고 10분 동안 부드럽게 피펫팅하여 배아를 배양하고, 1x 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 1/3x Ringer's buffer로 가득 찬 아가로스 플레이트에 배아를 조심스럽게 놓습니다. 배반구가 모세혈관 끝을 향하도록 배아의 방향을 변경합니다.
        참고: 배아는 융모막의 보호 없이는 매우 약하기 때문에 조심스럽게 이식하는 것이 중요합니다. 매체의 표면에 닿지 않도록 하십시오!
      5. 마이크로인젝터를 사용하여 모세혈관 작용으로 인한 흡인을 보상하는 평형압을 조심스럽게 줄임으로써 각 배아에서 20-40개의 세포를 흡인합니다15. 평형 압력을 증가시켜 PCR 튜브의 개구부 가장자리에서 이러한 세포를 2μL의 탈이온화된 H2O로 방출합니다.
        알림: 교차 오염을 방지하려면 각 흡인 전에 탈이온화된 H2O 3x를 흡입 및 배출하여 유리 바늘을 세척해야 합니다.
      6. 200μL의 RNA 추출 시약을 추가하여 세포를 씻어내고 튜브를 얼음 위에 임시로 보관합니다. 그런 다음, 발달 결함이 있거나 없는 배아에서 세포의 유전자형을 분석합니다.
        참고: 추출 시약에 보존된 세포는 해당 배아가 비정상적인 표현형을 나타낼 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
      7. 세포 흡인 후 배아를 아가로스 플레이트에 그대로 두거나 1x 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 1/3x Ringer 용액이 주입된 24웰 플레이트에 개별적으로 배치합니다.
        참고: 탈피된 배아를 이식할 때 주의를 기울여야 합니다! 일반적으로 한 번의 실험에서 20-40개의 배아를 검사하며 약 1시간이 소요됩니다.
    2. 흡인 세포에서 관심 있는 모계 mRNA 분석
      1. 추출 시약의 세포에 클로로포름 40μL를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 혼합물을 12,000 × g 에서 4 °C에서 1 분 동안 원심 분리한다.
      2. 상층액을 조심스럽게 모으십시오. 1 μL의 글리코겐 용액(20 mg/mL)과 같은 부피의 이소프로판올(상등액의 부피가 100 μL인 경우 100 μL의 이소프로판올을 첨가)을 넣고 잘 섞는다. 침전을 용이하게 하기 위해 -20°C에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.
        참고: 흡인된 세포에는 총 RNA의 양이 적기 때문에 침전 효율을 높이고 침전물의 시각화를 용이하게 하기 위해 글리코겐을 추가해야 합니다.
      3. 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
      4. 500mL의 70% 에탄올을 첨가하고 12,000×g에서 1 분 동안 원 심분리하여 펠릿을 2x 세척합니다.
      5. 액체를 버리고 뚜껑을 열어 펠릿을 실온에서 5분 동안 건조시킵니다.
      6. 펠릿을 녹이기 위해 7μL의 물을 첨가합니다. 사용 설명서에 제공된 자세한 프로토콜에 따라 First-strand cDNA synthesis kit를 사용하여 역전사를 수행합니다.
      7. 적절한 프라이머( Table of Materials) 로 전체 코딩 영역을 증폭하고 아가로스 전기영동을 실행합니다.
      8. PCR 산물을 클로닝하고 각 배아에 대해 최소 30개의 클론을 염기서열분석하여 mRNA에서 나타난 돌연변이를 분석합니다.
        참고: 결함 있는 표현형의 존재가 관심 있는 모계 인자의 표적 돌연변이에 의해 발생하는지 확인하기 위해, 결함 표현형을 가진 모든 배아(n > 5)는 야생형 모계 전사체가 없음을 보여야 합니다. 반대로, 야생형 모계 mRNA는 정상적으로 발달하는 모든 sgRNA 발현 배아에 존재해야 합니다(n > 5). 동시에 sgRNA 음성 배아에서는 야생형 mRNA만 검출할 수 있습니다(n > 5).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

rbm24a 모계 돌연변이의 빠른 생성
우리는 모계 BFP 마커와 rbm24a 코딩 염기서열을 표적으로 하는 4개의 고효율 sgRNA의 발현을 가능하게 하는 형질전환 벡터를 구축했습니다. Tol2 전위를 통해 이 벡터를 동형접합 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 배아에 도입한 후, Rbm24a-RFP 단백질이 없기 때문에 BFP 양성 F1 배아에서 Mrbm24a를 쉽고 빠르게 식별했습니다(그림e 11A-D). BFP 양성 배아의 약 30%-70%는 RFP 신호가 부족했습니다. 이러한 Mrbm24a 배아는 nanos3 프로브를 사용한 in situ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

치명적인 접합 돌연변이는 유전자의 모계 기여에 대한 분석을 방해합니다. 대체 전략, 특히 생식세포 대체(germline replacement)와 난세포 미세주입 제자리(Oocyte Microinjection In Situ, OMIS)는 기술적으로 까다롭다6,8. 생식세포 치환의 세포 이식 과정에서 수혜 배아는 PGC를 거의 받지 못하여 정상적인 여성의 발달을 방해하는 경우가 많습니다 16,17,18. 생식세포 치환에서 유도 PGC(induced PGCs, iPGCs)를 사용하면 최소한의 개선을 이룰 수 있다: iPGC와 분화된 생식세포의 수가 현저히 낮아졌고, 이로 인해 iPGC 이식 키메라의 모든 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

이 프로토콜은 중국 국가 지적 재산권 관리국(China National Intellectual Property Administration)에 의해 특허로 부여되었으며, 저자의 허가를 얻은 후 이 방법의 제한된 사용을 완화할 것입니다. 저자는 다른 경쟁 또는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

생명과학부 핵심 시설 및 서비스 플랫폼의 Jianlin Shen, Yiteng Xu 및 Qingqing Wei에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(보조금 32170816, 32370860, 32450630, 31871451), 산둥대학교 우수 중년 및 청년 학자 프로그램, 산둥성 타이산 학자의 지원을 받았다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2x M5 HiPer Taq PCR 믹스메이5바이오고양이 #MF001-BD-100
아가로스MD바이오고양이#A006L
AxyPrep 플라스미드 미니프렙 키트액시젠고양이#AP-MN-P-4
모세관 전기영동 기기(Qsep400)바이옵틱해당 사항 없음
DIG 라벨링 믹스로슈고양이#11277073910
DNase I로슈고양이#4716728001
DTT써모 피셔 사이언티픽고양이#R0861
첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트트랜스젠 바이오텍고양이#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS 뉴클레아제젠스크립트고양이#Z03389
유리 모세관(1.0 x 100mm)란타이 교육 장비 공장고양이#OS-2B
글리코겐BBI 생명과학고양이#28985
그래프패드 프리즘 9그래프패드https://www.graphpad.com/
이미지J오픈 소스https://imagej.net/software/fiji/
저융점 아가로스생명 공학고양이 #CA1351
마이크로포지(MF2)나리시게해당 사항 없음
마이크로 분광 광도계(Nano-300)올셩해당 사항 없음
올리비아올림푸스해당 사항 없음
페니실린-스트렙토마이신깁코고양이#15140122
피코리터 인젝터(PLI-100A) 하버드 장치해당 사항 없음
뾰족한 핀셋WPI고양이#500341
뾰족한 핀셋  WPI 500341
풀러(PC-100)나리시게해당 사항 없음
RiboLock RNase 억제제써모 피셔 사이언티픽고양이 #EO0381
rNTP써모 피셔 사이언티픽고양이#R0481
실리콘 하이드록실 마그네틱 비드상곤바이오텍고양이 #B518720-0001
T7 RNA 중합효소NEB고양이#M0251L
졸드WPICat# Z-금형

참고문헌

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

제브라피쉬 게놈 편집난모세포 특이적 넉아웃Tol2-프리 제브라피쉬모체 인자 결실배아 미세주입세포 흡입형광 단백질 마커역전사 PCR
zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.