여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
난자형성(Oogenesis)과 초기 배아 발달은 모계에서 유래한 mRNA와 단백질에 결정적으로 의존합니다. 이러한 모계 요인을 제거하려면 암컷 제브라피시에서 동형접합 돌연변이가 필요하며, 이는 종종 모계 돌연변이 배아의 획득을 방해하는 치명적이거나 불임 표현형을 초래합니다. 이전 연구에서는 난모세포 특이적 게놈 편집을 통해 접합자 치사율을 우회하는 빠른 접근 방식을 도입했습니다. 그러나 이전에 보고된 cas9 전이유전자는 불안정성을 보이며 다음 세대에 걸쳐 점진적인 침묵을 겪습니다. 또한, 이 라인에서 zpc:cas9 카세트 옆에 있는 Tol2 전이 가능한 요소의 존재는 현재 제브라피시에서 가장 효율적인 형질전환 시스템인 Tol2 시스템을 사용한 추가 sgRNA 형질전환 가능성을 방해합니다. 따라서 안정적이고 강력한 난모세포 특이적 Cas9 발현을 보장하는 Tol2가 없는 제브라피시 계통이 절실히 필요합니다. 여기에서는 이 요구 사항을 해결하는 rbm24a 유전자 자리에서 zpccas9 knock-in이 있는 라인을 제시합니다. 이 향상된 도구를 사용하여 우리는 제브라피시 모델 내에서 접합적으로 치명적인 돌연변이 표현형을 가진 유전자의 모계 돌연변이를 빠르게 생성하기 위한 파이프라인을 제공합니다.
서론
척추동물의 초기 배아 발달은 난자 내에 저장된 RNA와 단백질에 크게 의존하며, 이를 통틀어 모계 요인(maternal factor)이라고 합니다. 이러한 모계 산물은 주로 감수 분열 I 1,2,3의 디플로텐 단계에서 합성됩니다. 이들의 기능적 역할을 조사하기 위해서는 난모세포의 동형접합 돌연변이만이 이러한 모계 인자를 완전히 고갈시킬 수 있기 때문에 동형접합 돌연변이 암컷 개체를 생성하는 것이 필수적입니다. 그러나 접합 동형접합 돌연변이가 치사율 또는 불임성을 초래할 때 이러한 동형접합 돌연변이 암컷을 얻는 것은 어려워집니다 4,5. 이것은 접합체, 치명적 또는 불임 유전자에 의해 암호화된 모계 산물의 기능을 밝히는 데 상당한 장벽을 제기합니다. 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 몇 가지 혁신적인 접근 방식이 개발되었습니다 6,7,8
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프로토콜
실험은 ARRIVE 지침에 따라 수행되었으며 산둥 대학의 기관 동물 관리 위원회(승인 번호)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다. SYDWLL-2021-15). 이 프로토콜의 개요는 그림 2에 나와 있습니다.
1. rbm24a-RFP zpc:cas9 knock-in 라인의 생성
- knock-in을 위한 sgRNA 스크리닝
- knock-in sgRNA 후보 물질 선정 및 합성
- rbm24a의 마지막 인트론 염기서열을 CRISPRscan(http://www.crisprscan.org)에 제출하여 높은 CRISPRscan 점수(on-target efficiency 나타남)와 낮은 CFD score(off-target effect 반영)를 모두 나타내는 최적의 sgRNA 후보 물질을 식별합니다. 각 sgRNA(sgRNA oligo)에 대해 긴 올리고를 합성합니다.
참고: CRISPRscan은 T7 promoter sequence, 20-nucleotide sgRNA target sequ....
- rbm24a의 마지막 인트론 염기서열을 CRISPRscan(http://www.crisprscan.org)에 제출하여 높은 CRISPRscan 점수(on-target efficiency 나타남)와 낮은 CFD score(off-target effect 반영)를 모두 나타내는 최적의 sgRNA 후보 물질을 식별합니다. 각 sgRNA(sgRNA oligo)에 대해 긴 올리고를 합성합니다.
- knock-in sgRNA 후보 물질 선정 및 합성
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결과
rbm24a 모계 돌연변이의 빠른 생성
우리는 모계 BFP 마커와 rbm24a 코딩 염기서열을 표적으로 하는 4개의 고효율 sgRNA의 발현을 가능하게 하는 형질전환 벡터를 구축했습니다. Tol2 전위를 통해 이 벡터를 동형접합 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 배아에 도입한 후, Rbm24a-RFP 단백질이 없기 때문에 BFP 양성 F1 배아에서 Mrbm24a를 쉽고 빠르게 식별했습니다(그림e 11A-D). BFP 양성 배아의 약 30%-70%는 RFP 신호가 부족했습니다. 이러한 Mrbm24a 배아는 nanos3 프로브를 사용한 in situ.......
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토론
치명적인 접합 돌연변이는 유전자의 모계 기여에 대한 분석을 방해합니다. 대체 전략, 특히 생식세포 대체(germline replacement)와 난세포 미세주입 제자리(Oocyte Microinjection In Situ, OMIS)는 기술적으로 까다롭다6,8. 생식세포 치환의 세포 이식 과정에서 수혜 배아는 PGC를 거의 받지 못하여 정상적인 여성의 발달을 방해하는 경우가 많습니다 16,17,18. 생식세포 치환에서 유도 PGC(induced PGCs, iPGCs)를 사용하면 최소한의 개선을 이룰 수 있다: iPGC와 분화된 생식세포의 수가 현저히 낮아졌고, 이로 인해 iPGC 이식 키메라의 모든 .......
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공개 사항
이 프로토콜은 중국 국가 지적 재산권 관리국(China National Intellectual Property Administration)에 의해 특허로 부여되었으며, 저자의 허가를 얻은 후 이 방법의 제한된 사용을 완화할 것입니다. 저자는 다른 경쟁 또는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
생명과학부 핵심 시설 및 서비스 플랫폼의 Jianlin Shen, Yiteng Xu 및 Qingqing Wei에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(보조금 32170816, 32370860, 32450630, 31871451), 산둥대학교 우수 중년 및 청년 학자 프로그램, 산둥성 타이산 학자의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2x M5 HiPer Taq PCR 믹스 | 메이5바이오 | 고양이 #MF001-BD-100 | |
| 아가로스 | MD바이오 | 고양이#A006L | |
| AxyPrep 플라스미드 미니프렙 키트 | 액시젠 | 고양이#AP-MN-P-4 | |
| 모세관 전기영동 기기(Qsep400) | 바이옵틱 | 해당 사항 없음 | |
| DIG 라벨링 믹스 | 로슈 | 고양이#11277073910 | |
| DNase I | 로슈 | 고양이#4716728001 | |
| DTT | 써모 피셔 사이언티픽 | 고양이#R0861 | |
| 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 | 트랜스젠 바이오텍 | 고양이#AT301 | |
| GenCrispr NLS-Cas9-NLS 뉴클레아제 | 젠스크립트 | 고양이#Z03389 | |
| 유리 모세관(1.0 x 100mm) | 란타이 교육 장비 공장 | 고양이#OS-2B | |
| 글리코겐 | BBI 생명과학 | 고양이#28985 | |
| 그래프패드 프리즘 9 | 그래프패드 | https://www.graphpad.com/ | |
| 이미지J | 오픈 소스 | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| 저융점 아가로스 | 생명 공학 | 고양이 #CA1351 | |
| 마이크로포지(MF2) | 나리시게 | 해당 사항 없음 | |
| 마이크로 분광 광도계(Nano-300) | 올셩 | 해당 사항 없음 | |
| 올리비아 | 올림푸스 | 해당 사항 없음 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 깁코 | 고양이#15140122 | |
| 피코리터 인젝터(PLI-100A) | 하버드 장치 | 해당 사항 없음 | |
| 뾰족한 핀셋 | WPI | 고양이#500341 | |
| 뾰족한 핀셋 | WPI | 500341 | |
| 풀러(PC-100) | 나리시게 | 해당 사항 없음 | |
| RiboLock RNase 억제제 | 써모 피셔 사이언티픽 | 고양이 #EO0381 | |
| rNTP | 써모 피셔 사이언티픽 | 고양이#R0481 | |
| 실리콘 하이드록실 마그네틱 비드 | 상곤바이오텍 | 고양이 #B518720-0001 | |
| T7 RNA 중합효소 | NEB | 고양이#M0251L | |
| 졸드 | WPI | Cat# Z-금형 |
참고문헌
- Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
- Yan, L., et al. Maternal Hulu....
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