방법 논문

큰 영향을 위한 축소: 간소화된 고처리량 재조합 아데노 관련 바이러스 생산

DOI:

10.3791/68646

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2025년 9월 12일

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1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 전달에 널리 사용됨에도 불구하고 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터는 주목할만한 생산 문제에 직면해 있습니다. 이 프로토콜은 부착 세포와 현탁 세포를 모두 사용하는 마이크로 스케일 및 미니스케일 생산 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 벡터 생성, 정제 및 최적화를 간소화하여 전임상 연구를 가속화하고 유전자 치료 파이프라인 내에서 진행을 촉진합니다.

초록

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최근 몇 년 동안 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터가 유전자 치료 응용을 위한 선도적인 플랫폼으로 부상했습니다. 그러나 번거로운 생산 및 정제 공정은 여전히 신약 개발의 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 정제 절차 없이 고처리량, 소규모 rAAV 생산은 전임상 연구 및 초기 단계 치료 스크리닝을 가속화할 수 있는 귀중한 대안 전략을 제공합니다. 이 접근법을 사용하면 초기 시험관 내 및 생체 내 평가에 충분한 품질의 다양한 rAAV 변이 또는 치료 구조물을 신속하게 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 유형 및 생산 규모에 따라 구별되는 두 가지 방법, 즉 마이크로 스케일 및 미니 스케일 rAAV 생산을 소개합니다. 마이크로스케일 생산은 부착성 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포(마이크로-6웰)를 사용하여 6웰 형식으로 수행되는 반면, 미니스케일 생산은 24웰 플레이트(mini-HT24)의 현유 세포를 활용합니다. 이러한 방법을 통해 생성된 벡터는 세포 배양 조건을 최적화하기 위해 다운스트림 분석을 거치거나 이식유전자의 생물학적 활성을 평가하는 데 사용됩니다. 주요 분석 판독값에는 벡터 게놈 적정(vg/mL), 캡시드 역가 측정(vp/mL), 웨스턴 블롯 분석 및 세포 형질도입 분석이 포함됩니다. 또한, 미니스케일에서 생산되고 친화성 수지를 사용하여 반정제된 벡터는 염화세슘 밀도 구배를 통해 정제된 미디스케일 제제와 비교됩니다. 여기에 설명된 간소화된 방법은 세포 배양 매개변수를 개선하고, 스크리닝 중 리드 후보(즉, 최적화된 형질전환 카세트 또는 우수한 AAV 캡시드)를 식별하고, 형질전환 발현을 향상시키는 데 상당한 잠재력을 보여줍니다. 전체적으로 제시된 워크플로는 모든 연구실에서 쉽게 구현할 수 있는 유전자 치료 파이프라인의 반복적인 개발을 위한 강력하고 효율적인 플랫폼 구축을 지원합니다.

서론

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약물 개발은 표적 식별, 전임상 검증, 임상 시험 등 다양한 단계의 고품질 데이터를 통합해야 하는 복잡하고 리소스 집약적인 프로세스입니다1. 더 빠른 일정과 비용 절감에 대한 수요 증가에 대응하여2, 제약 산업은 현대 개발 전략의 초석으로 고급 인공 지능(AI)과 결합된 고처리량(HT) 소규모 분석을 점점 더 많이 채택하고 있습니다 3,4,5. HT 분석을 사용하면 기존 방법에 비해 훨씬 적은 시간과 비용으로 많은 수의 약물 후보 또는 분석 변수를 신속하게 스크리닝하고 평가할 수 있습니다 5,6.

유전자 치료 응용 분야, 특히 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 활용하는 응용 분야에서는 높은 제품 비용과 긴 제조 일정으로 인해 심각한 문제가 발생합니다7. 개발 과정은 형질감염에 필요한 플라스미드 물질을 생산하는 것으로 시작하여 바이러스 벡터 생산에 충분한 고밀도로 세포 성장을 이룹니다. 형질감염 후, 수확하기 전에 2-5일의 배양기가 필요하며, 공정은 정제 및 배치 특성화 8,9로 끝납니다. 종합적으로, 이 워크플로우는 최대 한 달이 소요될 수 있으며 일반적으로 친화성 컬럼 또는 그래디언트 초원심분리 9,10,11,12를 사용할 때 병렬로 실행할 수 있는 제한된 수의 준비로 제한됩니다.

소규모, 미니 또는 마이크로 규모의 AAV 생산 프로토콜의 필요성을 인식한 이 분야에서는 소규모 실험실 규모 설정에서 재조합 AAV(rAAV)를 생산하기 위해 여러 가지 접근 방식을 채택했습니다. 이러한 접근법은 일반적으로 부착 세포에 대해 여러 개의 15cm 접시를 사용하는 것을 포함합니다: 현탁 배양을 위해13,14 또는 50-2000mL15 쉐이크 플라스크. 과거에는 구배 초원심분리(예: 요오딕산올16, 염화세슘(CsCl)17 또는 자당 구배18)와 같은 AAV 정제 방법이 사용되었습니다. 이 저렴하고 혈청형 독립적인 방법은 실험실 규모에서 rAAV를 생산하는 데 매우 적합했지만 노동 집약적인 특성과 제한된 초원심분리기 용량으로 인해 처리량이 많은 응용 분야에 덜 도움이 됩니다19,20.

더 높은 처리량에 대한 지속적인 요구로 인해 rAAV 생산 규모를 축소하기 위한 대체 접근 방식이 모색되었습니다. 부착 세포를 사용하여, 6-웰 13,21,22, 96-웰23 및 심지어 384-웰 플레이트24와 같은 형식이 조사되었다. 보다 최근에는 현탁 세포가 채택되었는데, 이는 향상된 확장성과 벡터 제제의 비슷하거나 심지어 우수한 효능을 감안할 때입니다8.

그러나 배양 부피가 15mL 미만인 현탁 세포에서 rAAV의 고처리량 생산은 제한된 공개 프로토콜 7,25,26과 함께 전문 영역으로 남아 있습니다. 대부분의 연구는 다운스트림 응용 분야에 대한 충분한 수율을 달성하기 위해 더 많은 양에 초점을 맞추고 있지만8,9,27, 부착 세포와 마찬가지로 미니스케일 형식은 자원 소비 및 처리 시간을 크게 줄여 현장의 중요한 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은 미니 및 마이크로 스케일 프로토콜이 다운스트림 특성화 및 분석을 위해 "조 용해물" 또는 벡터 입자를 포함하는 정제되지 않은 세포 배양 수확물을 활용하는 경우가 많다는 것입니다.

이 연구는 부착 및 현탁 생산자 세포를 모두 활용하는 두 가지 프로토콜을 간략하게 설명합니다(그림 1). 부착 HEK293T 세포에서 생산된 조 rAAV 용해물은 표적 세포의 형질도입과 같은 후속 응용 분야에 직접 사용됩니다. 대조적으로, 현탁 세포에서 생성된 rAAV는 고처리량 친화성 수지 정제 를 통해 추가 처리를 거칩니다. 이러한 방법은 수율을 개선하고, 벡터 품질을 평가하고, 이식유전자 발현을 모니터링하는 동시에 값비싼 시약과 재료의 소비를 최소화하기 위해 특별히 개발되었습니다. 여기에 제시된 결과는 적용 범위에 따라 조 용해물(부착 세포에서)과 친화성 정제 물질(현탁 세포에서)이 모두 적합하다는 것을 보여줍니다. 또한, 친화성 수지를 사용하여 얻은 rAAV는 인간 유래 신경 공동 배양에서 수율, 순도 및 형질도입 효율 측면에서 전통적인 염화세슘 초원심분리를 사용하여 정제된 rAAV와 직접 비교되었습니다.

유전자 치료제 개발에 고처리량, 소규모 분석을 채택하는 것은 혁신을 가속화하고 과학적 발견과 치료 현실 사이의 격차를 해소하는 데 없어서는 안 될 발전을 나타냅니다. 이러한 방법은 비용과 일정을 줄일 뿐만 아니라 다양한 조건을 병렬로 테스트할 수 있게 하여 궁극적으로 혁신적인 치료법의 효율적인 개발에 기여합니다.

프로토콜

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1. 부착 세포에서 rAAV 벡터의 마이크로-6웰 생산

참고: rAAV의 마이크로-6웰 생산은 Fakhiri et al.21에 의해 이전에 발표된 프로토콜에서 채택된 버전입니다.

  1. HEK293T 세포의 파종 및 형질감염
    1. HEK293T 세포28 바이알을 37°C의 수조에서 해동합니다.
    2. T175 플라스크에 세포를 30mL의 부착 세포 배양 배지로 옮기고 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) + 10% 송아지 태아 혈청(FCS)에서 37°C 및 5% CO2에서 유지합니다.
    3. 2-3일마다 HEK293T 분할: 세포 배양 배지를 흡인하고 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 조심스럽게 첨가하여 세포를 세척합니다.
      참고: rAAV 생산에 직접적인 영향을 미치는 세포의 무결성과 건강을 보장하기 위해 이 프로토콜에서는 계대 번호 15 미만의 세포 계대만 사용되었습니다.
    4. 2mL의 0.025% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 세포에 첨가하고 37°C에서 2분 동안(또는 세포가 분리될 때까지) 배양합니다.
    5. 20mL의 신선한 배지를 추가하고 25mL 피펫을 사용하여 배지에 세포를 현탁시켜 반응을 중지합니다. 컨플루언스에 따라 세포를 24mL의 DMEM 고포도당 배지에서 1:10 또는 1:20으로 희석할 수 있습니다. 형질감염을 위한 충분한 세포 밀도를 얻으려면 T175 플라스크에 7 ×10 6 HEK293T 세포를 시드합니다.
    6. 37°C에서 72시간 후, 트립신화에 의해 세포를 수확하고(단계 1.1.3-1.1.5에 설명된 대로), 20mL의 배지에 재현탁하고, 세포를 계수한다.
      참고: 원하는 정확도, 처리량 및 사용 가능한 장비에 따라 다양한 방법을 사용하여 세포를 계산할 수 있습니다. 주로 수동 계수(Neubauer 챔버)와 자동 세포 계수기의 두 가지 접근 방식이 사용됩니다. 이 프로토콜은 완전 자동화 된 이미지 기반 셀 분석기를 사용하여 생존 가능성, 세포 밀도, 집계 속도와 같은 중요한 셀 매개변수를 측정합니다.
    7. 6웰 플레이트에서 0.5 × 106 세포/웰의 밀도로 세포를 시드합니다. 세포를 고르게 분포시키려면 플레이트를 부드럽게 흔들어 CO2 인큐베이터에 넣습니다.
    8. 24시간 후, 세포는 60-70%의 합류점에 도달하고 삼중 형질감염될 수 있습니다.
    9. 각 웰에 대해 90μL의 무혈청 배지와 pTransgene, pRep/Cap 및 pHelper를 포함한 총 2.6μg 플라스미드 DNA를 1:1:1 몰 비율로 혼합합니다.
    10. 두 번째 튜브에서 형질감염 직전에 5μL의 폴리에틸레니민(PEI)을 90μL의 무혈청 배지에 첨가합니다.
    11. 두 용액을 결합한 후 혼합물을 소용돌이치고 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
    12. 형질감염 혼합물을 각 웰에 적방 첨가합니다. 접시를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 부드럽게 흔듭니다.
      참고: 형질감염 후 배지 변경을 수행할 수 있지만 세포가 실험 내내 양호한 생존력을 유지했기 때문에 표준 관행으로 적용되지 않았습니다.
  2. 세포의 수확 및 용해
    1. 형질감염 후 72시간, 플레이트에서 세포 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
    2. 각 웰에 500μL의 PBS를 첨가하여 세포를 분리하고 조심스럽게 위아래로 피펫팅합니다.
    3. 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    4. 제조업체의 지침에 따라 세포 생존력과 밀도를 수동 또는 자동으로 측정하십시오.
    5. 현탁액에서 96U-바닥 플레이트로 50μL를 옮겨 유세포 분석을 통해 리포터 양성 집단을 정량화하여 형질감염 효율을 결정합니다.
      참고: 플레이트의 형질감염 효율을 모니터링하기 위해 형질감염 제어, 즉 형광 단백질(예: 녹색 형광 단백질(GFP), mCherry 등)을 운반하는 이식유전자로 1-2웰의 형질감염을 병렬로 수행하는 것이 항상 권장됩니다. 형질도입되지 않은 세포가 있는 웰은 음성 대조군 역할을 합니다.
    6. 나머지 세포 현탁액을 RT에서 10분 동안 800× g 에서 원심분리하여 생성된 벡터의 주요 부분을 포함하는 펠릿 세포로 만듭니다.
    7. 상청액을 버리고 세포를 100μL의 PBS에 재현탁합니다. 세포 현탁액은 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
      참고: 수확된 세포에서 조 용해물을 얻으려면 아래에 설명된 두 가지 접근 방식 중 하나를 사용하십시오.
    8. 첫 번째 접근법에서는 세포를 37°C 예열된 수조와 액체 질소를 사용하여 각각 5분씩 5번의 동결-해동 주기를 거칠 수 있습니다. 2-3초 동안 사이클 사이에 샘플을 잠시 소용돌이치게 합니다.
    9. 이 프로토콜에서 두 번째이자 주로 사용되는 옵션은 초음파 처리입니다. 여기서, 세포 현탁액을 얇은 벽 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 플레이트 또는 튜브로 옮기고 수조 초음파 발생기에 4 °C에서 놓습니다.
      1. 25% 진폭(강도)에서 30초의 온-오프 증분으로 총 3분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.
    10. 초음파 처리 후, 탁상용 원심분리기 (4 °C에서 10 분 동안 16,100 × g )를 사용하여 세포를 펠릿화하여 세포 파편을 제거하고 무세포 벡터 현탁액을 얻습니다.
    11. 상청액을 1.5mL 튜브로 옮기고 디지털 액적(dd)PCR 또는 디지털 (d)PCR 분석을 위해 각 샘플 10μL를 저결합 96웰 플레이트에 피펫팅합니다.
    12. 튜브와 96웰 플레이트를 추가로 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
  3. 조 용해물을 이용한 HEK293A 세포의 형질도입
    참고: HEK293A 세포는 모든 AAV 혈청형에 적합하지 않을 수 있습니다. 적절한 세포주를 식별하려면 SPIRIT29(SPIRIT 데이터베이스에 대한 링크는 재료 표 참조) 또는 관련 원본 연구 논문30,31과 같은 데이터베이스를 참조하십시오.
    1. 형질도입 하루 전에 3개의 96웰 플레이트에 HEK293A 세포를 플레이트당 1.5 × 106 세포의 밀도로 시드합니다.
    2. 다음날, 생성된 벡터 10μL를 서로 다른 부피의 PBS와 혼합하여 1:2, 1:10 및 1:100 희석액을 생성합니다.
    3. 다중 채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 세포를 기술 삼중으로 형질도입합니다.
    4. 배지 교환 없이 rAAV와 함께 세포를 72시간 동안 배양합니다. 그 후, 발현된 이식유전자에 따라 단백질 수준 측정, 형광 단백질 발현을 위한 유세포 분석, 녹다운/녹아웃 분석 등과 같은 다운스트림 실험을 수행합니다.
    5. 이 프로토콜에서 수행된 표준 유세포 분석의 경우, 배지를 흡인하고 25μL의 0.025% 트립신/EDTA를 첨가하여 세포를 분리합니다.
    6. 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
    7. PBS에 175μL의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 각 웰에 첨가하여 반응을 중지합니다.
    8. 유세포 분석을 위해 100μL의 세포 현탁액을 사용합니다.

2. 현탁 세포에서 rAAV 벡터의 Mini-HT24 생산

참고: mini-HT24 설정에서, 앞서 설명한 마이크로-6-웰 생산과 달리 rAAV 벡터의 정제된 제제는 현탁 세포를 사용하여 생성됩니다. 현탁 배양은 동일한 배양량 내에서 달성할 수 있는 증가된 세포 밀도로 인해 더 많은 양의 rAAV를 산출합니다. 이 프로토콜에서는 24 깊이의 우물 형식이 사용되었습니다. 조세포 용해물은 조 용해물이 적합하지 않은 특정 응용 분야에 필요한 청정 제품을 생성하는 것을 목표로 AAVX 친화성 수지를 사용하여 고처리량으로 정제됩니다(토론 섹션 참조).

  1. 24-딥 웰 플레이트에서 현탁 세포의 배양 및 삼중 형질감염
    1. 현탁액 바이러스 생산 세포(VPC) 바이알을 37°C의 수조에서 해동합니다. 생산된 벡터의 일관된 품질을 보장하기 위해 세포를 30회 미만으로 계대합니다.
    2. 쉐이크 플라스크에 세포를 30mL의 현탁 배양 배지로 옮기고 유지 배양 조건(37°C, 8% CO2, 95% 습도 및 140rpm(진영 플랫폼 반경 25mm)에서 2-3일 동안 배양합니다.
    3. 2-3일 후에 생존 가능한 세포 밀도를 결정합니다(단계 1.1.6의 참고 참조). AAV 생산에 필요한 원하는 수의 생존 세포에 도달할 때까지 계대 배양 및 확장을 계속합니다.
      참고: 세포를 4 × 106 cells/ mL > <생존 밀도 및 6 × 106 cells/mL의 생존 밀도로 또는 사용된 개별 세포주에 따라 제조업체의 지침에 따라 세포를 계대배양합니다. 3일 동안 6 × 105 cells/mL의 생존 밀도로 시드하고, 4일 동안 분할 또는 3 × 105 cells/mL로 시드합니다. 제조업체의 지침에 따라 분할하십시오.
    4. 24-딥 웰 플레이트의 각 웰 2.5mL에 3 ×10 6 cells/mL를 시드하고 멸균 멤브레인 뚜껑으로 플레이트를 덮습니다.
    5. 다음과 같이 각 rAAV 구조물에 대한 삼중 형질감염 혼합물을 준비합니다.
      1. 생산 플라스미드(pHelper, pRep/Capsid, pTransgene)의 DNA 믹스를 1:1:1 몰 비율로 1 × 106 생존 세포당 600ng DNA로 준비합니다.
      2. 현탁 배양 배지에서 형질감염할 배양 부피의 최종 부피 2.5%로 혼합물을 준비합니다.
      3. PEI-Mix를 현탁 배양 배지에서 형질감염할 배양 부피의 2.5%로 준비합니다. DNA 1ng당 1ng PEI의 최종 질량을 사용합니다.
      4. 개별 PEI-Mix의 전체 부피를 해당 DNA-Mix로 옮겨 DNA-Mix와 PEI-Mix를 결합하면 배양 부피의 5%가 되는 형질감염 혼합물 부피가 됩니다.
      5. 위아래로 10회 피펫팅하여 혼합합니다.
        참고: 배양32 동안 형성된 PEI-DNA 복합체의 파괴를 방지하기 위해 배양 시간 후에 형질감염 혼합물을 소용돌이치지 마십시오.
      6. RT에서 10분 동안 배양합니다.
    6. 딥웰 플레이트를 조심스럽게 흔들면서 형질감염 혼합물을 해당 웰에 적방적으로 추가합니다.
    7. 멸균 통기성 레이온 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 증발을 최소화하기 위해 해당 멤브레인 뚜껑으로 추가로 덮습니다.
    8. 플레이트가 적절한 딥웰 셰이커 트레이에 놓여 있는지 확인하고 단단히 고정하십시오.
    9. 세포를 37°C, 8% CO2, 95% 습도 및 225rpm에서 72시간 동안 배양합니다.
      참고: 다양한 딥웰 플레이트 형식은 시간이 지남에 따라 세포가 바닥에 침전되지 않고 균질한 현탁액에서 세포의 효율적인 가스 교환 및 배양을 가능하게 하기 위해 진과 속도에 대한 개별 평가가 필요합니다. 이를 위해서는 개별 실험실 장비 및 설정, 생산에 사용되는 셀 라인에 따라 초기 테스트가 필요합니다. 특히 세포 현탁액을 균질하게 유지하고 세포가 바닥에 침전되는 것을 방지하기 위해 쉐이킹 반경, 플레이트 형식 및 웰 바닥 모양을 고려하십시오.
  2. 수확 및 용해
    1. 각 웰의 전체 배양 부피를 개별적으로 표지된 5mL 튜브로 옮겨 세포를 수확하고 4°C에서 20 분 동안 800×g에서 원심분리합니다.
    2. 상청액을 흡인하고 펠릿을 550μL의 Dulbecco's (D)PBS에 재현탁한 다음 현탁액을 1.8-2.0mL 스크류 캡 튜브로 옮겨 튜브를 열 때 에어로졸과 방울을 방지합니다.
      참고: 나중에 정제 과정을 진행하기 위해 이 시점에서 펠릿을 보관할 수도 있습니다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 재현탁 펠릿을 -80°C에서 보관하고 동결-해동 주기 단계에서 이를 고려해야 합니다.
    3. 튜브를 액체 질소에 약 2분 동안 넣은 다음 37°C 수조에서 해동하여 용해물을 준비합니다. 이 주기를 3-5회 반복합니다.
    4. 4°C에서 1000× g 에서 5분 동안 원심분리 용해물을 합니다. 원심분리기 버킷을 에어로졸 단밀한 뚜껑으로 덮습니다.
    5. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 용해물은 정제 공정에 사용되는 수지가 막히는 것을 방지하기 위해 투명하고 눈에 보이는 파편이나 탁도가 없어야 합니다. 펠릿을 흔들거나 방해하지 마십시오. 상청액이 투명하지 않은 경우 원심분리 단계를 반복합니다. 고농축 샘플이나 파편이 많은 샘플의 경우 더 높은 원심분리 속도 또는 더 긴 지속 시간을 고려하십시오.
  3. 친화성 수지 기반 고처리량 rAAV 정제
    1. 비커에서 720mg의 구연산을 50mL의 초순수에 첨가하여 75mM 구연산의 최종 농도에 도달하여 용출 완충액을 준비합니다.
    2. 분말이 완전히 녹을 때까지 버퍼를 저어줍니다.
      알림: 웰 부피가 인접한 웰의 교차 오염 위험 없이 완충액 부피와 피펫 팁을 수용하기에 충분한지 확인하십시오.
    3. 완충액을 지속적으로 저어주고 pH 전극으로 측정하면서 1M 염산(HCl)을 적가하여 pH를 3.0으로 조정합니다.
    4. 0.22μm의 기공 크기를 사용하여 완충액에서 멸균 여과를 실행합니다.
    5. 표 1에 설명된 방식에 따라 정제를 위해 웰 부피가 2-2.2mL인 96 딥웰 플레이트의 컬럼을 준비합니다.
      참고: 여기의 샘플은 전자 다중 채널 피펫 설정을 사용하여 정제되었습니다. 이 프로세스는 자동 액체 처리 시스템 (automated liquid handling system) 과 호환되며, 더 높은 샘플 처리량을 위해 확장할 수 있습니다.
    6. 정제 계획에 표시된 매개변수( 표 1 참조)를 사용하여 RT의 생물 안전 캐비닛에서 정제를 실행하거나 수지 또는 샘플 부피, 예상 역가 등에 따라 개별 요구 사항에 따라 매개변수를 최적화합니다.
    7. 용출 후 각 샘플에 1/4 용출량의 Neutralization Buffer를 추가합니다.
    8. 부피의 80%를 위아래로 10배 피펫팅하여 혼합합니다.
    9. 멤브레인 카세트를 제거하고 각 웰에 1600μL의 투석 완충액을 추가하여 투석 플레이트를 준비합니다.
      알림: 재건조는 멤브레인의 무결성과 기능을 손상시킬 수 있으므로 투석을 수행하기 전에 멤브레인이 액체에 닿지 않도록 하십시오.
    10. 전체 샘플 부피(최대 300μL)를 적절한 부피 형식 및 멤브레인 기공 크기(MWCO(≥ 20,000분자량 컷오프))의 투석 카세트로 옮깁니다. 멤브레인이 균일하게 로드되고 기포가 없는지 확인하십시오.
    11. 투석판의 적재된 웰에 카세트를 놓고 밀봉 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
    12. 투석 플레이트를 진탕 플랫폼으로 옮기고 300rpm, 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
    13. 투석 완충액을 교체하고 300rpm, 4°C에서 30분 동안 배양을 반복합니다.
    14. 완충액 교환 및 배양을 총 3회 반복합니다.
    15. 투석된 샘플의 전체 부피를 표지된 저장 튜브로 옮기고 이후에 특성화 또는 기타 실험에 사용하는 경우 4°C에서 보관합니다.
    16. 장기간 보관을 위해 -80°C에서 보관하십시오. 동결 해동 주기는 AAV의 효능에 영향을 미칠 수 있으므로 피하고 필요한 경우 소량의 분취량을 준비하십시오.
  4. 디지털 PCR(dPCR)을 사용한 조 용해물 및 수지 기반 정제에서 rAAV 게놈 역가의 적정
    1. 조 용해물의 게놈 역가, 즉 mL당 바이러스 게놈(vg/mL)을 결정하기 위해 수확된 벡터 샘플을 RT에서 해동한 다음 10μL를 튜브에 피펫팅합니다.
      참고: 벡터 제제의 바이러스 게놈(vg/mL) 역가를 결정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있으며, 절대 정량화는 일반적으로 두 가지 주요 접근법, 즉 액적 또는 에멀젼 기반 방법(ddPCR)과 디지털 PCR(dPCR)33,34로 표시되는 마이크로플레이트 기반 방법에 의존합니다. 이러한 디지털 방법 외에도 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 절대 정량화를 달성할 수도 있습니다. qPCR은 전통적으로 상대적 정량화 방법이지만 플라스미드 표준 곡선을 사용하여 절대 정량화에 적용할 수 있습니다. 이것은 알려진 농도의 표적 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하며, 이는 바이러스 게놈 역가를 외삽하기 위한 참조 역할을 합니다21,33. qPCR은 ddPCR 또는 dPCR보다 빠르고 저렴하지만 정확도가 떨어지고 플라스미드 표준의 정확도에 크게 의존합니다16. 정량 방법에 관계없이 입자에서 바이러스 게놈을 방출하기 위해 샘플을 전처리해야 합니다. 이 프로토콜은 Dobnik, D. etal 35에 의해 이전에 설명된 방법을 따릅니다.
    2. rAAV 샘플을 37°C에서 30분 동안 뉴클레아제로 처리하여 형질감염 공정에서 유리 플라스미드 DNA를 분해합니다.
      참고: 사용된 효소에 따라 선택 사항: 샘플을 95°C로 15분 동안 가열하여 효소를 비활성화하고 벡터의 캡시드를 용해합니다.
    3. RT로 냉각한 후 Proteinase K를 15분 동안 첨가하여 캡시드 단편을 소화합니다.
    4. Proteinase K의 비활성화를 위해 샘플을 다시 95°C로 15분 동안 가열합니다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 ddPCR 또는 dPCR 마스터 믹스를 준비합니다.
    6. 표지된 DNA 프로브는 삽입 염료보다 더 구체적인 신호를 제공하므로 사용하십시오. 프로모터 또는 폴리A 꼬리가 아닌 바이러스 게놈, 즉 이식유전자(NOTE 참조)에서 "중앙적으로" 결합하도록 프로브를 설계하고 각각의 PCR 시스템과 호환되는 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(HEX) 또는 6-카르복시플루오레세인(FAM)과 같은 형광단을 선택합니다.
      참고 : 최근에, 바이러스 게놈의 상이한 영역을 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트를 사용하는 멀티플렉스 ddPCR 또는 dPCR이 역가 측정의 정확도를 향상시키기 위해 활용되고 있다36,37. 이 접근 방식을 사용하면 참조된 연구에 설명된 공식을 적용하거나 통합 소프트웨어 솔루션을 사용하여 온전한 게놈을 정량화할 수 있습니다.
    7. 낮은 DNA 결합 96웰 플레이트를 사용하여 ddH2O에서 후처리된 샘플을 10배 연속 희석합니다. 마지막으로, 5.5μL(ddPCR의 경우) 또는 2μL(dPCR의 경우)의 템플릿(희석액 10,4- 및 10,5)을 프라이머/프로브를 포함한 ddPCR/dPCR 마스터 믹스가 이미 들어 있는 ddPCR 96웰 플레이트로 옮깁니다. 개별 구조의 생산 효율성에 따라 희석 범위를 조정하여 측정값이 선형 검출 범위 내에 있는지 확인합니다.
      참고: dPCR/ddPCR 정량화는 매우 민감한 방법이므로 샘플의 104 및 105 희석이 필요합니다.
    8. ddPCR에 대해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
      1. PCR 증폭의 경우 사용된 프라이머/프로브 세트에 따라 어닐링 및 증폭 시간 조정을 포함하여 분석 조건을 최적화하기 위한 제조업체의 지침을 따르십시오. 이 연구에 사용된 표준 사이클링 프로토콜은 다음과 같습니다: 9°C에서 10분 동안 초기 변성(램프 °C/s); 30초 동안 9°C에서 35회 변성 및 6°C에서 60초 동안 증폭; 이어서 9°C에서 10분 동안 최종 연신율 단계를 수행합니다(램핑 °C/s).
      2. rAAV 바이러스 게놈 표적의 PCR 증폭 후 플레이트를 액적 판독기로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 각 웰의 형광 강도를 측정합니다. 액적 리더를 사용하면 바이러스 게놈 복제 수 pe μL 반응의 절대 정량화가 가능합니다.
    9. dPCR에 대해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
      1. ddPCR 기반 정량화에 대해 설명한 대로 분석 조건을 최적화하기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오.
      2. 시작점으로, dPCR 장치에서 사전 설정된 열 프로파일을 따르며, 여기에는 9°C에서 2분 동안 초기 변성 단계, 9°C에서 15초 동안 40회 변성 및 5°C에서 30초 동안 어닐링/확장이 포함됩니다.
        참고: 이 프로토콜은 제조업체에서 지정한 권장 램프 속도 및 반응 부피를 사용하여 수행되었습니다.
    10. 일반적으로 기기 제조업체에서 제공하는 다양한 소프트웨어 솔루션(예: 각각 QX 관리자 및 QIAcuity Software Suite 1.2)을 사용하여 ddPCR 및 dPCR 데이터를 분석합니다. 두 방법 모두 정량화를 위해 양수 대 음수 분할/액적의 적절한 비율을 가진 샘플 희석액만 선택합니다.
      참고: 조 용해물 및 AAVX 수지 정제 물질로부터 rAAV 입자 역가(vp/mL; vp = 바이러스 입자)를 측정하기 위해 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용할 수 있습니다., AAV 정량화를 위한 다양한 상업적으로 이용 가능한 표준 샌드위치 ELISA 키트를 사용할 수 있습니다(이 작업에 사용된 키트는 재료 표에 나열되어 있습니다.). 제조업체의 설명서에 따라 분석을 수행합니다. 사용된 ELISA 키트가 생산 중인 AAV 혈청형과 호환되는지 확인하십시오.
  5. 정제된 rAAV의 VP 비율 분석
    참고: 24개의 딥웰 설정의 개별 웰에서 각 샘플의 바이러스 캡시드 단백질(VP) 비율을 결정하기 위해 표준 웨스턴 블롯 또는 자동화된 모세관 기반 프로토콜을 수행할 수 있습니다.
    1. AAV2 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 검출하려면 1차 항-AAV VP1/VP2/VP3 단클론 항체를 사용합니다. 1차 항체가 각각의 혈청형 또는 캡시드 변이체와 함께 작동하는지 확인하십시오.
    2. 재조합 VP1, VP2 및 VP3 또는 AAV 참조 표준과 같은 적절한 양성 대조군을 사용하십시오.
    3. 예상되는 VP 비율을 모방하기 위해 1:1:10(VP1:VP2:VP3)의 분자 비율로 양성 대조군을 준비합니다. 이는 신호 영역 통합을 사용한 VP 비율 정량화를 위한 참조 사용도 합니다.
    4. 가장 작은 것(~60kDa의 VP3)과 가장 큰 것(~82kDa의 VP1)을 포함하여 검출할 캡시드 단백질을 포함하는 적절한 범위의 모세관 키트를 선택합니다. 이는 사용된 혈청형 및 캡시드 변종에 따라 달라질 수 있습니다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 시약과 비오티닐화 사다리를 준비합니다.
    6. 키트의 제공된 희석 완충액에서 일련의 희석 샘플(1 × 1012 vg/mL에서 1 × 1010 vg /mL 또는 희석되지 않은 샘플에서 시작하여 1:64까지 1:2 희석액을 기반으로 합니다).
    7. 제조업체의 지침에 따라 또는 이전 테스트에 따라 제공된 항체 희석 완충액에서 1차 항체를 희석합니다. 1:100으로 시작합니다.
    8. 1차 항체의 공급원에 따라 해당 검출 키트를 사용하십시오.
    9. 키트와 함께 제공된 구성표에 따라 플레이트를 로드합니다.
    10. 빈 컬럼에 물 또는 샘플 희석 완충액을 채워 건조로 인해 기기 모세관이 손상되지 않도록 하십시오.
    11. 플레이트를 밀봉 호일로 덮고 1200 × g, 5분, 4°C에서 원심분리합니다.
    12. 플레이트와 모세관을 기기로 옮기고 실행에 대해 미리 설정된 표준 조건을 사용합니다.
    13. Compass(버전 6.3.0)38와 같은 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 실행을 분석합니다.
      참고: 입자 무결성, 단분산성 및 순도 음성 염색 투과 전자 현미경(ns-TEM)을 분석하는 것이 좋습니다. TEM 분석은 Steininger 등이 설명한 대로 수행할 수 있습니다. 알25. 그러나 질량 광도계(39), SEC-MALS(40 ) 및 은색 염색(41 )과 같은 다른 방법도 rAAV 제제의 품질을 평가하기 위한 보완적인 판독값을 제공할 수 있습니다.
  6. 정제된 바이러스 입자를 사용한 형질도입
    참고: 정제된 바이러스 벡터로 세포를 형질도입하려면 감염 다중도(MOI)를 결정해야 합니다. MOI는 세포당 추가된 입자 함유 게놈의 수로 정의됩니다. 이것은 이론적 값이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 세포당 전달되는 rAAV 게놈의 실제 수는 표적 세포를 성공적으로 형질도입하는 캡시드의 능력에 따라 달라집니다. 따라서 최적의 MOI는 항상 실험적으로 결정되어야 합니다. 이 섹션의 목표는 서로 다른 정제 방법(염화세슘 초원심분리 및 AAVX 친화성 수지)을 사용하여 생산된 두 가지 바이러스 벡터 스톡을 비교하는 것이었습니다. 이를 위해 인간 유래 신경 공동 배양을 두 제제로 형질도입하고 형광 현미경을 사용하여 형질도입 효율을 평가했습니다.
    1. 96웰 검정색 광학 바닥판을 0.1%(폴리-L-오르니틴) PLO로 4°C에서 밤새 코팅하거나 37°C에서 ≥ 1시간 동안 배양합니다.
    2. 파종 당일, PLO 코팅 시약을 흡인하고 Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix로 코팅하고 37°C에서 ≥1시간 동안 배양합니다.
    3. 성상세포로 운동 뉴런을 1:6 비율로 배양하거나 공급업체 권장에 따라 배양합니다.
    4. 시험 관 내 (DIV) 2일, 50,000의 MOI에서 공동 배양을 형질도입합니다.
    5. 4°C에서 바이러스 분취량을 해동합니다.
    6. 형질도입 배지(세포당 바이러스 게놈을 기반으로 원하는 MOI의 바이러스 벡터 + 웰당 배양 배지의 50%를 대체하기 위해 적절한 부피의 세포 배양 배지)을 준비합니다.
    7. 형질도입 배지와 50% 배지 교환을 수행합니다.
    8. 5 DIV에서 일반 배양 배지와 완전한 배지 교환을 수행합니다.
    9. 2-3일마다 또는 공급업체의 권장 사항에 따라 정기적인 배양 배지 교환으로 세포를 유지하십시오.
    10. 리포터 이식유전자에 대한 정확한 여기가 장착된 라이브 이미징 현미경으로 발현 수준을 모니터링합니다. 인간 유래 뉴런의 경우 형질도입 후 10-14일 사이에 정체 발현이 관찰됩니다( 그림 4A 참조).
걸음버퍼/재료웰 부피 [μL]작업량 [μL]사이클유량
[μL/분]
1. 평형평형/
세척 I 버퍼		11009502500
2. 로딩 /
캡처		샘플 상청액5505004
3. 워시 I평형/
세척 I 버퍼		11009502
4. 워시 II세척 II 완충액11009502
5. 용출용출 완충액70 μL(20 μL 레진 팁)
250 μL (80 μL 레진 팁)		60 μL(20 μL 수지 팁)
240 μL(80 μL 레진 팁)		4
6. 중화중화 버퍼용출 부피의 1/4을 각 샘플에 직접 첨가합니다.
용출된 시료 70 μL → 17.5 μL 추가
용출된 시료 250 μL → 62.5 μL 추가		--

표 1: rAAV의 친화성 수지 정제를 위한 플레이트 레이아웃 및 정제 매개변수.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 몇 년 동안 실험실 규모의 AAV 벡터 생산에 대한 수요가 크게 증가하여 이를 서비스로 제공하는 수많은 계약 연구 기관이 설립되었습니다42. 아웃소싱과 관련된 높은 비용과 지연된 일정을 고려할 때 사내 rAAV 생산은 여전히 매력적인 옵션입니다. 특히, 정제 단계를 통합하면서 재료 소비와 작업 시간을 최소화하는 고처리량 프로토콜은 신약 개발 파이프라인에 매우 유용합니다.

이 프로토콜은 rAAV 생산을 위한 두 가지 고처리량 설정, 즉 부착 세포를 사용하는 마이크로-6-웰 접근법과 현탁 세포를 위한 미니-HT24 프로토콜을 간략하게 설명합니다( 그림 1의 개요 참조). 마이크로 6 웰 설정은 부착 HEK293T 세포를 사용하여 6 웰 형식으로 rAAV를 생산합니다. 이 물질은 rAAV2 생산에 대한 두 가지 상업적으로 이용 가능한 PEI 형질감염 시약과 염화나트륨(NaCl)의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다(그림 2A). 여기서, (i) GFP 전이유전자를 사용한 생산자 세포의 생존력 및 형질감염 효율(그림 2B 및 보충 그림 1), (iii) 조 용해물로 형질도입 후 GFP 양성(GFP+) 세포의 백분율(그림 2C)을 동시에 모니터링했습니다. 형질도입 실험은 벡터 역가와 기능에 대한 저렴하고 빠른 간접 판독 역할을 했습니다. 흥미롭게도, DNA에 대한 형질감염 시약의 비율이 낮아도 우수한 세포 생존율을 유지하면서 효율적인 벡터 생산을 촉진하기에 충분했습니다(그림 2B). 또한, 150mM NaCl의 첨가는 특히 PEIpro 시약을 사용할 때 유익한 것으로 나타났습니다. 마이크로 스케일에서 이 실험을 수행하면 다음과 같은 몇 가지 이점이 있었습니다: (i) 세포 파종, 형질감염 및 벡터 수확이 1주일 이내에 완료되는 빠른 워크플로우; (ii) 표준 다운스트림 분석 분석과의 호환성; (iii) 모든 AAV 혈청형에 대한 광범위한 적용 가능성.

생 체 내 실험 또는 시험관 내 동역학 연구(더 높거나 더 넓은 범위의 MOI가 적용되는 경우)와 같이 더 많은 양의 rAAV 벡터가 필요한 응용 분야의 경우 확장이 필요합니다. 고처리량 정제를 위한 충분한 물질을 제공하는 mini-HT24 프로토콜을 확립하기 위해 현탁 세포를 사용했습니다. 부착 세포에 비해 현탁 배양은 표면적에 제약을 받지 않기 때문에 더 나은 확장성을 제공하고 공간 효율성이 더 높습니다. 현유 세포는 배지 내에서 자유롭게 성장하기 때문에 전체 배양 부피를 차지할 수 있어 3차원 스케일업이 더 간단합니다. 이를 통해 층계 배양에 비해 더 높은 세포 밀도를 달성할 수 있습니다. 또한 서스펜션 시스템은 계승 또는 수확 중에 분리 단계가 필요하지 않기 때문에 유지 관리 및 처리가 더 쉽습니다. 24웰 형식에서 rAAV 생산의 균일성은 플레이트 전체에 걸쳐 세 가지 주요 매개변수를 분석하여 평가되었습니다(그림 3): (A) 입자 역가(vp/mL); (B) 캡시드의 VP 비율; (C) 게놈 역가(vg/mL) 및 (D) 비어 대 전체 비율.

이러한 매개변수에 걸쳐 약간의 변동성이 관찰되었지만 측정 오차 범위 내에 있는 두 배 범위 내에 머물렀습니다. VP 단백질 발현은 또한 자동화된 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 평가되었습니다(그림 3E). 마지막으로, 마이크로-6웰, 미니-HT24 및 중규모(쉐이크 플라스크) 생산에서 얻은 총 수율을 비교하여 실험 요구 사항 및 다운스트림 분석 요구 사항에 따라 적절한 규모를 선택하는 데 도움이 됩니다(그림 3F).

모든 AAV 정제 프로토콜의 중요한 측면은 벡터 순도와 효능을 평가하는 것입니다. 여기서, 수지 정제된 벡터를 2단계 염화세슘(CsCl) 기반 초원심분리(UC) 방법을 사용하여 정제된 벡터와 나란히 비교했습니다(그림 4). 두 제제 사이의 비슷한 효능은 운동 뉴런과 성상세포의 성공적인 형질도입에 의해 입증된 바와 같이 형광 현미경에 의해 관찰되었습니다(그림 4A). 전자현미경 분석에서는 입자 모양이나 응집 상태에 큰 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 그러나 CsCl 정제가 보다 일관되게 더 깨끗한 제제를 산출한다는 약간의 경향이 있었습니다(그림 4B).

figure-results-1
그림 1: rAAV 생산 및 준비 접근법에 대한 개요. 이 그림은 중간 규모의 쉐이크 플라스크에서 미니 HT24 현탁액 배양 및 마이크로-6웰 부착 배양에 이르는 rAAV 생산 방법을 보여줍니다. 이러한 접근 방식을 통해 다양한 세포 용해 및 벡터 정제 전략을 활용하여 다양한 규모에서 rAAV 생성이 가능합니다. rAAV의 최종 특성화에는 일반적으로 바이러스 게놈 정량화(vg/mL)를 위한 qPCR/dPCR, 캡시드 역가(vp/mL) 측정을 위한 ELISA 및 생물학적 활성을 평가하기 위한 세포 형질도입 분석이 포함됩니다. BioRender에서 생성되었습니다. 올랜드, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 마이크로-6웰 rAAV 생산을 위한 형질감염 프로토콜의 최적화. (A) 테스트된 매개변수 및 분석 판독값을 사용한 실험의 개략적 개요. (B) 형질감염 24시간 전에 HEK293T 세포를 0.5 × 106 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 파종했습니다. 다양한 DNA 양, PEI 유형(Pro 또는 Max), 비율 및 NaCl 농도를 테스트했습니다. (C) 패널 A(각각 10μL)에서 동일한 부피의 용해물을 갖는 형질도입 후 72시간 동안 GFP 양성(GFP+) HEK293A 세포의 백분율. 단순화를 위해 가장 높은 벡터 수율(2650ng)을 초래한 DNA 조건만 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: mini-HT24 설정에서 생성된 rAAV의 분석 특성화 및 다양한 규모에 걸친 역가 비교. (A) 각 웰에서 정제된 rAAV 캡시드 역가의 ELISA 분석. 값은 정제 후 플레이트의 평균 입자 역가 이상의 변동으로 표시됩니다. 예상 역가는 사용된 AAV 캡시드와 패키지된 이식유전자에 따라 다릅니다. 다양한 AAV 벡터에 대한 입자 역가는 낮은 1011 에서 높은 1012 VP/mL 사이였습니다. (B) 표시된 웰에서 정제된 rAAV의 WES에 의한 VP-비율 분석. 재조합 AAV2 VP1, VP2 및 VP3를 1:1:10의 몰비로 양성 대조군으로 사용하였다. (C) 각 웰에서 정제된 rAAV의 dPCR 분석. 값은 정제 후 플레이트의 평균 게놈 역가 이상의 변화로 표시됩니다. 예상 역가는 사용된 AAV 캡시드와 패키지된 이식유전자에 따라 다릅니다. 다양한 AAV 벡터에 대한 게놈 역가는 낮은 1010 (rAAV2)에서 높은 1011 vg/mL(rAAV9, 여기에 표시되지 않음) 사이의 범위였습니다. (D) 패널 A 및 C의 게놈 및 입자 역가 결과에 기초한 표시된 웰의 빈 대 전체 비율(E/F). 값은 플레이트 평균으로 정규화됩니다. 표시된 rAAV2에 대한 mini-HT24 형식의 평균 E/F는 AAVX 친화성 수지 정제 후 10.6% ± 3.0%입니다. (E) 각 웰에서 정제된 rAAV2 샘플에서 VP 단백질의 모세관 웨스턴 블롯 분석. (F) 각 방법의 최종 샘플 부피 및 농도를 고려한 총 바이러스 게놈 수율의 비교. 데이터는 가장 작은 형식(마이크로 6웰)에 대한 평균 배수 차이로 표시되며, 오차 막대는 생물학적 복제와의 표준 편차(SD)를 나타냅니다. AAVX 친화성 수지 정제를 통한 고처리량 24-딥웰 생산의 경우, SD = ±0.176(n = 24); 마이크로 6-웰 초음파 처리용; SD = ±0.349 (n = 6); CsCl 구배 정제를 사용한 표준 중간 규모 생산의 경우 SD = ±134.70(n = 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 고처리량(HT) 수지 정제 rAAV와 표준 CsCl 정제 샘플 간의 효능 및 순도 비교. (A) 인간 유래 운동 뉴런 및 성상세포는 MOI 50,000에서 리포터로서 인간 시냅신 프로모터 하에서 형광 리포터 mRuby3를 발현하는 동일한 rAAV 구조물로 형질도입되었습니다. 형광 현미경 이미지는 형질도입(DPT) 후 7일 후에 라이브 이미징 현미경으로 캡처되었습니다. rAAV는 표준 CsCl 그래디언트 방법(상단) 또는 HT AAVX 친화성 수지 팁 기반 접근법(하단)을 사용하여 정제되었습니다. CsCl 정제 샘플은 형질도입을 수행하기 전에 한 번의 추가 동결-해동 주기에 노출되어 수지 정제된 rAAV와 비교되었습니다. (B) CsCl 구배(상단) 및 HT 수지 팁 방법(하단)을 통해 정제된 rAAV2-혈청형 기반 변이체의 투과 전자 현미경(TEM) 분석. rAAV2의 HT 수지 정제 샘플의 두 배치를 투석 없이(왼쪽 하단)와 투석 시(오른쪽 하단)로 비교할 수 있습니다. TEM을 사용하여 빈 대 전체 비율(E/F)을 CsCl 구배 초원심분리 정제 샘플의 경우 90% >, AAX 친화성 수지 정제 샘플의 경우 40% < 결정했습니다. 스케일 바 = 100nm. 패널 B는 표시된 방법을 사용하여 정제된 배치의 대표적인 사진을 보여줍니다. 이 이미지는 패널 A에 표시된 형질도입 실험에 사용된 것과 동일한 제제에 속하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 마이크로-6-웰 설정을 사용하여 rAAV2-GFP 생산을 위한 HEK293T 세포의 형질감염. 다양한 DNA 양, NaCl 농도(mM 단위), PEI 생성물 및 PEI-대 DNA 비율을 형질감염에 사용했습니다( 그림 2 참조). 이미지는 동일한 노출 시간(320ms)을 사용하여 형질감염 후 72시간 후에 촬영되었습니다. 대표적인 명시야 및 형광 현미경 이미지가 이 그림에 나와 있습니다. 배율: 10X. 축척 막대가 표시되지 않습니다. 이미지는 설명 목적 및 정성적 평가만을 위한 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 문서는 부착 세포와 현탁 세포를 모두 활용하는 고처리량, 소규모 환경에서 rAAV를 생산하는 효율적인 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법론은 시간, 비용 및 자원 소비를 최소화하면서 전임상 연구를 지원하는 확장 가능하고 유연한 rAAV 생산 프로세스에 대한 수요 증가를 해결합니다.

부착 세포 시스템과 현탁 세포 시스템 모두 소규모 rAAV 생산에 뚜렷한 이점과 과제를 제공합니다. 멀티웰 플레이트 형식으로 성장한 HEK293T 세포(28 )와 같은 부착 세포 시스템은 초기 단계의 벡터 설계 및 비교 연구에 특히 적합합니다. 확립된 배양 및 형질감염 프로토콜과의 호환성으로 인해 대부분의 실험실에서 간단하게 구현할 수 있습니다. 예를 들어, Grosse et al. 바이러스 캡시드22의 조립에 중요한 단백질인 AAP 기능을 조사하기 위해 6웰 플레이트에서 소규모 생산을 활용했습니다. Drittantiet al. rAAV 복제의 동역학을 평가하고 rAAV 생산에 대한 다양한 아데노바이러스 도우미의 효과를 테스트하기 위해 96웰 플레이트에서 rAAV 벡터를 생산했습니다23. 특히, 후자의 연구에서는 신호를 더욱 증폭하기 위해 AAV Rep 및 Cap을 발현하는 특수 HeLa 세포를 사용하는 복제 분석이 설명되었습니다. 보다 최근에, Quan et al. siRNA 스크리닝의 맥락에서 384웰 고처리량 생산 프로토콜을 적용하여 상대적 역가를 보고했습니다24. 그러나 제한된 양의 물질을 감안할 때 얼마나 많은 분석 및 판독을 수행할 수 있는지, 형광 단백질 측정 이상의 세포 형질도입 실험에서 충분한 MOI를 달성할 수 있는지 여부는 여전히 불확실하여 잠재적으로 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다.

이 작업에서는 부착 HEK293T 세포에서 마이크로-6웰 기반 생산을 사용하여 rAAV2에 대한 배양 조건을 최적화했습니다(그림 1 및 그림 2). 이전 연구 및 기술 보고서43,44에 따라 형질감염 중 낮은 PEI 대 DNA 비율과 NaCl 첨가는 rAAV 생산에 긍정적인 영향을 미쳤습니다. 이는 HEK293A 세포에서 생산된 벡터의 형질도입 효율에 간접적으로 반영되었습니다. 낮은 PEI:DNA 비율에서 관찰된 현저한 차이는 특히 PEIpro의 낮은 세포 생존력으로 표시되는 바와 같이 주로 세포 스트레스에 기인했습니다. PEImax 조건에서 효과는 덜 분명했지만 현미경 이미지는 세포층에서 세포가 없는 영역을 드러내며 스트레스 또는 세포 박리를 나타냅니다(보충 그림 1).

중요한 것은 이러한 발견이 현탁 배양의 벡터 생산에 직접적으로 적용되지 않았으며, 부착 HEK293T 세포에서 rAAV 생산을 향상시키는 실험 조건이 기본 세포 유형이 동일하게 유지되더라도 항상 현탁 세포로 번역되는 것은 아닐 수 있음을 강조합니다. 이러한 불일치는 이 두 시스템 사이의 전사체 및 단백질체 수준의 차이에 기인할 수 있습니다45. 결과적으로, 임상 생산 공정과 긴밀하게 조정하려면 초기 개발 단계에서 현탁 배양을 사용해야 할 수도 있습니다. 이러한 관찰과 현탁액에서 더 높은 세포 밀도를 달성하는 이점을 바탕으로 미니스케일 현탁액 배양(mini-HT24)에서 rAAV를 생산하기 위해 24 깊이의 웰 시스템이 채택되었습니다. 이 시스템은 광범위한 검증을 거쳐 균일한 VP 단백질 발현 및 비율과 함께 플레이트 전체에서 일관된 vg/mL 및 vp/mL 역가를 입증했습니다(그림 3A-E). 실제로, 마이크로-6웰 형식(웰당 5 × 105개 세포)에 비해 미니-HT24 설정(3 × 106 세포/mL)에서 달성된 더 높은 세포 밀도는 그림 3F와 같이 더 높은 rAAV 역가를 초래했습니다. 이는 배양 용기의 표면적에 의해 제한되지 않는 현탁액 기반 시스템의 주요 이점을 강조합니다. 그러나 이러한 시스템을 구현하려면 모든 실험실에서 사용할 수 없는 특수 장비가 필요합니다. 마지막으로, AMBR15 또는 AMBR250와 같은 미니바이오리액터 시스템을 사용하여 미니-HT24 시스템에서 확인된 리드 분자 또는 우수한 배양 조건을 추가로 검증하는 것이 권장되며, 이는 이러한 시스템이 대형 바이오리액터에서 생산 조건을 보다 밀접하게 모방하는 것으로 나타났기 때문입니다46,47.

정제 수준의 선택은 특정 다운스트림 응용 분야에 대한 rAAV 준비의 적합성을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 부착(마이크로-6웰) 및 현탁 배양(mini-HT24) 모두에서 파생된 조 용해물은 예비 스크리닝 분석을 위한 신속하고 자원 효율적인 옵션을 제공합니다. 이러한 용해물에는 바이러스 입자, 세포 파편 및 배지 성분의 혼합물이 포함되어 있어 벡터 게놈/입자 역가, 형질도입 효율 스크리닝 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 응용 분야에 적합합니다. 특히 근본적인 생물학적 질문(위에서 AAP 기능 조사에서 예시된 바와 같이), 세포 배양 조건 최적화, 전임상 후보 스크리닝 및 선택을 다루는 연구에 적용할 수 있습니다. 그러나 불순물이 있으면 더 높은 희석이 필요할 수 있으며, 그 결과 분석 민감도가 낮아질 수 있습니다. 또한 불순물은 일차 세포와 같은 민감한 세포 유형의 생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

조 용해물과 달리 현탁액 기반 프로토콜에서만 사용되는 AAVX 친화성 수지 정제 제제는 온전한 캡시드를 선택적으로 분리하여 더 높은 수준의 순도를 달성합니다. 이는 조세포 용해물의 한계를 극복하여 이러한 제제를 생체 내 연구뿐만 아니라 이식유전자 발현 동역학에 대한 상세한 시험관 내 분석 및 종종 더 많은 양의 물질이 필요한 정확한 기능적 판독과 같은 응용 분야에 더 적합하게 만듭니다( 그림 3F의 수율 비교 참조). 시험관 내 응용 분야의 경우, mini-HT24 설정에서 생산된 rAAV 벡터의 수율은 일반적으로 세포 수와 필요한 MOI에 따라 대부분의 판독에 충분했습니다. 대조적으로, 생체 내 응용 분야는 일반적으로 용량, 투여 경로 및 동물 모델에 따라 미디쉐이크 플라스크 규모 이상에서 생산해야 합니다. 정제에 필요한 비용과 시간이 증가했음에도 불구하고 결과 재료의 일관성과 신뢰성은 종종 중요한 사용 사례에 대한 투자를 정당화합니다. 특히, 그림 4 에 표시된 결과는 친화성 수지 방법을 사용하여 정제된 rAAV 벡터가 기존의 염화세슘(CsCl) 초원심분리를 통해 정제된 벡터와 비슷한 성능을 발휘한다는 것을 보여줍니다. 이것은 빈 캡시드가 형질도입에 영향을 미치지 않거나 존재하는 AAV 종에 따라 형질도입을 향상시킬 수도 있다는 이전 관찰과 일치합니다48. 그러나 이 실험에서는 하나의 MOI와 하나의 시점만 사용되었으며 각 세포 유형에 대해 최적의 조건을 개별적으로 결정해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. CsCl 정제는 일반적으로 더 깨끗한 배경을 생성하는 반면, HT 수지 팁 정제된 AAV는 순도에서 더 큰 변동성을 나타냅니다( 그림 4의 TEM 이미지 참조). 종합적으로 이러한 결과는 처리량이 많은 소규모 워크플로의 채택을 더욱 뒷받침합니다.

고처리량 정제에 소규모 친화성 수지 충전 팁을 사용하면 신속한 rAAV 스크리닝을 위한 실용적인 솔루션을 제공하지만 신뢰할 수 있는 결과를 보장하려면 몇 가지 기술적 측면에 주의가 필요합니다. 제한된 수지 베드 부피로 인해 이러한 팁은 특히 조한 용해물을 처리할 때 특히 막히기 쉽습니다. 따라서 정화가 불충분하면 유속이 감소하고 수율이 저하될 수 있으므로 로딩 전에 세포 파편을 제거하려면 고속 원심분리에 의한 용해물의 정화가 필수적입니다. mini-HT24 설정의 경우 형질감염 프로토콜을 최적화하고 웰당 최대 작업 부피를 2.5-3mL로 유지하는 것이 좋습니다. 다양한 혈청형 또는 캡시드 라이브러리로 작업할 때 결합 효율 및 회수율은 캡시드 구조49에 따라 달라질 수 있으므로 다양한 친화성 수지 유형을 테스트하는 것이 좋습니다. 휴대용 전자 다중 채널 피펫팅 시스템을 사용하면 소규모 실험실에서 이 워크플로우를 쉽게 통합할 수 있어 자동화 없이도 유연성을 제공합니다. 그러나 수동 취급으로 인해 변동성과 로트 간 차이가 발생할 수 있습니다. 일관성을 높이려면 자동화된 액체 취급 플랫폼이 도움이 될 수 있습니다. 샘플 및 완충액 추가 중 교차 오염을 방지하기 위해 세심한 주의를 기울여야 하며, 오버플로를 방지하려면 적절한 웰 부피를 갖춘 적절한 플레이트 형식을 사용하는 것이 필수적입니다. 샘플 정화, 프로토콜 최적화, 수지 선택, 신중한 피펫팅 등 이러한 고려 사항을 해결함으로써 연구자들은 기술적 문제를 최소화하고 처리량이 많은 소규모 친화성 정제 작업 흐름의 견고성과 재현성을 향상시킬 수 있습니다.

결론적으로, 고처리량, 소규모 rAAV 생산 방법과 응용 분야별 정제 전략의 조합은 유전자 치료 연구를 발전시키기 위한 다양한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 실험 요구 사항을 충족할 수 있는 유연성을 유지하면서 비용 효율적이고 효율적인 작업 흐름에 대한 증가하는 수요를 해결합니다. 순도, 확장성 및 자원 소비 간의 균형을 유지함으로써 연구자들은 전임상 개발을 가속화하고 임상 응용 분야로의 전환을 촉진할 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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Julia Fakhiri는 Roche 박사후 연구원을 통한 지원에 감사를 표합니다. 전자 현미경 데이터는 Roche cryo-EM 시설 Nautilus에서 획득되었습니다. 시설 운영과 지원에 기여한 Moritz Classen과 Lubomir Kovacik에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 무완충 식염수B. 브라운, 독일 멜순겐7647-14-5세척 II 완충액
1 M 하이드로클로서클산Merck Millipore, 미국 매사추세츠주 벌링턴1099700050완충액의 pH 조정
10x DNase I 버퍼Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬AM8170GddPCR/dPCR
1M 트리스-HCl, pH 9.0Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬J60707입니다. AP중화 완충액
24-딥 웰 마이크로플레이트Enzyscreen, Heemstede, 네덜란드CR1424cl현탁 배양 장비
250mL 폴리카보네이트 삼각형 플라스크(벤트 캡 포함)Corning, New York, NY , 미국431144현탁 배양 장비
66 - 440 kDa 분리 8x25 모세관 카트리지BioTechne, 미국 미네소타주 미니애폴리스SM-W008 시리즈자동 웨스턴 블롯 키트
96웰 2.2mL 폴리프로필렌 DeepWell Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬AB0661샘플 처리 및 보관 플레이트
96웰 블랙/클리어 바닥판, TC 표면Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬165305형질도입 분석
AAV2 VP1, 재조합 단백질PROGEN, 하이델베르크 독일640823웨스 시약
AAV2 VP2, 재조합 단백질PROGEN, 하이델베르크 독일640824웨스 시약
AAV2 VP3, 재조합 단백질PROGEN, 하이델베르크 독일640825웨스 시약
AAV2 엑스프레스 ELISAPROGEN, 하이델베르크 독일PRAAV2XPHT 수지 정제 샘플에 사용됩니다.
Wes용 안티 마우스 감지 모듈BioTechne, 미국 미네소타주 미니애폴리스DM-002자동 웨스턴 블롯 키트
분석/템플릿별 포워드 프라이머관습관습ddPCR/dPCR
분석/템플릿별 프로브관습관습ddPCR/dPCR
분석/템플릿별 역방향 프라이머관습관습ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - 액체FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, 산타아나, 캘리포니아, 미국NC1192689현유세포 배양용 배지
소 혈청 알부민 SERVA 전기영동, 하이델베르크, 독일c소 혈청 알부민부착 세포 배지 보충제
통기성 레이온 필름, 멸균 VWR International LLC, 미국 펜실베이니아주 래드너391-1262현탁 배양 장비
C1000 열순환기Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국1851096ddPCR
CaptureSelec AAVX 리간드 누출 ELISA 키트Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬8113522000엘리사
Cedex HiRes 분석기 Roche Holding AG, 바젤, 스위스5650216001셀 카운터
CELL 배양 마이크로플레이트, 96웰Greiner Bio-One, Kremsmü nster, 오스트리아655162Adeherent 세포 배양 장비
구연산Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국5949-29-1정제 시약; 주의
CMOS 기반 TEM 카메라 TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, 길칭, 독일XF416 비디오 및 이미지 처리 시스템
나침반 소프트웨어(버전 6.3.0)BioTechne, 미국 미네소타주 미니애폴리스WES 소프트웨어
Costar 6-well 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트Corning, New York, NY , 미국    3516Adeherent 세포 배양 장비
ddPCR 액적 발생기 오일 Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국#1864110ddPCR 시약
ddPCR 액적 리더 오일 Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국#1863004ddPCR 시약
프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음) Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국#1863023ddPCR 시약
DMEM, 고포도당Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬11960044부착 세포 배양용 배지
DMEM, 저포도당Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬11885084부착 세포 배양용 배지
DNA 저결합 96웰 플레이트Eppendorf, 함부르크, 독일30129504ddPCR/dPCR
DNA 저결합 튜브Eppendorf, 함부르크, 독일30108051ddPCR/dPCR
DPBSThermo Fisher Scientific, 미국 월섬14190094세척 완충액
EM 그리드(T600H-Cu 698 l/inch 육각 메쉬 얇은 막대; EMS)전자 현미경 과학, 미국 펜실베이니아주 햇필드FFTH600-Cu-UL전자현미경 분석
EVO M5000 이미징 시스템Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬AMF5000형질도입 분석을 위한 라이브 이미징 현미경
EZ 스탠다드 팩 3BioTechne, 미국 미네소타주 미니애폴리스PS-ST03EZ-8자동 웨스턴 블롯 키트
Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific, Schwerte, 독일11507411샘플 처리
Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브Fisher Scientific, Schwerte, 독일10203001샘플 처리
Geltrex LDEV 프리 감소 성장 인자 기저막 매트릭스Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬  A1413201배양판 코팅
글루타맥스 보충제(L-알라닐-L-글루타민)Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬35050061부착 세포 배지 보충제
HEK293AThermo Fisher Scientific, 미국 월섬R70507형질도입 분석(연구용만 해당)
HEK293TATCC, 미국 버지니아 주 매너서스CRL-3216rAAV 생산에 사용되는 Adeherent 세포 배양(연구용만 해당)
HEPES 용액, 1MMerck, 다름슈타트, 독일#H0887부착 세포 배지 보충제
HL-Salt 활성 뉴클레아제, SAN(25 U/µ L)ArcticZymes Technologies, Tromsø, 노르웨이70910-202ddPCR/dPCR
HydroSpeed 마이크로플레이트 세척기테칸, Mä nnedorf, 스위스30190101엘리사
iCell 성상세포 키트, 01434FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨R1092형질도입 분석
iCell 모터 뉴런 키트, 01279FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨R1051형질도입 분석
인피니트 200 프로테칸, Mä nnedorf, 스위스30213617엘리사
JEM-1400Plus는 투과 전자 현미경입니다.JEOL Ltd., 아키시마, 도쿄, 일본JEM-1400플러스투과 전자 현미경
핀이 있는 저증발 샌드위치 커버Enzyscreen, Heemstede, 네덜란드CR1224c현탁 배양 장비
마이크로플레이트 리더  스펙트럼맥스 i3Molecular Devices, 산호세, 캘리포니아, 미국i3x엘리사
마우스 anit-AAV2 VP1/VP2/VP3 단클론 항체PROGEN, 하이델베르크 독일690058웨스 시약
뉴클레아제가 없는 물 Roche Diagnostics GmbH, 만하임, 독일3036430103ddPCR/dPCR
Opti-MEM, 환원 혈청 배지 Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬#31985070PEI-DNA 복합체 형성용 배지
PBS Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬#10010023세척 완충액
PEI-MAX, 폴리에틸렌이민, 1mg/ml 스톡폴리사이언스 유럽,  Hirschberg an der Bergstraß e, 독일24765 또는 24765형질감염 시약
페이프로Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, 프랑스101000033/10mL형질감염 시약
Pierce 미세투석 플레이트, 96웰, 0.3mL, 20K MWCOThermo Fisher Scientific, 미국 월섬A50472정화 장비
폴록사머 188Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국P5556-100mL세포 배양 시약; 주의
폴리-L-오르니틴 용액(0.01%)시그마-알드리치A-004-M형질도입 분석
프로테이나제 K 용액(20 mg/mL)Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬25530049ddPCR/dPCR
프로틴 심플 " 웨스"BioTechne, 미국 미네소타주 미니애폴리스004-600자동 웨스턴 블롯 장치
QIAcuity Eight 플랫폼 시스템Qiagen, Hilden, 독일911052dPCR
QIAcuity 나노플레이트 8.5k 96웰Qiagen, Hilden, 독일250021ddPCR/dPCR
QIAcuity 프로브 PCR 키트Qiagen, Hilden, 독일250101, 250102 또는 250103ddPCR/dPCR
QIAcuity 소프트웨어 제품군 1.2Qiagen, Hilden, 독일dPCR 소프트웨어
QX 매니저 Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국ddPCR 소프트웨어
QX200 액적 리더Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국1864003ddPCR
스크류 캡 마이크로 튜브, 1.5 ml, PCR 성능 테스트 완료사르스테트, Nü mbrecht, 독일72.703.416현탁 배양 장비
스크류 캡, DNA LoBind, 5.0 mLEppendorf, 함부르크, 독일30122348현탁 배양 장비
셰이커 인큐베이터Infors AG, 보트밍겐, 스위스멀티트론현탁 배양 장비
피루브산나트륨(100mM)Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬11360070부착 세포 배양용 배지
초음파 처리기 마이크로 플레이트 혼 시스템QSonica, 뉴타운, 코네티컷, 미국Q700MPXC조 용해물 생성에 사용되는 초음파 발생기
정신SPIRIT 데이터베이스 링크: https://spirit.cladiac.com/aav.html 
Steriflip-GP 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 장치Merck Millipore, 미국 매사추세츠주 벌링턴SCGP00525완충액 준비 장비
T-175, 세포 배양 플라스크, 550 ML, 175 CM²Greiner Bio-One, Kremsmü nster, 오스트리아660175Adeherent 세포 배양 장비
트립신/EDTA 0.025%Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬R001100세포 배양 시약
바이러스 생산 세포 2.0(VPC2.0)Thermo Fisher Scientific, 미국 월섬A49784 또는 A51218rAAV 생산
J63596입니다. 케이2작업 용액 PBST의 경우 1:10 희석

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