급성 호흡곤란 증후군에 준비된 앵커리지 의존 중간엽 기질 세포의 미생물반응기 기반 생성

Summary

고정 의존 세포의 마이크로캐리어-미생물반응기 생성에 관한 프로토콜이 잠재적인 세포 기반 치료법으로 설명되어 있습니다. 급성 호흡곤란 증후군의 사용 사례를 목표로 하며, 플라스크 기반 공정 조건에 비해 유사한 세포 수율과 유리한 유전자 발현을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다른 앵커리지 의존성 세포 및 표적 적응증에도 확장 가능합니다.

Abstract

세포 기반 치료는 다양한 건강 상태에 대한 신흥 치료 접근법입니다. 그러나 충분한 양의 고품질 셀을 생산하는 것은 여전히 과학적·기술적 도전 과제로 남아 있습니다. 최종 세포 생성물은 멸균할 수 없으며; 따라서 멸균성과 설계에 의한 품질 고려사항이 가장 중요합니다. 고정 의존 세포의 경우, 플라스크 기반 확장은 여전히 개발 및 산업 규모에서 사용되며, 이는 큰 물리적 발자국을 요구하고, 생화학적 환경(pH,_CO2 및_O2, 영양소 및 대사산물의 확산 구배)을 제한하며, 최종 세포 품질에 영향을 미칠 수 있는 물리적 신호를 제공합니다. 이러한 도전 과제는 바이오리액터 기반 제조 접근법의 채택을 촉진했지만, 이러한 접근법은 일반적으로 부피 규모로 진행되어 탐색적 벤치탑 연구나 공정 개발에는 도전 과제가 발생하고 비용이 부담스러울 수 있습니다. 미생물반응자-미세운반자 세포 치료 생산은 세포원의 시험 사례인 간엽 기질 세포의 경우 배양 중 생화학적 조절을 제공하는 것으로 보고되었습니다. 시험 관 내 세포 질 초기 평가를 위해 급성 호흡곤란 증후군이 잠재적 사용 사례로 고려되었습니다. 여기 제시된 접근법은 미생물생물반응기 내 작은 부피(2 mL)와 엄격한 생화학적 제어 덕분에 벤치 탑 규모에서 빠른 공정 개발을 가능하게 합니다. 중간엽 기질 세포와 같은 고정 의존 세포 유형에 이를 달성하기 위해 미생물생물반응기 공정의 상당한 수정이 필요했으며, 사내에서 마이크로유체 공정을 통해 생산된 젤라틴 마이크로캐리어 플랫폼을 활용했습니다. 여기서는 미생물생물반응기에서 이러한 앵커리지 의존 세포를 배양하는 방법과 공정 매개변수에 대한 추가 세부 사항을 설명하여, 다른 연구자들이 자신의 사용 사례와 세포원 유형에 맞게 이러한 관행을 조정할 수 있도록 돕고자 합니다.

Introduction

살아있는 세포를 치료제로 사용하는 것은 최근 여러 건강 문제에 대한 유망한 새로운 치료 옵션으로 떠오르고 있습니다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등 이전에 사용 가능한 모든 치료에 저항했던 이른바 액체암 환자들에게 지속적인 관해를 가져왔습니다^1. 최근에는 중간엽 줄기세포/기질 세포(MSC) 제품(Ryoncil)이 스테로이드 저항성 급성 이식편대숙주 질환(SR-aGvHD)을 앓고 있는 어린이 치료에 승인되었으며, 이 질환은^사망률이 50%> 2. 하지만 다른 충족되지 않은 임상 요구를 확장하려면 치료법과 그 제품을 개발·제조할 수단의 집중적인 개발이 필요합니다.

이러한 충족되지 않은 임상적 필요성 중 하나는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 앓고 있는 개인들에게서 발견될 수 있습니다. 여기서는 ARDS를 구체적인 사용 사례로 설명하여 방법, 결과, 그리고 다른 질병 표적으로의 확장 가능성에 대한 논의를 제시합니다. ARDS는 매우 치명적(몇 시간에서 일일 단위로 진행됨), 유병률(미국에서 연간 20만 건 >), 치명적인 적응증(27%-46% 사망률, 증상 심각도에 따라 다름)으로, COVID-19 팬데믹 기간 동안 SARS-CoV-2 감염 환자의 사망 기전으로 다시 주목받았다 ^3,4. ARDS는 폐혈관 투과성 증가로 인해 간질성 부종, 폐포 홍수, 호중구 및 적혈구 등 세포 구성 요소가 폐포 구획⁵로 침투되는 것이 특징입니다. ARDS의 초기 삼출 단계에서 선천성 면역세포 매개 염증이 내피 및 상피 장벽의 완전성을 손상시키고 염증성 사이토카인 분비를 통해 면역 세포의 모집과 활성화를 촉진함으로써 이러한 병원성 결과를 촉진합니다; 염증 반응의 성공적인 해결, 장벽 무결성 회복, 과도한 섬유화 방지는 생존에 매우 중요합니다^. 렘데시비르와 같은 항바이러스 치료제가 SARS-CoV-2 매개 ARDS와 싸우는 데 유망함을 보여주었지만, 다른 병인에 대해서는 현재 사망률을 줄이는 승인된 약물 치료법이 없습니다^.

MSC는 전신 주사 시 폐 특이적 영양성과 주변 미세환경에 면역조절성 파라크린 신호를 분비하는 능력으로 인해 ARDS 치료에 유망한 접근법을 제공할 수 있다 ^6,7. 기전 연구들은 인터루킨-10(IL-10)⁸, 인돌아민 2,3-디옥시게나제1(IDO1)⁹, 프로스타글란딘 E2(PGE2)¹⁰ 등 파라크린 인자의 발현이 급성 폐손상(ALI)/ARDS¹¹을 포함한 다중 적응증에서 MSC 치료 효능을 유발하는 데 관여한다고 밝혔습니다; 따라서 이들 유전자 산물의 발현 수준은 임상 효능을 예측할 수 있는 잠재적 핵심 품질 속성(pCQA)으로, 제조 시 최종 세포 산물에 대한 처리 가능한 방출 기준을 제공합니다. 하지만 효과적인 치료용 용량에 도달하기 위해 충분한 세포를 생산하는 것은 어렵습니다; 예를 들어, 리오실은 환자 질량의⁶ 세포당 2회 용량을 주 2회 투여하는 데 적응증이^{있습니다.} 80kg 환자라면 단일 치료 과정에 12억 MSC가 > 것에 해당하므로, 이 2차원 성장 상태를 수용하기 위해 충분한 표면적을 수용하기 위해 큰 물리적 발자국이 필요합니다. 이 생체 세포 제품은 환자 투여 전에 살균할 수 없으므로, 멸균 방식으로 생산할 수 있는 현행 우수 제조 기준(Good Manufacturing Practice) 지침을 활용하는 것이 매우 중요하며, 이는 세포 제조의 물류 복잡성을 더하고 결과적으로 상품 비용을 증가시킵니다¹³.

더 나아가, 이전 연구들은 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플라스크에서 전형적인 MSC 생성이 집단 내 표현형 이질성 발생에 기여한다는 증거를 보여주었습니다. 일부 최종 용도에서는 연구 및 임상 번역에서 배치 간 품질 관리 작업이 어려워집니다^{14, 15, 16, 17}. TCPS 플라스크에서 제공되는 제한된 생화학적 방제, 예를 들어 가스, 영양분, 대사 폐기물의 확산 구배, 불완전한 pH 조절 등이 이러한 도전에 기여한다고 추측됩니다.

이러한 문제들은 동적 혼합을 포함한 제어된 3차원 성장 형식에서 제공되는 우수한 생화학적 조절과 세포 밀도를 활용하기 위해 바이오반응자 기반 배양 채택을 촉진^합니다. 하지만 바이오리액터 기반 가공 또는 제조에는 고유한 도전 과제가 있습니다: 고정 의존 세포 유형인 MSC는 바이오리액터에서 성장할 기질이 필요하므로 마이크로캐리어의 추가가 필요합니다. 또한, 많은 상업용 생물반응기는 세포 품질의 측정 가능한 지표 발현에 영향을 미치는 미지의 공정 매개변수를 식별하고 정교화하기 위해 필요한 탐색적 벤치 상형 연구를 위해 3L의 성장 배지 > 정도 자원 집약적인 부피 규모로 작동합니다. 이러한 특징들은 잠재적 중요 품질 속성(pCQAs⁾으로 설명됩니다.

Krupczak 등은 이전에 마이크로캐리어-미생물반응기 접근법을 보고하여 ARDS에 대해 pCQA 발현이 개선된 MSC를 생산했으며, 이는 시험관 내 평가에 한정되었다^. 이 접근법은 사내에서 생산된 용해성 젤라틴 마이크로캐리어 플랫폼과 상업적으로 이용 가능한 미생물생물반응기 플랫폼인 Mobius Breez 마이크로바이오리액터²¹을 결합한 것입니다. 이 미생물생물반응기는 2mL 일회용 일회용 반응기 챔버를 사용하며, 온도, pH,_{CO2, 산소 조절} 등 생화학적 제어 개선을 위한 많은 바람직한 기능을 동적으로 혼합된 폐쇄 루프 관류 공급 시스템에서 구현했으나, MSC와 같은 고정 의존 세포를 염두에 두고 설계되지는 않았습니다. 실제로 원자로 내용물을 주입하는 표준 마이크로플루이딕 채널은 마이크로캐리어의 통과를 허용하기에는 너무 작아, 이 플랫폼에서 MSC를 성공적으로 생산하기 위해서는 상당한 적응이 필요합니다.

여기서는 이 미생물생물반응기를 MSC의 고정 의존 배양에 맞게 적응시키기 위한 상세한 프로토콜을 설명하고 그림을 제시합니다. 본 보고서에 보고된 공정 매개변수는 ARDS의 치료 효능에 대한 전임상 시험관 평가를 위한 MSC의 공정 개발 및 제조에 정보를 제공하기 위해 확인되었습니다. 그러나 원칙적으로 이 프로토콜은 다른 최종 사용자 응용, 기타 염증성 또는 면역 조절 관련 질환, 그리고 실험실 규모에서 향상된 생화학적 제어가 도움이 될 수 있는 다른 고정 의존 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다. 그림 1은 첨부된 영상에서 설명된 프로토콜을 도식화하며, 그림 2, 그림 3, 그림 4는 주요 결과를 보여줍니다.

Protocol

1. 미생물반응기 설치 및 준비

1. 필요한 수의 마이크로바이오리액터 소모품 준비
   1. 생물안전 캐비닛(BSC)이 켜져 있으며 멸균 상태인지 확인하세요. 새 소모품을 덮고 있던 포일 파우치를 봉지 상단을 뚫고 제거하고, 실험이 끝날 때까지 호일 봉지를 보관하세요(결함 시 로트# 세부 사항을 기록하기 위해). 외부 블리스터 포장을 열고 그 안에 담긴 수분 팩을 버리세요. 외부 물집 포장은 버리세요.
   2. 내부 블리스터 포장에 70% 에탄올을 뿌리고 BSC로 가져가세요. 내부 블리스터 포장을 열고 버리세요.
   3. 멸균 주사기를 사용해 플런저를 제거하고 노즐을 0.22 μm 멸균 필터에 연결합니다. 주사기 통에 멸균되지 않은 초순수 50mL를 부어줍니다. 주사기를 대기 중인 멸균 50mL 튜브 위에 올려놓은 상태에서 플런저를 다시 주사기에 넣고, 멸균된 여과된 물을 대기 중인 수집관에 주입합니다.
   4. 병걸이에 있는 Bottle LL에 연결된 투명 플라스틱 캡을 제거하세요. 새 멸균 50mL 주사기를 사용해 플런저를 제거하고 노즐을 병 LL에 연결하세요. 멸균된 여과된 물을 주사기 통에 부어 병 LL에 주입하세요.
      참고: 바늘 없는 연결 포트가 제조사의 멸균 과정에서 걸릴 수 있으므로, 병의 밀봉을 깨고 내용물을 성공적으로 주입하려면 주사기를 여러 번 연결하고 분리해야 할 수 있습니다. 또는 튜브 용접기를 사용해 소스 병을 용접 가능한 튜브에 멸균 상태로 연결할 수도 있습니다.
   5. 같은 절차를 사용해, 병 L에 비FBS 보충제가 포함된 저포도당 DMEM 25mL, 병 R에 멸균 PBS 25mL, 병에 8mL의 부착 방지 세척액을 채웁니다. 각 액체마다 새 멸균 주사기를 사용하세요.
   6. 이 과정을 실험에서 필요한 만큼 많은 소모품에 대해 반복합니다.
2. 이 실험에 사용되는 각 POD마다 POD 자가 테스트를 수행하세요.
   참고: 자가 검사는 문제없이 완료되어야 합니다; 자가 테스트의 구성 요소가 실패하면, 진행하기 전에 해당 실패를 먼저 해결하세요.
3. 자가 검사 카세트는 빛 차단 보관 가방에 넣으세요.
4. 아래에 설명된 대로 소모품을 바이오리액터에 장착하세요.
   1. 소모품 밸브에서 녹색 테이프를 제거하고 POD에 장착하세요. 클램프를 다시 설치하고 가스나 공기가 빠져나가는 소리가 들리지 않는지 확인하세요.
   2. 흰색 병걸이 압력 센서 라인, 빨간색 공기 압력 라인, 그리고 소모품과 베이스 스테이션/POD 사이에 파란색 진공 라인을 연결하세요. 측면 주입 포트는 흰색 물방울 클램프로 고정되어 있는지 확인하세요.
   3. 소프트웨어 절차를 따라 새로운 실험을 시작하세요. 이 과정은 자동 프라임과 보정 기능으로 마무리되며, 약 4-5시간 걸리고 밤새 작동할 수 있습니다.
5. 각 병 선반에 POD 위치를 표시해 바이오리액터에서 꺼낸 후 어떤 POD로 반환할지 쉽게 구분할 수 있도록 하세요. 위치를 표시하는 데는 색 테이프를 사용하세요: Pod0 = 빨간색, Pod1 = 주황색, Pod2 = 노란색, Pod3 = 녹색. 실험 이름과 날짜를 테이프에 적으세요.
6. 소모품은 하룻밤 동안 보정하도록 두세요. 매체가 반응로로 들어와 폐기물 라인으로 배출될 수 있도록 하세요.
7. 액체 질소에 저장된 세포를 사용할 계획이라면, 주입 전에 냉동 보관 후 24시간 동안 회복할 수 있도록 해동하고 도판을 >하세요.

2. 재보정 및 마이크로캐리어 준비

1. 자동 프라이밍과 보정 단계가 성공적으로 완료되었는지 확인하세요.
   1. 보정이 성공적으로 완료되지 않았다면, 근본 원인 문제를 찾아 수정한 후 재보정을 시도하세요. 일반적인 문제로는 흰색 병걸이 클램프를 제거하지 않거나, POD에 넣기 전에 소모품에서 녹색 테이프를 제거하지 않거나, 미디어 병 내 미디어 용량이 부족한 경우가 있습니다.
2. 용존 산소 센서가 안정적인지 확인하세요.
   1. 보정 후 소모품의 거의 10%가 DO 센서에서 센서 드리프트를 보입니다. 선호하는 시정 조치인 전체 보정을 다시 실행하는 것입니다. 필요하다면 다음 중 하나를 수행하세요.
      1. 카세트에 공기가 없는지 확인한 후, 제어 표시 표시 체크박스를 해제한 후 자동 보정 DO와 pH를 클릭하세요.
         1. 재보정이 필요할 때 원자로에 공기가 존재했다면, 해당 POD의 창 왼쪽 상단에 있는 파란색 왼쪽 화살 표를 클릭하여 MBS 대시보드 첫 페이지로 돌아가십시오. 버튼을 클릭해 수동 조작 을 시작 하세요. 폐기물 튜브 준비 박스를 체크하고 텍스트 입력란에 W를 입력해 폐기물 병을 선택하세요. Eject-wash 버튼을 클릭한 후 팝업 창에서 'Yes'를 클릭하세요. 이렇게 하면 원자로 챔버가 비워지고 미디어 소스 병에서 매체를 채웁니다.
3. 각 조건별로 15mL 원뿔 튜브에 적절한 수의 마이크로캐리어를 준비하세요.
   참고: 마이크로캐리어 수, 집합 표면적, 셀 시딩 밀도는 귀하의 응용 분야에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에서는 절대 수의 마이크로캐리어를 주입하여 T75 플라스크와 비교할 수 있도록 75 cm² 의 이용 가능한 마이크로캐리어 성장 면적을 만드는 것이 권장됩니다.
4. 마이크로캐리어가 튜브 내에 자리 잡도록 허용하고; 미세운반체를 제거하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 흡입하여 세포와 신선한 배지를 위한 공간을 확보하세요.

3. 셀 및 마이크로캐리어 주입

1. 자동 프라임과 보정 기능이 성공적으로 완료되었는지 확인하세요.
2. 표준 서스펜션 셀 워크플로우에 따라 반응기에 접종하는 것처럼 소프트웨어 창을 클릭하세요.
3. 팝업 창에 이 단계에서 세포 주입이 없었음을 표시하는 메모를 입력하세요.
4. 수동 조작을 작동시켜 반응기 혼합을 일시정지하고, 병 선반 라인에 흰색 C-클램프를 추가하세요.
5. 각 소모품을 제거하고 BSC로 옮기세요. 폐기물과 관류병에서 사용한 배지를 제거하고 버리세요.
   1. 연구 중 어느 시점에 컨디셔닝 배지를 수확할 계획이라면, 큰 관류 병과 관류 병 내 작은 1.5mL 튜브의 모든 폐기물을 반드시 제거해야 합니다.
6. L병에서 비혈청 보충제가 첨가된 성장 배지를 꺼내 버리세요. L병을 멸균 PBS 약 ~20mL로 씻어내고 버리세요. L 병에 혈청 보조 배지 25mL를 추가하세요.
7. 소모품을 각각 POD로 돌려놓으세요. 실험이 끝날 때까지 미디어 소스 병을 얼음에 보관하세요. 매일 얼음을 새롭게 하세요.
   참고: 젖은 얼음은 냉동용 팩으로 보충하여 온도 조절 시간을 연장할 수 있습니다.
8. 원자로를 PBS로 세척하고 라인을 세척하세요.
   1. 병 플러시 버튼을 클릭하고, 병 L의 라디오 버튼을 활성화한 뒤, 폐기물 배출을 선택한 후 MSC세럼 플러시 시작을 클릭하세요.
      참고: 이 과정에서 새로 추가된 hMSC 매체가 라인을 통해 배출되어, FBS 보조가 아닌 매체가 더 이상 원자로로 들어오지 않도록 합니다.
   2. 다시 병 플러시 버튼을 클릭하고, Radio 버튼을 선택해 병 RR을 선택한 후 플러싱을 시작하세요. 이렇게 하면 부착 방지 세척액이 라인을 통해 흘러내리고, 반응기 진입에 준비가 되어 있습니다.
   3. 병 내용물 창에서 소프트웨어에서 MSCserum이 실제로 PBS를 포함하는 병 R에 위치해 있음을 표시하세요.
   4. 수동 조작으로 들어가서 폐기병에 대해 세 번의 배출-세척 사이클을 수행하세요.
9. 반응기에 부착 방지 세척액을 추가하세요.
   1. 병 내용물 창으로 돌아가서 MSCserum이 실제로 부착 방지 세척액이 포함된 병 RR에 있다고 표시하세요.
   2. 수동 조작으로 가서 폐기병에 한 번 배출-세척 사이클을 수행하세요.
      참고: 이전 PBS 세척은 DMEM 내 어떤 부품도 반접착 워시에 간섭하지 않도록 하기 위한 것이었습니다; 이제 반응기는 미량 PBS가 포함된 부착 방지 세척액으로 가득 차 있어야 합니다.
10. 30분이 지나면 부착 방지 용액이 남아 있으면, PBS로 소모품을 헹구세요.
    1. 병 내용물 창에서 소프트웨어에서 MSCserum이 실제로 PBS를 포함하는 병 R에 위치해 있음을 표시하세요.
    2. 수동 조작으로 들어가서 폐기병에 대해 세 번의 배출-세척 사이클을 수행하세요.
    3. 병 내용물 창으로 돌아가서 소프트웨어에서 MSCserum이 hMSC 매체가 포함된 병 L에 위치해 있음을 표시하세요.
11. 셀과 마이크로캐리어 주입을 기다리기 위해 원자로를 비우세요. 수동 운영 패널에서 '재주종(Reinoculate) '을 클릭하고, 대시보드가 원자로에 백신을 접종하라고 표시하는 단계에서 시스템을 그대로 두세요.
    참고: 여기서 '백신'이라는 용어는 단순히 미생물반응기에서 증식을 목적으로 한 세포를 주입하는 것을 의미합니다.
12. 추가 저항을 추가하여 기본 R0 저항과 일치하는 혼합 속도를 조절하세요.
13. 플라스크에서 세포를 꺼내 혈구계에 세어보세요. BSC에서 모든 개방 수술을 수행하여 멸균을 보장합니다.
    1. 배지를 흡입한 후 5-10mL 미리 데워진 PBS로 세척합니다. PBS를 흡인하고 플라스크에 5mL의 트립신 + EDTA를 추가하세요.
    2. 37°C에서 5분간 또는 모든 세포가 플라스크 표면에서 눈에 띄게 떠올릴 때까지 배양합니다.
    3. 트립신 활성을 중화시키기 위해 미리 가열한 hMSC 배지 10mL를 추가하세요. 액체 내용물을 꺼내 15mL 원심분리관에 보관하세요.
    4. 셀을 300 x g 에서 5분간 원심분리합니다. 상원액을 버리고 세포 펠릿을 적절한 양의 hMSC 배지에 재현탁하여 계수를 진행합니다. 완전히 융합된 T75 플라스크의 경우 적절한 부피는 일반적으로 2-4 mL이며, 이는 mL당 ~1-2E6 세포 농도를 제공합니다.
    5. 재현탁된 세포 샘플을 같은 비율의 Trypan Blue 생존성 염료와 혼합한 후, 이 혼합물을 혈구계에 넣어 계수를 측정합니다. 제조사 설명서에 따라 셀 수를 세세요.
14. 150,000개의 세포에 도달하는 데 필요한 세포 용액의 부피를 계산하고, 그 양을 각 조건별 마이크로캐리어가 들어 있는 대기 중인 15mL 원뿔형 튜브에 피펫 넣습니다. 튜브 내 부피를 2.2에서 2.5mL 사이로 채우고, 신선하고 따뜻한 hMSC 배지를 넣으세요.
    참고: 각 15 mL 원뿔형 원뿔의 부피는 2 mL보다 약간 커야 하며, 이는 주입 시 기포를 방지하기 위해 약간 과충전되는 반응기 상태를 초래하며, 기포는 이후 단계에서 평형화될 예정입니다.
15. 적절한 부피의 세포를 T75 플라스크 대조군에 추가하세요.
16. 한 번에 한두 개의 소모품을 다루면, POD에서 소모품을 제거해 BSC로 가져오세요.
17. 녹색 4인치 무딘 바늘로 5mL 주사기에서 세포와 미세운반체를 추출하세요. 셀과 마이크로캐리어를 원자로에 주입하세요.
18. 소모품을 기지국으로 돌려보내고 모든 소모품이 주입될 때까지 반복하세요.
19. 접종이 완료되었음을 표시하려면 소프트웨어 창 을 클릭하세요. 소프트웨어가 일반 홈 페이지로 돌아오면, 소모품 출력 라인에서 흰색 클램프를 제거하세요.
20. 수동 조작에 들어가 배출 초과 기능을 수행하고, 출력 포트를 P로 설정하여 관류를 수행합니다. 정적 믹싱 모드를 활성화하여 1680초 켜고 120초 꺼지세요. 정적 믹싱을 위해 믹싱 주파수는 5Hz로 유지하세요.
21. 광학 밀도 기준 측정을 꺼.
    1. MBS 클라이언트를 열고 연결(Connect)을 클릭하세요. 인용문에 포함된 다음 명령어를 입력하세요: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. 전송을 클릭하고 명령어가 성공적으로 전송되었는지 확인을 기다린 후 MBS 클라이언트를 종료하세요.
22. 24시간 후에는 정적 혼합 모드를 비활성화하고 일반 혼합을 다시 활성화하세요. 믹싱 주파수를 1.5Hz로 낮추세요.

4. 미생물반응기 작동

1. 미생물반응기를 매일 모니터링하여 실험에 문제가 없도록 하세요. 매체 소스 병이 >5mL의 매질을 유지하도록 하여 반응기에 성공적으로 관류할 수 있도록 하세요.
2. 미디어 소스 병의 온도 조절을 유지하려면 얼음통을 필요에 따라 교체하세요. 광 차단 드레이프를 미생물생물 반응기 앞쪽에 유지하여 휘발성 매체 성분의 빛에 의한 열화를 방지하세요.
3. 기포가 원자로에 유입되지 않도록 하세요. TCPS 플라스크 제어에서 매체를 주기적으로 변경하는 것을 잊지 마세요.

5. 미생물반응기 수확

1. BSC가 멸균되어 작동 준비가 되었는지 확인하세요.
   1. 다음 필요한 시약을 구슬 또는 물욕에서 37 °C로 예열합니다: ~25 mL의 따뜻한 hMSC 배지, 10 mL의 따뜻한 PBS, 그리고 수확에 필요한 10 mg/mL Pronase 1.5 mL.
2. 수확을 위해 병걸이를 준비하세요.
   1. 소프트웨어에서 각 POD마다 수동 운영 모드를 활성화하세요.
   2. 소모성 입력선을 흰색 C-클램프로 선의 투명 부분에 고정하세요.
   3. 소모품을 BSC로 제거하세요. 폐기물 병 내용물을 꺼내 버리세요.
   4. 폐기물 병에 ~20mL PBS를 넣고 버리세요. 미디어 병 내 남은 부피를 평가하고 필요하다면 신선한(차가운) hMSC 미디어를 보충하세요.
      참고: 여기서는 수확을 위한 세 가지 필수 배출-세척 사이클을 완료하기 위해 > mL의 배지가 필요합니다.
   5. 폐기물 병에 ~5mL의 차가운 hMSC 배지를 감싸 채취한 액체를 완충합니다.
3. 미생물반응기에서 세포를 채취하세요.
   1. 1 mL 주사기를 사용해 10 mg/mL 프로나제 200 μL 양과 ~300-400 μL 공기를 흡입합니다.
   2. 측면 포트 인젝션 라인 캡을 돌려 풀고 바늘 없는 밸브 커넥터에 70% 에탄올을 뿌리세요. 매듭진 측면 포트 주입 라인을 고정하는 테이프를 제거하고 매듭을 풀어주세요. 흰색 물방울 클램프를 풀어주세요.
   3. 1mL 주사기를 연결하고 프로나제를 부드럽게 반응기에 주입하세요. 액체를 주입 라인을 따라 공기로 따라 따라 흘러가게 하여 모든 액체 내용물이 반응기로 전달되도록 하세요.
   4. 물방울 클램프를 다시 연결하고 측면 포트 주입 라인을 다시 캡으로 고정하세요. 소모품을 POD에 다시 연결하고, 모든 라인을 다시 연결하며, 흰색 C-클램프를 제거한 후 혼합을 재개하세요.
   5. 폐기물과 미디어 소스 병은 얼음 위에 보관하세요. 5분 타이머를 시작하고 프로나스가 반응기 내 마이크로캐리어를 소화하도록 하세요.
   6. 5분 후에는 마이크로캐리어가 더 이상 원자로에 눈에 띄지 않는지 확인하여 분해되었는지 확인하세요. 마이크로캐리어가 여전히 보이면 소화를 위해 1분을 더 두세요. 마이크로캐리어가 보이지 않으면 진행하세요.
   7. 세포를 채취하세요. 수동 운영 모드를 활성화하고, # of cycles를 3으로 설정하며, 출력 포트를 W로 폐기용으로 설정한 후 Eject Wash를 클릭하세요.
   8. 배출 세척 사이클이 끝난 후에는 소모품을 다시 BSC로 옮기고 10 또는 20 mL 주사기로 폐기병 내용물을 꺼냅니다.
   9. 폐기병의 내용을 15mL 원뿔형 원심분리관에 분배합니다. 세포를 300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 흡인한 후 세포 펠릿의 크기를 평가합니다.
   10. 세포 펠릿을 1-5mL 성장 배지 또는 PBS에 재현탁한 후 혈액세포계로 세포 수를 세세요. 이 과정을 모든 소모품에 대해 반복하세요.
4. 일반적인 세포 배양 프로토콜을 사용해 플라스크 상태의 상태를 수확하세요. MSC의 전형적인 프로토콜은 3.13에 설명되어 있습니다.

6. 미생물반응기 조건과 플라스크 조건에서 세포를 분석하여 후속 적용을 위해

참고: 주요 결과를 산출하기 위해 사용된 분석 방법은 아래에 간략히 제공되며, Krupczak, Farruggio, Van Vliet (2024)²⁰에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 환경 제어: 미생물생물반응기가 제공하는 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 배양 기간 동안 각 소비재의 통합 센서에서 데이터를 접근하고 표시합니다. 이 데이터는 마이크로바이오리액터에 포함된 노트북에 설치된 Breez Explorer 소프트웨어에 제공됩니다.
2. 세포 수율: 위에서 설명한 대로 MSC를 채취하고 300 x g 에서 5분간 세포를 펠릿으로 넣으세요. 상정액을 조심스럽게 제거하고 적절한 양의 PBS 또는 hMSC 배지(1-2 mL)에 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 재현탁된 세포 혼합물을 샘플로 추출하여 같은 부피의 트리판 블루 염료와 섞으세요. 염색된 샘플 혼합물을 헤모세포미터 칩에 마이크로피펫 넣고, 자동 또는 수동 헤모사이트토미터로 세포 수와 생존 가능성을 측정합니다.
3. 아래에 설명된 2단계 역전사 정량 중합효소 연쇄반응으로 유전자 발현을 확인하세요.
   1. RNA 정제: 제조사 지침에 따라 RNeasy Mini 키트를 사용해 각 샘플에서 RNA를 분리하고 정제하세요. 간단히 말해, 세포를 용해시키고, 세포 내용물을 정제 스핀 튜브로 옮긴 뒤, 각 완충제로 샘플을 세척하여 불필요한 세포 성분, 핵산, 단백질을 제거하여 이후 PCR에 방해가 될 수 있습니다.
   2. cDNA 변환: 제조사 지침에 따라 정제된 RNA를 상보성 DNA(cDNA)로 변환하기 위해 고용량 역전사 키트와 열 사이클러를 사용합니다. 간단히 말해, 키트 구성 요소를 해동하고 샘플 수에 맞는 볼륨으로 구성 요소를 조합해 마스터 믹스를 만드는 것입니다. 정제된 RNA와 준비된 마스터 믹스(각각 10 μL)를 PCR 플레이트의 각 웰에 적재하며, 각 샘플 식별 위치를 추적하는 데 주의를 기울입니다. 제조사의 프로토콜을 따라 열 사이클러에서 역전사 반응을 완료하세요.
   3. qPCR: 엑손 전반 시퀀스 특이적 프라이머를 사용해 프라이머 다이머를 피하고, 384웰 qPCR 플레이트에 전방향 프라이머, 역프라이머, 템플릿 cDNA, 뉴클레아제 무분수, 마스터 믹스를 적정 용량(일반적으로 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL 각각 1 μL)으로 적재하며, 각 유전자와 샘플에 대해 여러 개의 기술적 복제 웰을 사용합니다. 필요하다면 모든 유전자 표적을 포착하기 위해 여러 플레이트에 내용을 나누어 나누어 사용하세요. 특정 유전자 표적에 대한 모든 샘플이 동일한 플레이트에 로드되어 결과 간 변동을 방지하고, 각 플레이트에 적절한 하우스키핑 유전자 및 무템플릿 대조군이 있는지 확인하세요. 적절한 qPCR 기계에서 형광 강도를 측정하고 ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 정량화를 통해 유전자 발현을 계산합니다.

Results

이 미생물반응기는 약 10일간 배양 환경에서 환경 요인을 모니터링하고 조절할 수 있게 했습니다. pH(그림 2A), 온도(그림 2B), 용존 산소(그림 2C), 이산화탄소(그림 2D) 등 환경 요인은 미생물생물반응기 조건에서 정확히 측정 및 유지되었으나, 플라스크 조건에서는 배양 기간 동안 유지되지 않았습니다. 그림 2A-D의 데이터는 명확성을 위해 한 POD의 대표적인 결과를 보여주지만, pH, 온도, 용존 산소, 이산화탄소의 안정성에서 정량적으로 유사한 관찰이 지금까지 30건 이상의 독립 임상시험에서 관찰되었습니다...

Discussion

이 프로토콜에서는 마이크로캐리어-미생물반응기 방식을 사용하여 세포를 확장, 프라이밍, 수확하는 방법을 설명합니다. 이 공정은 MSC와 같은 앵커리지 의존 세포가 기존 TCPS 플라스크에 비해 생물반응기 플랫폼의 우수한 생화학적 제어 하에서 세포 수를 증가시킬 수 있게 하여 빠른 공정 개발에 적합합니다. 더 나아가, MSCs의 미세운반체-미생물반응기 생성은 ARDS 치료에 향상된 치료 효능을 보일 수 있는 프라이머드 세포 표현형을 만들어낸다는 점이 입증되었습니다.

바이오리액터 기반 접근법은 pH, 온도, 이산화탄소, 용존 산소 등 환경 변수를 모니터링하고 조절할 수 있는 등 공정 개발과 셀 제조에 중요한 이점을 제공합니다. 이러한 매개변수의 변동이 세포 수율과 표현형에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 기능이 없는 배양 플랫폼(기존 TCPS 플라스크 포함)은 일관성 없고 질과 양이 불안정한 세포 배치를 생성할...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
부착 방지 세척 용액	줄기세포 기술	7010
생물안전 캐비닛
브리즈 마이크로바이오리액터	밀리포어 시그마
원심분리기
원뿔관 15mL
원뿔관 50mL
둘벡코 변형 독수리 중량, 저혈당	깁코	11885084
에탄올
태아 소 혈청	깁코	A5670701
혈구계
실험실 테이프
마이크로캐리어
마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL
현미경
바늘, 블런트, 4인치, 18게이지	아마존	B0D663ZR6D
인산염 완충 식염수	코닝	21-040-CM
스트렙토마이세스 그리세우스의 프로나세스	밀리포어 시그마	10165921001
혈청학적 피펫, 10 mL	VWR	75816-100
멸균 탈이온수
주사기 필터, 0.22 um, 멸균	셀트리트 사이언티브 프로덕츠	229762
주사기, 1 mL	BD	309628
주사기, 20 mL	BD	302830
주사기, 5 mL	BD	309646
주사기, 50 mL	BD	309653
조직 배양용 폴리스티렌 플라스크, T75	써모피셔 사이언티브	130190
트리판 블루	시그마알드리치	T8154-100ML