연구 환경에서의 긍정적 강화 훈련을 통한 게르빌 복지 향상

요약

클리커 훈련은 실험실 게르빌에 대한 긍정적인 강화 기술 역할을 합니다. 이 방법은 긍정적 강화를 통해 스트레스를 줄이고 핸들링 효율성을 향상시켜 실험 동물의 웰빙에 기여하는 것을 목표로 합니다.

초록

스트레스를 최소화하고 종에 적합한 취급을 촉진하여 실험 동물 복지를 개선하는 것은 전 세계 현대 생물 의학 연구의 핵심 목표입니다. 널리 알려진 긍정적 강화 훈련의 형태인 클리커 훈련은 딸깍 소리를 조건화된 강화 물질로 사용하여 원하는 행동과 보상을 연결하여 동물이 스트레스를 줄이면서 더 빨리 학습할 수 있도록 합니다. 우리 연구 그룹은 이전에 클리커 훈련이 생쥐와 쥐의 인지 강화의 한 형태로 기능한다는 것을 입증했습니다. 본 연구에서 우리는 몽골 게르빌(Meriones unguiculatus)에 대해 이 훈련 접근 방식을 성공적으로 적용하여 저빌의 종별 행동 특성에 맞게 프로토콜을 조정했습니다. 43마리의 근친 교배 저빌(암컷 27마리, 수컷 16마리)으로 구성된 코호트는 표준화된 10일간의 클리커 훈련 프로토콜을 거쳤으며, 그 동안 음식 보상을 받는 대가로 실험자의 손에 자발적으로 접근하고 상호 작용하는 방법을 배웠습니다. 훈련 기간이 끝난 후, 동물들은 탐색적 행동과 인간-동물 상호 작용에 대한 훈련의 효과를 평가하기 위해 오픈 필드 테스트 및 표준화된 인간 상호 작용 테스트를 포함한 행동 평가를 받았습니다. 우리의 연구 결과는 저빌의 클리커 훈련 구현이 빠르고 효율적이며 내약성이 우수하다는 것을 보여줍니다. 훈련된 동물, 특히 암컷은 실험자의 손과의 자발적인 상호 작용이 증가하고 불안과 유사한 행동이 감소하는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 종에 적응한 클리커 훈련 프로토콜이 실험자와 동물 간의 신뢰 개발을 촉진하여 궁극적으로 스트레스를 줄이고 동물 복지와 실험 결과의 신뢰성을 모두 향상시킬 수 있음을 시사합니다.

서론

스트레스를 줄이고 복지를 개선하기 위해 생물 의학 연구에서 동물 사용을 개선하는 것은 널리 인식되는 국제적 목표입니다 ^1,2,3. 2022년 유럽연합 집행위원회는 유럽연합(Alures)에서 사용되는 838,539마리의 동물 중 3,440마리가 게르빌이라고 보고했습니다⁴. 독일에서는 동물복지법(TierSchG)⁵ 섹션 7(2)에 따라 2023년 약 146만 마리의 척추동물과 두족류가 동물 실험에 사용되었습니다. 과학적 목적으로 도살된 동물을 합치면 2023년 독일에서 사용되는 총 실험동물 수는 약 210만 마리에 달했습니다⁶. 이 수치는 생물의학 연구에서 저빌 사용의 관련성을 강조하며 동물 복지를 위한 프로토콜의 지속적인 개선의 필요성을 강조합니다.

실험 동물의 행동 요구와 종별 복지를 지원하는 관리 전략의 중요성은 윤리적, 과학적 실천에 필수적인 것으로 널리 인식되어 왔습니다⁷. 사육에서 인간과 동물의 상호 작용은 조련사와 동물 사이의 유대감을 조성하지 않고 동물을 더러운 우리에서 깨끗한 우리로 옮기는 필수 작업으로 제한되는 경우가 많습니다. 이러한 사회적 상호 작용의 부족은 스트레스로 이어질 수 있으며, 이는 동물의 행동과 생리학에 부정적인 영향을 미쳐 궁극적으로 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다⁸. 부적절한 취급은 연구 데이터의 변동성의 원인으로 잘 알려져 있습니다⁹. 예를 들어, 쥐의 꼬리를 들어 올리는 것은 불안과 스트레스를 증가시키는 반면, 터널 또는 손을 벌린 방법은 자발적인 접근 방식을 촉진하고 불안과 유사한 행동을 감소시킵니다^10,11. 취급은 글루코코르티코이드 수치와 같은 생리학적 지표에 대한 일관된 효과로 인해 소형 포유류 연구에서 표준화된 급성 스트레스 요인으로도 사용됩니다¹². 이러한 발견은 짧은 인간 상호 작용의 실질적인 영향과 세련된 저스트레스 처리 기술의 필요성을 강조합니다¹³.

훈련 기반 개선은 동물의 복지와 연구 품질을 모두 향상시키는 효과적인 방법으로 점점 더 인정을 받고 있습니다^10,14. 동물 연구에 사용되는 가장 효과적인 훈련 방법 중 하나는 클리커 훈련이며, 이는 종종 음식 보상과 짝을 이룹니다^15,16. 지난 수십 년 동안 클리커 훈련에 대한 34개의 연구가 발표되었으며, 이는 이 훈련 접근 방식에 대한 과학적 관심이 높아지고 있음을 반영합니다¹⁷. 연구에 따르면 개(47%)와 말(30%)이 가장 일반적으로 훈련된 실험 동물이며 고양이, 소, 물고기, 염소, 원숭이(각각 3%)가 그 뒤를 이었습니다¹⁷. 훈련된 동물은 자발적으로 시술에 참여하여 스트레스를 줄이고 신체적 구속의 필요성을 최소화할 수 있습니다¹⁸.

긍정적인 강화 프로토콜은 작은 포유류에도 적용되었습니다. 최근 연구에서는 사육 절차를 위한 토끼와 행동 연구를 위한 게르빌의 성공적인 훈련을 보고합니다^19,20. 일부 이전 연구에서 우리는 클리커로 훈련된 마우스가 실험자와의 접촉이 증가하고 배뇨, 배변, 발성 및 부유 행동과 같은 스트레스와 관련된 행동 지표가 더 적다는 것을 보여주었습니다 21,22,23. 이는 토끼, 설치류, 흰족제비와 같은 소형 포유류의 훈련이 공포 반응을 줄이고 긍정적인 강화 기술을 통해 취급을 용이하게 하는 것으로 나타난 수의학 분야의 연구 결과와 일치합니다²⁴. 특히, 우리는 또한 훈련 성과에서 성별에 따른 차이를 관찰했습니다: 암컷 쥐는 훈련 세션에서 수컷보다 더 큰 동기와 더 높은 반응 빈도를 보였습니다. 이것은 암컷 마우스가 표준화된 조건²¹에서 자발적인 훈련 작업에 더 쉽게 참여할 수 있음을 시사합니다.

유망하지만 저빌에 대한 기존 훈련 접근 방식은 일반적으로 특정 행동 패러다임과 연결되어 있으며 일상적인 사육 루틴에서 일반적으로 사용하도록 설계되지 않았습니다²⁵. 몽골 게르빌(Meriones unguiculatus)에 대한 광범위하고 표준화된 프로토콜은 특정 실험 설정과 무관하게 아직 확립되지 않았습니다. 이러한 격차를 해소하기 위해 본 연구는 저빌의 종별 특성에 맞는 간단한 클리커 훈련 프로토콜을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 부드러운 취급과 실험자와의 자발적인 참여를 통한 스트레스 감소에 중점을 둡니다. 우리는 이 접근 방식이 동물 복지를 개선하고 보다 일관된 행동 기준선을 설정하며 실험 결과의 신뢰성을 높일 것이라는 가설을 세웁니다. 단순성과 유연성으로 인해 광범위한 실험실 환경에서 쉽게 구현할 수 있습니다.

제안된 교육 프로토콜의 효과와 적용 가능성을 평가하기 위해 다음과 같은 구체적이고 테스트 가능한 예측을 공식화했습니다.
훈련된 게르빌은 10일의 훈련 기간 내에 자발적으로 실험자의 손에 앉는 표적 행동을 안정적으로 수행할 것입니다.
훈련된 동물은 훈련되지 않은 대조군에 비해 표준화된 테스트에서 실험자와의 자발적인 상호 작용이 증가했습니다.
훈련된 동물은 특히 야외 테스트의 중앙 영역에서 더 많은 시간을 보내는 것으로 감소된 불안과 유사한 행동과 일치하는 행동 지표를 나타낼 것입니다.
암컷 저빌은 수컷보다 훈련에 대해 더 강한 행동 반응을 보일 수 있으며, 이는 잠재적으로 인간 상호 작용에 대한 적응의 성별 차이를 반영합니다.
이러한 예측은 행동 평가의 설계를 안내하고 프로토콜의 평가 기준을 알렸습니다.

프로토콜

저빌의 취급과 실험 절차는 동물 관리에 대한 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 지방 당국의 라이센스 G 21-1-100에 의해 승인되었습니다. 프로토콜에는 10일간의 교육(월요일부터 금요일까지)이 포함되며 주말(토요일과 일요일)에는 휴식이 있습니다. 프로토콜은 특정 요구 사항에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 필요한 모든 재료 는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 준비

1. 기관 사육 시설에서 필요한 수의 동물을 확보하십시오. 개방형 사육 시스템에서 12시간의 빛/암흑 주기로 동물을 유지합니다.
2. 생후 5주에 자손을 떼십시오. 젖을 뗀 후 동물에게 귀 태그를 달고 우리당 2-3마리의 동성 그룹에 수용합니다.
3. 모든 저르빌을 Type 4 케이지(590 x 380 x 200mm, 1.815m2)에 뒤쪽으로 보관합니다. 각 케이지에 최소 3개의 터널을 장착하고 농축을 위해 나무를 씹습니다. 음식과 물을 자유롭게 제공하십시오( 재료 표 참조).
4. 동물을 훈련된 그룹(암컷: n=27, 수컷: n=16) 및 훈련되지 않은 그룹(암컷: n=16, 수컷: n=5) 그룹에 무작위로 할당하여 선택 편향을 최소화하고 치료 전반에 걸쳐 비교 가능한 기준선 조건을 보장합니다. 2.2단계에서 설명한 대로 번식 케이지 환경 내에서 동물을 음식 보상과 실험자의 손 모두에 익숙하게 합니다. 프로토콜의. 훈련 시작 당시 동물(암컷 및 수컷)은 생후 약 8주였습니다.

2. 동물 습관화

알림: 저빌을 운송하지 않으면 습관화 시간을 줄일 수 있습니다. 프로토콜의 그래픽 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 사내 사육 동물의 경우 부모 동물이 잘 습관화되어 있고 새끼가 움직일 수 있게 된 시점부터 적어도 일주일에 한 번 손 기반 습관화가 계속되면 어린 동물의 습관 기간이 크게 단축될 수 있습니다. 이 준비 단계는 신생 공포증을 줄이고 긍정적인 식품 취급 연관성을 확립하여 클리커 기반 교육으로의 원활한 전환을 보장하기 위해 고안되었습니다.

그림 1: 외부 조달 및 사내 사육 동물에 대한 습관화 및 훈련 프로토콜 개요: 이 그림은 외부 조달 저빌 및 사내 사육 저빌에 사용되는 습관화 및 훈련 프로토콜의 타임라인과 주요 절차 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에는 초기 취급, 음식 습관화, 클리커 소개 및 클리커 훈련이 포함되며 동물의 기원지와 사전 노출에 따라 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 1주차: 외부 공급된 동물의 습관화
   1. 도착하면 저르빌을 우리당 2-3마리의 동물로 구성된 동성 그룹으로 수용합니다. 적응을 돕기 위해 소량의 친숙한 식품 알갱이와 함께 운송 상자에서 둥지 및 침구 재료를 추가합니다.
   2. 각 케이지에 최소 3-4개의 터널(예: 판지 튜브 또는 플라스틱 대피소)을 제공하고 종의 전형적인 굴착 행동을 허용하기 위해 침구를 약 8-10cm 깊이까지 채웁니다.
   3. 저빌의 꼬리를 들어 올리면 스트레스를 유발하고 꼬리 부상의 위험이 있으므로 피하십시오²⁶. 대신 컵 처리를 사용하여 필요한 경우 동물을 부드럽게 옮깁니다( 그림 2A 참조).
   4. ~5g의 호박 또는 해바라기씨를 침구에 뿌려 즉시 음식 기반 습관화를 시작합니다( 재료 표 참조). 이것은 땅을 파는 것을 장려하고 동물들이 보상에 익숙해지도록 합니다.
   5. 다음날, ~10개의 보상 씨앗이 들어 있는 한 손을 2-3분 동안 새장에 넣습니다. 동물이 씨앗을 직접 가져가지 않으면 ~5g의 씨앗을 침구에 넣으십시오.
   6. 동물이 손에서 음식을 먹을 때까지 하루에 한 번 이 절차를 반복합니다. 보통 일주일 정도 걸립니다. 이전에 성공하면 클리커 훈련을 진행합니다(3단계 참조).
   7. 익숙해지는 동안 다양한 씨앗 유형을 손에 쥐고 2-3분 후에 남은 씨앗을 세어 음식 선호도를 평가합니다.
      참고: 원하는 행동을 강화하기 위한 보상으로만 음식을 조금씩 제공하십시오. 음식 보상이 실험 동물에 대한 영양 지침을 준수하는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 호박과 해바라기씨를 사용하지만 시설 위생 요구 사항을 충족하는 경우 다른 적절한 보상을 사용할 수 있습니다. 실험 동물을 위해 고안된 시중에서 판매되는 간식도 허용됩니다.
2. 1주차: 사육 동물의 습관화
   1. 2.1.3단계에서 설명한 대로 ~5g의 호박 또는 해바라기씨를 침구에 넣어 사육 우리에서 직접 먹이 보상에 익숙해지기 시작합니다. 이 단계는 보상에 익숙해지기 위해 분만 전에 번식 쌍과 함께 시작해야 합니다.
   2. 번식 동물이 침구에서 종자를 안정적으로 섭취하면 2.1.4단계에 설명된 절차에 따라 실험자의 손에서 보상을 제공합니다. 동물이 매일 2-3분 동안 자발적으로 탐색하고 보상을 받을 수 있도록 합니다.
   3. 암컷이 출산 후 최소 1주일 동안 손 기반 습관화를 중단합니다. 이 기간 동안 노출을 유지하기 위해 일주일에 1-5번 케이지 침구에 직접 음식 보상을 계속 제공하십시오.
   4. 새끼가 움직일 수 있게 되면(약 산후 18-21일) 손 기반 습관화를 재개합니다. 동물들이 세션당 2-3분 동안 보상으로 손을 탐색할 수 있도록 합니다. 이는 자손이 훈련 상황에 조기에 익숙해지는 것을 지원합니다.
   5. 생후 5주가 되면 새끼를 젖을 떼고 우리당 2-3마리의 동물로 구성된 동성 그룹으로 집단으로 수용합니다. 이송 당일 음식 보상을 새 케이지 침구에 넣어 습관화를 계속합니다.
   6. 이유식 다음 날, 위에서 설명한 대로 손 기반 음식 배달을 다시 도입합니다(단계 2.1.4 및 2.1.5).
   7. 동물이 손에서 음식을 먹을 때까지 하루에 한 번 이 절차를 반복합니다.
   8. 청소년이 손에서 지속적으로 보상을 받으면 훈련 프로토콜을 진행합니다(3단계 참조). 일반적으로 약 1주일이 소요됩니다. 이전에 성공하면 클리커 훈련을 진행합니다(3단계 참조).

그림 2: 포지티브 강화를 사용한 게르빌의 취급 및 습관화. (A) 저빌의 컵 취급: 스트레스를 최소화하기 위해 양손으로 컵 모양으로 저빌을 부드럽게 퍼냅니다. (B) 훈련 시작: 실험자의 손은 손바닥에 음식 보상을 얹고 케이지 바닥에 놓입니다. 게르빌은 보상을 받고 클릭은 행동을 표시하는 데 사용됩니다. (C) 게르빌은 자발적으로 실험자의 손에 앉아 성공적인 훈련을 나타냅니다. 음식 보상은 눈에 띄게 손바닥에 놓입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 클리커 교육

알림: 게르빌이 실험자의 손에서 음식을 받아들이는 경우에만 훈련을 시작하십시오. 그렇지 않은 경우 2.1단계에서 설명한 대로 음식 습관화 단계를 기간을 초과하여 연장합니다. 또는 2.2.

1. 교육 개요
   1. 게르빌당 하루에 한 번의 훈련 세션을 각각 4분 동안 실시합니다. 스트레스를 줄이고 친숙한 환경을 유지하기 위해 동물의 집 케이지에서 직접 훈련을 실시하십시오. 모든 농축 항목을 제거할 필요는 없지만 케이지에 적어도 하나의 튜브 또는 터널이 남아 있고 케이지 바닥에 실험자의 손이 닿을 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
      알림: 이상적으로는 전용 조용한 방에서 교육을 실시해야 합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 환경 소음 및 교란에 대한 노출을 효과적으로 줄이는 경우 동물 시설 내 방음 캐비닛을 사용할 수 있습니다.
   2. 청각적 신호가 교란 변수가 되는 것을 방지하려면 훈련 세션 중에 언어적 의사소통이나 음성 소리를 엄격히 피하십시오. 동물과의 음성 상호 작용을 훈련 맥락 이외의 기간으로 제한하십시오.
   3. 목표 행동의 반복(예: 자발적으로 실험자의 손에 앉는 것)을 훈련 중 성공적인 습관화 및 학습의 실질적인 지표로 사용합니다. 연속 3일 동안 이 동작이 세션당 최소 5회 관찰되면 훈련이 성공한 것으로 간주합니다(3.4.4단계 참조).
2. 교육 준비
   1. 필요한 모든 재료를 준비하세요: 보상으로 해바라기씨를 반으로 자르거나 호박씨를 3등분하세요. 발 리모콘, 색상 신호(소리 없음) 또는 기타 무음 타이머(디지털 또는 아날로그)를 사용하는 타이머 앱, 깨끗한 보조 케이지( 재료 표 참조)를 제공합니다.
   2. 환경 스트레스 요인을 최소화하기 위해 훈련이 진행될 조용하고 산만하지 않은 장소로 홈 케이지를 옮기십시오. 게르빌은 청각 자극에 매우 민감하므로 세션 중 말소리, 문 쾅 닫기, 장비 소리 등 갑작스럽거나 큰 소음을 피하십시오.
   3. 터널 하나를 제외한 모든 강화 항목을 제거합니다. 나머지 터널이 훈련 구역에 대한 접근을 방해하지 않는지 확인하십시오. 손을 수용할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
   4. 분리 중 스트레스를 줄이기 위해 소량의 가정용 케이지 침구와 농축물을 포함하여 반려동물을 깨끗한 보조 케이지로 옮깁니다.
   5. 발 리모콘(발로 눌렀을 때 딸깍 소리를 내는 기계 장치, 재료 표 참조)을 테이블이나 훈련 표면 아래에 놓습니다. 이를 통해 조련사는 손을 사용하지 않고도 원하는 행동을 표시할 수 있으므로 양손을 동물과 상호 작용할 수 있는 상태로 유지하면서 일관된 타이밍을 보장할 수 있습니다.
3. 교육 1-5일차: 클리커 소개
   1. 타이머 시작: 앱에서 시작을 탭하거나 무음 타이머의 버튼을 누릅니다.
   2. 케이지 앞에 서거나 앉습니다. 선택한 씨앗 5개를 손바닥에 놓고 케이지 한쪽 모서리에 있는 기질 위에 손을 평평하게 놓습니다.
   3. 게르빌이 손에서 씨앗을 빼앗는 순간을 클릭합니다(그림 2B). 여러 개의 시드가 순서대로 채취되는 경우 각 시드 뒤를 클릭합니다. 딸깍 소리를 사용하여 음식 보상을 손에서 먹이는 행동과 연관시킵니다.
   4. 동물이 원하는 행동을 5회 수행하거나 타이머가 0에 도달하면(4분 후) 훈련을 종료합니다.
   5. 3일차부터 저빌의 행동에 따라 씨앗을 한 번에 하나씩 제공하기 시작합니다. 케이지 바닥 바로 위에 손을 잡고 동물이 앞발을 펴거나 잠시 접촉하도록 격려합니다(그림 2C). 이것은 행동을 점진적으로 형성하고 다음 훈련 단계를 위해 동물을 준비하는 데 도움이 됩니다(3.4단계 참조).
4. 훈련 6-10일
   참고: 선택적 훈련 팁: 게르빌이 손 위로 올라가는 것을 꺼리면 작업을 자신감을 키울 수 있는 더 작은 단계로 나눕니다. 첫째, 동물이 올라갈 것으로 예상하기 전에 손을 만지는 행동을 강화하십시오. 이 성형 전략을 사용하여 스트레스를 줄이고 다루기에 익숙해지는 데 더 많은 시간이 필요한 동물을 지원하십시오.
   1. 한 번에 하나의 씨앗만 제공하십시오. 손을 기질 위로 약간 높게 잡아 게르빌이 보상에 접근하기 위해 손 위로 완전히 올라가도록 유도합니다. 이 단계는 이전 셰이핑 프로세스를 기반으로 하며 최종 대상 동작으로의 전환을 나타냅니다.
   2. 게르빌이 지속적으로 손 위로 올라가면 클릭하여 행동을 강화합니다. 초침을 사용하여 씨앗을 제공하기 시작합니다( 그림 3 참조). 게르빌이 케이지 바닥 위로 완전히 올라갈 수 있도록 훈련용 손을 케이지 바닥 위에 유지하십시오. 한 손을 사용하여 엄지와 검지 사이에 씨앗을 잡거나(그림 3A) 한 손을 사용하여 다른 손의 손바닥 위에 보상을 제시하여 동물이 올라가도록 권장합니다(그림 3B).
   3. 게르빌이 세션당 자발적으로 실험자의 손에 5번 앉아 손바닥이나 두 번째 손에서 보상을 받아들이는 훈련 성공을 평가합니다.
   4. 최대 3주(주 5일) 기간 후 또는 연속 3일 동안 훈련 목표가 일관되게 입증되면 훈련을 종료합니다.
      참고: 프로토콜은 최대 3주의 구조화된 훈련 단계를 정의하지만, 특히 훈련 종료와 실험 절차 시작 사이에 지연이 예상되는 경우 필요한 경우 이 기간 이후에도 강화 세션을 계속할 수 있습니다. 지속적인 긍정적 강화는 학습된 행동을 유지하고 시간이 지나도 신뢰성을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 훈련 단계를 성공적으로 마친 후 일주일에 한 번 강화를 계속하는 것이 좋습니다. 그러나 동물 간의 일관성과 비교 가능성을 보장하려면 실험 작업으로 전환하기 전에 목표 행동의 안정적이고 반복적인 성능으로 정의되는 명확한 훈련 종점을 문서화해야 합니다.

그림 3: 보상 전달 중 손 위치 지정의 예. (A) 보상은 같은 손의 엄지와 검지 사이에 잡고 동물은 손바닥 위에 앉습니다. (B) 보상은 두 번째와 검지로 잡고 동물은 다른 손바닥에 앉습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 훈련 후 행동 테스트 실시(10+일)

1. 상호 작용 테스트
   참고: 종속 변수: 1차 종속 변수는 테스트의 두 번째 분 동안 동물과 실험자의 손 사이의 자발적인 상호 작용 기간입니다. 상호작용은 냄새를 맡거나, 오르거나, 앞발로 손을 만지는 것과 같은 직접적인 신체적 접촉으로 정의된다(¹⁰). 행동 점수는 비디오 녹화를 기반으로 하며 수동으로 수행하거나 행동 분석 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
   1. 상호 작용 테스트가 수행될 테이블 위의 삼각대에 장착된 카메라를 배치합니다.
   2. 동물이 무리를 지어 사육되는 경우 가정 케이지에서 한 줌의 침구가 들어 있는 깨끗한 보조 케이지로 동물을 옮깁니다.
   3. 홈 케이지에서 모든 터널이나 대피소를 제거하고 깨끗한 케이지에 넣으십시오. 테스트 케이지(=홈 케이지)에는 침구만 남겨 둡니다. 이제 침구만 들어 있는 홈 케이지를 카메라 아래에 놓습니다.
   4. 컵 처리를 사용하여 실험 동물을 가정 케이지로 부드럽게 되돌립니다.
   5. 녹음을 시작합니다. 케이지 앞에서 1분 동안 가만히 있습니다. 1분 후 장갑을 낀 한 손을 앞쪽 가장자리 근처의 케이지 안에 1분 더 넣습니다.
   6. 성별이 다른 동물 간에 장갑을 교체하세요.
2. 오픈 필드 테스트
   참고: 종속 변수: 측정된 변수에는 총 이동 거리, 중앙 구역 대 주변에서 보낸 시간, 중심 진입 횟수 및 사육 이벤트가 포함됩니다. 이러한 지표는 일반적인 운동 활동과 불안과 유사한 행동을 반영합니다. 센터 시간 증가는 일반적으로 불안 감소로 해석됩니다. 행동은 비디오로 기록되고 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다( 재료 표 참조).
   1. 오픈 필드 경기장 위에 카메라를 배치합니다(100cm x 100cm x 40cm).
   2. 비디오 녹화를 시작한 다음 컵 핸들링을 사용하여 동물을 경기장 중앙에 부드럽게 놓습니다. 7분 동안 동작을 기록합니다.
   3. 테스트 후 동물을 집 케이지로 돌려보내십시오. 각 동물 후에 70% 에탄올로 열린 들판 상자와 벽을 청소하십시오. 에탄올이 완전히 증발할 때까지 기다렸다가 다음 동물을 경기장에 배치하십시오.

5. 통계 분석

1. 동물과의 직접적인 상호 작용의 특성으로 인해 훈련 세션 동안 실험자의 완전한 눈가림은 실현 가능하지 않았지만 관찰자 편향을 줄이기 위해 맹검 방식으로 행동 데이터 분석을 수행합니다.
2. 상호 작용 및 공개 필드 테스트 모두에서 모든 세션을 비디오로 녹화합니다. 훈련된 관찰자가 수동으로(상호 작용 테스트) 행동 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 개방 현장 기록(중앙 영역에서 보낸 시간)을 자동으로 종속 변수를 수집합니다.
3. 통계 분석 전에 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규 분포에 대해 모든 데이터를 테스트합니다. 잘못된 발견률(Q)을 10%로 설정한 ROUT(Robust Regression and Outlier Removal) 방법을 사용하여 이상값을 식별하고 제외합니다. 훈련과 성별이 행동 결과에 미치는 영향을 분석하기 위해 상호 작용 테스트에 대한 양방향 반복 측정 ANOVA와 오픈 필드 테스트의 중심에서 보낸 시간을 평가하기 위해 혼합 양방향 ANOVA를 수행합니다.
4. 상호 작용 테스트와 열린 필드의 중앙 영역에서 소요된 누적 시간을 주요 종속 변수로 분류합니다. Tukey의 HSD(Honest Significant Difference) 테스트를 사용하여 사후 비교를 수행합니다. 0.05<의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

결과

훈련된 모든 게르빌은 10일 이내에 할당된 작업을 학습하여 이 종에서 클리커 훈련의 타당성을 입증했습니다. 그림 4 는 1일차부터 10일차까지 암컷(n=27) 및 수컷(n=16) 게르빌의 훈련 성공률을 보여줍니다. 수컷과 암컷 저빌의 훈련 1일차와 10일차의 성과를 분석한 반복 측정 ANOVA는 시간과 성별 사이에 유의미한 상호 작용 효과가 없는 것으로 나타났으며(F_{(1, 41)} = 0.003; p = 0.955), 시간 경과에 따른 개선은 남녀 모두에서 유사함을 나타냅니다. 매우 유의미한 시간 효과가 관찰되었으며(F_{(1, 41}) = 38.83, p < 0.0001), 남녀 모두의 저빌이 10일째까지 훈련 프로토콜을 완전히 준수했음을 보여주었습니다.

훈련된 저빌이 10일 이내에 할당된 임무를 준수했다는 사실은 이 종에서 클리커 훈련 방법론의 효과를 입증합니다. 이 성공률은 조작적 조건화의 기본 원리와 일치하며, 여기서 클리커는 원하는 행동과 1차 보상(해바라기/호박씨) 사이의 격차를 해소하는 2차 강화제 역할을 합니다. 클리커는 행동과 보상 사이의 다리 역할을 하여 트레이너가 원하는 행동이 발생하는 정확한 순간을 정확한 타이밍으로 표시할 수 있도록 해줍니다. 이는 행동과 긍정적인 결과 사이에 명확하고 즉각적인 연관성을 만드는 데 도움이 됩니다.

행동 테스트는 훈련 프로토콜 완료 후, 특히 훈련 10일차 후에 수행되었습니다. 양방향 혼합 ANOVA 분석은 훈련된 게르빌이 실험자의 손과의 자발적인 상호 작용을 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 5A). 훈련의 유의미한 효과가 감지되었으며(F _{(1, 60)} = 22.89; p < 0.0001), 훈련된 동물이 실험자와 더 자주 관여했습니다. 사후 분석 결과 여성(p < 0.0001, n = 27)과 남성(p = 0.049, n = 16)의 훈련의 구체적인 차이가 나타났습니다. 성적 효과는 관찰되지 않았으며(F_{(1, 60)} = 0.621, p = 0.434), 수컷과 암컷 저빌이 전반적으로 비슷한 성과를 거두었음을 시사합니다. 분석 결과 성별과 훈련 사이에 유의미한 상호 작용이 없는 것으로 나타났습니다(F_{(1, 60)} = 0.078, p = 0.781).

게르빌의 자발적인 상호 작용 증가는 클리커 훈련이 긍정적인 강화를 통해 타고난 공포 반응을 효과적으로 감소시켰음을 나타냅니다. 이는 취급 및 실험 절차 중 스트레스를 최소화하여 동물 복지와 데이터 품질을 모두 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

훈련 후 불안과 유사한 행동에 대한 평가는 Open Field Test를 사용하여 수행되었습니다. 그림 5B 는 중앙 영역에서 보낸 누적 기간을 보여줍니다. Open Field Test의 중앙 영역에서 누적 기간에서 성별과 훈련 사이의 상호 작용은 관찰되지 않았습니다(F_{(1, 60)} = 0.101, p = 0.751). 또한 성별의 유의미한 주효과는 발견되지 않았습니다(F_{(1, 60)} = 0.001, p = 0.969. 훈련의 매우 유의미한 주요 효과가 관찰되었습니다(F_{(1, 60)} = 17.26, p < 0.0001; HSD Tukey 테스트: 암컷과 수컷에서 각각 p = 0.003 및 p = 0.052), 훈련된 저빌이 훈련되지 않은 저빌에 비해 센터에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈음을 나타냅니다. 이러한 결과는 동물이 10일의 훈련 기간을 마친 후 측정된 행동 반응을 반영합니다.

OFT는 설치류가 새로운 환경을 탐색할 때 경험하는 자연스러운 접근-회피 갈등을 이용합니다²⁷. 저빌은 탐험하려는 타고난 욕구와 잠재적으로 위험한 열린 공간을 피하려는 자연스러운 경향 사이의 균형을 맞출 수 있습니다. 따라서 훈련된 게르빌이 불안을 유발하는 중심 구역에서 더 많은 시간을 보냈다는 사실은 클리커 훈련이 전반적인 탐색 행동 의지를 향상시켰음을 나타내며, 이는 일반적인 복지의 개선을 나타낼 수 있습니다.

그림 4: 클리커 교육 검증. 남성 및 여성 피험자의 1일차 대 10일차 훈련 성공: 훈련 성공은 훈련 프로토콜의 1일과 10일에 암컷(흰색 막대, n = 27) 및 수컷(회색 막대, n = 16) 게르빌에서 평가되었습니다. 양방향 반복 측정 ANOVA는 훈련일의 유의미한 주요 효과를 나타냈습니다(p < 0.0001). Tukey의 HSD 테스트를 사용한 다중 비교는 여성(p < 0.0001, n = 27)과 남성(p < 0.0001, n = 16) 모두에서 1일차부터 10일차까지 훈련 성공률이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 데이터는 평균± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 행동 평가. (A) 상호 작용 테스트: 동물이 10일의 훈련 기간을 마친 후 훈련된(회색 막대) 및 훈련되지 않은 암컷 및 수컷 게르빌에서 실험자의 손과의 상호 작용 기간(s)을 측정했습니다. 양방향 혼합 ANOVA는 훈련의 유의미한 주효과(p < 0.05)와 유의미한 상호 작용 효과(p < 0.05)를 나타냈습니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용한 사후 분석은 훈련된 마우스가 훈련되지 않은 마우스에 비해 실험자의 손과 훨씬 더 오래 상호 작용하는 것으로 나타났습니다(암컷: p < 0.0001, 수컷: p = 0.0497). 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 훈련된 여성: n= 27; 훈련을 받지 않은 여성: n =16; 훈련된 남성: n = 16; 훈련을 받지 않은 수컷: n = 5. (B) 오픈 필드 테스트: 테스트는 훈련 프로토콜 완료 후, 특히 훈련 10일째 후에 수행되었습니다. 중앙 영역에서 보낸 누적 기간은 훈련된(회색 막대) 및 훈련되지 않은(흰색 막대) 암컷 및 수컷 저빌에서 측정되었습니다. 중심 영역 탐색에 대한 훈련의 효과를 분석하기 위해 양방향 혼합 ANOVA를 수행했습니다. Tukey의 HSD 테스트를 사용한 다중 비교 결과 훈련된 암컷은 훈련되지 않은 암컷에 비해 중앙 영역에서 훨씬 더 많은 시간을 보낸 것으로 나타났습니다(p = 0.003). 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 훈련된 여성: n= 27; 훈련을 받지 않은 여성: n =16; 훈련된 남성: n = 16; 훈련을 받지 않은 수컷: n = 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

연구 결과는 실험 환경에서 저빌을 인간 상호 작용에 익숙하게 만들기 위해 제안된 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 훈련된 모든 동물이 10일 이내에 원하는 작업을 완료할 수 있는 능력은 이 방법의 효율성을 강조합니다.

프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 실험자의 손에 점진적으로 익숙해지도록 하여 저빌이 인간의 상호 작용을 긍정적인 자극과 연관시키도록 하는 것입니다. 종별 보상을 사용하면 훈련 프로세스가 더욱 최적화됩니다. 훈련 세션 기간을 조정하거나 보상 유형을 변경하는 등의 수정을 통해 저빌 간의 개인차에 맞게 프로토콜을 더욱 맞춤화하고 실험의 특정 요구 사항에 맞게 최적화할 수 있습니다.

우리는 생쥐와 몽골 저빌 사이의 행동 및 학습 역학의 주목할만한 종별 차이에 초점을 맞춥니다. 이러한 차이점은 교육 프로토콜을 설계할 때 고려해야 합니다. 예를 들어, 생쥐는 신공포증과 스트레스에 더 민감한 경향이 있으며, 종종 새로운 환경과 인간 상호 작용에 익숙해지는 데 더 많은 시간이 필요합니다²⁸. 대조적으로, 저빌은 더 높은 탐구 욕구와 사회적 호기심을 나타내며, 이는 훈련 작업에 더 빠르게 참여할 수 있습니다²⁹. 본 연구에서 저빌은 실험자의 손에 쉽게 접근하여 생쥐에 대해 일반적으로 보고된 것보다 적은 세션에서 클리커를 보상과 연관시키는 방법을 배웠습니다^21,22. 그러나 저빌은 특히 수컷에서 더 큰 개인차를 보였는데, 이는 마우스 모델에서 덜 두드러지는 성별별 스트레스나 동기 부여 요인을 반영할 수 있습니다. 이러한 구별은 종에 적응한 훈련 전략의 중요성을 강조하고 저빌은 자발적인 상호 작용에 더 중점을 둔 더 짧고 보상 중심적인 세션의 이점을 얻을 수 있는 반면, 쥐는 보다 점진적인 둔감화와 일관된 반복이 필요할 수 있음을 시사합니다. 이러한 행동 및 인지적 차이를 이해하는 것은 훈련 프로토콜을 개선하고 종 전반에 걸쳐 효과를 극대화하는 데 중요합니다.

몽골 저빌은 특정 실험 설정에 대한 준비보다는 긍정적인 인간-동물 상호 작용과 기본 행동 조건화에 초점을 맞춘 비특이적 또는 일반화된 클리커 훈련을 통해 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 이러한 일반화된 훈련은 취급 내성을 향상시키고, 기저 스트레스 수준을 감소시키며, 광범위한 실험 맥락에서 가치 있는 보다 예측 가능한 행동 기준 요인을 촉진합니다³⁰. 비특이적 훈련은 행동 유연성과 실험자와의 일관된 자발적 상호 작용을 촉진하여 동물이 다양한 환경, 설정 또는 테스트 패러다임에 더 잘 적응할 수 있도록 합니다 16,31,32. 이는 동물이 다양한 절차에 노출되는 장기 연구나 다단계 실험에 특히 유용합니다. 본 연구에서 훈련이 단일 테스트 프로토콜과 직접적으로 연결되지는 않았음에도 불구하고 저빌은 실험자와의 상호 작용이 개선되고 스트레스 관련 행동이 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 긍정적인 강화를 통한 일반적인 습관화가 전반적인 실험 탄력성과 동물 복지를 향상시킬 수 있다는 생각을 뒷받침합니다.

실험자와의 상호 작용이 증가하는 것 외에도 훈련된 암컷 동물은 야외 테스트의 중앙 영역에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈습니다. 이 행동 패턴은 일반적으로 설치류의 불안 유사 행동의 감소로 해석되며, 특히 새롭거나 약간 혐오스러운 환경에 대한 반응으로 해석됩니다³³. 이러한 발견은 클리커 훈련이 불안의 행동 지표 감소에 기여하여 실험 절차에 대처하는 동물의 능력을 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 이는 긍정적 강화 기반 습관화 프로토콜이 실험실 게르빌의 스트레스 탄력성과 행동 안정성을 향상시킬 수 있다는 광범위한 결론을 뒷받침합니다. 스트레스 감소 외에도 클리커 훈련은 실험 결과에 더 광범위한 영향을 미칩니다³⁴. 훈련된 저빌은 연구 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 스트레스로 인한 생리적 변화를 최소화하는 취급에 대한 더 큰 내성을 보여주었습니다. 실험실 토끼와 생쥐를 포함한 다른 종에서도 유사한 발견이 보고되었으며, 클리커로 훈련된 동물은 배뇨, 배변, 발성 감소 및 부유 행동과 같은 실험자 상호 작용이 증가하고 불안 및 우울증 관련 행동이 감소했습니다^19,21.

이러한 결과는 스트레스 관련 반응의 가변성을 줄임으로써 동물 복지와 행동 데이터의 일관성을 모두 향상시킬 수 있는 클리커 훈련의 잠재력을 강조합니다. 이 프로토콜의 목적은 채혈과 같은 본질적으로 혐오적인 절차를 클리커와 같은 긍정적인 자극과 연관시키도록 동물을 조건화시키는 것이 아니라는 점을 명확히 하는 것이 중요합니다. 오히려 목표는 기본 스트레스를 줄이고, 동물을 인간 상호 작용에 익숙하게 하며, 중립적이거나 약간 도전적인 작업에 자발적으로 참여하도록 장려하는 것입니다. 일부 연구에서는 보다 침습적인 절차를 위해 동물을 준비하기 위해 양성 강화의 사용을 탐구했지만³⁵, 이를 위해서는 신중하게 구조화된 탈감작 프로세스가 필요하며 현재 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 불편함과 관련된 맥락에서 클리커 단서를 잘못 적용하면 실제로 의도하지 않은 부정적인 연관성이 발생할 수 있습니다. 그러나 올바르게 적용되면 긍정적 강화 기술은 예측 가능성을 높이고 어느 정도의 제어를 허용함으로써 동물이 잠재적으로 혐오스러운 절차에 대처하는 데 도움이 될 수 있습니다³⁶. 개와 인간이 아닌 영장류와 같은 다른 종에서 성공적으로 입증된 바와 같이 저빌이 이러한 상황에 대해 안정적으로 훈련될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다^37,38.

성공에도 불구하고 이 방법에는 한계가 있습니다. 일부 저빌은 더 긴 습관화 기간이 필요했는데, 이는 학습 속도의 개인차를 나타냅니다. 또한 훈련되지 않은 수컷 저빌의 수가 상대적으로 적기 때문에 분석의 통계적 검정력이 제한되어 강력한 결론을 도출하기 어렵습니다. 이 그룹의 표본 크기를 늘리면 결과의 신뢰성과 해석 가능성이 향상될 수 있습니다. 추가 연구에서는 스트레스 반응 및 학습 메커니즘의 잠재적인 성별 차이를 탐구해야 합니다.

이 연구의 더 넓은 의미는 스트레스 감소를 넘어 확장됩니다. 표준 사육의 일부로 구조화된 훈련 프로토콜을 구현하면 스트레스로 인한 생리적 반응으로 인한 변동성을 줄이고 실험 결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있습니다^39,40. 이는 스트레스가 중요한 교란 요인인 신경과학이나 대사 연구와 같은 분야와 특히 관련이 있습니다. 의도하지 않은 강화 효과를 피하기 위해서는 교육 절차의 신중한 보고와 표준화가 필수적입니다.

앞으로 향후 연구에서는 대체 강화 일정, 훈련 절차 자동화, 종 전반에 걸친 장기적인 효과를 탐구해야 합니다. 과학적 지원이 증가함에 따라 클리커 훈련은 데이터 품질과 동물 복지를 모두 향상시킬 수 있는 귀중한 개선 전략을 나타냅니다. 실험실 전반에 걸쳐 교육 및 처리 프로토콜을 표준화하면 재현성을 개선하고 생물 의학 연구에서 인도적이고 효과적인 관행을 광범위하게 채택하는 데 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케이지	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
카메라	Sony	HDR-CX240E	디지털 HD 비디오 카메라 레코더
식품 펠릿	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. I-Clicker-Blau
풋 리모콘		https://www.hundeschulen.com
GraphPad 프리즘	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	버전 10 Windows 오픈
필드 박스	Noldus	MXO1S-M001	오팔 100 x 100 x 40 cm
호박씨	REWE	8820911	REWE 바이오
철탑 뷰어	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Sunflowerseeds	Seeberger	4744292
삼각대	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
터널	Plexx	14179 152	x 76 x 3 mm