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방법 논문

경피 전달을 위한 CAGE 기반 이온성 액체 시스템의 개발, 특성화 및 평가

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/68658

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2025년 9월 26일

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1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 재현성을 보장하고 다양한 과학 실험실에서 전체 워크플로를 간소화하기 위해 CAGE 기반 이온 액체 시스템 준비를 위한 표준화에 대해 논의합니다.

초록

이온성 액체는 최근 약물 전달 내 응용, 특히 피부 약물 침투를 가능하게 하고 약물 투과를 향상시킬 수 있는 잠재력으로 놀라운 인정을 받았습니다. 장벽 투과성을 향상시키는 것 외에도 이온성 액체는 우수한 용매화 특성을 가지고 있어 용해성이 낮은 약물을 용해시키는 문제를 해결합니다. 유기 양이온과 음이온 사이의 큰 비대칭으로 인해 이러한 기능성 염은 실온에서 액체 상태를 유지합니다. 응용 관점에서 볼 때, 이온성 액체는 여러 치료 분야에 서비스를 제공할 수 있는 유망하고 고도로 조정 가능한 접근 방식을 제공합니다. 화학량론적 이온 비율이 1:2인 콜린과 제라닌산(CAGE)으로 구성된 생체 적합성 이온 액체는 소분자, 펩타이드, 단백질 및 핵산을 포함한 광범위한 활성 제약 성분을 경피적으로 전달할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 피부 장벽 기능에 미치는 영향이 최소화됩니다. 여기에서는 CAGE의 준비, 특성화 및 평가 방법을 공유합니다. NMR 분광법, 시차 주사 열량계, 수분 함량 분석을 위한 Karl-Fischer 적정 및 돼지 피부에 대한 생체 외 장벽 상호 작용 연구를 사용한 CAGE 특성화에 대한 대표적인 결과가 나타났습니다.

서론

피부는 신체에서 가장 크고 중요한 기관으로, 유해 물질에 대한 보호 장벽 역할을 하는 동시에 수분 손실을 방지합니다1. 동시에 피부에 약물을 바르고 피부를 통해 약물을 바르는 것은 다양한 이점을 제공합니다. 주사제 및 경구 전달과 비교하여 피부 투여는 환자의 순응도를 높이고 간에서 1차 통과 대사를 피합니다2. 특히 피부 상태의 경우 피부 투여 제형은 국소적인 효과를 제공하여 전신 노출을 줄이는 데 탁월합니다3. 그러나 피부의 거의 불투과성 특성은 성공적인 피부 전달에 큰 어려움을 겪습니다4. 인간의 피부는 표피, 진피 및 피하 4의 세 가지 층으로구성됩니다. 표피는 피부의 바깥층이며 각질층이 주로 각질 세포로 구성된 가장 바깥층인 여러 하위 층으로 더 나눌 수 있습니다. 각질층은 대부분의 분자에 대한 두드러진 투과 장벽 역할을 하여 피부의 더 깊은 층으로의 이동을 억제합니다5. 이 장벽 기능은 주로 인지질, 스테롤 및 세라마이드로 구성된 촘촘하게 채워진 지질 배열에 내장된 각질세포의 존재로 인해 발생하며, 종종 벽돌과 박격포 구조라고 합니다6. 이러한 피부 장벽을 극복하기 위해 화학적 투과 강화제(CPE)가 각질층에 존재하는 지질 및 단백질과 상호 작용하여 각질층의 구조를 파괴하기 때문에 거대분자를 전달하기 위해 배치되었습니다7.

이온성 액체(IL)가 차세대 CPE로 등장했습니다8. 이들은 부피가 큰 유기 양이온과 음이온으로 구성되며, 비대칭 방식으로 배열되고 약하고 무방향성 이온 상호 작용에 의해 조정됩니다9. 이러한 약한 분자간 힘으로 인해 IL은 100°C 이하에서 액체로 존재하며 잘 정의된 결정 구조로 포장될 수 없습니다10. IL은 그 효능이 양이온 또는 음이온의 선택과 이들 이온 간의 화학량론적 비율에 크게 의존하기 때문에 매우 조정 가능합니다. 따라서 다양한 소수성을 갖는 약물에 대해 높은 가용화 및 안정화 능력을 가지고 있습니다11. IL은 각각 거대분자의 지속 방출 및 캡슐화를 제공함으로써 지질과 중합체 모두의 고유한 특성을 제공합니다12.

1:2의 화학량론적 몰비로 존재하는 콜린 및 제라닌산(CAGE)을 기반으로 하는 생체 적합성 IL은 친수성 및 소수성 화합물의 경피 전달에 중요한 응용 분야를 가지고 있습니다. CAGE는 단백질(인슐린13) 및 핵산(siRNA14)의 경피 전달을 크게 향상시키는 것으로 보고되었습니다. CAGE는 콜린 중탄산염과 제라닉산 사이의 염 복분해 반응에 의해 제조되며, CO2 를 부산물로 사용합니다15. 염 복분해 반응은 온화한 조건에서 이온 교환 을 통해 직접적이고 신속하며 매우 선택적인 방식으로 새로운 화합물을 형성합니다. 일반적으로 CAGE IL 개발 및 평가를 위한 따라하기 쉬운 워크플로가 부족합니다. 따라서 여기에서는 다양한 배경을 가진 연구자가 이 연구 공간에 진입할 수 있도록 CAGE 준비의 각 단계를 자세히 설명하는 이러한 워크플로 중 하나를 제공합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 유럽 연합 지침 2010/63에 따라 수행되었으며 덴마크 수의학 및 식품청(면허 번호. DK-13-oth-931833).

1. 염 복분해 반응에 의한 CAGE 제조

  1. 제라닉산의 재결정(순도 85%, mol wt 168.23g/mol)
    1. 500mL 둥근 바닥 플라스크를 가져다가 무게를 측정합니다.
    2. 플라스크에 제라닉산 40.0g을 담습니다. 이는 제라닉산 0.2mol에 해당합니다.
    3. 70:30%(w/w) 제라닉산에서 제라닉산을 재결정화:아세톤: 둥근 바닥 플라스크에 (40 g*0.85*0.30)/(0.70*0.784 g/mL) = 18.42 mL의 아세톤을 첨가합니다.
    4. 5L 비커를 가져다가 약 0.5L의 드라이아이스와 에탄올을 준비합니다.
    5. 둥근 바닥 플라스크를 소용돌이치지 않고 드라이아이스-에탄올 콜드 믹스에 넣어 외부 냉각을 허용합니다. 결정화가 평형에 도달했을 때 고체/재결정화된 제라닉산에서 아세톤과 불순물을 디캔팅합니다(일반적으로 0.5-2시간 이내에 첨가된 아세톤의 대략적인 부피에 해당). 충분한 순도를 보장하기 위해 이 단계를 5-6회 반복합니다.
    6. 최소 20분 동안 40rpm의 진공 상태에서 회전 증발하여 또는 둥근 바닥 플라스크를 만졌을 때 더 이상 차갑게 느껴지지 않을 때까지 회전 증발하여 남은 아세톤을 제거합니다(아세톤의 증기압은 20°C에서 240mbar입니다).
    7. 플라스크와 재결정화된 제라닉산의 질량을 측정하고 기록하십시오. 초기 빈 플라스크 무게를 기준으로 수율을 계산합니다. 예상 수율 범위는 60-80%입니다.
  2. 염 복분해 반응
    1. 제라닉산:콜린의 몰 비율이 2:1인 경우 제라닉산 재결정화의 수율을 고려하여 콜린의 몰 수를 계산합니다. 예를 들어, 수율이 70%인 경우 0.07mol의 콜린을 첨가해야 합니다(0.2*70/100=0.14, 0.14/2 = 0.07).
    2. 중탄산콜린은 순도가 80%이고 분자량은 165.19g/mol입니다. 따라서 유출을 방지하기 위해 14.45g(0.07*165.19 = 11.56g; 100/80*11.56g = 14.45g)의 중탄산콜린을 적가합니다.
    3. 실온(18 ± 3시간)에서 300rpm(또는 적절)의 속도로 또는 CO2 증발이 멈출 때까지 밤새 샘플을 저어줍니다.
    4. 60°C, 30mbar에서 40분 동안 회전 증발하여 샘플을 건조시킵니다. 먼저 온도를 높인 다음 거품이 생기지 않도록 천천히 압력을 낮춥니다.
    5. CAGE를 의도한 용도에 적합한 용량의 유리 바이알에 분취합니다(예: 4mL 유리 바이알에 2mL의 CAGE).
    6. 바이알을 60°C의 진공 상태에서 48시간 동안 건조시킵니다.

2. CAGE의 특성화

  1. 핵자기공명(NMR) 분광법
    1. 중수소화 디메틸 설폭사이드(d-DMSO)에 CAGE를 25mg/mL의 농도로 용해시켜 최소 500μL의 최종 부피를 보장합니다.
      참고: 중수소화 용매는 용매의 수소 원자로부터의 간섭을 피하기 위해 NMR에서 필수적입니다.
    2. 준비된 용액 500μL를 깨끗하고 건조한 NMR 튜브(기기에 따라 일반적으로 직경 5mm)로 옮깁니다. 증발 및 오염을 방지하기 위해 캡으로 튜브를 밀봉하십시오.
      알림: 기포는 자기장 균질성에 영향을 미칠 수 있으므로 유입을 피하십시오.
    3. 다음 매개변수와 함께 NMR 분광기(예: 400MHz)를 사용하십시오.
      -스캔 횟수: 1HNMR의 경우 8-16개; 13C NMR의 경우 1,000-5,000(농도 및 원하는 신호 대 잡음(S/N) 비율에 따라 다름).
      -이완 지연(D1): 1시간 및 13CNMR의 경우 1-2초.
    4. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다.
      1. 위상 및 기준선 보정 을 통해 최적의 피크 모양을 조정합니다.
        참고: 이것은 일반적으로 위상 조정 및 기준선 보정을 위한 자동 도구를 사용할 수 있는 처리 또는 보정 탭(사용된 소프트웨어에 따라 다름) 내의 NMR 소프트웨어에서 수행됩니다.
      2. 잔류 용매 피크(d-DMSO)를 기준으로 사용합니다: 1H의 경우 ~ 약 2.50 ppm, 13C NMR의 경우 ~ 약 39.52 ppm. 불순물 참조는 Fulmer et al.15를 참조하십시오.
    5. 피크를 통합하고 구조의 양성자에 할당합니다( 그림 1 참조).
  2. 칼 피셔 적정법으로 결정된 수분 함량
    1. 300mg의 CAGE를 300μL의 메탄올에 녹입니다. 1mL 주사기에 넣고 주사 전후에 무게를 측정합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 전기량 칼 피셔 적정기를 사용하여 수분 함량을 측정합니다.
      1. 주사기를 사용하여 중격을 통해 적정 셀에 샘플을 주입하고 빈 주사기 무게를 입력한 다음 Enter 키를 누릅니다. 결과는 % w/w로 표시됩니다.
      2. 메탄올의 수분 함량을 조정하여 CAGE의 실제 수분 함량(일반적으로 1-2% w/w)을 얻습니다. (W샘플 = W샘플+희석제*(m샘플+m희석제) - (W희석제*m희석제)/m샘플).
  3. 시차 주사 열량계(DSC)에 의한 CAGE의 열 안정성
    1. 각 샘플 3-5mg을 알루미늄 Tzero 팬에 넣고 밀폐 뚜껑으로 밀봉합니다.
    2. 80°C에서 -80°C의 온도 범위에서 DSC를 사용하여 샘플을 분석하고 -80°C로 냉각하기 전에 10분의 등온 기간을 유지합니다.
    3. 5°C/min의 일정한 가열/냉각 속도와 50mL/min의 질소 퍼지를 사용합니다.
    4. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다.

3. 피부 장벽 상호작용의 생체 외 평가

  1. 돼지 피부의 피부 부분절 처리
    1. 발포 폴리스티렌(EPS)을 더마톰 블레이드에 맞게 자르고 접목 테이프로 감쌉니다. 돼지의 허리 부위에서 채취한 피부를 메스로 활용합니다. 여기에서 3.5개월 된 암컷 덴마크 토래종 또는 요크셔 돼지(30-40kg)로부터 피부를 채취했습니다.
    2. 근육과 지방 조직을 제거합니다. 조직의 피부분화를 용이하게 하려면 평평하고 균일한 기저외측을 보장하는 것이 중요합니다.
    3. 헤어 트리머를 사용하여 피부에서 가능한 한 많은 머리카락을 제거하십시오.
    4. 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 피부를 헹구어 혈액과 느슨한 모발을 제거합니다.
    5. EPS 블록에 맞게 칼을 사용하여 피부를 더 작은 조각(5cm x 15cm)으로 자릅니다.
    6. 바늘로 피부를 EPS 블록에 부착합니다.
    7. 피부분절을 0.5mm 두께로 설정하고 피부를 절개합니다.
    8. 피부 분열 피부를 이식 테이프의 두 층 사이에 보관하고 -70 °C에서 보관합니다.
  2. 경표피 수분 손실(TEWL)
    1. 초순수 200mL에 1정을 녹여 PBS(pH 7.4)를 준비합니다. 초음파 수조에서 20 분 동안 탈기합니다.
    2. Franz 확산 셀에 연결된 수조를 켭니다. 약 12mL의 탈기된 PBS와 마그네틱 비드를 각 세포에 추가합니다. 자기 교반(예: 600RPM)을 켜서 난류를 생성하지 않고 수용체 매질에 균일한 분포를 보장합니다. 모든 Franz 셀 설정에서 교반 속도를 정밀하게 제어할 수 있는 것은 아닙니다. 수용체 매체에서 37°C의 온도에 도달하도록 가열원을 조정합니다.
    3. 피부분절 피부를 메스를 사용하여 직경 약 3cm(또는 적정 크기)로 자르고 클램프와 밀봉 링을 사용하여 각질층이 위를 향하도록 피부분열 피부를 프란츠 확산 세포에 조심스럽게 장착합니다.
    4. 다음으로, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 수용체 챔버를 PBS로 완전히 채우고 알려진 수용체 배지의 부피를 나타내는 표시까지 채워졌는지 확인합니다. 세포를 조심스럽게 반전시켜 기포를 제거합니다. 30분 동안 수분을 공급합니다.
    5. TEWL 장치를 켜고 제조업체의 지침에 따라 안정될 때까지 20분 동안 평형을 유지합니다.
    6. 각 Franz 셀에 TEWL 프로브를 놓고 소프트웨어에서 시작 을 누릅니다. 판독값이 표시될 때까지 누르고 있습니다.
    7. 피부 위에 300μL의 샘플을 추가하고(3회, n=3) 프란츠 세포 위에 이식 테이프를 놓아 폐색합니다. 37°C(수용체 매체 온도)에서 24시간 동안 배양합니다.
    8. 보푸라기가 없는 물티슈로 티슈를 닦아 샘플을 제거합니다. 30분 동안 그대로 둡니다.
    9. 각 세포에 대한 TEWL을 측정하여 샘플이 피부 장벽에 미치는 영향을 조사합니다. 노출 전 값을 기준으로 TEWL 값을 계산하고 PBS 대조군을 기준으로 조정합니다(상대 TEWL = (TEWL post-TEWL-pre/TEWL pre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre))*100.

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결과

NMR 스펙트럼
이 기술의 목표는 1H및 13CNMR 분광법을 사용하여 수소 및 탄소 원자의 화학적 환경을 분석하여 CAGE의 성공적인 형성을 확인하는 것입니다. 결과 스펙트럼은 합성된 IL의 분자 구조와 조성을 반영하는 특징적인 화학적 이동, 분할 패턴 및 통합 값을 제공합니다. 그림 1 의 양성자 NMR 스펙트럼은 제라닉산과 콜린의 2:1 몰비를 확인합니다. 이는 제라닉산(9)에 해당하는 피크가 교정을 위한 기준으로 사용된 적분 값에서 분명하게 드러납니다. 그 결과, 콜린의 통합 값은 예상되는 화학량론과 일치하는 제라닉산의 약 절반으로 나타났습니다.

그림 1과 그림 2의 NMR 스펙트럼은 이전에 Zakrewsky et

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토론

본 연구에서 설명한 CAGE의 제조 방법은 문헌15에서 채택되었습니다. 그러나 합성 공정은 최종 제품의 특성에 영향을 미칠 수 있는 다양한 외부 요인에 민감하다는 점을 인정하는 것이 중요합니다. 따라서 일단 준비되면 CAGE 시스템의 형성을 확인하기 위해 NMR 분광법과 같은 기술을 사용하여 CAGE 시스템을 특성화해야 합니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 CAGE의 양성자 스펙트럼은 각 분자에 대한 양성자의 화학적 이동을 보여줍니다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼 모두에 대한 자세한 피크 할당은 참조 문헌16에 제공됩니다. 물의 존재는 COOH, OH 및 H2O 그룹 간의 양성자 교환 증가로 인해 1

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공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 LEO 재단 보조금 번호의 지원을 받았습니다. LF15007 및 LF-FE-23-700013.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5mm NMR 튜브시그마 올드리치41121705
아세톤VWR23L064039
알루미늄 Tzero 팬TA 악기90,16,83,901
아쿠아 플럭스 장치바이오스 시스템
브루커 아반스 III NMR브루커NMR 분광 기기
콜린 중탄산염시그마 올드리치C7519
피부종양짐머 바이오멧
차동 주사 칼로리미터TA 악기
에탄올VWR23J314009
팽창 폴리스티렌스티로폼
프란츠 확산 셀퍼미기어
제라닉산시그마 올드리치427764
접목 테이프파라필름
칼 피셔 적점자메틀러 톨레도30252662
메탄올VWR85681.32
PBS피셔 사이언티브10388739
TA 범용 분석 2000 소프트웨어TA 악기DSC 데이터 분석을 위한 소프트웨어
탑스핀 소프트웨어브루커NMR 데이터 분석을 위한 소프트웨어

참고문헌

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