방법 논문

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

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DOI:

10.3791/68674

⸱

2025년 8월 26일

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

이 논문에서

요약

이 NMR 기반 프로토콜은 시아노비린-N 및 D-만노스를 사용하여 약한 단백질-글리칸 상호작용을 조사합니다. 리간드 및 단백질 검출 방법을 결합하여 결합 부위를 매핑하고, 알로스테릭 효과를 감지하고, 만남 복합체를 식별합니다. 이 접근 방식은 샘플 준비 및 데이터 분석을 간략하게 설명하며 글리칸 특정 진단 및 인식 메커니즘에 유용한 구조적, 동적 통찰력을 제공합니다.

초록

단백질-글리칸 상호작용은 많은 생물학적 과정의 핵심이며 감염성, 염증성 및 신생물성 질환의 진단 전략을 위한 유망한 표적으로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 이러한 상호 작용을 특성화하는 것, 특히 약하고 일시적인 경우 기술적으로 여전히 어렵습니다. 핵자기공명(NMR) 분광법은 생리학적 조건에 가까운 조건에서 이러한 상호 작용을 연구하는 데 고유한 이점을 제공하여 구조적 측면과 역학적 측면 모두에 대한 원자 분해능 통찰력을 제공합니다. 이 연구에서 우리는 만노스 특이적 렉틴 시아노비린-N과 단당류 D-만노스를 모델 시스템으로 사용하여 저친화성 단백질-글리칸 상호 작용을 조사하도록 설계된 통합 NMR 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 리간드 및 단백질 기반 NMR 접근법을 결합하여 결합 부위를 포괄적으로 매핑하고 잠재적인 알로스테릭 효과 또는 만남 복합체를 포함한 미묘한 결합 이벤트를 감지합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 신중한 샘플 준비, 정확한 농도 제어, 데이터 재현성과 신뢰성을 보장하기 위한 스펙트럼 표준화가 포함됩니다. 용액 내 NMR을 사용하면 다른 기술로는 종종 접근할 수 없는 일시적인 상호 작용을 감지할 수 있습니다. 약한 상호 작용이 생명에 필수적이지만, 낮은 친화성 복합체가 신호 전달 및 세포-세포 통신과 같은 많은 중요한 생물학적 기능과 관련이 있음에도 불구하고 문헌에는 친화도가 높은 복합체에 대한 편향이 있습니다. 이 기술은 단백질-글리칸 인식을 조사하기 위한 강력한 플랫폼을 제공하며 글리칸 특이적 상호 작용을 기반으로 새로운 진단 마커를 식별하는 데 유용한 도구 역할을 할 수 있습니다.

서론

단백질-글리칸 상호작용은 세포-세포 인식, 면역 반응 조절 및 병원체-숙주 상호작용을 포함한 광범위한 생물학적 과정의 기본입니다 1,2. 이러한 분자 상호 작용은 매우 특이적이고 역동적이며 생리학적 및 병리학적 메커니즘 모두에서 중요한 역할을 합니다 3,4,5. 이러한 상호 작용의 전형적인 예는 글리칸을 특이적으로 인식하고 결합하는 단백질인 렉틴에서 발생합니다. 예를 들어, 시아노비린-N(CVN)은 높은 만노스 올리고당과 고친화성 상호 작용하는 능력 때문에 실험 모델로 널리 연구되어 왔습니다 5,6,7.

렉틴 외에도 인테그린과 같은 많은 당화 단백질도 인식 및 세포 신호 전달에 필수적인 역할을 합니다. 인테그린은 서브유닛의 글리코실화를 자주 겪는 막관통 수용체로, 글리칸 5,8,9,10을 포함한 리간드에 대한 안정성과 친화력에 영향을 미칩니다. 그러나 이러한 상호 작용의 구조적 특성화는 글리칸의 본질적인 이질성과 유연성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있으며, 이는 전통적인 구조 생물학 접근 방식을 복잡하게 만듭니다. 이러한 맥락에서 용액에서 이러한 상호 작용을 포착할 수 있는 고급 방법론의 개발은 이 분야, 특히 당생물학에 큰 가치가 있습니다11,12.

핵자기공명(NMR) 분광법은 원자 수준에서 단백질-리간드 상호작용을 조사하기 위한 강력한 도구로 등장했습니다. X선 결정학 및 극저온 전자 현미경과 같은 다른 기술과 달리 NMR을 사용하면 생리학에 가까운 조건에서 생체 분자 상호 작용을 연구할 수 있어 구조와 역학 모두에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 유연성을 통해 연구자들은 pH(일반적으로 4.0-8.0 사이), 이온 강도(예: 0-500mM NaCl) 및 온도(일반적으로 273-330K)와 같은 환경 매개변수를 조절하여 단백질-글리칸 복합체의 특이성에 맞게 조건을 조정할 수 있습니다. 또한, NMR은 단백질-글리칸 인식 이벤트의 특징인 일시적이고 약한 상호 작용을 분석하는 데 특히 유리합니다13,14.

단백질 및 리간드 기반 접근 방식을 모두 활용하여 단백질-글리칸 상호 작용을 조사하기 위해 여러 NMR 기술이 사용되었습니다. 단백질 관점에서 이종핵 단일 양자 간섭(HSQC) 적정은 리간드 추가 시 화학적 이동 교란을 모니터링하여 결합 부위를 매핑하는 데 널리 사용됩니다. 이완 분산 실험을 통해 마이크로초에서 밀리초까지의 시간 척도에서 발생하는 구조 및 화학적 교환 과정을 검출할 수 있어 글리칸 인식의 동적 측면에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다15,16. 이러한 단백질 기반 기술은 일반적으로 단백질 안정성 및 라벨링 효율에 따라 50 μM에서 2 mM 범위의 샘플 농도를 필요로 합니다17,18.

리간드 기반 NMR 기술은 결합 중 글리칸 변화에 초점을 맞춰 보완적인 정보를 제공합니다. 포화 전달 차이(STD-NMR)는 단백질과 밀접하게 접촉하는 리간드 영역의 NMR 신호를 선택적으로 포화시키기 때문에 인식에 관여하는 글리칸 에피토프를 식별하는 데 특히 유용합니다19,20. 구배 분광법(WaterLOGSY)21,22 및 전달된 핵 오버하우저 효과 분광법(Tr-NOESY)을 통해 관찰된 물-리간드는 상호 작용 동안 리간드 결합 및 형태 변화를 평가하는 추가 수단을 제공합니다23. 또한, CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 이완 실험은 기존 방법으로는 감지하기 어려운 약하고 일시적인 상호 작용을 식별하는 데 도움이 됩니다24. 리간드 기반 실험은 종종 10-50μM의 단백질 농도에서 수행되며 혼합 시간 및 포화 매개변수의 최적화가 필요할 수 있습니다25. 특히, 이러한 방법은 작은 리간드로 작업할 때 글리칸의 낮은 용해도나 낮은 신호 대 잡음비로 인해 제한될 수 있습니다.

이러한 NMR 방법은 단백질-글리칸 상호 작용의 구조적, 동적 특성을 밝히기 위한 포괄적인 프레임워크를 제공합니다. 민감도 및 동위원소 표지 전략의 지속적인 발전으로 이 기술은 당생물학에서 점점 더 중요해지고 있으며, 약물 개발 및 바이오마커 발견에 잠재적인 응용과 함께 분자 인식 메커니즘에 대한 새로운 관점을 제공하고 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근법의 성공 여부는 샘플 균질성, 글리칸 복잡성, NMR 신호를 확장하거나 해석을 방해할 수 있는 유연하거나 무질서한 영역의 존재와 같은 요인에 달려 있습니다26. NMR은 구조 생물학의 주요 과제인 일시적인 사건을 연구하는 강력한 방법입니다.

CVN은 나노몰 친화력을 갖는 고만노스 올리고당에 존재하는 α(1,2) 결합 만노실 잔기를 인식합니다 27,28,29. 그러나 단당류 D-만노스를 잘 인식하지 못합니다. 본 연구에서 우리는 NMR이 일시적인 상호 작용을 이해하는 데 어떻게 강력한지 설명하는 방법으로 CVN과 D-만노스의 상호 작용을 연구했습니다.

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프로토콜

참고: 기관의 생물안전성 프로토콜에 따라 박테리아 배양 및 완충액 준비와 관련된 모든 단계를 수행합니다. 개인 보호 장비(PPE)를 사용하고 개방된 배양 또는 화학 물질을 취급할 때 필요한 경우 생물 안전 캐비닛 또는 화학 연기 후드에서 작업하십시오.

1. 시아노비린-N의 발현

  1. pET26a 벡터에 삽입된 CVN 유전자를 암호화하는 플라스미드로 대장균 BL21 세포를 형질전환합니다.
  2. 카나마이신(50μg/mL), 0.5%(w/v) 포도당 및 1.6mM MgSO4를 보충한 1L의 슈퍼 육수(트립톤 32g, 효모 추출물 20g, NaCl 5g)에서 세포를 배양합니다. 37°C에서 ~250rpm의 연속 교반 하에 배양합니다.
  3. 15N-표지 CVN의 생산을 위해, 15NH4Cl을 유일한 질소 공급원으로 사용하여 변형된 M9 최소 배지에서 세포를 성장시킵니다.
    1. 64g/L의 Na2HPO4, 15g/L의 KH2PO4, 2.5g/L의 NaCl, 5g/L의 NH4Cl을 함유한 멸균 5x M9 염 용액 200mL를 혼합하여 1L의 M9 최소 배지를 준비합니다.
    2. 1 M MgSO4 2 mL(0.22 μm 필터 멸균), 0.1 mL 1 M CaCl2 (0.22 μm 필터 멸균) 및 포도당 4g(최종 농도 0.4%, 멸균 증류수에 용해 및 0.22 μm 필터 멸균)을 추가합니다.
    3. 멸균 증류수로 최종 부피를 1L로 만듭니다.
      참고: 필요에 따라 아미노산이나 비타민과 같은 보충제를 추가할 수 있습니다.
  4. 약 1.2의 광학 밀도(OD600)에 도달할 때까지 배양을 모니터링합니다. 그런 다음 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 1.0mM로 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다.
  5. 유도 후 37°C에서 20시간 동안 배양합니다.
  6. 4°C에서 10분 동안 7,000 × g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다.
  7. 다음과 같이 periplasmic 분획을 분리합니다.
    1. 20% 자당과 1mM EDTA를 함유하는 0.4부피의 30mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 세포 펠릿을 재현탁하고 실온에서 10분 동안 쉐이크합니다.
    2. 10,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    3. 생성된 펠릿을 0.4부피의 얼음처럼 차가운 증류수에 재현탁하고 얼음 위에서 10분 동안 흔들면서 배양합니다.
    4. 10,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.
    5. 단백질 추출을 위해 주위 세포질 분획에 해당하는 상청액을 수집합니다.
      참고: 모든 완충액은 단백질 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제 칵테일을 포함해야 합니다.

2. NMR 실험

참고: 모든 실험은 298K에서 1H/15N/13C 삼중 공명 역검출 프로브( 재료 표 참조)를 사용하여 14.1 T에서 획득되었습니다.

  1. 리간드 기반 실험
    1. 시료 준비
      1. CVN을 포함하는 샘플과 CVN이 없는 샘플(리간드 전용 대조군)을 준비합니다. 각 샘플에는 50mM NaCl을 함유한 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 600μL의 80μM CVN이 포함되어 있습니다.
      2. D-만노스를 최종 농도 4mM까지 첨가합니다.
      3. 각 샘플에 5%(v/v) D2O를 첨가합니다.
      4. 샘플을 5mm NMR 튜브로 옮깁니다.
      5. 단백질에 비해 리간드의 50배 몰 초과를 사용하십시오.
        참고: 일반적으로 10배에서 1000배 범위의 리간드 과잉이 권장되며, 작은 단백질의 경우 더 낮은 과잉이 선호됩니다.
    2. D-만노스 할당을 위한 스펙트럼 획득
      1. 표준 펄스 시퀀스를 사용하여 2D TOCSY 및 2D 1 H-13C HMBC 스펙트럼을 획득합니다.
        2D TOCSY: 수분 억제(DIPSI2ESGPPH)를 위한 여기 조각을 사용한 위상 민감 총 상관 분광법(TOCSY).
        2D HMBC: 1 H-13C 구배 선택 및 비분리 획득(HMBCGPNDQF)을 통한 이종핵 다중 결합 상관관계.
        참고: 이러한 실험은 D-만노스 할당을 목적으로 수행되었지만 화학적 이동 할당이 이 연구의 범위에 포함되지 않기 때문에 표시되지 않습니다.
    3. 리간드의 화학적 이동 섭동(CSP)을 통한 리간드 결합 매핑
      1. ¹H-¹³C HSQC 스펙트럼의 시료 전처리 및 획득을 위해 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 50mM NaCl 및 5% D2O와 함께 4mM D-만노스 용액을 준비합니다. 용액을 80μM CVN이 있는 샘플과 CVN이 없는 샘플(리간드 전용 참조)의 두 샘플로 나눕니다.
        참고: 이 스펙트럼은 CVN과의 상호 작용 시 D-만노스의 CSP를 결정하는 데 사용됩니다.
      2. 1 H-13C HSQC 획득 파라미터를 설정하려면 표준 펄스 시퀀스 HSQCETGPSI(그래디언트 선택 및 감도 강화 1 H-13C HSQC)를 사용합니다. 획득을 위해 다음 매개변수를 설정합니다.
        시간 도메인(TD): 1024 × 128개의 복소수점(¹H × ¹³C 차원)
        스펙트럼 폭(SW): ¹H의 경우 10.0171ppm(6009.615Hz), ¹³C의 경우 80ppm(12069.106Hz)
        캐리어 주파수: ¹H의 경우 4.7ppm, ¹³C의 경우 75ppm
        - 스캔 수: 448.
      3. 다음 방정식을 사용하여 CSP를 계산합니다.
        figure-protocol-1
        여기서 figure-protocol-2 및 CVN figure-protocol-3 (그림 1A, 빨간색으로 표시됨)과 유리 D-만노스(그림 1B)의 존재 하에서 D-만노스 사이의 화학적 이동 차이를 나타냅니다.
    4. 포화 전달 차이(STD)를 통한 리간드 결합 매핑
      1. 새 데이터 세트를 생성하고 STD-NMR 실험을 위한 매개변수를 구성합니다. 두 가지 실험 전략이 적용될 수 있습니다: (i) 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해 서로 다른 포화 주파수의 스크리닝; (ii) 포화 주파수를 고정하고 포화 시간을 변경하여 축적을 평가합니다.
      2. zgpr 펄스 시퀀스를 사용하여 1D ¹H NMR 실험을 설정합니다. 분광계를 ¹H로 조정하고, 시밍을 수행하고, 단단한 90° 펄스를 측정합니다(예: -10.6dB 감쇠에서 ~10μs, ~11.482W에 해당).
      3. ¹H 반송파 주파수를 물 신호에 해당하는 약 4.7ppm의 중심에 둡니다.
      4. STDDIFFESGP.3 펄스 시퀀스를 선택하고 다음과 같이 획득 매개변수를 구성합니다.
        샘플 요구 사항에 따라 스펙트럼 폭을 설정합니다.
        인터스캔 지연(d1)을 4초로 설정합니다.
        원하는 실험을 기반으로 포화 시간(d20)을 정의합니다.
        오프 공명 포화 주파수(-40ppm)와 온 공진 주파수가 포함된 FQ2LIST를 로드하여 단백질 신호만 포화시킵니다.
        참고: 공명 주파수는 단백질 양성자와 일치해야 하며 직접적인 포화를 피하기 위해 리간드 신호에서 최소 1000Hz 떨어져 있어야 합니다.
      5. 최적의 조건을 결정하기 위해 다음 공진 포화 주파수를 테스트합니다: -0.59ppm, 0.73ppm 및 8.1ppm( 그림 2A 참조).
        참고: 0.73ppm은 최상의 신호 대 잡음비를 제공했기 때문에 공진 포화 주파수로 선택되었습니다. 이 주파수를 사용하여 STD 증폭 인자(ASTD)를 포화 시간의 함수로 정량화했습니다. 이를 위해 STD 스펙트럼을 서로 다른 포화 시간(0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 및 4초)에서 획득하여 STD 축적 곡선을 구성했습니다(그림 2B). 그런 다음 해당 ASTD 값을 포화 시간의 함수로 표시하고(그림 2C), 단백질에 대한 리간드 수소의 시간 및 근접성에 비례하는 포화 전달의 효율성을 평가할 수 있었습니다. 성병 요인은 다음과 같이 정의됩니다.
        figure-protocol-4
        ISTD 는 온 공명 스펙트럼과 오프 공진 스펙트럼 사이의 신호 강도 차이이고, I0은 오프 공명 스펙트럼의 신호 강도이며, [L]T는 총 리간드 농도, [P]는 단백질 농도입니다. 이 정규화는 농도 효과를 설명하고 다양한 실험 조건에서 비교할 수 있습니다. STD는 스핀 확산과 느린 분자 텀블링에 의존하여 단백질에서 결합된 리간드로 포화를 효율적으로 전달합니다. 더 큰 단백질(느린 텀블링)은 단백질 19,30,31,32 내에서 자화의 보다 효율적인 포화 및 확산을 허용합니다.
      6. 스캔 횟수(ns)를 64로 설정하고 실험 l4(루프 4)를 평균화합니다.
      7. 총 스캔 횟수를 다음과 같이 계산합니다: 총 스캔 = ns × l4. 스펙트럼 폭(SW)이 10.0171ppm(6,009.615Hz)인 직접 차원(TD)에서 32,768개의 복소수 포인트를 사용합니다.
      8. 인터스캔 지연(d1)을 4초로 설정하고 획득 시간(AQ)을 2.7262976초로 설정합니다. 총 완화 지연은 d1 + AQ와 같습니다.
      9. 포화 펄스를 다음과 같이 구성합니다: 지속 시간 50ms; 모양 가우스(p42); 성형 프로그램 9(SP9) 를 통해 제어됩니다.
      10. 잔류 단백질 신호를 억제하기 위해 T1ρ 필터를 포함하는 STD 펄스 서열 변이체를 사용합니다. 단백질 분자량을 기준으로 스핀 잠금 시간(d29)을 설정합니다. 더 큰 단백질의 경우 더 작은 스핀 잠금 시간(~20ms)을 사용하고 더 작은 단백질의 경우 더 큰(> 40ms)을 사용합니다.
        참고: 모든 STD 스펙트럼은 599.93MHz(BF1)에서 획득되었습니다. d29의 조정은 리간드 신호 무결성을 유지하면서 단백질 배경을 최소화하는 데 중요합니다. 필요한 경우 이 매개변수를 경험적으로 최적화합니다.
    5. 1H-R2를 통한 리간드 결합 매핑
      1. Bruker 표준 라이브러리에서 CPMG_ESGP2D 펄스 프로그램을 선택합니다. 이 시퀀스는 수분 억제를 위한 여기 조각을 통합한 CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 실험을 기반으로 합니다33.
      2. 실험을 2D 획득으로 설정합니다.
        참고: 이것은 화학적 이동 정보에 직접 차원만 사용되는 의사 2D 실험입니다.
      3. 다음과 같이 획득 매개변수를 구성합니다.
        시간 영역(TD): 직접 ¹H 차원의 32,768개 복소수 점.
        (TD1): 2점.
        스펙트럼 폭(SW): 7.9932ppm(4,795.396Hz).
        인터스캔 지연(d1): 4초.
        반송파 주파수(o1): 4.7ppm(물 신호 중심).
        스캔 수(ns): 8.
        더미 스캔 수(ds): 4.
        CPMG 지연(d20): ≤1ms(즉, 1⁄3 J_HH보다 짧음).
        평균 수(TDav): 200.
      4. 각각 8개의 스캔으로 구성된 200주기 동안 실험을 실행하면 총 1,600개의 스캔이 누적됩니다. CPMG 주기(TCPMG)의 원하는 총 시간에 따라 변수 카운터 목록(vclist)을 조정합니다. 여기에서는 TCPMG=8ms에 대해 2주기를 선택했고 TCPMG=800ms에 대해 200주기를 선택했습니다.
      5. 단백질(4mM D-만노스 및 80μM CVN)을 포함하는 샘플에 대해 다른 하나는 유리 D-만노스(4mM D-만노스)에 대해 두 개의 1H-CPMG 실험을 실행합니다.
      6. 명령 efp(지수 곱셈 후 푸리에 변환 및 위상 보정) 또는 sinm(사인 곱셈이 90° 이동, SSB=2) 다음에 fp(푸리에 변환 및 위상 보정) 명령을 통해 각 TCPMG에 대한 1H스펙트럼을 플로팅합니다. 최상의 처리 전략에 따라 창 기능을 조정합니다.
        참고: 이 실험에서는 sinm 및 fp를 사용했습니다. 1번째 직렬은 TCPMG 가 8ms(vclist에서 첫 번째)인 스펙트럼이고 2번째 직렬은 800ms(vclist에서 두 번째)입니다. 처리된 1H-스펙트럼은 그림 3에 표시됩니다.
      7. 방정식 3 을 통해 CPMG 몫(Q)을 계산합니다.
        ​figure-protocol-5
  2. 단백질 기반 실험
    1. 시료 준비
      1. 50mM NaCl 및 5% 산화중수소(D2O)가 보충된 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 436μM을 균일하게 15N-표지 CVN으로 함유한 샘플 600μL를 준비합니다. D-만노스를 샘플에 적정하여 최종 농도 60mM으로 합니다. 적정을 위해 5mm NMR 튜브를 사용합니다.
    2. 공명 할당(선택적 검증 단계)
      1. 이전에 보고된 화학적 이동 값34를 사용하여 용액에서 유리 CVN의 할당을 확인합니다. HNCO, HNCA, HNCACB 및 CBCACONH 35,36,37과 같은 삼중 공명 스펙트럼을 획득합니다.
        참고: 이러한 실험은 할당을 검증하는 역할만 하며 화학적 이동 할당이 이 프로토콜의 주요 목적이 아니기 때문에 표시되지 않습니다.
    3. 단백질의 화학적 이동 섭동에 의한 CVN에 대한 D-만노스의 결합 매핑
      1. 298K에서 15N-표지 CVN의 1 H-15N HSQC 스펙트럼을 획득합니다. D-만노스를 첨가하여 적정을 수행하여 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 및 60 mM의 최종 농도에 도달합니다.
      2. Bruker 표준 라이브러리의 위상 민감성 FHSQCF3GPPH 펄스 시퀀스를 사용하여 1 H-15N Fast-HSQC 실험을 설정합니다. 다음 매개변수를 사용합니다.
        시간 영역(TD): 1H및 15N차원에서 1024 × 140개의 복소수점.
        스펙트럼 폭(SW): 16.0274 H 차원에서 9615.385 ppm (1 Hz), 15N 차원에서 34 ppm (2067.119 Hz).
        반송파 주파수: 4.7ppm(1H) 및 119ppm(15N).
        스캔 수: 128.
      3. 다음 방정식을 사용하여 화학적 이동 섭동(Δδ)을 계산합니다.
        figure-protocol-6
        여기서 figure-protocol-7 및 는 figure-protocol-8 D-만노스의 존재 및 부재 시 CVN 간의 화학적 이동 차이입니다(그림 4A).
        참고: 계수 10은 양성자와 질소 치수 사이의 스펙트럼 폭 차이를 설명합니다.
      4. 각 잔기에 대한 CSP 값을 D-만노스 농도의 함수로 플로팅하여 해리 상수(KD)를 계산합니다. 다음 방정식(5)을 사용하여 결과 데이터를 단일 부위 결합 등온선에 적합시킵니다.
        figure-protocol-9방정식 5
        여기서 [PT]는 적정에 사용되는 단백질 농도(CVN)이고, [PT]는 리간드 농도(D-만노스)이며, CSPmax는 리간드의 포화 농도에서의 CSP 및 리간드가 없는 경우 CSPmin입니다.
    4. 단백질의 15N-R2 위치를 통해 CVN에 대한 D-만노스의 결합을 매핑합니다.
      1. 60mM D-만노스의 부재 및 존재 상태에서 CVN의 개별 잔기의 15N-R2 값을 측정합니다. 모든 실험을 298K에서 수행합니다.
      2. Bruker 표준 라이브러리의 위상 민감성 CPMG 기반 펄스 시퀀스 HSQCT2ETF3GPSI3D 사용하여 15N-R2 실험을 설정합니다. 다음 매개변수를 사용합니다.
        시간 영역(TD): 1H 및 15N 차원의 1024 × 128개의 복소수 점, 의사 차원의 8점.
        스펙트럼 폭(SW): 16.0274ppm(1H, 9615.385Hz) 및 34ppm(15N, 2067.119Hz).
        반송파 주파수: 4.7ppm(1H) 및 119ppm(15N).
        스캔 수: 32. (v) 변수 카운터 목록: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 및 7, 각각 16.96, 135.68, 33.92, 101.76, 50.88, 84.96, 67.84 및 118.72ms의 완화 지연(T이완)에 해당합니다.
      3. 소프트웨어 자습서에 따라 NMRPipe38을 사용하여 의사 3D 스펙트럼을 일련의 HSQC와 유사한 1H/15N 상관 완화 스펙트럼으로 처리합니다(자습서 링크는 재료 표 참조).
      4. 처리된 스펙트럼을 적절한 NMR 분석 플랫폼(예: CCPNMR39)으로 가져옵니다. 모든 스펙트럼을 선택하고 "강도 변화 따라가기" 도구를 적용합니다. 각 교차 피크의 강도를 T이완 의 함수로 플로팅하고 붕괴를 단일 지수 함수에 맞춰 각 잔차에 대해 15개의 N-R2 값을 추출합니다.
      5. 67.84ms에서 HSQC 유사 스펙트럼의 신호 대 잡음비에서 실험 오류를 계산합니다. 노이즈만 포함된 스펙트럼 영역을 처리하고 다음 명령을 사용하여 텍스트 파일로 변환합니다.
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. 통계 소프트웨어(예: Origin(Pro), 버전 2021)를 사용하여 노이즈 영역의 표준 편차를 결정합니다. 이 값을 노이즈 강도 I노이즈로 정의합니다.
      7. 다음 방정식을 사용하여 각 잔류물에 대한 실험 오차를 계산합니다.
        figure-protocol-10
        참고: 피팅 오차보다는 실험 오차를 사용하는 것이 중요합니다. 실험 오류는 D-만노스의 부재 및 존재 상태에서 15N-R2 를 비교할 때 해석 한계를 정의합니다.

figure-protocol-11
그림 1: CVN의 존재 하에서 D-만노스의 화학적 이동 섭동. (A) CVN의 존재 하에서 D-만노스의 1 H-13 C-HSQC 스펙트럼. (B) 유리 D-만노스의 1 H-13C-HSQC 스펙트럼. 스펙트럼의 라벨은 각 화학적 이동 할당과 각각의 아노머 구성(α 또는 β)을 보여줍니다. 빨간색 레이블은 결합된 형태에 할당된 레이블이고 검은색 레이블은 자유 형태에 할당된 레이블입니다. (C) CVN의 존재(녹색) 및 부재(파란색)에서 1 H-13C-HSQC 스펙트럼의 중첩. (D) 방정식 (1)에 따라 계산된 관찰된 CSP를 강조하는 α- 및 β-D-만노스의 화학 구조. CSP 값은 녹색 원 아래에 표시됩니다. 빨간색 원은 CVN이 있을 때 사라진 β 아노머 수소를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-12
그림 2: CVN의 존재 하에서 D-만노스의 포화 전달 차이(STD) 스펙트럼. (A) 서로 다른 포화 주파수에서 획득된 STD: -0.59, 0.73 및 8.1ppm. (B) 서로 다른 포화 시간에서 획득된 STD: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 및 4초. (C) 포화 시간의 함수로서 방정식 2에 따라 계산된 STD 증폭 계수(ASTD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-13
그림 3: CVN의 존재 및 부재 상태에서 D-만노스의 1HR2. (A) CVN의 부재(하단) 및 존재(상단)에서 8 및 800ms의 R2 완화 시간으로 획득된 결합제 및 비결합제에 대한 예상 D-만노스 1H-CPMG 스펙트럼의 표현. Q는 방정식 3에 따라 계산되었습니다. 상호작용이 없는 경우(Q ≈ 1), 신호 강도는 단백질이 있거나 없는 리간드의 이완 시간 모두에서 유사하게 유지됩니다. 결합 시(Q < 1), 단백질을 포함하는 샘플의 이완이 증가함에 따라 신호 강도가 감소합니다. (B) D-만노스의 자유 상태와 결합 상태 사이의 화학적 교환의 개략적인 표현. 화학적 이동 차이(Δω)와 환율 상수(kex = kon + koff)의 상대 값에 따라 시스템은 느림, 중간 또는 빠른 교환 체제로 속합니다. (다)1CVN이 있는 상태에서 유리 D-만노스 및 D-만노스의 H NMR 스펙트럼은 8ms 및 800ms 이완 시간에서 신호 강도의 차이를 보여줍니다. 특정 수소(H6β, H3β, H5α, H4β)에 대해 계산된 Q 인자가 표시되며, Q 값이 낮을수록 CVN과의 상호 작용이 더 강함을 나타내고 결합에 관여하는 당 영역을 식별합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-14
그림 4: D-만노스 결합에 관여하는 CVN 잔기를 밝히는 화학적 이동 섭동(CSP) 분석. (A) 10mM(상단) 및 60mM(하단) 농도에서 D-만노스로 적정 시 CVN의 백본 아미드(15 N-1H) CSP를 보여주는 막대 플롯. 수평선은 평균 CSP에 1개 또는 2개의 표준 편차(av + sd, av + 2 sd)를 더한 것을 나타내며, 이는 크게 교란된 잔기를 식별하기 위한 임계값으로 사용되었습니다. (B) 이당류 Manα1-2Manα(PDB ID: 1IIY40)와 복합된 CVN의 구조에 유의하게 교란된 잔기의 매핑. av + 2 sd 임계값을 초과하는 CSP가 있는 잔기는 빨간색으로 강조 표시되고 av + sd와 av + 2 sd 사이의 잔기는 파란색으로 표시됩니다. 이당류 Manα1-2Manα 분자는 결합 위치를 나타내기 위해 주황색으로 표시됩니다. (C) D-만노스 농도의 함수로서 CSP를 나타내는 선택된 결합 곡선. 데이터는 방정식 5에 따라 KD를 추정하기 위한 단일 부위 결합 모델로 적합되었으며, D44가 가장 강한 상호 작용(KD = 1.1 ± 0.35 mM)을 나타내고 E41이 가장 약한(KD = 35 ± 29 mM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-15
그림 5: CVN이 없고 D-만노스에 결합된 15N-R2 분석. (ᅡ, ᄂ) (A) 자유 및 (B) D-만노스 결합 상태에서 CVN의 각 잔기에 대해 측정된 횡방향 이완율(15NR2). (C) 잔기당 표시된 R2 값의 차이(ΔR2 = R2경계 - R2자유). 파란색 및 빨간색 선은 각각 평균(av ± sd 및 av ± 2 sd)에서 1 및 2 표준 편차를 나타냅니다. 유의미한 ΔR2 값을 가진 잔기는 레이블이 지정됩니다. (D) 이당류 Manα1-2Manα(PDB ID: 1IIY40)와 복합된 CVN의 구조에 대한 ΔR2 값의 매핑. ΔR2가 av± 2 sd보다 높거나 낮은 잔기는 빨간색으로 표시됩니다. AV± SD와 AV± 2 SD 사이의 것은 파란색으로 표시됩니다. D-만노스 분자는 결합 위치를 나타내기 위해 주황색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

본 연구에서는 단백질-글리칸 상호작용을 조사하기 위한 NMR 실험을 제시했습니다. 단백질-글리칸 분자 인식은 세포 접착, 이동, 증식 및 기타 다양한 형태의 세포 통신의 조절을 포함하여 세포외 기질(ECM)과 관련된 수많은 생물학적 과정의 기초가 됩니다.

여기에서 우리는 약한 결합제로 설명되는 단당류 D-만노스로 작업하기로 결정했습니다. 목표는 일시적인 상호 작용을 측정하는 방법을 설명하고 결합 메커니즘을 밝히는 데 있어 그 중요성을 강조하는 것이었습니다. 리간드의 상호 작용 부위를 특성화하기 위해 세 가지 다른 리간드 기반 NMR 접근법이 사용되었습니다.

첫 번째 방법은 CVN이 있는 상태에서 D-만노스의 화학적 이동 섭동(CSP)을 평가하는 것이었습니다. 이를 위해 CVN에 비해 50배 초과된 D-만노스(그림 1A)와 동일한 완충 조건(...

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토론

NMR 분광법은 특히 CVN과 D-만노스 사이에서 관찰되는 것과 같은 약하고 일시적인 상호 작용을 감지할 수 있는 능력 때문에 단백질-글리칸 상호 작용을 조사하기 위한 다목적 접근 방식을 나타냅니다. 여기에 설명된 프로토콜은 리간드 및 단백질 기반 NMR 방법을 결합하여 상호 작용 인터페이스의 보다 포괄적인 특성화를 가능하게 합니다.

프로토콜의 중요한 단계에는 단백질 및 리간드 농도의 정밀한 제어, 스펙트럼 매개변수의 표준화 및 NMR 실험의 적절한 선택을 통한 신중한 샘플 준비가 포함됩니다. 데이터의 재현성은 특히 용매 포화도의 영향을 받는 STD 및 WaterLOGSY21,43과 같은 민감한 실험에서 시료 안정성에 크게 좌우됩니다.

이 작업에서 리간드와 단백질 관...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

NMR 분광기를 사용해 주신 CNRMN(Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas)에 감사드립니다. Manα1-2Manα와 복합체에서 CVN의 화학적 이동 할당을 공유해 주신 Carole Bewley 박사에게 감사드립니다. 또한 자금 지원 기관인 FAPERJ와 CNPq에도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
13C 포도당Cambrige 동위원소 연구소.CLM-481
15N 염화암모늄Cambrige 동위원소 연구소.NLM-467 시리즈
염화칼슘시그마-알드리치C4901
코케텔은 프로테아제를 억제합니다.시그마-알드리치4693159001
D2OCambrige 동위원소 연구소.DLM-4
D-만노스시그마-알드리치M2069-5G
염화마그네슘시그마-알드리치M8266
NMR파이소프트웨어 자습서 링크: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
염화칼륨(K2HPO4)시그마-알드리치P3786
염화칼륨(KCl)시그마-알드리치P3911
염화칼륨(KH2PO4)시그마-알드리치P0662
시게미 튜브브루커Z1Z10684A
염화나트륨(NaCl)시그마-알드리치에스9625
인산나트륨(Na2HPO4)시그마-알드리치567545
인산나트륨(NaH2PO4)시그마-알드리치S97263
분광계 Bruker 600MHz브루커
분광계 Bruker 800 MHz브루커
티아민시그마-알드리치T1270
삼중 공진 TXI 프로브브루커
트립톤시그마-알드리치93657
효모 추출물시그마-알드리치Y1625

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