Method Article

폐경 후 골다공증의 쥐 모델에서 Bupleurum의 뼈 보호 역할

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 폐경 후 골다공증의 난소 절제술 쥐 모델을 사용하여 Bupleurum(Chai hu) 경구액이 염증 유발 인자를 억제하고 항염증 인자를 강화하여 뼈 미세 구조를 개선한다는 것을 입증했습니다. 이는 항염증 메커니즘이 에스트로겐 결핍으로 유발된 골다공증을 부분적으로 완화한다는 것을 시사합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 난소 절제술(OVX) 쥐의 폐경 후 골다공증에 대한 차이후 투여의 효과를 조사하는 것을 목표로 합니다. 8주 된 암컷 Sprague-Dawley 쥐는 폐경 후 골다공증 모델을 확립하기 위해 등쪽 접근법을 사용하여 양측 난소 절제술을 받았습니다. 다양한 용량의 차이후 경구액을 연속 12주 동안 경구 위관으로 투여한 후 뼈 미세 구조를 평가하고 염증성 사이토카인 수치를 측정했습니다. 중용량 및 고용량 차이후 치료는 OVX 쥐에서 뼈 손실을 부분적으로 억제하고 전염증성 사이토카인 발현을 감소시키며 항염증성 사이토카인 수치를 상향 조절했습니다. 뼈 파괴의 중증도가 저용량에서 고용량으로 크게 감소했으며 뼈 미세 구조 재건에서 용량 관련 개선이 관찰되었습니다. Chai hu는 에스트로겐 결핍으로 인한 뼈 손실과 미세 구조 악화를 완화하여 이 OVX 모델에서 OP 진행을 억제했습니다. 이것은 관련된 경로의 항염증 효과로 인해 발생했을 가능성이 높습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골다공증(OP)은 골량 감소, 뼈 강도 감소 및 뼈 미세 구조의 파괴를 특징으로 하는 일반적인 대사성 뼈 질환입니다1. OP는 1차 또는 2차로 나타날 수 있으며 1차 OP는 폐경 후 OP(PMOP), 노인성 OP 및 특발성 OP(청소년에서 자주 발생함)로 분류됩니다. 그 중 I형 PMOP는 주로 PM 여성에서 발생하며, 에스트로겐2의 순환 수치 감소로 인해 폐경 후 골밀도가 현저하게 감소합니다. 전신 대사성 뼈 질환으로 파골세포 활동이 증가하고 분화가 심해집니다3. 또한 뼈 흡수의 강도가 형성보다 훨씬 커서 골량이 감소하고 뼈 취약성 및 골절 위험이 증가합니다4.

현재 연구에 따르면 골관절염 및 치주염과 같은 많은 만성 염증성 질환이 상당한 뼈 손실과 관련이 있는 것으로 나타났으며, 이는 염증이 OP5와 밀접한 관련이 있을 수 있음을 시사합니다. PM 여성은 나이가 들수록 내분비 변화와 함께 생리 및 면역 기능이 저하되어 신체는 장기간 만성 염증 상태에 놓이게 됩니다. 이러한 염증 촉진 인자와 T 세포 유래 사이토카인 중 다수는 뼈 손실에 중요한 역할을 합니다. 따라서 PMOP는 만성 염증성 질환으로도 인식됩니다 6,7.

한의학(TCM)은 PMOP의 예방 및 치료에 있어 오랜 역사와 풍부한 임상 경험을 가지고 있으며 전체적인 관리와 개별화된 진단 및 치료에 중점을 두고 있으며 내분비계와 면역계를 동시에 조절할 수 있어 폐경 후 여성에게 축복입니다8. 이를 통해 많은 비율의 여성이 치료를 받을 수 있습니다. 현대 약리학 연구와 임상 시험에 따르면 TCM은 다중 표적화, 낮은 독성 및 부작용의 장점이 있으며 가격이 저렴하다는 것을 보여주었습니다. PMOP9의 TCM 치료에서 합병증의 위험을 크게 줄일 수 있습니다.

차이후 자체에는 항염증제10 와 항우울제11특성이 있으며, 체내 호르몬 분비를 조절할 수 있을 뿐만 아니라건강 에도 도움이 될 뿐만 아니라13. 차이후는 감정을 진정시키고 소화를 촉진하며 위와 장에서 흡수하는 효과가 있는 한의학 복합 제형인 Xiaoyao Pills에서 중요한 역할을 하는 주성분입니다. 또한 기와 혈액 에너지를 보충하고 월경 주기의 증상과 관련 불편함을 조절하는 것으로 알려져 있습니다14. 차이후의 주성분은 차이후사포닌으로 강력한 항염증 활성을 갖고 있으며, 주로 종양괴사인자α(TNF-α), 인터루킨 1β, IL-615 등 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것으로 나타난다. 또한 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시켜 대장염, 자궁내막염, 간염16과 같은 염증을 완화시킵니다.

표준 OP 치료(비스포스포네이트17, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제18 및 데노수맙19 사용 포함)와 비교하여 일반적으로 사용되는 TCM인 Chai hu는 다중 성분, 다중 표적 작용 메커니즘의 잠재적 이점을 가지고 있습니다. 표준 요법은 일반적으로 특정 뼈 대사 경로20(파골세포 활동 억제)를 표적으로 하며, 이는 위장 불편, 턱 골괴사 위험 증가, 독감 유사 증상과 같은 특정 부작용과 관련될 수 있을 뿐만 아니라 높은 장기 약물 비용21.

관련 문헌을 검토한 결과 OP가 있는 PM 쥐에 개입하기 위해 차이후를 사용하면 치료 완화 효과가 있을 수 있는 것으로 나타났습니다22. 따라서 도킹 부위23을 예측하기 위한 생물정보학 및 약리학적 분석과 분자 도킹 시뮬레이션을 기반으로 차이후가 염증 과정에 개입하고 신체의 면역 상태를 조절하며 뼈 면역 항상성을 회복할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이는 뼈 재건 상태의 안정성을 촉진하고 OP 완화의 원하는 치료 효과를 달성할 것입니다.

이 연구는 연속 12주에 걸쳐 차이후 경구액(농도: 1g/mL) 투여를 사용했습니다. 투여 요법은 TCM 및 약동학 연구에서 임상적으로 일반적인 용량을 기반으로 설계되었습니다24.

이 투여 방법의 전반적인 목표는 안정적이고 임상적으로 관련된 투여 프로토콜을 확립하여 표적 모델(폐경 후 골다공증의 쥐 모델)에서 Chai hu의 지속적인 개입 효과를 체계적으로 평가하는 것입니다. 이 투여 접근법은 약물이 실험 기간 동안 효과적인 혈장 농도를 유지하도록 보장하여 후속 평가(예: 뼈 대사 지표 및 염증 인자 수준)를 위한 신뢰할 수 있는 개입 기반을 제공합니다. 또한, 관련 질병에서 차이후의 역할과 용량-효과 관계를 명확히 하는 데 도움이 되는 동시에 실험 연구에서 한약의 표준화된 투여를 위한 참조 패러다임을 제공합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 NIH 실험 동물 관리 및 사용 가이드(제8판)에 따라 수행되었으며 Youjiang Medical University for Nationalities의 동물 윤리 위원회(승인 번호 2024071001)의 구체적으로 승인되었습니다.

1. 네트워크 약리학 분석

참고: 사이버약리학은 시스템 생물학, 전산 생물학 및 약리학을 결합한 접근 방식이며 생체 분자 네트워크를 분석하여 약물의 작용 메커니즘 및 약물-약물 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 합니다25.

  1. TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)과 같은 도구를 사용하여 경구용 생체이용률(OB) 및 약물 유사성(DL)이 우수한 활성 화합물을 스크리닝합니다. OB를 ≥30%로, DL을 ≥0.1826으로 설정합니다. Chai hu를 검색하고 허브 세부 정보를 클릭하고 모든 화합물 데이터를 다운로드합니다. 다운로드한 파일의 이름을 Chaihu로 지정합니다.
  2. 핵심 성분의 MOL ID를 TCMSP 데이터베이스에 붙여넣어 핵심 성분의 대상 이름을 얻습니다. TCMSP 일괄 검색에 붙여넣고 대상 예측을 선택한 다음 제출을 클릭합니다.
  3. UniProtsh 데이터베이스를 열고 표적 이름 열을 검색에 복사한 다음 붙여넣은 표적 단백질 이름과 정확히 동일한 굵게 표시된 단백질 이름을 찾습니다. 해당 단백질 이름을 찾은 후 그 뒤의 열에서 해당 유전자 이름을 수집합니다.
  4. Relevance 점수 ≥ 1에 따라 GeneCards(https://www.genecards.org) 데이터베이스에서 골다공증 관련 유전자를 필터링하고 모든 (5741) 유전자를 얻습니다27.
    참고: GeneCards 데이터베이스에서 관련성 점수 ≥ 1인 유전자를 선택하는 이유는 다음과 같습니다. ≥점수 1은 유전자가 표적 질병과의 연관성을 문서화했음을 나타내며, 보고된 연관성이 없는 유전자와 명확하게 구별됩니다(점수 = 0). 이 임계값은 관련 없는 유전자의 과도한 간섭을 피하면서 신뢰할 수 있는 질병 관련성을 가진 유전자의 유지를 보장합니다. 더 낮은 임계값(<1)에는 검증된 연관성이 없는 유전자가 포함될 수 있으므로 위양성이 증가할 수 있습니다.
  5. 질병 관련 유전자 세트를 교차를 위한 약물 표적과 결합한 후 교차하는 유전자를 얻습니다. 질병 표적과 약물 활성 성분 간의 상호 작용을 기반으로 Cytoscape 소프트웨어를 사용하여 한약-활성 성분-표적-질병 교차 네트워크를 구축합니다.
  6. String 데이터베이스(https://cn.string-db.org/)를 통해 단백질-단백질 상호작용(PPI) 정보를 얻고 PPI 네트워크를 구축합니다. Cytoscape(https://www.cytoscape.org)를 열고 업로드 네트워크에서 다운로드한 TSV 파일을 로드한 다음 TOP10 또는 TOP20> 계산을 선택하고 제출을 클릭합니다.
  7. Cytoscape로 가져올 두 개의 테이블을 만듭니다. 네트워크라는 전자 스프레드시트 파일을 만듭니다. A 열에 중국 전통 의학의 약어로 대체된 동일한 MOL ID(CH1, CH2...)를 입력합니다. 열 B에 MOL ID로 레이블을 지정하고 MOL ID를 기준으로 오름차순으로 정렬합니다. 열 C에 기호로 레이블을 지정합니다. Chaihu 관련 파일의 구성 요소 ID(MOL ID) 및 유전자 이름을 각각 B 및 C 열에 복사합니다. 그런 다음 B 열을 삭제하고 A 열의 이름을 MOL ID로 바꿉니다.
  8. 표를 텍스트 끝까지 확장합니다. 기호 열에 MOL ID(CH1, CH2...)를 입력하고 한약의 약어로 대체합니다. MOL ID 열에 한약의 약어인 CH를 입력합니다. 위의 단계를 통해 정보 보완 및 한의학-구성 요소-대상 네트워크 구축이 완료되었습니다.
  9. 다음으로 두 번째 형식인 TYPE 파일을 수행합니다. 새 스프레드시트를 만들고 이름을 TYPE으로 지정합니다. 열 A를 Term으로 레이블을 지정하고 열 B를 TYPE으로 레이블을 지정합니다. 유전자 이름을 용어 열에 복사하고 유형 열에 유전자 속성을 부여합니다(목적은 유전자를 검색하는 것입니다. 모든 유전자 이름이 선택되므로 작동하기 쉽습니다). Term 열에 성분을 입력하고 성분에 drug1 속성을 지정합니다.
  10. Cytoscape 소프트웨어로 가져옵니다. 네트워크 파일을 업로드하려면 네트워크 가져오기를 누르고 테이블을 가져와 유형 파일을 업로드하려면 테이블을 가져옵니다. 검색 상자에 gene을 입력하고 Enter 키를 눌러 모든 유전자가 선택되도록 한 다음 선택한 유전자를 왼쪽으로 당긴 다음 Layout > Attribute() > Selected (괄호 안의 원형 또는 사각형 선택)를 클릭합니다.
  11. 네트워크 약리학 분석 결과와 실험 데이터를 결합하여 약물 작용의 주요 화합물과 분자 메커니즘을 식별합니다.

2. 분자 도킹

참고: 분자 도킹은 소분자(리간드)와 표적 단백질 또는 생체분자 사이의 최적 결합 모드 및 친화도를 예측하기 위한 계산 기술입니다28.

  1. 수용체 및 리간드 준비
    1. 수용체(단백질) 소스: RCSB 단백질 데이터 뱅크(https://www.rcsb.org)에서 표적 단백질의 PDB 파일을 얻습니다. 3Q4B(IL-6 수용체 예)를 검색하고 파일 다운로드 > PDB 형식을 클릭합니다.
    2. 편집 > 삭제 > 물, 외부 이온 및 비필수 리간드(금속 이온과 같은 중요한 보조 인자 유지)를 클릭하여 결정학적 물 분자를 제거 > > 헤테로원자를 제거합니다. Edit > Hydrogens > Add를 클릭하여 누락된 수소 원자를 추가합니다. protein.pdbqt로 저장합니다. Edit > Charges(전하 편집)를 클릭하여 Gaseiger> 계산한 다음 Grid > Macromolecule을 클릭> Save as PDBQT> 선택합니다.
    3. 리간드(소분자) 출처: PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)에서 리간드 구조를 다운로드합니다. Saikosaponin A(CID:6443568)를 검색하고 3D Conformer > Download SDF를 클릭합니다.
    4. Open Babel 소프트웨어를 사용하여 SDF 형식의 Saikosaponin A 파일을 저에너지 3차원 형태의 PDB 형식 파일로 변환하고 이름을 saikosaponinA로 지정합니다.
  2. 도킹 매개변수 설정(AutoDock 도구)
    1. 수용체 및 리간드 파일을 로드합니다. 소분자 파일 사이코사포닌 A를 가져와 PDBQT 파일로 저장합니다. 그런 다음 수용체와 리간드를 로드합니다: 고분자 > 도킹 > 열기를 클릭하고 IL6_receptor.pdbqt를 선택합니다. 그런 다음 도킹 > 리간드 > 열기를 클릭하고 saikosaponinA.pdbqt를 선택합니다.
    2. 그리드 상자 구성: 그리드 > 그리드 상자를 클릭하고 활성 사이트를 완전히 포함하도록 상자 크기를 조정한 다음(왼쪽 패널의 컨트롤 다이얼을 사용하여 미세 조정) 파일 > 현재 저장 닫기를 클릭하고 파일 이름을 grid.gpf로 지정합니다.
    3. AutoGrid 실행 프로그램 설정: AutoGrid 실행을 클릭하고 grid.gpf 파일을 선택한 다음 실행을 클릭합니다. 다음으로 도킹 매개변수를 구성합니다. 순차적으로 도킹 메뉴에서 고분자를 클릭하고 단백질 파일 IL6_receptor.pdbqt를 선택합니다. 리간드를 클릭하고 소분자 파일 saikosaponin A.pdbqt를 선택합니다. 유전 알고리즘을 설정하고 확인합니다. 도킹 매개변수를 조정하고 확인합니다. 마지막으로 출력에서 Lamarckian(4,2) 알고리즘을 선택하고 파일 이름을 dock.dpf로 지정한 다음 저장합니다.
    4. AutoGrid를 실행하고 결과를 저장합니다: AutoDock 실행을 클릭하고 dock.dpf 파일을 선택한 다음 시뮬레이션을 시작합니다. 완료되면 복합체 쓰기를 클릭하고 복합 구조의 이름을 지정하고 PDBQT 형식으로 저장합니다.
  3. PyMOL을 사용한 결과 분석
    1. Open Babel 소프트웨어를 사용하여 이전 분자 도킹 단계에서 얻은 PDBQT 형식 파일을 PDB 형식으로 변환합니다. 그런 다음 후속 시각화 작업을 위해 PDB 형식 파일을 PyMOL 소프트웨어로 가져옵니다.
    2. 리간드를 찾아 개별적으로 분리: 리간드를 선택한 후 Sele 을 클릭한 다음 색상에서 색상 을 선택하여 색상을 변경합니다. Sele 열에서 조치 아래의 객체 추출 을 클릭하여 리간드를 새 독립 객체로 추출하십시오.
    3. 수소 결합 거리 측정: 셀레 열에서 작업을 클릭하고 극성 접촉을 찾은 다음 개체의 다른 원자로; 수소 결합은 노란색 선으로 표시됩니다. 마법사 열에서 측정 옵션을 클릭하고 수소 결합의 양쪽 끝에 있는 원자를 순서대로 클릭한 다음 완료 를 클릭하여 측정을 완료합니다.
  4. 이미지 내보내기: 파일에서 이미지를 PNG로 내보내기를 클릭합니다. 고화질 렌더링이 필요한 경우 광선 300(픽셀 조정 가능)을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.

3. 마이크로 CT 분석

  1. 암컷 SD 쥐(32주령, 320-350g)에게 심부 마취를 위해 펜토바르비탈 나트륨(40mg/kg)을 복강 내 주사하고, 각막 반사(면봉 만질 때 깜박임 없음) 및 통증 반사(집게에 대한 뒷다리 수축 없음)가 없음으로 확인됩니다.
    1. 뒷지 격리 수술을 시행합니다. 쥐를 외과적 마취 용량의 3-5배(40mg/kg)의 용량으로 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 안락사시키고, 누운 자세로 눕힌 후 사타구니 인대를 따라 치골결합 위 1cm에 3cm의 가로 절개를 한다. gracilis근과 sretorius 근육 사이의 틈을 뭉툭하게 해부하여 대퇴 동맥(박동성 세뇨관 구조)을 노출시킵니다. 4-0 봉합사를 사용하여 대퇴 동맥의 양쪽 끝을 결찰하고 그 사이에 결찰되지 않은 부분을 남겨두고 안과용 가위로 혈관을 자르고 횡단합니다.
    2. 하지를 내부로 회전시켜 비구에서 대퇴골두를 탈구시키고 관절낭과 원형 인대를 절단하여 대퇴골두 무결성을 보존합니다. 온전한 뒷다리를 예냉된 식염수에 담근 다음 4% 포름알데히드 용액에 24-48시간 동안 고정합니다.
  2. 이미징 설정: 마이크로 CT 스캔을 위해 고정된 대퇴골을 시설로 전달합니다. Micro-CT 장치를 켜고 작은 동물 뼈 스캐닝 사전 설정 프로그램을 선택합니다. X선 전압 = 90kV, X선 전류 = 80μA, 시야(FOV) = 36mm, 픽셀 크기 = 72.0μm, 회전 = 360°, 스캔 시간 = 14분의 스캔 매개변수를 사용합니다.
  3. 고정된 쥐의 왼쪽 다리 대퇴골을 샘플 홀더에 놓고 사진을 찍을 대퇴골 골단을 고정한 후 장치를 시작한 후 기계 자체 테스트가 완료될 때까지 기다립니다. 미리보기 스캔(저해상도 고속 스캔)을 시작하여 샘플이 중앙에 있는지 확인한 다음 관심 영역을 조정하여 대퇴골 전체를 덮습니다.
  4. 스캔 및 촬영이 완료되면 X선 광원이 자동으로 꺼집니다. 이때 기계 내부의 방사선 값이 기준을 초과하므로 보호 장비 없이 샘플을 꺼내는 것은 절대 금지되어 있습니다.
  5. 이미지 분석: 스캐너에 내장된 소프트웨어를 사용하여 뼈 매개변수(골밀도[BMD], 섬유주수)를 분석합니다. 추가 평가를 위해 재구성된 이미지를 저장하고 내보냅니다.

4. 쥐 뼈 조직에서 RNA 추출을 위한 정량적 실시간 PCR

  1. 오른쪽 대퇴골에서 부착된 근육과 근막을 제거합니다. 뼈 조직 100-200mg을 작은 조각으로 자릅니다. 2-3개의 분쇄 비드와 500μL의 RNA 추출 완충액을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 70Hz의 티슈 그라인더를 사용하여 균질화합니다.
  2. 상 분리: 원심분리 후 용액은 상부 수성상(RNA 포함)과 하부 암흑 침전물(단백질, DNA 및 다당류 포함)으로 분리됩니다. 상청액 500μL를 RNase가 없는 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 추출을 위해 분리에서 얻은 상부 용액을 처리합니다.
  4. 용해 용액에 이소프로판올을 첨가한 후 튜브를 부드럽게 뒤집어 용액을 혼합하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 이 시점에서 육안 검사를 수행합니다. 백색 응집성 RNA 침전물이 관찰되면(튜브 벽에 부착됨) RNA가 효과적으로 침전되었음을 나타냅니다.
  5. 200μL 피펫 팁을 사용하여 잔류 액체를 흡인합니다. 튜브 바닥/벽에 흰색 RNA 펠릿을 유지합니다. RNA를 50-100μL의 RNase가 없는 물에 재현탁하고 -80°C에서 보관합니다.
  6. 뉴클레아제가 없는 튜브에 RNA 주형 2μL, 마스터 믹스 10μL, DNase 2μL, 뉴클레아제가 없는 물 5μL를 혼합합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
  7. 게놈 DNA 오염을 제거하기 위해 37°C에서 2분 동안 배양합니다. 55°C에서 15분 동안 배양합니다. 반응이 끝나면 85°C에서 5분 동안 배양하여 반응을 중단합니다.
  8. 역전사된 DNA를 얼음 위에 놓아 실시간 형광 정량 PCR 시스템을 구성합니다. 모든 성분을 미리 혼합합니다: qPCR SYBR Green Master Mix(Rox 없음) 10μL, Forward Primer 및 Reverse Primer 각각 0.4μL, RNase가 없는 물 8.2μL를 분할하여 첨가하고 얼음 위에서 조작하고 빛으로부터 보호합니다.
  9. 다음과 같이 qPCR 프로그램을 실행합니다: 95°C에서 5분 동안 1사이클 사전 변성한 후 95°C에서 10초 동안 40사이클 동안 변성합니다. SYBR Green 채널에서 40주기 동안 60°C에서 30초 동안 어닐링, 확장, 형광 획득을 수행합니다. 65-95°C의 온도에 대한 용융 곡선을 0.5°C 증분/단계 및 5초/단계로 얻습니다. 사용된 프라이머는 표 1에 나와 있습니다.

5. 동물 준비

  1. 암컷 미산부 SD 쥐 48마리(SPF 등급, 8주령, 체중 200-220g)를 확보합니다.
  2. 실험 절차 전에 SPF 등급 격리 시설에서 7일의 격리 기간으로 모든 쥐를 적응시키고 SPF 제어 실험실 환경(온도: 22-24°C, 습도: 45%-55%)에 수용합니다.

6. 시험약의 조제

  1. 차이후 경구액(중국 국가 의료 제품 승인 번호 Z41021539호)을 획득합니다. 이 제형에는 Chai hu(북부 소스)가 활성 성분으로 포함되어 있으며 향료, 자당 및 프로필렌 글리콜을 포함한 부형제가 포함되어 있습니다. 각 10mL 바이알에는 10g의 원유 허브에 해당하는 추출물이 들어 있습니다.

7. 난소 절제술 쥐 모델의 준비

  1. 수술 전 준비: 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 동안 빠른 쥐. 모든 수술 도구를 고압멸균하여 기구 멸균을 수행합니다.
  2. 마취 및 준비: 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사(40mg/kg)로 투여합니다. 각막 반사 부재(면봉으로 각막을 만졌을 때 깜박임 없음) 및 발가락 꼬집기 반사 부재(클램핑 시 뒷다리 수축 없음)를 평가하여 마취 깊이를 확인합니다. 15-20분 후 수술 부위를 면도하고 요오드로 소독한 후 천공 드레이프로 덮습니다. 동물의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 수술 중 비타민 A 눈 연고(15,000 IU/g 함유)를 바르십시오(표 2).
  3. 난소 절제술 쥐 모델: 전용 멸균 수술실에서 수술을 시행합니다. 모든 직원은 완전한 격리 가운을 입었습니다. 수술 전 조리대와 주변 장비를 75% 에탄올 (표 2) 으로 닦고 자외선 램프를 최소 30분 동안 켜서 공기와 표면의 미생물을 제거합니다.
    1. 등쪽 피부에 1cm 절개를 하고 피하 조직을 무뚝뚝하게 해부하고 근육층을 꼬집어 1cm 절개합니다. 지방 패드를 찾아 외부에 적용하여 난소(밝은 빨간색)를 식별합니다. 나팔관을 4-0 봉합사로 결찰하고 난소 조직을 절제한 다음 4% 파라포름알데히드가 함유된 50mL 원심분리관에 넣습니다(표 2).
  4. 상처 봉합 및 소독: 봉합하기 전에 페니실린 분말을 상처에 뿌립니다. 6번 비흡수성 봉합사로 근육층을 봉합하고 2번 봉합사로 피부를 봉합합니다. 닫힌 절개 부위를 요오드로 소독하고 국소 페니실린 분말을 바릅니다.
  5. 수술 후 관리: 체온을 유지하기 위해 따뜻한 물병과 수건이 있는 신선한 케이지에 쥐를 넣으십시오. 장폐색을 예방하기 위해 수술 후 24시간 동안 동물을 단식(물 허용) 합니다. 페니실린 분말을 3일 연속 절개 부위에 매일 바르십시오.
    1. 수술 직후 통증을 줄이기 위해 수술 절개 부위 주위에 리도카인(1%-2% 농도, 최대 5mg/kg)을 주입합니다. 3-5일 동안 지속적인 진통제를 제공하고 갑작스러운 중단을 피하기 위해 통증 중증도에 따라 점차적으로 용량을 줄입니다.
    2. 혀가 떨어지고 기도가 막히는 것을 방지하기 위해 깨어나기 전에 동물을 측면 자세 또는 머리를 아래로 향하게 하십시오. 깨어난 후 자율적으로 편안한 자세를 취할 수 있습니다. 싸움이나 교차 감염을 피하기 위해 완전히 회복될 때까지 수술 후 동물을 다른 동물로부터 격리합니다(그림 1).

8. 실험적 그룹화 및 약물 투여

  1. 그룹 할당: 총 40마리의 SD 쥐를 정상 대조군, 모델 대조군, 저농도 차이후, 중농도 차이후, 고농도 차이후의 5개 그룹(그룹당 n = 8개)으로 나눕니다.
  2. 중간 용량(5mL/kg) 그룹의 경우29,30에 있는 지침에 따라 용량을 선택합니다. 저농도 그룹: 2.5 mL/kg, 중농도 그룹: 5 mL/kg 및 고농도 그룹: 10 mL/kg에 대해 1:2:4의 농도 구배 비율을 따릅니다.
  3. 약물 투여: 경구 위관을 사용하고 1일 1회 약물을 투여합니다. 정상 대조군과 모델 대조군(양측 난소 절제술을 받은 동물)의 경우 동일한 양의 식염수로 경구 위관 시행합니다. 수술 후 1주차에 치료를 시작하여 12주 동안 계속합니다.

9. 실험 후 분석 및 데이터 수집

  1. 5개의 동물 그룹에 대해 다음 분석을 수행합니다: 뼈 구조의 마이크로 CT 및 쥐 대퇴 조직에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현 결정.
  2. 대퇴 섬유주 미세 구조의 시각화 이미지를 포함하는 데이터를 수집합니다. 정량적 뼈 매개변수(골밀도, 골 부피 분율, 섬유주 두께 표준 편차, 섬유주 간격, 섬유주 수 및 연결 밀도 포함); 대퇴 조직에서 전염증성 사이토카인(IL-6, IL-17) 및 항염증성 사이토카인(IL-4, IL-10)의 상대적 mRNA 발현 수준.
  3. GraphPad Prism 10.1.2 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 통해 데이터 분석을 수행합니다. 평균의 그룹 간 차이에 대한 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 사후 다중 비교는 Tukey의 테스트를 사용하여 실행되었습니다.

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Results

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GO 기능 및 KEGG 경로 농축 분석

우리는 PMOP에 대한 Chai Hu의 잠재적인 작용 메커니즘을 예측하기 위해 생물정보학에서 GO 및 KEGG 농축 분석에 의존했습니다. 질병에 대한 차이후의 활성 성분과 교차하는 표적 유전자의 GO 농축 분석에서 2138개의 유의한 항목이 산출되었으며 각 그룹에 대해 상위 10개의 중요한 결과가 나열되어 있습니다 (그림 2D). 생물학적 과정 (그림 2A)과 관련하여 교차하는 유전자는 주로 지질다당류 및 활성 산소종에 대한 피드백에 관여했습니다. 세포 성분 섹션 (그림 2B)

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Discussion

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PMOP는 PM 여성에게 자주 발생하는 전신적인 골대사 장애로, 에스트로겐 부족으로 인해 조골세포-파골세포 균형이 붕괴되어 파골세포 뼈 흡수가 강화되고 조골세포 뼈 생성이 감소합니다31. 점점 더 많은 연구에서 체내 염증 인자의 수준도 파골세포와 조골세포의 분화에 영향을 미치고 전염증 인자의 과발현이 파골세포의 분화에 기여한다는 사실이 밝혀졌습니다32. 유사하게, 항염증 인자의 과발현은 파골세포 발현을 억제합니다33. 이것은 항염증 기반 요법을 사용하여 PMOP를 치료하는 것이 가능할 수 있음을 나타냅니다.

한약 차이후는 염증 치료, 감기 및 독감 예방, 체내 호르몬 분비 조절, 간 보호 등을 위해 임상에서 널리 사용됩니다34. 허브 제형의 차이후는 ...

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 작업은 백세시 과학 연구 및 기술 개발 프로그램과 2025년 광시 대학 청년 및 중년 교사 과학 연구 기초 능력 향상 프로젝트(프로젝트 번호: 2025KY0549)의 지원을 받았습니다. 저자는 원고 편집을 해준 Imperial College London의 Dev Sooranna 박사와 YMUN에게 감사를 표합니다. ZY와 LYR은 이 작업에 동등하게 기여했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% 염화나트륨 주사 화렌제약h1712059
1× PBS 써모피셔10010023
75% 알코올 난징시약C069156931
95% 에탄올 난징시약C0691520075
무수 에탄올맥클린E809056
Bupleurum chinense 허난 바이취안 약국 Co.Z41021539
석회질 제거 용액&NBSP;솔라바이오E1171
에리스로마이신 연고 광저우 Baiyunshan 제약 그룹 회사 유한 Baiyunshan Hejigong 제약 공장H44023088
이소프로필 알코올 지난 Jinrihe 화학 유한 회사23727-29-9
페니실린 V 칼륨 캡슐쓰촨 제약H20103156
폴리포름알데히드(CH2O)n비요타임P0099
포비돈-요오드 소독제&NBSP;광동 Hengjian 제약 Co.H44023924
Real-Time 형광 PCR 키트Yeasen Biotechnology11201ES03
RNA 추출 키트모나드바이오텍MI20201S
RNA 역전사 키트유공바이오텍EG15123S
펜토바르비탈나트륨 상하이 Jixiang 생명 공학 유한 회사JX082085
트리졸 써모피셔15596026CN

References

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