방법 논문

단백질 어셈블리 간의 동적 교환 분석을 위한 FRET 희석 분석

DOI:

10.3791/68678

⸱

2025년 9월 19일

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 리플렉틴 A1의 정제 및 공유 라벨링뿐만 아니라 단백질 어셈블리 간의 리플렉틴 단백질의 동적 교환을 연령의 함수로 특성화하기 위한 FRET 희석 분석을 설명합니다.

초록

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두족류에서 조정 가능한 무지개 빛깔의 분자 동인으로서 리플렉틴 A1 단백질의 조정 가능한 위상 거동은 계속해서 생체 재료 공학의 초점이 되고 있습니다. 리플렉틴 A1의 염 농도와 단백질 순 전하 밀도를 조절하면 단백질이 액체-액체상 분리의 중간체로서 동적 어셈블리를 형성하도록 유도합니다. 반사 어셈블리는 단백질의 양이온, 쿨롱 반발력의 전하 중화 정도에 의해 크기가 제한되지만 처음에는 주변 용액의 단량체 또는 올리고머와 동적으로 교환됩니다. 새로운 형광 공명 에너지 전달(FRET) 희석 분석을 동적 광산란(DLS) 및 단백질 농도 분석과 함께 사용하여 리플렉틴 A1 어셈블리와 희석상 사이의 단백질의 양방향 플럭스를 어셈블리 연령의 함수로 특성화했습니다. 이 FRET 희석 분석은 단백질 어셈블리 안팎으로 들어오는 단백질의 단방향 플럭스와 양방향 플럭스를 구별하므로 어셈블리 형성 중에 적용할 수 있습니다. 동적 단백질 어셈블리와 동역학적으로 정지 된 단백질 어셈블리를 구별하는 것은 생물물리학적 기원을 이해하는 데 중요하며, 이 새로운 FRET 희석 분석은 다른 단백질 어셈블리에 대한 생물물리학적 조사를 보완하는 데 적용될 수 있습니다.

서론

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롤리지니드 오징어의 조정 가능한 무지개 빛깔은 홍채 세포 1,2,3의 리플렉틴 단백질에 의해 매개됩니다. 홍채세포는 각도 및 파장 의존적 방식으로 빛을 반사하는 단백질 밀도가 높은 Bragg 라멜라 스택을 형성하는 광범위하고 규칙적인 막 함입을 포함합니다 1,4,5,6. 아세틸콜린 유발 신호 캐스케이드는 양이온성 반사 단백질 1,2,7의 인산화에서 절정에 이르며, 단백질 내 및 단백질 간 정전기 반발력을 감소시키고 브래그 라멜라에서 반사의 응축을 10-50nm 유체역학적 반경 입자에서 조밀한 액체 응축수로 유도합니다 3,8,9. 시험관 내 리플렉틴 A1은 단백질 순 전하 밀도10,11,12에 의해 크기가 정밀하게 조정되는 크기가 안정적인 10+ nm 반경 어셈블리를 형성하며, 이러한 조정 가능한 콜로이드 거동은 리플렉틴 기반 조정 가능한 생체 광자 재료 13,14,15,16,17,18 설계에 많은 생명 공학적 관심을 불러일으켰습니다. NaCl이 소수성 효과의 에너지 기여도를 엔트로피적으로 증가시키고 교대 양이온 링커의 반발 전하를 스크리닝함으로써 A1 어셈블리 및 LLPS(액체-액체상 분리)를 구동한다는 것이 최근에 입증되었습니다19.

단백질 밀도가 높은 액체 유사 응축물의 경우, 조밀한 상과 희석상 사이의 동적 교환은 전체 액적 FRAP(광표백 후 형광 회복)20을 사용하여 쉽게 분석할 수 있습니다. 나노미터 규모의 단백질 어셈블리에 대한 유사한 분석이 필요합니다. LLPS 19,21,22의 중간체로서 생리학적으로 관련된 단백질 어셈블리에 대한 최근 보고는 어셈블리와 공존하는 희석상 사이의 어셈블리 역학 및 동적 교환을 조사하기 위한 동등한 방법의 필요성을 시사했습니다. 단백질 클러스터는 정지된 스피노달 분해에 의해 생성된 운동학적으로 정지된 유리 유사 콜로이드, 희석상으로부터 단량체 또는 올리고머를 교환하는 동적 평형 어셈블리 및 준안정 클러스터 23,24,25,26,27을 포함할 수 있습니다. 따라서 연령에 따른 단백질 조립 역학은 보다 복잡한 상 거동의 맥락에서 단백질 조립의 형성을 주도하는 물리적 과정을 이해하는 데 핵심입니다.

기증자 형광단 표지 단백질의 조립체와 수용체-형광단 표지 단백질의 조립체 사이의 상호 작용을 분석하는 FRET 기반 접근법은 준안정 단백질 클러스터의 역학을 특성화하는 데 사용되었습니다21. 이러한 클러스터를 혼합하면 FRET의 출현은 단백질이 클러스터21로 교환되고 수송되는 것을 보여줍니다. 그러나, 리플렉틴 A1과 같은 일부 단백질의 경우, 클러스터는 실험 기간 동안 지속적으로 형성되고 성장한다19. 이러한 단백질의 경우, 동적으로 정지된 클러스터의 지속적인 형성 중에 발생할 수 있는 것처럼 단백질의 단방향 클러스터 수송을 클러스터로 디콘볼루트하는 접근 방식과 어셈블리 간의 단백질의 양방향 수송이 필요합니다.

FRET 희석 접근법은 형광단 희석을 통해 이를 달성하며(그림 1), 여기서 FRET의 감소는 어셈블리 간 단백질의 양방향 수송을 의미합니다. 리플렉틴 단백질의 단백질 어셈블리는 수용체-형광단 또는 공여자-형광단으로 표지된 동일한 양의 단백질을 포함하는 것으로 제조되었습니다. 이러한 공동 표지 반사 어셈블리를 표지되지 않은 반사 어셈블리를 포함하는 용액으로 희석하고, 어셈블리 간 단백질의 동적 교환을 어셈블리 연령의 함수로 분석했습니다. 이 방법은 준안정 클러스터, 오스트왈드 숙성 또는 유사한 거칠기 과정으로 인해 성장하는 클러스터, 융합에 의해 성장하는 클러스터 및 LLPS의 중간체가 아닌 클러스터를 포함하되 이에 국한되지 않는 동적 클러스터와 동역학적으로 정지된 단백질 클러스터의 지속적인 형성을 구별합니다. 동적 광 산란, 나노입자 추적 분석(NTA) 및 브래드포드 분석과 같은 직교 방법이 필요한 동적 교환의 이러한 다양한 메커니즘만 구별하는 것이 아닙니다19,21. 이 프로토콜은 리플렉틴 A1 야생형 및 단일 시스테인 함유 돌연변이 A1-C232S의 정제 방법, A1-C232S의 공유 라벨링 및 FRET 희석 분석을 설명합니다.

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프로토콜

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사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 단백질 정제 및 공유 라벨링

  1. 변형
    1. reflectin A1 및 reflectin A1 C232S 유전자(GenBank KF661517.1)를 pj411 플라스미드로 복제합니다.
    2. 열충격 처리를 사용하여 플라스미드로 Rosetta 2(DE3) 세포를 형질감염시킵니다28.
    3. 형질감염된 세포를 50μg/mL 카나마이신을 함유한 한천에 플레이트합니다.
    4. 분리된 콜로니를 선택하고 50μg/mL 카나마이신을 함유한 5mL TB(Terrific Broth)에 첨가하고 셰이커에서 250rpm의 37°C에서 밤새 배양합니다.
    5. 시퀀싱을 위해 플라스미드 분리 키트 프로토콜을 사용하여 플라스미드를 분리합니다.
  2. 단백질 발현, 용해 및 봉입체 정제
    1. 50 μg/mL 카나마이신과 함께 1 L LB(용원성 국물)에 배양액 5mL를 첨가하고 37°C에서 흔들면서 배양합니다. 0.6-0.7의 A600 에서, IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)를 5 mM의 최종 농도에 첨가하여 발현을 유도한다.
    2. 16시간 후, 펠릿 세포를 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상청액을 디캔팅하고 -80°C 냉동고에서 세포 펠릿을 동결합니다.
    3. 세포 펠릿의 초기 재현탁 후 mL당 1μL(25-29단위)의 벤조나제 및 3-5KU의 리소자임으로 20분 처리하는 것을 포함하여 제조업체의 프로토콜에 따라 봉입체 정제 시약을 사용하여 세포를 용해하고 봉입체를 정제합니다. 정제된 봉입체는 짙은 갈색 펠릿으로 나타납니다.
  3. FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피)
    1. 8M 요소 2L: 5% v/v 아세트산 용액(완충액 A) 및 8M 구아니디늄 염산염 1L: 5% v/v 아세트산 용액(완충액 B)을 준비합니다. 0.22μm 진공 플라스크 필터를 사용하여 둘 다 필터링합니다.
      주의 : 구아니디늄 염산염의 흡입, 눈 및 피부 접촉을 피하고 취급 시 적절한 PPE(개인 보호 장비)를 착용하십시오. 전용 쓰레기통에 버리십시오.
    2. 8M 요소: 5% 아세트산 용액에 봉입체 펠릿을 자기 교반 막대로 세게 교반하여 재현탁합니다. 용액이 탁하게 나타납니다. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하고, 4°C에서 18,000 x g 에서 70분 동안 원심분리하고, FPLC용 상청액을 수집합니다. 상청액은 갈색으로 투명하게 나타납니다.
    3. 다음 모든 단계에서 2mL/min의 유속을 사용하여 양이온 교환 컬럼 10mL를 95% 버퍼 A, 5% 버퍼 B의 5컬럼 부피(CV)로 평형화하고 샘플을 로드합니다. 5개의 CV로 결합되지 않은 샘플을 씻어낸 다음 스텝 그래디언트를 수행합니다: 94% 버퍼 A/6% 버퍼 B의 5CV를 사용한 다음 10% 버퍼 B 5개의 CV를 사용합니다. 리플렉틴 A1은 10% 버퍼 B에서 용리됩니다.
    4. SDS-PAGE에 의해 10% 버퍼 B로의 초기 단계 변경에 해당하는 분획의 순도를 평가하고 유사한 경우 풀링합니다. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하고 15mL 10kDa MWCO 스핀 농축기를 사용하여 분획을 4-5mL의 최종 부피로 농축합니다.
  4. HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)
    1. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 포함된 18mΩ 물 2L와 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 2L를 준비합니다. 0.22μm 진공 플라스크 필터를 사용하여 둘 다 필터링합니다.
      주의: TFA는 강한 발연산입니다. 적절한 PPE를 착용하고 연기 후드에서 취급하고 유리를 사용해서만 옮기십시오. 아세토니트릴의 흡입, 눈 및 피부 접촉을 피하고 취급 시 적절한 PPE를 착용하십시오. 전용 쓰레기통에 버리십시오.
    2. 다음 모든 단계에서 1 mL/min 유속을 사용하여 C4 컬럼을 85% 18mΩ 물, 0.1% TFA 및 15% 아세토니트릴, 0.1% TFA의 5 CV로 평형화합니다.
    3. 흐름을 시작하고 샘플을 주입합니다. 2 CV를 흐른 다음 5 CV에 걸쳐 80% 아세토니트릴, 0.1% TFA로 일정한 구배를 시작합니다. Reflectin A1은 일반적으로 73% 아세토니트릴에서 용리됩니다.
    4. 에탄올과 드라이아이스 수조를 사용하여 5mL 튜브에 리플렉틴 단백질을 포함하는 껍질 동결 분획. 동결건조하고 -80°C에서 보관합니다. 단백질은 얇은 흰색 시트로 나타납니다.
  5. 표지되지 않은 단백질 스톡 준비
    1. 빙초산과 아세트산나트륨 삼수화물을 사용하여 pH 4, 25mM 아세트산 완충액 4L(21.05mM 아세트산, 3.95mM 아세트산나트륨 삼수화물)를 준비합니다. 필요한 경우 4 M HCl 또는 4 M NaOH로 pH를 조정합니다. 0.22μm 진공 필터를 사용하여 필터링합니다.
      주의 : 적절한 PPE를 착용하고 강산/염기를 다루십시오. 농축된 강산이나 강염기에 물을 첨가하지 마십시오.
    2. 동결건조된 리플렉틴 단백질이 들어 있는 튜브를 해동하고 튜브를 얼음 수조에 넣고 pH 4, 25mM 아세트산 완충액으로 재용해화합니다. 완전히 재용해된 단백질 용액은 눈에 보이는 탁도나 침전물 없이 무색으로 나타납니다.
      1. 10kDa 분자량 차단 투석 카세트를 사용하여 4°C에서 두 번의 12시간 변화를 사용하여 4°C로 사전 냉각된 pH 4, 25mM 아세트산 완충액의 1000x 샘플 부피에서 재용해화된 반사탄 단백질을 투석합니다.
    3. pH 4, 25mM 아세트산 완충액으로 샘플을 희석하여 최종 단백질 농도 100μM, 최종 부피 150μL 이상을 얻습니다. UV-VIS 분광계를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하고 반사판 A1(123,685M-1cm-1)의 몰 흡수 계수29를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
    4. 리플틴 단백질 스톡을 0.5mL 스냅캡 미세원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 최대 7일 동안 보관합니다. 실험 직전에, 18,000 x g 의 사전 냉각된 미세 원심분리기에서 4°C에서 리플렉틴 단백질 스톡을 15분 동안 원심분리합니다. 123,540 M-1 cm-1의 몰 흡수 계수를 사용하여 유사하게 리플렉틴 A1 C232S 스톡을 제조한다.
  6. 단백질 라벨링
    1. 10mg의 형광 프로브 및 피펫 혼합이 들어 있는 바이알에 1mL의 건조 디메틸-설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 FMTS(플루오레세인-메탄티오술포네이트) 및 SRMT(설포르로다민 메탄티오술포네이트) 10mg/mL 스톡을 별도로 준비합니다.
      주의: 메탄티오술폰산염 시약의 흡입, 눈 및 피부 접촉을 피하십시오.
    2. 7.7 μL의 10 mg/mL FMTS 스톡 또는 10.4 μL의 10 mg/mL SRMT 스톡을 pH 4, 25 mM 아세트산 완충액에 첨가하여 최종 부피 150 μL, 최종 농도 500 μM FMTS 또는 SRMT로 만듭니다. 용액이 탁하게 나타납니다. 나머지 형광 프로브 스톡을 분취하여 -80°C에서 동결합니다.
    3. 150μL의 100μM 리플틴 단백질 스톡과 혼합하고 완전히 피펫으로 혼합합니다. 최종 단백질 농도는 50 μM이고 최종 형광 프로브 농도는 500 μM입니다. 용액의 탁도가 감소합니다.
    4. 호일로 싸서 실온에서 4시간 동안 부드럽게 궤도를 저으면서 똑바로 배양한 다음 4°C에서 밤새 배양합니다. 용액의 탁도는 변하지 않아야 합니다.
    5. 침전물이 있는 경우 피펫을 세게 혼합하여 재현탁합니다. 용액은 탁해집니다. 10,000kDa MWCO 원심 필터를 사용하여 리플렉틴을 목표 부피 100μL, 농도 150μM로 농축합니다.
    6. 단백질 정제와 동일한 HPLC 및 동결건조 방법을 사용하여 결합되지 않은 형광 프로브를 제거하고 호일로 포장한 단백질을 -80°C에서 보관합니다. 표지되지 않은 단백질에 대해 동일한 방법을 사용하여 표지된 단백질을 재용해합니다. 라벨링 정도를 결정합니다.
      참고: 재용해된 형광 표지 리플렉틴 단백질은 탁도나 침전 없이 황록색(C199-F) 또는 짙은 적색(C199-R)으로 나타납니다.
  7. 공동 표지 단백질 스톡 준비
    1. 27 μL의 100 μM A1 단백질 스톡을 0.5 mL 스냅 캡 마이크로 원심분리기에 첨가합니다.
    2. 1.5μL의 플루오레세인 표지 리플렉틴 A1-C232S(플루오레세인의 아미노산 위치를 나타내기 위해 C199-F라고 함)를 동일한 튜브에 추가합니다.
    3. 1.5μL의 설포로다민 표지 리플렉틴 A1-C232S(플루오레세인의 아미노산 위치를 나타내기 위해 C199-R이라고 함)를 동일한 튜브에 추가합니다. 최종 농도는 90μM A1, 5μM C199-F 및 5μM C199-R입니다.
    4. 호일로 싸서 4°C에서 최대 7일 동안 보관합니다.

2. FRET 시계열

  1. 완충액 준비 및 여과
    1. 25mM 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS) 완충액 500mL를 준비합니다. 4M 수산화나트륨을 천천히 첨가하여 용액의 pH를 7로 조정합니다. 10mL 주사기와 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 10mL를 여과합니다.
  2. 단백질 원심분리
    1. 탁상용 미세원심분리기를 4°C로 미리 냉각합니다. 표지되지 않은 반판 및 공동 표지된 리플란틴 A1 스톡을 4°C에서 15분 동안 18,000 x g 으로 원심분리합니다.
  3. 레이블이 있는 A1 어셈블리 준비
    1. 3회 반복실험을 준비하려면 9.6μL의 MOPS 완충액(pH 7, 25mM)을 3개의 0.5mL 스냅캡 미세원심분리기 튜브에 피펫팅합니다.
    2. 이미 9.6μL의 MOPS 완충액이 들어 있는 각 튜브에 0.4μL의 표지된 단백질 스톡을 최종 단백질 농도 4μM까지 첨가합니다. 전체 샘플 부피를 흡인하고 분주하여 천천히 피펫으로 두 번 혼합합니다.
    3. 즉시 은박지로 싸서 25°C의 인큐베이터에 넣습니다. 이 솔루션과 다음 모든 어셈블리 솔루션은 배양 전후에 명백한 탁도 또는 강수량이 부족합니다.
  4. 레이블이 지정되지 않은 A1 어셈블리 준비
    1. 3회 반복실험을 준비하려면 38.4μL의 MOPS 완충액을 3개의 0.5mL 스냅캡 미세원심분리기 튜브에 피펫팅합니다.
    2. 이미 38.4μL의 MOPS 완충액이 들어 있는 각 튜브에 1.6μL의 리플렉틴 A1 단백질 스톡을 최종 단백질 농도 4μM까지 추가합니다. 전체 샘플 부피를 흡인하고 분주하여 천천히 피펫으로 두 번 혼합합니다.
    3. 즉시 은박지로 싸서 25°C의 인큐베이터에 넣습니다.
  5. 공동 라벨링된 A1 어셈블리와 라벨링되지 않은 A1 어셈블리의 타이밍 및 혼합
    1. 다음과 같이 어셈블리 준비를 주문하십시오: 실험용 공동 표지 반사형과 실험용 표지되지 않은 리플렉틴 어셈블리를 동시에 별도로 준비합니다. 2.3 및 2.4단계를 반복합니다.
    2. 표지되지 않은 A1 어셈블리 실험용 40μL를 각각의 공동 표지 실험용 10μL에 첨가하여 혼합하고, 전체 부피를 흡인 및 분주하여 부드럽게 피펫 혼합물을 혼합합니다. 측정은 이 단계 후 24시간 후에 수행됩니다.
    3. MOPS 완충액(pH 7, 25mM)으로 희석하여 리플렉틴 A1의 조립을 구동하고 표지된 어셈블리와 표지되지 않은 어셈블리를 혼합하는 사이의 시간이 조립 연령입니다. 이 데이터에 사용된 어셈블리의 연령은 0분, 1분, 10분, 30분, 60분, 120분, 180분, 540분, 1080분 및 1620분이었습니다.
  6. 컨트롤
    1. 양성 대조군
      1. A1 및 표지된 단백질 스톡에서 80 μM A1 및 20 μM 공동 표지 단백질 스톡인 20 μL의 단백질 스톡을 준비합니다.
      2. 0.5mL 스냅캡 미세원심분리기 튜브에 38.4μL의 MOPS 완충액을 첨가한 다음 1.6μL의 80μM A1/20μM 표지 단백질을 추가하고 전체 부피를 천천히 흡인하고 분주하여 피펫 혼합을 두 번 혼합합니다. 즉시 호일로 덮고 25°C의 인큐베이터에 넣습니다. 총 9개의 샘플에 대해 반복합니다.
    2. 음성 대조군
      1. 이미 9.6μL의 MOPS 완충액이 들어 있는 0.5mL 스냅캡 미세원심분리기 튜브에 0.4μL의 표지된 스톡을 추가합니다. 전체 샘플 부피를 흡인하고 분주하여 천천히 피펫 혼합을 두 번 합니다.
      2. 40μL의 MOPS 완충액을 추가하고 전체 샘플 부피를 흡인 및 분주하여 피펫 혼합을 두 번 혼합합니다. 즉시 호일로 덮고 25°C의 인큐베이터에 넣습니다. 총 9개의 샘플에 대해 반복합니다.
  7. 큐벳 및 버퍼 블랭크
    1. 형광계를 488nm에서 여기하도록 설정하고 520-700nm의 연속 스펙트럼을 기록합니다.
    2. 깨끗한 석영 서브 마이크로 형광계 큐벳에 50μL의 MOPS 완충액(pH 7, 25mM)을 채우고 측정합니다.
    3. 버퍼를 제거합니다.
  8. 실험 절차
    참고: 모든 실험은 공동 표지 및 표지 없는 반사 A1 어셈블리를 혼합한 후 24시간 후에 기록되어야 합니다. 실험 용액 50μL를 큐벳에 부드럽게 피펫팅하고 측정합니다.
    1. 샘플을 제거하고 500 μL 아세트산 완충액으로 헹구고 500 μL 0.22 μm-여과된 18 mΩ 물로 헹구십시오. 버퍼 공백을 수행합니다.
  9. 컨트롤
    1. 대조군을 준비한 후 1440분, 1960분, 3060분에 측정합니다(0분, 520분, 1620분의 조립 기간에 해당). 이러한 측정은 프로토콜의 실험 부분을 마무리합니다.

3. 데이터 분석

  1. 실험 스펙트럼에서 버퍼 블랭크의 스펙트럼을 뺍니다.
  2. Em588/Em520의 비율을 결정합니다.
  3. 각 반복실험에 대해 세 개의 반복실험으로 구성된 각 그룹의 평균 및 표준 편차를 결정합니다. Em588/Em520 을 조립 연령의 함수로 표시합니다.

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결과

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기증자 형광단 표지 단백질과 수용체 형광단 표지 단백질을 모두 포함하는 리플렉틴 A1 어셈블리를 표지되지 않은 리플렉틴 A1 어셈블리로 희석한 후, 희석되지 않은 어셈블리에 비해 588nm에서 FRET 방출의 초기 감소가 관찰되었습니다(그림 2A). 0분 연령의 어셈블리에 대한 FRET는 양성 대조군과 유사했으며 1620분 연령의 어셈블리(어셈블리 형성과 표지되지 않은 반사체 어셈블리와 표지된 반사체 어셈블리의 혼합 사이의 시간)에 대한 FRET는 음성 대조군보다 작았습니다(그림 2A). Em588/Em520 을 어셈블리 연령의 함수로 플로팅하면 전체 어셈블리 모집단이 처음에는 완전히 동적이었고 동적 교환의 정도는 어셈블리의 나이가 증가함에 따라 점진적으로 감소했음을 보여줍니다(그림 2B). 인구의 19%만이 24시간 된 어셈블리에...

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토론

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정제 중 단백질 손실의 공통 지점은 봉입체 정제 프로토콜의 모든 단계에 대한 봉입체 펠릿의 불완전한 재현탁과 8 M 요소 5% v/v 아세트산에서 정제된 봉입체의 최종 재현탁입니다. 봉입체 재용해화는 40mL 원추형 튜브에서 작은 자기 교반 막대를 사용하여 최대 24시간의 격렬한 교반이 필요할 수 있습니다. 필터에 대한 상당한 단백질 손실을 방지하기 위해 FPLC 및 HPLC 이전의 여과를 70분 동안 15,000 x g 에서 원심분리로 대체하여 용액을 정화하고 액체 크로마토그래피 시스템을 막을 수 있는 큰 입자를 제거했습니다. 봉재체의 상대적 순도는 정제 공정에서 FPLC를 생략할 수 있으며, HPLC 단독으로 리플렉틴 A130을 정제하기에 충분할 수 있습니다. 그러나 역상 HPLC 컬럼을 더 자주 심층적으로 세척해야 합니다. 완전성을 위해 이 프로토콜에 FPLC를 포함시켰습니다.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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연구는 미 육군 연구실의 보조금 W911NF-19-2-0026 및 W911NF-23-1-0330을 통해 협력 생명 공학 연구소의 지원을 받았습니다. 정보의 내용이 반드시 정부의 입장이나 정책을 반영하는 것은 아니며 공식적인 지지를 추론해서는 안 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 & 뮤; L 용량 마이크로피펫
2 & 뮤; L 용량 마이크로피펫
2-[(5-플루오레세이닐)아미노카르보닐]에틸 메탄네티오술폰산염산타크루즈 바이오테크놀로지SC-216155CAS  351330-42-2
20 & 뮤; L 용량 마이크로피펫
200 & 무; L 용량 마이크로피펫
3-(N-모르폴리노)프로판술폰산, 4-모르폴린프로판술폰산시그마-알드리치M1254CAS 1132-61-2
아세트산시그마-알드리치A6283CAS 64-19-7
아세토니트릴시그마-알드리치34851-1엘라CAS 75-05-8
한천 분말캐롤라이나 생물학842133CAS 9002-18-0
알루미늄 호일
Amicon 울트라 원심 필터, 10 kDa MWCO밀리포어 시그마UFC5010080.5 ml 용량
Amicon 울트라 원심 필터, 10 kDa MWCO밀리포어 시그마UFC90100815ml 용량
분석 저울
벤조나제밀리포어-시그마70664-3CAS 9025-65-4
BugBuster 단백질 추출 시약밀리포어 시그마70584-3
Cary Eclipse 형광 분광계캐리 이클립스
Cary Eclipse 소프트웨어
Corning 50 ml 원심분리기 튜브밀리포어-시그마CLS430829
일회용 주사기, Luer-Lok 10 mL콜-파머UX-12915-02
DMSO시그마-알드리치D8418CAS 67-68-5
드라이아이스
듀얼 펌프 FPLC 시스템
듀얼 펌프 HPLC 시스템
에탄올밀리포어 시그마EX0280-3CAS 64-17-5
플로어 스탠딩 원심분리기 로터 500ml 바이알 용량
플로어 스탠딩 원심 분리기 
냉동고, -80도; C
흄 후드
구아니딘 염산염써모 사이언티픽AAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼사이티바17115101
염산시그마-알드리치258148-25MLCAS 7647-01-0
부 화기
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노사이드시그마-알드리치I6758-1G
카나마이신 설페이트시그마-알드리치K1637CAS 25389-94-0
동결건조기
리소자임써모 사이언티픽90082
마그네틱 교반 바
마그네틱 교반 플레이트
마이크로 pH 전극 S7메틀러 톨레도51343160
온도 제어 기능이 있는 미세 원심분리기
Millex PVDF 주사기 필터밀리포어SLGVR33RS0.22 &무; m, 직경 33mm.
Milli-Q Millipak 필터밀리포어 시그마MPGP002A1
Milli-Q UltraPure 정수 시스템밀리포어 시그마
나크롬써모 사이언티픽AA12314A9CAS 7647-14-5
Nalgene 원심분리기 병, 스타일 3120밀리포어-시그마B1283-4개박테리아 펠릿용
궤도 연구실  인큐베이터가 있는 셰이커
개인용 컴퓨터
페트리 접시시그마-알드리치P5731-500EA
PJ411 플라스미드DNA 2.0
단백질 LoBind  원추형 튜브에펜도르프EP301083025ml 용량
단백질 LoBind  마이크로 원심분리기 튜브에펜도르프EP0224311020.5 ml 용량
파이렉스 배플 삼각 플라스크 1,000ml밀리포어-시그마CLS44501박테리아 배양 배양용
파이렉스 그리핀 비커 2,000mL밀리포어-시그마CLS10002L모든 완충액 및 용액 준비 용;
파이렉스 원형 미디어 보관 병 1,000ml밀리포어-시그마CLS13951L모든 완충액 및 용액 전제의 보관에는 진공 플라스크 필터와 함께 사용하십시오.
Qiaprep 스핀 미니프렙 키트키아겐27104
냉장고
Rosetta 2(DE3) 유능 셀노바겐71397-3
슬라이드 라이저 투석 카세트 10K MWCO써모 사이언티픽PI663830.5 ml 용량
아세테이트 나트륨 삼수화물시그마-알드리치S8625CAS 6131-90-4 (영어)
수산화나트륨시그마-알드리치567530-250GMCAS 1310-73-2
Steritop 진공 병 상단 필터밀리포어 시그마S2GPT05RE0.22 &무; M 멸균 필터
서브 마이크로큐벳, 50 uL 용량스타나 셀16.40F-Q-10/Z15
설포르호다민 메탄 시오 술 포네이트산타크루즈 바이오테크놀로지SC-220172CAS  386229-71-6
트리플루오로아세트산시그마-알드리치106232-25GCAS 407-25-0
트립톤스펙트럼 케미컬 티1333
요소써모 사이언티픽AAA123600ECAS 57-13-6
UV-VIS 분광계
효모 추출물깁코211929

참고문헌

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