특정 장과 관련된 림프 통신의 선택적 교란을 위한 쥐 장간막 림프절출술

요약

이 프로토콜은 장간막 림프절 사슬의 네 개 스테이션 각각에서 안전하고 잘 내약하는 쥐 장간막림프절 절제술의 생존 절차를 설명합니다. 이 절차는 원위 대장, 근위 대장 및/또는 소장과의 림프 통신을 선택적으로 방해할 수 있도록 조정 가능합니다.

초록

면역감시와 항원 내성의 균형은 장 미세환경 내에서 미묘한 균형이며, 이 과정에서 국소 림프절 내에서 순환 T 세포 프라이밍의 중요한 역할이 잘 알려져 있습니다. T 세포 프라이밍 이후, 최근 문헌들은 비순환 T 세포가 장기의 배액 림프절에 존재하는 독특하고 중복되지 않은 역할을 입증하기 시작했습니다. 특히 림프 배출이 매우 특이적으로 알려진 장에서 더욱 그러할 수 있습니다. 그러나 이러한 국소 세포가 전신 기능 중복과 어떤 독특한 영향을 미치는지 진정으로 이해하려면, 과학계는 이러한 결절을 분리하고 선택적으로 교란시키는 잘 설명된 절차가 필요합니다. 여기서는 장간막림프절 사슬의 네 개 부위에서 안전하고 잘 내약되는 쥐 장간막림프절 절제술을 위한 생존 절차에 대해 설명합니다. 이 절차는 원위 대장, 근위 대장 및/또는 소장과의 림프 통신을 선택적으로 방해할 수 있도록 조정 가능합니다. 상세한 지침, 시각적 도구, 성공률을 높이기 위한 유용한 팁, 그리고 최적이 아닌 생존을 위한 문제 해결 방법이 포함되어 있습니다. 절제된 림프절은 원할 경우 즉시 추가 처리 준비가 되어 있습니다. 이 기법은 원위 대장, 근위 대장 및/또는 소장에서 림프 배출을 선택적으로 차단하는 연구에 가장 적합합니다.

서론

T 세포는 적응 면역에서 주요 효과 세포 유형 중 하나로, 감염, 자가면역, 악성 종양^등 다양한 질병 범주에서 역할을 ^{설명합니다.} T 세포 기능에 중요한 단계는 국소 림프절과 같은 2차 림프관 내 항원 제시 세포에 의한 3상 프라이밍^입니다. 현대 의학에서 여러 장기 시스템에 걸친 적절한 종양 절제의 주요 방법은 국소 샘플링 또는 전체 림프절 절제술(5,6,7,8)입니다. 예를 들어, 대장암에서는 장기 생존율 향상과 명확한 상관관계가 있으므로 12개의 림프절을 제거하고 치료 의도 절제술을 검사할 것을 합의된 지침에 따라 권장합니다 ^6,7. 하지만 국소 림프절을 정말로 아무런 처벌 없이 절제할 수 있을까요? 최근 쥐 연구에서는 종양 배출 림프절에 항종양 T 세포 전구체가 존재하며, 이는 종양^미세환경 내에서 발생하는 말단 분화와 T 세포 소진으로부터 보호될 수 있음이 밝혀^{졌습니다.} 이는 이처럼 중요한 인구를 제거하는 것이 현재 진행 중인 면역 감시 능력을 약화시킬 수 있음을 시사한다.

쥐의 장 림프 배출 패턴은 장간막 림프절 사슬을 따라 상당히 특수화된 것으로 알려져 있습니다; 예를 들어, 근위 결장은 거의 전적으로 첫 번째 림프절 스테이션에 의해 배출되고, 소장은 두 번째/세 번째 지점에서, 원위 결장은 주로 네 번째 림프절 스테이션¹²에 의해 배액됩니다(그림 1, 보조 그림 1). 따라서 장 구간과 림프관 간의 직접적인 소통은 이 결절의 표적 절제술로 방해될 수 있습니다. 림프절과 조직 간 이동을 차단하기 위해 FTY720과 같은 S1P 수용체 작용제와 인테그린 차단제가 흔히 사용됩니다; 그러나 이 약물들은 전반적으로 밀매를 억제하므로 특정 림프절의 기여도를 조사하는 데 사용할 수 없다^13,14. 그러나 각 스테이션에 대해 잘 설명된 외과적 절제가 없다는 점에서 더 넓은 과학계가 장 림프절 내 면역 상호작용의 국소적 영향을 연구하는 능력은 제한적입니다. 이러한 공백을 염두에 두고, 각 림프절 지점에서 생계 수술을 위한 생존 절차가 개발되었으며, 여기에서 설명합니다. 이 절차의 전반적인 목표는 수술 후 생존율과 내성이 높은 마우스에서 장간막 림프절 부위를 안전하고 신뢰할 수 있게 절제하는 것입니다.

이 절차는 여러 변주(예: Balb/c, C57BL/6J, 129S4)의 어린 및 성체 쥐에서 시험되어 쉽게 시행될 수 있으나, 접근하기 쉽고 쉽게 식별 가능한 림프절의 필요성에 제한이 있습니다. 따라서 림프절이 일반보다 작거나 감지되지 않는 마우스 모델이나 유전자형(예: 림포토신-알파 결핍 마우스)과 결합하는 것은 적합하지 않을 수 있습니다¹⁵. 또한 나이가 많은 쥐(>15주)는 내장 비지방이 더 많아 림프절 식별과 격리가 더 어려워지며, 이는 금기사항은 아니지만 성공률이나 절차에 제한이 될 수 있습니다. 이러한 한계 외에도 장간막림프절제술은 림프절을 매우 통제되고 선택적으로 교란하는 수술을 제공합니다. 이 절차는 림프절과 그에 연관된 주재 면역세포, 그리고 장의 일부 구간(예: 근위 대장, 원위 대장, 소장)에 미치는 국소적 영향에 관한 질문을 풀어내는 데 가장 적합합니다.

그림 1: 장간막 림프절 사슬의 해부학적 이정표 .(A) 표지 미표지, (B) 네 개의 주요 장간막 림프절 관측소가 제자리에 표시된 표지. 근위 대장 배출은 주로 스테이션 1을 통해 이루어지며, 소장은 주로 스테이션 2/3, 원위 대장은 주로 스테이션 4를 통해 이루어집니다. (DC= 원위 결장, ICV= 회장혈관, PC= 근위 결장, CEC= 맹장, IV/JV= 회장혈관/공주혈관, SI=소장). 스케일 바: 1.5 cm. 이 도형의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

모든 절차는 예일 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 프로토콜을 준수하여 수행됩니다. 이 절차를 개발하기 위해 8-12주 된 C57BL/6 균주, 야생형 쥐, 그리고 연령/성별/유전자형 일치 가짜 대조군이 사용되었습니다. 수컷과 암컷 쥐 모두 포함되었습니다. 체중은 18-25g 사이였다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 기구, 동물, 수술실 준비

1. 모든 수술 기구를 멸균하세요. 수술 표면과 마취 코 콘은 70% 에탄올로 깨끗이 세척되도록 하세요.
2. 흡입 마취 증기 기계에 코콘과 흡입을 설치해 과도한 마취제를 흡수하세요. 동물의 체온과 물품을 유지하기 위해 온수 순환 패드가 있는 작업 표면을 편리하고 무균 상태로 마련하세요.
   참고: 이 절차는 수술용 현미경이 필요하지 않습니다; 하지만 시각화를 개선하기 위해 이 도구를 포함하는 것을 고려해 보세요.
3. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 흡입된 마취 증기 기기에서 코 콘을 통해 2L/분의 산소 유량으로 2%-3% 흡입된 이소플루란을 투여하여 마취를 유도합니다.
   1. 호흡 수가 약 30-40회 분당 정상이고 뒷발 압박에 반응이 없음을 확인하여 적절한 마취 면을 확보하세요. 적절한 마취 면을 주기적으로 재확인하고 이소플루란 유량을 조절하세요.
      참고: 또는 주사형 마취제도 적합합니다.
4. 적절한 진통과 국소 마취에 관한 기관 지침을 따르세요. 예를 들어, 3.25 mg/kg 부프레노르핀 XR과 같은 장기 진통제를 피하 투여하고, 계획된 절개 부에 체중 1mg/mL 리도카인 용액을 최대 0.04 mL/5g 양의 피하 투여합니다.
5. 동물을 등을 대고 눕히고, 눈 윤활제를 바르며, 복부 털을 뽑거나 잘라내고, 복부를 포비돈/요오드 용액으로 소독한 후 70% 에탄올을 투여하여 시술 준비를 합니다(그림 2A).
6. 멸균 장갑을 착용하고 수술 부위로 통하는 창문을 두고 멸균 드레이프를 동물에게 덮으세요. 시술 내내 멸균을 유지하세요.

그림2: 장간막림프절제술의 주요 절차 단계를 대표하는 이미지입니다. (A) 배 창문을 뽑아 소독. (B) 피부와 백선을 관통한 0.5cm 절개. (C) 장간막 림프절 사슬을 노출시켜 회장을 오른쪽, 근위 결장을 왼쪽, 맹장을 하로 정렬하는 것. 첫 번째 장간막 림프절은 회장동맥(흰색 화살표)을 따라 위치해 있습니다. (D) 절제된 장간막 림프절(희미한 화살표). 눈금 막대: 0.5 cm. (E) 체외 장간막 림프절 (흰색 화살표; 2.5 mm x 3 mm). 틱 = 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 장간막림프절제술 준비

1. 피부를 가로지르는 0.5-1cm 중앙선 절개를 하세요. 복벽에서 피부를 무딘 채로 제거하면 백선(linea alba)을 식별합니다. 복강에 접근하기 위해 백선을 0.5-1cm 절개합니다(그림 4B).
   참고: 2/3/4 스테이션의 림절 접근성을 개선하기 위해 절개 두부를 연장하는 것을 고려하되, 연골성 상골 돌기(gratilaginous xiphoid process)를 넘지 않도록 해야 합니다.
2. 무딘 끝 가베지 바늘 로 복막강에 체온 멸균 식염수 1mL를 주입하고, 장 위치 측정을 위해 멸균 드레이프를 적셔 준비합니다. 멸균되고 촉촉한 면봉을 사용해 절개 부위를 통해 맹장을 식별하고 내장을 제거하세요.
   1. 날카로운 도구를 사용해 장을 다루는 것은 부상을 초래할 수 있으므로 피해야 합니다. 건조 손상을 방지하기 위해 주기적으로 커튼과 장 부위를 다시 촉촉하게 하세요.
      참고: 쥐 맹장은 일반적으로 복부 왼쪽 하부 사분면에 분포하지만, 어느 사분면에도 서식할 수 있습니다.
3. 절제를 위한 목표 장간막 림프절 부위를 명확히 하고 아래의 구체적인 지침(예: 3.1-3.4)을 따르세요. 해부학적 기준점과 식별은 그림 1A, B 를 참조하십시오.

3. 장간막 림프절 부위의 박리 및 절제

1. 첫 번째 림프절 역(근위 대장 배액; 보조 그림 1A, B').
   1. 외부에 노출된 장을 습윤된 커튼 위에 위치시키고, 맹장은 아래쪽에, 근위 결장은 위쪽에, 말단 회장은 외과의사의 오른쪽(동물의 왼쪽 쪽) 쪽으로 향합니다. 그림 1A, 그림 2C).
   2. 장간막 림프절 사슬을 확인하는데, 이 사슬은 대장을 따라 종방향으로 흐르는 것입니다. 각진 미세 팁 겸자를 사용해 회장혈관에서 떨어진 첫 번째 림프절 부위를 둔하게 박리하며, 닫힌 겸자를 이 구조물 사이 공간에 놓고 겸자가 부드럽게 벌리도록 합니다.
      1. 겸자를 제거하고 이 동작을 2-3번 또는 안전한 절제에 충분한 평면이 만들어질 때까지 반복하세요. 주요 대장 혈관 손상을 피하세요(그림 3A,B).
         참고: 심한 출혈이 발생하면 절차를 중단하고 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 동물을 인도적으로 안락사시키십시오.
   3. 선택: 인근 림프절에 담수혈이 생길 위험을 이론적으로 줄이기 위해, 9-0 검은색 단필라멘트 나일론 봉합사와 미세 꼬집자를 사용해 바늘을 주입하는 선택적 봉합술(원위 1mm 거리 1mm, 첫 림프절 지점 1mm 근위)을 이용한 선택적 봉합술을 시행합니다(그림 3C,D).
   4. 결찰된 림프관 후손을 부드럽게 당기고, 가위를 사용해 목표 림프절 부위를 두에서 후두에서 후두로 절단합니다(그림 3E).
      참고: 쥐는 종종 회장동맥에서 림프절 후방으로 가는 작지만 눈에 보이는 영양관을 가지고 있습니다. 이 혈관에서 발생하는 출혈은 면봉이 담긴 면봉으로 부드럽게 압박하여 지혈이 이루어질 때까지 조절할 수 있습니다.

그림3: 장간막림프절절제술(첫 시점)의 주석 스틸 및 해설. (A) 장의 올바른 방향은 첫 번째 장간막 림프절 지점(흰색 화살표)을 노출시킵니다. (B) 회장동맥(bluearrow)과 결절 사이에 평면이 형성됩니다. (C) 림프절 꼭대기로 들어오는 영양관의 봉합 결찰술(파란색 화살표)은 회장혈관을 제거한 채 이 구조들 사이의 공간을 벗어나게 하여 시행됩니다(흰색 화살표). (D) 림프절 기저부의 봉합 결사를 시행하며, 회장동맥의 원위 가지를 관찰하고 피합니다. (E) 림프절이 이전에 생성된 조직면을 따라 절제되어 림프절 쪽으로 높은 위치에 유지하며 봉합선 결찰(검은 화살표)을 남깁니다. (F) 지혈이 확인되고, 회장동맥의 원위 분지가 관찰되어 혈류가 제대로 유지되며, 결절이 이전에 있던 빈 공간(희미한 화살표)에는 잔여 결절이 없다는 점이 확인된다. 스케일 바: 0.5 cm. 이 도형의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 두 번째 림프절 스테이션(중원위 소장 배액)
   1. 소장도 부드럽게 내장을 꺼내세요. 외부에 노출된 장을 습윤된 커튼 위에 위치시키고, 맹장은 아래쪽에, 근위 결장은 위쪽에, 소장은 외과의사의 오른쪽(동물의 왼쪽)을 향하게 합니다. 그림 1A).
   2. 장간막 림프절 사슬을 확인하는데, 이 사슬은 대장을 따라 종방향으로 흐르는 것입니다. 두 번째 역은 회장/주유관이 합류하는 지점에서 시작됩니다(그림 1B).
      1. 각진 미세 팁 겸자를 사용해 두 번째 림프절 스테이션을 대장 혈관에서 떨어진 곳에 닫힌 겸자를 두고, 겸자가 부드럽게 열리도록 하여 두드럽게 해리합니다.
      2. 겸자를 제거하고 이 동작을 2-3번 또는 안전한 절제에 충분한 평면이 만들어질 때까지 반복하세요. 주요 대장 혈관 손상을 피하세요. 또한 회장혈관과 공주혈관에 특히 주의하세요. 부상 시 해롭습니다.
         참고: 심한 출혈이 있을 경우 절차를 중단하고 인도적으로 안락사하십시오.
   3. 선택: 인근 림프절에 대한 측수성 위험을 이론적으로 줄이기 위해, 9-0 검은색 모노필라멘트 나일론 봉합사와 미세 팁 겸자를 사용해 림프절 사슬을 따라 단일 단절 봉합(1mm 원위, 1mm 근위)을 사용하여 선택적 봉합 결찰술을 시행합니다(보충 그림 2A).
   4. 결찰된 림프관을 부드럽게 당기고, 가위를 사용해 목표 림프절 역을 두에서 고리에서 절제합니다(보충 그림 2B).
      참고: 쥐는 종종 회장동맥에서 림프절 후방으로 가는 작지만 눈에 보이는 영양관을 가지고 있습니다. 이 혈관에서 발생하는 출혈은 면봉이 담긴 면봉으로 부드럽게 압박하여 지혈이 이루어질 때까지 조절할 수 있습니다.
3. 두 번째와 세 번째 림프절 지점(중간-원위 소장 배액; 보조 그림 1C, D'
   1. 소장 전체를 부드럽게 내장하여 후방 연결(트라이츠 인대)까지 제거합니다. 외부에 노출된 장을 습윤된 커튼 위에 위치시키고, 맹장은 아래쪽에, 근위 결장은 위쪽에, 소장은 외과의사의 오른쪽(동물의 왼쪽)을 향하게 합니다. 그림 1A).
   2. 장간막 림프절 사슬을 확인하는데, 이 사슬은 대장을 따라 종방향으로 흐르는 것입니다. 두 번째 역은 회장/주유관이 합류하는 지점에서 시작됩니다(그림 1B).
      1. 각진 미세 팁 겸자를 사용해 두 번째와 세 번째 림프절 부위를 대장혈관에서 멀리 떨어뜨리며, 이 구조물 사이 공간에 닫힌 겸자를 놓고 겸자가 부드럽게 벌어지도록 합니다.
      2. 겸자를 제거하고 이 동작을 2-3번 또는 안전한 절제에 충분한 평면이 만들어질 때까지 반복하세요. 주요 대장 혈관 손상을 피하세요. 또한 회장혈관과 공주혈관에 특히 주의하세요. 부상 시 해롭습니다.
         참고: 심한 출혈이 있을 경우 절차를 중단하고 인도적으로 안락사하십시오.
   3. 선택: 인근 림프절에 측수혈이 생길 위험을 이론적으로 줄이기 위해, 9-0 검은색 단필라멘트 나일론 봉합사와 미세 겸자를 사용해 림프절 사슬을 따라 단일 중단 봉합(보통 1mm 원위, 측면 1mm 2개, 2/3번째 림프절 지점 근위쪽 1mm 1개)을 이용한 선택적 봉합 결찰술을 시행합니다(보충 그림 3B, C).
      1. 회장/공주동맥 혈관 다발 바로 옆에 위치한 구심성 림프로를 주목하세요(보충 그림 3B). 봉합 결찰은 림프관 깊숙이 이어지고 주요 혈관 구조에서 표면까지 이어지도록 주의해야 하며, 회장/공주동맥 혈관 다발에 손상을 줄 수 있습니다.
   4. 결찰된 림프관을 부드럽게 젖히고, 미세 또는 초가운 가위를 사용해 목표 림프절 부위를 고리에서 두까지 절제합니다.
      참고: 진행 전에 소장이 분홍색으로 유지되고 충분히 충혈되어 있는지 확인하세요. 회장/공주동맥의 우연한 결찰은 허혈성 소장을 초래합니다.
4. 네 번째 림프절 지점(원위 대장 배액; 보조 그림 1E,F')
   1. 소장 전체를 부드럽게 내장하여 후방 연결(트라이츠 인대)까지 제거합니다. 외부에 노출된 장을 습윤된 커튼 위에 위치시키고, 맹장은 아래쪽에, 근위 결장은 위쪽에, 소장은 외과의사의 오른쪽(동물의 왼쪽)을 향하게 합니다. 그림 1A).
   2. 장간막 림프절 사슬을 확인하는데, 이 사슬은 대장을 따라 종방향으로 흐르는 것입니다. 네 번째 역은 원위 결장 바로 내측, 세 번째 역의 외측에 위치한다(그림 1B, 그림 4A).
      1. 각진 미세 팁 겸자나 초가운 끝 가위를 사용해, 네 번째 림프절 부위를 대장혈관과 주변 지방 조직에서 멀리 떨어진 곳에 닫힌 겸자/가위를 놓고 부드럽게 벌리도록 하여 무딘 상태로 절단합니다.
      2. 겸자/가위를 제거하고 이 동작을 2-3번 반복하거나 안전한 절제에 필요한 충분한 평면이 만들어질 때까지 반복하세요. 주요 대장 혈관 손상을 피하세요.
         참고: 심한 출혈이 있을 경우 절차를 중단하고 인도적으로 안락사하십시오.
   3. 선택: 주변 림프절에 측수혈이 생길 위험을 이론적으로 줄이기 위해, 각 림프절(보통 림프절에서 1mm 떨어진 곳)에 단일 단절 봉합을 하여 9-0 검은색 단섬유 나일론과 미세 팁 겸자를 사용하여 바늘을 주입하는 선택적 봉합술을 시행합니다(그림 4B - D).
   4. 결찰된 림프관을 부드럽게 당기고, 초가운 가위를 사용해 목표 림프절 지점을 고리에서 두부에서 절제합니다(그림 4D, E).

그림 4: 장간막림프절절제술(네 번째 지점)에 따른 주석 스틸 및 해설. (A) 올바른 장 방향은 네 번째 장간막 림프절 지점(흰색 화살표)을 원위 대장 내측과 세 번째 지점 외측에 노출시킵니다. (B, C) 림프절 스테이션의 둔탁한 박리 후에는 각 림프절 영양관(파란색 화살표)을 포함한 봉합 결찰(검은 화살표)을 시행합니다. (D) 림프절은 이전에 형성된 조직면을 따라 절제되며, 림프절 쪽으로 높은 위치에 유지하며 봉합 결찰(검은 화살표)을 남깁니다. (E) 결절 부위(흰색 화살표) 절제 후 지혈이 확인되고, 봉합 결찰이 보이고(검은 화살표), 결절이 이전에 있던 빈 공간(희미한 화살표)이 잔여 결절이 없는 것으로 확인됨. 스케일 바: 0.2 cm. 이 도형의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 장간막림프절제술 완료

1. 회장대장혈관, 회장혈관, 빈혈관의 원위 가지를 관찰하여 혈액 공급이 온전한지 확인하세요. 잘 관류된 장은 밝고 분홍빛이며 뚜렷한 맥박이 있습니다.
   1. 면봉을 사용한 면봉을 사용해 복부 내용물을 복강 안으로 다시 투여합니다. 복귀 전에 장 내 면, 보풀, 드레이프, 봉합사를 반드시 제거해야 하며, 이는 추가 수술 염증을 유발할 수 있습니다.
   2. 장이 장막에 꼬이지 않도록 장이 밝거나 분홍색(관류된 상태)으로 유지되는지, 흐릿하거나 회색, 보라색(허혈성 등)이 아닌지 확인하세요.
2. 폐쇄 직전에 복부에 체온 멸균 식염수 1mL를 주입하여 무감각한 체액 손실/증발을 보충시킵니다. 복부를 두 겹(복벽과 피부)으로 6-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사로 달리듯 봉합하세요.
3. 상처에 멸균 수술용 접착제를 바르세요.
   참고: 또는 피부 봉합을 위해 중단된 봉합사나 상처 클립을 사용할 수 있습니다.

5. 수술 후 관리

1. 동물을 깨끗한 우리로 옮기세요. 이 케이지는 반은 온수 순환 패드에 달려 있고 반은 꺼져 있고, 음식과 물을 자유롭게 사용할 수 있습니다.
2. 동물이 마취에서 회복할 시간을 주고, 고통의 징후를 면밀히 관찰하세요. 동물이 적절한 행동(예: 호흡 증가, 자립, 보행, 미용)으로 마취에서 신속히 회복하지 못하면 인도적으로 안락사시킨다.
3. 모든 동물이 마취에서 회복되면, 우리를 동물 관리 시설로 돌려보내고, 물, 음식, 침구, 풍 화 재료가 제공되도록 하세요.
4. 수술 후 3일간 12시간마다 쥐의 통증이나 고통 징후(예: 구부정한 자세, 활동 감소, 참여 감소, 미용 부실 등)를 평가합니다. 고통의 징후가 보이는 쥐는 인도적으로 안락사하세요.
5. 영구 봉합사(예: 6-0 모노필라멘트 폴리프로필렌)를 사용할 경우, 수술 후 10일째에 절개 부위를 검사하여 남은 봉합 재료를 제거하세요.

6. 림프절 처리

1. 즉시 절제 조직을 500 μL 인산염 완충 생리식염수(PBS)가 포함된 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 넣어 부력 검사를 수행하세요. PBS에서 조직이 침몰하는 것을 관찰하여 림프절 절제를 확인하라, 부유하는 지방은 부유합니다(그림 5A).
   참고: 절제된 림프절 스테이션은 즉시 추가 처리 절차에 들어갈 준비가 되어 있습니다.
2. 생세포 기법의 경우, 절제된 림프절 스테이션을 세포 배양 배지(예: DMEM, RPMI) 또는 PBS를 얼음 위에 올려놓습니다. 계획된 조직학 검사의 경우, 절제된 림프절 스테이션을 고정제(예: 중성 완축 포르말린 10%, 파라포름알데히드 4%)에 투여합니다.

결과

이 절차의 정확성을 확인하기 위해, 4-6주 생후 나이, 성별, 유전자형이 일치하는 C57BL/6J 계통 11마리에 장간막림프절제술을 시행하였습니다. 시술 시간은 쥐당 5분에서 15분 사이였습니다. 모든 쥐는 수술을 잘 견디며 수술 전후 생존율이 100%였습니다. 절제된 샘플은 PBS에 얼음 위에 보관되었습니다. 모든 샘플은 즉시 침몰하여 낮은 지방 함량이 확인되었습니다. 절제된 샘플(및 네 개의 별도 내장 지방 대조군)은 100 μm 세포 체에 의해 분쇄된 후 PBS로 세척되었습니다. 세포 현탁액은 450 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리한 후, 100 μL PBS에 얼음 위에서 60분간 다음 항체/농도와 함께 염색했습니다: FITC 접합 항생쥐 CD45.2 (104), 마우스 단클론 항체(1:100; 5 μg/mL), DAPI(1:100; 15 μg/mL)를 사용하여 생존 여부를 확인했습니다. 세포는 PBS로 세척하고, 450 x g

토론

여기서는 네 개의 림프절 각 지점에서 안전하고 잘 내약하는 쥐 장간막림프절제술의 생존 절차에 대해 설명합니다. 이 절차의 주요 한계는 노출과 장간막 사슬을 따라 림프절의 진행 사이에 간접적인 관계가 있다는 점입니다. 첫 번째 림프절 관측소는 전체적으로 쉽게 노출됩니다. 두 번째 림프절 역은 자주 보이며, 두^번째 에서 네^{번째 림프} 절 지점 노출은 피부/복벽 절개 두부를 확장하면 개선될 수 있습니다. 그러나 원위 대장의 후방 부착 부위로 인해 이 절개를 통해 깊은 구조물 손상 위험 없이 접근할 수 있는 접근(즉, 가장 원위쪽 대장, 직장)은 제한적입니다.

또 다른 중요한 제한은 가성 구심성 및/또는 측부 림프관 형성입니다. 슬와림프관에서 측부 림프관이 수술 후 2-7일 이내에 발달을 시작하고 2-3주 이내에 기능적 수축을 얻는 것으로 입증되었습니다^16,...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마취 회로	어떤 것이든		아니면 주사형 마취제도
BD LSRII 유세포계(또는 동등한 기기)	BD 생명과학		FACS Diva 소프트웨어(유세포측정용) 및 nbsp;
부프레노르핀 XR	어떤 것이든		진통을 위해
세포 배양 배지	어떤 것이든		(생세포 기술의 경우; 즉, DMEM 또는 RPMI)
다피	바이오레전드	422801	작동 농도: 15 ug/mL
에탄올 (물 속 70%)	어떤 것이든		청소를 위해
FITC 결합 반마우스 CD45.2 (104)	바이오레전드	109806	작동 농도: 5 ug/mL
겸자: 각도가 있는 미세 끝 겸자(pets)	로보즈	RS-5058	재료: 듀목셀; 패턴 #5, 45도 각도; 팁 크기 0.1 X 0.06mm
겸자: 끝이 가는 겸자	로보즈	RS-4960	자료: 듀모스타르; 패턴 #1; 팁 크기: 0.20 X 0.12mm
겸자: 끝이 가는 겸자	로보즈	RS-4966	자료: Dumostar, Biologie 팁; 패턴 #3; 팁 크기: 0.08 x 0.04mm
리도카인	어떤 것이든		진통을 위해
금속 가비지 바늘	어떤 것이든		20/22 게이지 재사용 직선 구강 개비지 바늘, 스테인리스 스틸.
니들 드라이버	로보즈	RS-6410	카스트로비에호 바늘 홀더; 직선
OPTIONAL:  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 듀얼/트윈 구스넥 현미경 LED 조명	어떤 것이든
선택사항: 에반스 블루 염료	시그마	E2129-10G	선택적으로 림프 추적을 위한 것입니다.
선택: 작동 현미경	라이카	MZ9.5	라이카 Mz9.5 스테레오 헤드 작동 현미경
인산염 완충 식염수(PBS)	어떤 것이든
포비돈/요오드 용액	어떤 것이든		피부 준비/멸균을 위해
가위: 아주 가늘한 가위	로보즈	RS-5605	맥퍼슨-배너스; 3mm 절삭날; 곡선형 (스테이션 3/4 노드용)
가위: 끝이 가는 가위	로보즈	RS-5650SC	슈어컷 카스트로비에호 가위 (스테이션 1/2/3 노드용)
가위: 중간 크기 가위	로보즈	RS-5676	노이스; 13mm 절단면; 직선
수술용 접착제	어떤 것이든		3M 베트본드 조직 접착제
봉합선: 6-0 블루 모노필라멘트 폴리프로필렉스	어떤 것이든
봉합선: 9-0 블랙 모노필라멘트 나일론 봉합사	어떤 것이든		(선택 사항) 조금 더 큰 8-0도 사용할 수 있습니다 사이즈 봉합사.
조직 고정제	어떤 것이든		(계획 조직학 기준; 즉, 10% 중성 완충 포르말린 또는 4% 파라포름알데히드 사용 시)
따뜻한 물 순환 온열 패드	어떤 것이든