여기에서는 최종 절차로 진공 펌프에 연결된 경피적 심장 내 캐뉼라 삽입을 사용하여 돼지로부터 많은 양의 혈액을 수집하는 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
일상적인 혈액 수집은 많은 기초 및 응용 연구에서 필요합니다. 돼지 혈액 채취를 위한 여러 가지 방법이 잘 설명되어 있습니다. 여기에는 작은 혈액량을 수집하기 위해 귓바퀴 정맥을 사용하고 더 많은 혈액량을 수집하기 위해 경정맥 또는 두개정맥을 사용하는 것이 포함됩니다. 일부 실험에서는 분석을 위해 한 번에 한 마리의 개별 동물로부터 많은 양의 혈액을 채취하거나 1차 세포 배양에 사용해야 하며, 이는 출혈을 통해 가장 잘 달성할 수 있습니다. 1차 세포 배양을 위해 채취한 혈액은 세포 무결성을 유지하기 위해 신선하고 신중하게 처리되어야 합니다. 우리는 심장에 경피적으로 삽입된 대구경 혈관 내 카테터 탐침과 진공 펌프를 사용하여 마취 수술 평면 하에서 돼지로부터 무균 혈액을 채취하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마취 수술면에서 최종 절차로 동물에게 한 번 수행되어 통증이나 고통에 대한 위험을 최소화합니다.
서론
돼지는 심혈관 연구에서 상처 치유 및 독성학뿐만 아니라 농업 기반 연구, 면역학 및 질병 연구에 이르기까지 다양한 연구에 사용되었습니다1. 연구에서 수집된 혈액은 질병, 약리학, 유전학, 면역 체계 연구 및 바이오마커 발견을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 세포 배양은 연구에서 수행되는 가장 기본적인 절차 중 하나이며 연구자가 세포 행동과 기능은 물론 질병 모델 및 백신 개발을 연구할 수 있도록 합니다2. 아프리카돼지열병 바이러스와 같은 질병을 유발하는 병원체의 배양은 엄격한 무균 실험실 조건에서 미리 정해진 배양 배지에서 수행되는 경우가 많습니다. 질병 전파는 침입, 확산 또는 부착을 통해 발생할 수 있으며, 여기에는 건강하고 안정적인 세포가 필요합니다3. 연구된 병원체는 전파될 수 있는 특정 세포 친화성을 가질 수 있으며, 많은 양의 혈액을 갖는 것은 더 많은 양의 세포를 사용할 수 있습니다.
개별 동물에서 높은 수율의 세포를 달성하려면 세포 분화를 위해 세포 분리 전에 세포 무결성을 유지하기 위해 많은 양의 혈액을 부드럽게 채취해야 합니다. 돼지의 경우 총 혈액량은 65mL/kg 4,5로 계산할 수 있습니다. 대량 수집을 사용한 경험에 따르면 동물의 총 혈액량의 약 절반을 회수할 수 있습니다. 따라서 최대 600파운드(273kg)의 대형 성인 돼지에서는 6-8L의 수확량이 가능합니다. 돼지의 경우 캐뉼라 삽입을 통해 두개정맥, 외부 경정맥, 복재정맥 또는 심장에서 많은 양의 혈액을 경피적으로 채취할 수 있습니다 4,5,6. 그러나 대구경 캐뉼라를 사용한 심장 내 혈액 채취를 통해 세포 용해 위험을 최소화하면서 가장 많은 양의 혈액을 효율적으로 채취할 수 있습니다. 말기 절차로서 이것은 마취의 수술면에서 수행되어야 합니다5. 이 기사에서는 진공 펌프 7,8에 연결된 대구경 IV 카테터 탐침을 사용하여 심장에 경피적 접근을 사용하여 진공 펌프를 사용하여 돼지로부터 여러 리터의 혈액을 수집하는 방법을 설명합니다.
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프로토콜
이 연구는 Midwest Veterinary Services Inc. 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. IACUC가 승인한 이 절차 중 안락사의 주요 방법은 출혈이므로 일부 돼지는 실혈로 인해 심정지에 이르게 될 것으로 예상됩니다. 이런 일이 발생하면 양측 개흉술과 같은 2차 안락사 방법이 시행됩니다. 필요한 혈액량을 채취한 후 만져지는 심장 박동이 있는 경우 안락사 용액이 담긴 주사기를 탐침에 부착하고 1차 안락사 방법으로 심장 내 투여한 후 2차 물리적 방법으로 투여합니다. 돼지는 연구 및 교육에서 농업 동물의 관리 및 사용에 대한 지침, 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침, 해당되는 경우 동물 복지법에 따라 관리됩니다.
1. 재료 및 동물의 준비(재료표 및 그림 1A-C)
- 튜브를 스테인리스 스틸 빨대에 조립하고 호스 끝을 버블 튜브에 부착합니다.
- 고르지 않은 금속 빨대 두 개와 유리병이 있는 고무 마개를 사용하여 튜브를 롤러 병에 부착합니다.
알림: 유리는 진공 펌프에 의해 생성된 용기의 붕괴를 억제하지만 압력 하에서 붕괴되지 않는 모든 재료를 사용할 수 있습니다. - 응고를 방지하기 위해 흡입 튜브와 카테터 탐침을 통해 헤파린 나트륨 10mL(1,000USP/mL)를 무균 상태로 주입합니다. 각 롤러 병에 헤파린 나트륨(1,000 USP/mL)을 무균 적으로 첨가하여 혈액 1리터당 최종 농도 50 IU/mL를 달성하고 수집 중 혈액 응고를 방지합니다. 셀 손상을 방지하기 위해 진공 펌프가 7파운드 이하로 설정되어 있는지 확인하십시오.
2. 마취 및 동물 위치 지정
- 마취 복합 약물의 필요한 용량을 계산하기 위해 시술 전 24시간 이내에 동물의 체중을 측정합니다.
- Telazol(3.0-5.0 mg/kg), 케타민(8-12 mg/kg) 및 자일라진(4.0-6.0 mg/kg)을 목 또는 기타 큰 근육 배(예: epaxial 근육), 30인치 확장 세트와 18G x 1.5" 바늘을 사용하여 깊은 마취를 유도합니다.
참고: 대형 돼지의 경우 최대 권장 IM 주입량은 10mL이므로 10mL 투여마다 위치를 변경해야 할 수 있습니다9. 우리가 이 칵테일을 선택했지만 이 절차는 마취의 수술면을 생성하는 IACUC 승인 마취 프로토콜에 따라 수행할 수 있습니다. - 동물이 마취 수술면(~5-8분)에 있는 것으로 확인되면 눈꺼풀 반사, 느슨한 턱 긴장도 및 통증 자극에 대한 반응이 없는 것으로 확인되면 돼지를 리프트 테이블, 바닥 또는 기타 평평한 표면에 오른쪽 측면 누운 자세로 놓습니다.
- 필요한 경우 팔꿈치 지점까지 꼬리 쪽의 심장 위, 네 번째와 다섯 번째 늑간 공간 근처에 있는 흉부의 머리카락을 자릅니다.
- 가능한 경우 초음파(그림 2A)를 사용하여 좌심실을 식별합니다. 사용할 수 없는 경우 좌심실은 최대 임펄스지점 8의 내측 네 번째 또는 다섯 번째 늑간 공간에 가장 가깝게 위치합니다.
- 4% 클로르헥시딘 스크럽에 적신 4인치 x 2인치 거즈 스펀지와 4% 이소프로필 알코올에 적신 4인치 x 70인치 거즈 스펀지로 해당 부위를 무균적으로 문지릅니다. 주입 지점에서 시작하여 바깥쪽으로 최소 3회 회전하면서 두 소독제를 번갈아 가며 원형으로 문지르며 피부를 준비합니다.
3. 심장내 채혈
- 눈꺼풀 반사, 턱 긴장도 및 페달 반사를 확인하여 동물이 마취의 수술 평면에 남아 있는지 확인합니다.
알림: 동물이 수술 마취 평면에 머물도록 절차 전반에 걸쳐 마취 깊이와 심장 및 호흡수를 확인하십시오. - IV 카테터에서 탐침을 제거합니다. 탐침을 좌심실 위에 놓고 피부에 수직으로 전진시켜 탐침을 좌심실에 삽입합니다(그림 2B). 탐침에서 혈액이 맥박이 뛰기 시작하면 롤러 병에 부착된 버블 튜브 호스 끝 커넥터에 부착한 다음 진공 펌프를 켭니다(그림 1A 및 그림 2C).
- 혈액이 꾸준히 흐르는지 확인하십시오. 혈액이 롤러 병으로 유입될 때 병을 부드럽게 휘돌려 혈액이 항응고제와 혼합되도록 하여 혈전 형성을 방지합니다.
- 1L의 혈액을 채취하면 지혈제를 사용하여 롤러 병 근처의 버블 튜브를 고정합니다. 고무 마개를 분리하고 다음 롤러 병에 붙입니다. 지혈제를 제거하고 롤러 병을 부드럽게 휘젓는 동안 혈액이 자유롭게 흐르도록 합니다.
- 필요한 혈액이 채취될 때까지 이 과정을 계속하십시오. 완료되면 과도한 혈액 유출을 방지하기 위해 튜브를 고정하고 펌프를 끕니다.
- 카테터 탐침에서 튜브 커넥터를 제거하고 펜토바르비탈 나트륨 주사기를 탐침에 부착합니다. 주사기를 뒤로 당겨 혈액이 번쩍이는 것을 확인한 다음 안락사 용액을 주입합니다. 심장 박동, 호흡, 근긴장도 및 반사 신경이 없어 사망을 확인합니다. 사망이 확인되면 심장에서 바늘을 제거하고 날카로운 용기에 넣으십시오.
- 버블 튜브를 생물학적 폐기물 용기에 버리십시오. 튜브 브러시를 사용하여 나머지 스테인리스 스틸 품목(예: 스테인리스 스틸 빨대, 호스 끝 커넥터)에서 총 혈액을 제거한 다음 나중에 사용할 수 있도록 오토클레이브합니다.
- 세척한 고무 마개, 빨대, 호스 끝 커넥터 및 지혈제를 새 오토클레이브 파우치에 넣고 다음 사용 전에 멸균하십시오.
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결과
채혈 전에 모돈은 마이코플라스마 하이오뉴모니아, 돼지 아데노바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 코로나바이러스(전염성 위장염, 돼지 전염성 설사), 돼지 혈구응집성 뇌척수염, 돼지 생식 및 호흡기 증후군, 인플루엔자 그룹 A, 서코바이러스 1 및 2, 세네카 바이러스 A. 우리는 체중이 300-600파운드인 암컷 요크셔 교배 모돈에서 이 절차를 여러 번 반복했습니다. 채혈 결과 작은 돼지의 경우 3L에서 큰 암퇘지의 경우 8L 사이가 나왔습니다. 두 가지 사례에서 혈전 형성이 의심되면 양호한 혈류를 회복하기 위해 초기 탐침을 제거하고 교체해야 했습니다. 수술용 마취 평면이 유지되었습니다. 수집하는 동안 혈전 형성을 완화하기 위해 수집 전반에 걸쳐 롤러 병을 부드럽게 휘젓는 것이 중요합니다. 분화 후 세포 품질 고려 사항은 대식세포가 세포 배양 플라스크에 얼마나 잘 부착되었는지에 반영되었습니다. 순응도 외에도 세포 형태와 생존력도 평가되었습니다. 건강한 대...
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토론
여기서의 절차는 모돈의 심장에서 일회성 대량의 혈액을 수집하기 위한 카테터-탐침-진공 펌프 어셈블리를 설명합니다. 통증과 고통의 가능성 때문에 이 절차는 마취 수술면에 있는 동물에서만 수행해야 합니다. 마취로 인한 부동성은 초보자가 이 절차를 배우고 빠르게 숙달할 수 있도록 합니다. 여러 정맥을 사용하여 동물의 혈액을 채취할 수 있습니다. 가장 일반적이고 접근 가능한 경로는 경정맥, 두개정맥 및 귀 정맥이며 꼬리 정맥, 대퇴 정맥 또는 두부 정맥이 추가 가능성입니다 5,6.
돼지의 경우 경정맥 및 두개정맥 정맥을 통해 많은 양의 혈액을 수집할 수 있습니다. 그러나 진공 펌프를 사용하여 심장에서 채취한 혈액은 채취할 수 있는 양을 훨씬 초과합니다. 이러한 혈관에서 혈액을 채취하려면 큰 주사기 또는 진공 혈액 튜브 외에...
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
특히 훌륭한 기술 지원을 해준 Plum Island Animal Disease Center Animal Resource Branch, Animal Health Techs 및 Animal Care에 감사드립니다. 계약 연구 기관의 프로젝트에 대한 자금은 NBAF의 USDA, ARS, 동물 자원 부서에서 제공했습니다.
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재료
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참고문헌
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
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