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방법 논문

박테리아, 장 및 면역 세포의 독성 및 면역 조절 요법을 위한 비동기 시스템 개발을 위한 3D 플립웰 엔지니어링

649 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

2025년 10월 17일

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

이 논문에서

요약

이 기사에서는 3D Flipwell 엔지니어링 및 활용을 안내하는 주요 단계와 함께 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 공동 배양 인서트 스택을 조립하고 장 점막 환경을 모델링하기 위해 장내 세균, 장 상피 및 대식세포의 층화 층을 공동 배양하는 데 활용하는 방법을 설명하고 보여줍니다.

초록

면역 세포 분극화 및 장 점막 항상성에서 박테리아 분비체의 역할을 연구하기 위해 우리는 상업적으로 이용 가능한 인서트를 연속 스택 형식으로 사용하여 3차원 공동 배양 모델을 개발했습니다. 우리는 이 시스템을 3D Flipwells라고 부르고 박테리아, 결장 상피 및 면역 세포를 층층에서 성공적으로 공동 배양하여 장 점막 미세 환경을 요약했습니다. 이 공동 배양 시스템은 막의 한쪽에 결장 상피 세포를 파종하고 다른 쪽에 미분화 비부착 단핵구를 파종할 수 있게 하여 전분화된 대식세포를 분리하고 재도배할 필요 없이 단일 공동 배양 내에서 결장 상피 분극화, 점액 형성, 단핵구-대식세포 분화 및 분극화의 동시 진행을 허용합니다. 이 시스템은 구성하기 쉽고, 쉽게 구할 수 있는 몇 가지 재료와 도구만 필요합니다. 우리는 산화질소 합성효소(NOS)의 보조 인자인 BH4 (테트라하이드로비옵테린)의 내인성 전구체인 세피압테린(SEP)에 대한 공동 배양 성분의 반응을 분석하여 그 유용성을 테스트했습니다. 우리는 3D Flipwell의 SEP 처리가 장내 세균에 의한 생물막 형성, 결장 상피에 의한 점액 생성 및 대식세포의 전면역원성 분극화를 유도한다는 것을 입증했습니다. 이는 SEP가 서로 다른 세포 구성 요소 간의 누화를 통해 점막 방어 메커니즘의 활성화를 촉발했음을 나타냅니다. 면역 세포 재프로그래밍으로 이어지는 점막 통신의 역할을 조사하고 새로운 면역 조절 요법을 스크리닝하기 위한 이 공동 배양 시스템의 유용성을 평가하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다.

서론

면역 세포-장내 미생물 군집 누화는 다양한 질병 치료의 효능에 큰 영향을 미칩니다. 이러한 누화는 숙주 대사 이상, 식이 변화, 질병 발현 및 약리학적 치료를 포함하되 이에 국한되지 않는 외부 자극에 의해 현저하게 변형됩니다. 이러한 변화는 미생물총합 구성의 불균형을 초래할 수 있으며, 이를 세균불균형이라고 합니다 1,2,3.

장내 미생물과 숙주 면역 세포 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 장 점막 환경을 요약하기 위해 여러 그룹에서 정교한 공동 배양 시스템이 개발되었습니다. Kim et al.4 에 의해 개발된 Gut-on-Chip 시스템에서 특수 흡수성 기질5을 사용하는 보다 복잡한 어셈블리에 이르기까지, 이러한 공동 배양 시스템은 구축이 간단하지 않으며 공동 배양 기질에 의한 흡수로 인해 분비된 성분의 전체 스펙트럼을 유지할 수 없습니다. 따라서 Noel et al. 따라서 상대적으로 제작하기 쉬운 장 점막을 모델링하기 위한 대체 공동 배양 시스템을 개발했습니다6. 이 새로운 시스템은 막의 한쪽에 결장 상피 세포가 파종되고다른 쪽에 사전 분화된 대식세포가 있는 단일 배양 삽입물을 활용합니다6. 그러나 사전 분화된 대식세포를 파종하려면 다른 곳에서 사전 분화하고 해리 및 공동 배양으로 재도금해야 하므로 잠재적으로 세포 무결성과 생존력에 영향을 미칩니다.

이러한 이전 시스템에 대한 개선 사항을 통합하여 3D Flipwell 시스템 7,8이라고 부르는 새로운 3차원(3D) 다층 공동 배양 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 연속적으로 쌓인 세포 배양 삽입물로 구성되어 단일 공동 배양 내에서 결장 상피 분극화, 점액 형성, 대식세포 분화 및 분극화의 동시 진행을 허용합니다. 이 시스템을 통해 장 점막 환경의 변화와 장내 세균, 상피 세포 및 면역 세포 간의 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 또한 이 시스템은 박테리아 대사산물, 독소, 식이 영양소 및 의약품을 포함한 외부 자극이 장 점막과 신체의 나머지 부분에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 7,8.

새로운 공동 배양 삽입 시스템을 활용하여 산화질소 합성효소(NOS)의 보조 인자인 BH4(테트라하이드로비옵테린)의 내인성 전구체인 세피압테린(SEP)에 대한 다양한 세포 성분의 반응을 조사했습니다. 우리는 이전에 SEP가 종양 관련 대식세포를 pro-immunogenic 유형 9,10,11,12로 재프로그래밍하여 유방 종양 미세 환경에 pro-immunogenic 활성을 발휘한다는 것을 보여주었습니다. 우리는 SEP가 장내 세균에 의한 생물막 형성, 결장 상피에 의한 점액 생성, 공동 배양에서 대식세포의 전면역원성 분극화의 동시 사건을 유도하여 점막 방어 메커니즘의 활성화를 나타낸다는 것을 입증했습니다7. 이러한 발견은 장 점막 미세 환경을 모델링하는 데 있어 이 새로운 공동 배양 시스템의 유용성을 뒷받침합니다7.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장 점막 환경을 모델링하기 위해 장내 세균, 장 상피, 점액 및 면역 세포의 새로운 공동 배양 구축에 대한 단계별 지침을 제공하는 것입니다. 우리는 또한 SEP 처리와 같은 외부 자극의 영향 하에서 공동 배양된 세포의 누화를 시각화할 수 있는 방법을 보여줍니다. 공동 배양에서 서로 다른 세포 간의 상호 작용을 촉진하는 분비된 세포 성분을 결정하고 새로운 치료제의 고처리량 스크리닝을 위한 이 공동 배양 모델의 유용성을 테스트하기 위해서는 이 공동 배양 시스템을 활용하는 추가 연구가 필요합니다. 또한, 장 점막 환경의 생리적 상태를 달성하려면 이 공동 배양 시스템에 추가 수정이 필요합니다. 예를 들어, 호기성 포유류 세포를 혐기성 박테리아와 공동 배양하려면 다른 곳에서 보고된 바와 같이 이러한 박테리아를 산소를 제거하는 혐기성 배지에서 별도로 배양하거나 산소 유입을 방지하는 액체 파라핀과 겹쳐야 합니다. 이 공동 배양 시스템의 이러한 고급 유용성과 적용은 추가 조사를 보증할 것입니다.

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프로토콜

1. 3D 플립웰 엔지니어링

  1. 모든 작업은 세포 배양 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다. 모든 소모품을 캐비닛 안에 넣으십시오.
  2. 페트리 접시 덮개를 열고 따로 보관하십시오. 보호 케이스에서 메스 칼날을 열고 페트리 접시 바닥 가장자리에 놓습니다. 무균성을 보장합니다.
    주의 : 메스 칼날을 조심스럽게 다루어야 합니다. 필요한 경우 절단 방지 섬유 강화 장갑을 사용하여 손을 보호하십시오.
  3. 12웰 상업용 인서트의 멸균 보호 포장을 엽니다. 무균성을 보장합니다. 멸균 핀셋 세트를 가져 가십시오. 인서트를 부드럽게 잡고 포장에서 꺼냅니다.
  4. 바닥이 위를 향하도록 인서트를 잡습니다. 다른 손으로 멸균 메스 칼날을 잡고 인서트까지 가져옵니다.
  5. C자형 동작을 사용하여 가장자리의 멤브레인을 뚫고 메스 칼날을 인서트 바닥 주위로 부드럽게 밀어 플라스틱 벽에 가깝게 유지합니다.
  6. PET 멤브레인을 잘라내고 두 번째 핀셋 세트를 사용하여 멤브레인을 제거합니다. 멤브레인을 버리십시오.
  7. 메스 칼날을 사용하여 흰색 멤브레인 부스러기를 긁어 인서트의 가장자리와 가장자리를 청소합니다. 새로 준비된 인서트를 원래의 멸균 팩에 조심스럽게 다시 넣습니다.
  8. 다음으로 실리콘 접착 튜브를 가져와 메스 칼날로 노즐 끝을 잘라 구멍을 만듭니다. 이 개구부의 너비는 3mm여야 합니다.
  9. 종이 타월에 접착제를 짜서 구슬 크기를 테스트합니다. 구슬의 두께는 2-3mm여야 합니다. 비드가 2mm 미만이고 튜브에서 짜내기 어려운 경우 노즐을 조정하십시오.
    1. 접착제 비드를 도포하고 펴는 또 다른 방법은 팁이 잘린 상태에서 200μL 피펫 팁을 사용하는 것입니다. 가위로 3-4mm 잘라내고 주걱을 사용하여 인서트 가장자리 주위에 접착제를 펴 바릅니다.
  10. 두 번째 인서트에서 보호 덮개를 떼어내고 따로 보관하십시오. 멸균 겸자를 집어 들고 멤브레인이 위를 향하도록 포장에서 두 번째 인서트를 잡습니다.
  11. 멤브레인에 닿지 않도록 주의하면서 인서트 바닥 주위에 얇은 2-3mm 실리콘 비드를 부드럽게 펴 바릅니다.
  12. 두 번째 멸균 겸자 세트를 집어 들고 첫 번째 인서트(멤브레인 제외)를 보호 팩에서 조심스럽게 들어 올립니다.
  13. 하단 테두리가 정렬되도록 두 개의 인서트를 아래에서 아래로 모으십시오. 과도한 접착제가 조인트에서 밀려날 수 있습니다. 접착제를 말리십시오. 접착제가 완전히 건조된 후(24-72시간) 잘라낼 수 있습니다. 이는 선택 사항입니다.
    참고: 최종 Flipwell 공동 배양 인서트(FCI) 스택에는 중간에 하나의 PET 멤브레인만 있어야 합니다. 상업용 인서트의 L자형 핸들은 서로 180° 떨어져 있는 위치(3시 및 6시 방향)에 배치하는 것이 가장 좋습니다. 건조 시간에 대한 실리콘 접착제 제조업체의 권장 사항을 따르십시오(브랜드에 따라 24-72시간일 수 있음). 대부분의 실리콘 기반 접착제의 경우 72시간의 건조 시간이 선호됩니다. 접착제는 UV 살균으로 24시간 동안만 건조할 수도 있습니다.
  14. FCI 스택이 접착되면 원래의 멸균 팩 안에 넣어 건조시키거나 깊은 페트리 접시 안에 넣습니다. 지정된 페트리 접시의 뚜껑을 사용하여 스택 어셈블리를 덮습니다.
  15. 스택 어셈블리를 멸균하려면 페트리 접시 뚜껑을 엽니다. 멸균 겸자를 사용하여 지정된 깊은 페트리 접시 테두리의 테두리에 FCI 스택을 건네줍니다.
  16. BSC 캐비닛의 유리 새시를 닫습니다. UV 조명을 켭니다. 안전을 위해 캐비닛에서 벗어나 멤브레인의 각 면을 30분-1시간 동안 멸균합니다. 각 멸균 주기가 완료되면 UV 조명을 끕니다.
  17. 페트리 접시 뚜껑(지정된 대로)을 인서트 스택이 있는 페트리 접시 위에 놓고 따로 보관합니다.

2. 콜라겐 코팅 전 누출 테스트

  1. 페트리 접시 뚜껑을 제거합니다. 멸균 PBS 또는 멸균 탈이온수 500μL를 추가합니다.
    참고: 시각적 지원을 위해 DMEM은 FCI 스택의 무결성을 시각화하는 데 사용되었습니다.
  2. 페트리 접시를 덮습니다. 밤새 그대로 두십시오. 아침에 FCI 무결성을 확인하십시오. 누출이 감지되면 FCI를 폐기합니다. 필요에 따라 새 삽입 스택을 만듭니다.
  3. 테스트에 사용된 액체(PBS 또는 물)를 흡인합니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다.
  4. 스택을 BSC 내부에서 건조시키십시오(1-2시간). FCI를 사용할 준비가 될 때까지 BSC에 보관하거나 부착 세포를 파종하기 위해 콜라겐으로 코팅합니다.

3. 플립웰 멤브레인의 콜라겐 코팅

  1. 3 mg/mL로 공급된 콜라겐 용액을 100 μg/mL에서 1:30 희석으로 희석하여 콜라겐 용액의 작업 스톡을 준비합니다. 상업적으로 제조된 콜라겐 용액 33μL를 미세 원심분리기 튜브의 멸균 탈이온수 1mL에 첨가합니다. 소용돌이로 혼합합니다.
    참고: 더 큰 부피의 경우 멤브레인 양면에 코팅할 인서트 스택의 수에 따라 15mL 원추형 튜브를 확장하고 사용하십시오. 매번 신선하게 만드십시오. 작업 스톡을 재사용하지 마십시오.
  2. 페트리 접시 뚜껑을 엽니다. 플립웰을 페트리 접시 테두리에 걸어두세요. 인서트 스택의 한쪽에 200 μL의 콜라겐 용액을 조심스럽게 추가합니다.
  3. 1시간 동안 그대로 두십시오. 콜라겐 용액을 흡인합니다. 멸균 PBS 200μL를 첨가합니다. PBS를 흡인합니다.
  4. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 멤브레인을 캐비닛 내부에서 60분 동안 건조시킵니다. 멤브레인이 건조되면 멸균 집게/핀셋을 가져다가 Flipwell을 반대쪽으로 뒤집어 페트리 접시 테두리에 걸어 놓습니다.
  5. 200μL의 콜라겐 용액을 멤브레인의 코팅되지 않은(현재 상단) 면에 첨가합니다. 1시간 동안 그대로 두십시오.
  6. 콜라겐 용액을 흡인합니다. 멸균 PBS 200μL를 첨가합니다. PBS를 흡인합니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 멤브레인을 캐비닛 내부에서 60분 동안 건조시킵니다. FCI 스택을 밤새 건조시키거나 같은 날 시드합니다.
    참고: 콜라겐 코팅의 무결성은 장기간 보관 조건에서 테스트되지 않았습니다. 플립웰이 사전 코팅되면 24시간 이내에 사용해야 합니다.

4. 박테리아 배양을 위한 박테리아 인서트 구조

  1. 두 세트의 멸균 겸자와 24웰 인서트를 BSC 내부에 넣습니다. 삽입물을 조심스럽게 열고 멸균 포장 안에 그대로 두십시오.
  2. 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 팩에서 인서트를 들어 올립니다. 두 번째 핀셋/집게를 사용하여 인서트 바닥에 있는 작은 플라스틱 다리를 부러뜨립니다.
  3. 멸균 FCI 스택 또는 원래 12웰 인서트 중 하나에 끼워 24웰 인서트를 테스트합니다.
  4. 인서트가 웰 안으로 미끄러지지 않으면 핀셋을 다시 사용하여 림과 발이 만나는 림에서 더 많은 플라스틱 재료를 떼어냅니다.
  5. 24웰 인서트가 12웰 인서트 웰 내부로 미끄러질 수 있을 때까지 적합성을 다시 테스트합니다. 인서트를 멸균 팩 또는 멸균 페트리 접시 안에 넣습니다.
  6. 인서트를 UV 멸균하거나 에탄올(옵션). 사용할 준비가 될 때까지 팩을 다시 덮거나 페트리 접시 뚜껑으로 덮습니다.

5. 바늘 구조

  1. 도구와 모든 소모품을 BSC 안에 가져오십시오. 노즈 플라이어로 바늘을 조심스럽게 잡습니다.
  2. 자를 사용하여 바늘의 각 구부러짐 위치를 측정합니다. 두 번째 노즈 플라이어 세트를 사용하여 선택한 위치에서 바늘을 잡고 바늘을 구부립니다.
  3. 두 번째 절곡부를 작성합니다. 바늘을 비틀려면 펜치로 바늘의 밑부분과 U자형 구부러짐을 잡고 반대 방향으로 비틀어 4-5mm 비틀기를 만듭니다. 이 단계는 기포 제거를 위해 Flipwell 내부에 바늘을 쉽게 삽입하는 데 중요합니다.
  4. 멸균 3mm 또는 5mm 주사기에 바늘을 부착합니다. 50mL 원뿔형 튜브 안에 70%-95% 에탄올 20mL로 바늘과 주사기 베이스를 멸균합니다.
  5. 바늘과 주사기를 통해 에탄올을 당겨 주사기의 바늘과 바닥이 멸균되었는지 확인합니다.
  6. 에탄올이 담긴 원추형 튜브에서 주사기와 바늘을 제거하고 페트리 접시 위에 올려 자연 건조시킵니다. 바늘을 공기로 퍼지하여 건조시키고 몇 분 동안 건조시킵니다.

6. 결장 상피 Caco-2:HT29-MTX-E12 세포주 파종

  1. Caco-2 및 HT29-MTX 세포주를 실험 2-3주 전에 각각의 성장 배지에서 별도의 100mm TC 코팅 접시에서 배양을 시작합니다.
    1. HT-29-MTX 배지의 경우, 고포도당(4.5g/L) 및 1%(v:v) 글루타맥스 배지가 포함된 DMEM 440mL와 10%(v:v) 열 비활성화 FBS 50mL, 1%(v:v) 펜 연쇄상구균 5mL, HEPES 10mM 최종 농도 5mL를 사용합니다.
    2. Caco-2 배지의 경우, 고포도당(4.5g/L) 및 1%(v:v) 글루타맥스 배지와 함께 DMEM 440mL를 10%(v:v) 열 비활성화 FBS 50mL, 1%(v:v) 펜 연쇄상구균 5mL, 비필수 아미노산 5mL를 사용합니다.
      참고: 조직 배양 코팅된 12웰 플레이트 웰을 사용하여 Caco-2 세포주의 파종 밀도를 결정합니다. 시작 시드 밀도에 따라 100% 합류까지의 일 수를 계산합니다. 우리는 지침으로 파종 밀도를 제공합니다. 그러나 이는 성장 배지 제형, 공급업체 및 사용되는 FBS에 따라 달라집니다. 이 단계는 THP-1 세포를 도금하고 박테리아/SEP 처리를 수행한 후 Flipwell의 장 상피 측에 대한 단층을 보장하는 데 중요합니다.
  2. Caco-2 및 HT-29 세포를 계대시키려면 배양 배지를 흡인합니다. 10mL의 PBS로 세척합니다.
  3. 2mL의 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 5% CO2와 함께 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
  4. 세포형 성장 배지 7mL를 플레이트에 첨가합니다. 세포를 별도의 멸균 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
  5. 실온에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.
  6. 펠릿을 예열된 DMEM 기반 HT-29 배지 1mL에 재현탁합니다. 혈구계 또는 세포 계수기로 세포를 계수합니다.
  7. 원하는 수의 플립웰에 필요한 세포 수에 따라 두 가지 세포 유형 Caco-2:HT-29 세포를 새로운 15mL 또는 50mL 원추형 튜브에 9:1의 비율로 결합합니다.
  8. 아래 단계에 콜라겐 사전 코팅 플립웰을 사용하십시오. 콜라겐 사전 코팅된 FCI 스택을 깊은 페트리 접시의 가장자리에 걸어두세요.
  9. Flipwell의 정점면당 cm2(2.6 x 105 세포/12웰 삽입물)당 7.5 x 104 세포 500 μL를 시종합니다. 사용 중인 스택 수를 기준으로 시작 셀 수를 계산합니다. 여기에는 9:1 비율의 두 세포 유형이 모두 포함됩니다.
  10. 페트리 접시 뚜껑으로 어셈블리를 덮으십시오. 세포가 부착될 때까지 37°C에서 5% CO2 와 함께 밤새 배양합니다. 세포는 배양 후 약 7-10일 후에 점액을 생성하기 시작합니다. 문화를 유지하기 위해 격일로 미디어를 바꿉니다.
    참고: 처리가 포함된 총 배양 일수는 미리 계산해야 합니다. 뒤집기 및 초기 시드 밀도는 해당 기간에 따라 달라집니다.

7. THP-1 세포 파종을 준비하기 위해 3D Flipwell 뒤집기

  1. Caco-2:HT-29 세포가 부착되어 증식하기 시작하지만(정확한 컨플루언스는 사용된 배지/FBS 및 배양 기간을 기반으로 추정해야 함) 100% 컨플루션이 아닌 경우, 플립웰을 뒤집어 멤브레인의 반대편에 THP-1 세포를 시드합니다.
    참고: THP-1 세포는 이 시점까지 별도의 배양에서 증식되어야 하며, 필요한 정확한 세포 수는 사용된 FCI 스택의 수를 기반으로 추정됩니다.
  2. 페트리 접시 뚜껑을 열고 FCI 스택의 정점(장 상피) 쪽에서 DMEM 배지를 흡인합니다.
  3. 멸균 겸자를 사용하여 후크를 잡고 Flipwell을 조심스럽게 집어 들고 180° 회전합니다. 두 번째 멸균 겸자 세트를 사용하여 현재 위쪽을 향하고 있는 다른 후크로 FCI 스택을 잡습니다.
  4. 어셈블리를 페트리 접시로 다시 내리고 페트리 접시 테두리 위에 후크를 걸 수 있습니다. THP-1 세포를 파종할 준비가 되지 않은 경우 깊은 페트리 접시에 충분한 배지를 추가하여 배지 레벨을 올려 멤브레인 상단까지 올립니다.
    참고: Flipwell은 이 위치에서 안정적이어야 하며 THP-1 세포 파종 및 배지 추가를 지금 즉시 고려해야 합니다. 이 단계는 빠르게 수행됩니다. THP-1 세포를 계수하고 도금할 준비가 되어야 합니다. THP1 세포는 더 큰 안정성과 최종 무게를 위해 FCI 스택의 무게를 줄이기 위해 먼저 시딩되었습니다. 그런 다음 DMEM 배지를 깊은 페트리 접시에 첨가하여 배지 레벨을 멤브레인 밑면까지 올렸습니다. 그런 다음 맞춤형 바늘을 사용하여 기포를 제거하여 FCI 스택을 더욱 안정화하고 최종 볼륨 조정이 가능했습니다.
  5. 다음 단계에 설명된 대로 바늘을 사용하여 기포를 제거합니다.

8. 기포 제거

  1. 사용하기 전에 바늘과 주사기를 에탄올에 미리 멸균하고 자연 건조하십시오(5단계 참조). 주사기 플런저를 급감시킵니다.
  2. 멸균 겸자로 FCI 스택을 팔로 잡습니다. 인서트 어셈블리 안팎에 바늘을 조심스럽게 내리고 위관 바늘의 부드러운 끝을 기포까지 매우 부드럽게 놓습니다.
  3. 주사기 플런저를 조심스럽게 매우 천천히 위로 당기고 기포가 천천히 사라지는 것을 지켜보십시오. 기포의 직경이 약 2mm일 때 중지하며, 이는 결장 상피 세포에 대한 우수한 DMEM 커버리지를 유지하기에 충분합니다.
  4. Flipwell에서 바늘과 주사기를 조심스럽게 제거합니다. 깊은 페트리 접시의 다른 인서트 어셈블리로 진행합니다.

9. THP-1 파종 및 PMA 처리

  1. 420mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지, 50mL의 10%(v:v) 열 비활성화 FBS, 5mL의 Glutamax 1%(v:v), 5mL의 HEPES(10mM 최종 농도), 11mL의 포도당(4.5g/L 최종 농도) 및 5mL의 Pen-Strep(1% v:v)으로 THP1 배지를 만듭니다.
    참고: THP-1 세포는 삽입물에 파종하기 전에 며칠 동안 RPMI 기반 배양 배지에서 성장해야 합니다. 시드 전에 셀 수를 계산하고 사용할 FCI 스택 수에 따라 확장합니다.
  2. 500 μL 부피를 기준으로 세포 현탁액을 제조하고 THP-1 배지 500 μL당0.5 x 10 6 세포로 준비합니다. PMA를 분화 및 분극에 사용해야 하는 경우 100ng/μL로 RPMI 배지에 첨가하십시오.
    1. PMA를 만들려면 5mg의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 1mL의 DMSO에 재구성하여 5mg/mL 원액을 만듭니다. 소용돌이로 혼합합니다. 각각 20μL의 미세 원심분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
    2. PMA를 사용하려면 5mg/mL 스톡 1μL를 99μL(1:100)의 완전 성장 배지에 희석하여 50μg/mL의 작업 스톡을 만듭니다. 1 μL의 작업 스톡을 500 μL의 배지에 또는 20 μL의 작업 스톡을 10 mL의 배지에 추가합니다.
  3. THP-1 세포를 94 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 5-10mL의 RPMI 배지에 재현탁합니다. 선호하는 계수 방법으로 THP-1 세포를 계수합니다.
  4. RT에서 5분 동안 94 x g 으로 다시 원심분리합니다. THP-1 배지 500μL당0.5 x 10 6세포로 재현탁합니다.
  5. 500μL의 THP-1 세포 현탁액을 공동 배양 삽입물 스택의 정점면에 추가합니다. 깊은 우물 페트리 접시에 배지를 추가하여 결장 상피 세포에 대한 HT-29 배지를 조정합니다.
  6. 필요한 경우 8단계에 따라 위관 바늘로 기포를 제거합니다. THP-1 세포가 부착될 때까지(하룻밤) 1-2일 동안 증식할 때까지 37°C, 5% CO2, 100% 습도의 세포 배양 인큐베이터에서 두 세포 유형을 모두 배양합니다.
  7. SEP 또는 기타 약물로 치료를 하거나 박테리아 삽입물을 준비할 준비를 하십시오(4단계 참조). 다음 FCI 스택 플립 1일 전에 박테리아 배양을 시작합니다.

10. SEP 및 박테리아 인서트를 위한 두 번째 Flipwell Flip Flip 및 기포 제거

  1. 페트리 접시 뚜껑을 엽니다. 정점 쪽에서 RPMI 배지를 흡인합니다. 멸균 핀셋으로 Flipwell의 팔을 잡고 스택을 들어 올립니다.
  2. 스택을 거꾸로 회전합니다. 두 번째 핀셋 세트를 사용하여 사용 가능한 암으로 스택 어셈블리를 잡습니다.
  3. 스택을 새 멸균 깊은 우물 페트리 접시에 내리고 테두리 위에 걸어둡니다. 500μL의 DMEM 배지를 이제 에피컬/장 상피 쪽에 추가합니다.
  4. 배지가 멤브레인 상단에 올 때까지 깊은 페트리 접시에 충분한 RPMI 배지를 추가합니다. RPMI 부피는 약 40-55mL로 추정되었지만 깊은 페트리 접시당 사용되는 FCI 스택 수에 따라 변경됩니다.
  5. 8단계를 사용하여 기포를 제거하고 2-3mm 기포를 남깁니다. 필요한 경우 RPMI 미디어를 조정합니다. 접시를 덮습니다.
  6. 결장 상피 세포가 점액을 생성하기 시작할 때까지 배양합니다. 격일로 미디어를 부분적으로 교체하십시오.
    참고: 결장 상피 세포가 충분히 오랫동안 배양되었고 이미 점액을 생성한 경우 박테리아 삽입물 또는 치료를 진행할 수 있습니다. 하단 구획의 미디어가 인서트의 멤브레인 밑면 아래로 들어가지 않도록 하십시오. 멤브레인에서 배지 수준을 유지하기 위해 DMEM 배지를 더 추가합니다. 배지를 교체하는 이상적인 방법은 기저외측 구획에서 배지의 절반을 제거하고 정점 구획에 소량의 배지를 남겨 공기 침투를 방지하는 것입니다.
  7. SEP 처리의 경우, 박테리아 배양을 사용하지 않는 경우 이때 SEP를 최종 농도 100μM로 웰에 첨가하십시오. 박테리아 배양 및 인서트를 사용하는 경우 세균 배양에 SEP를 첨가하십시오. 박테리아 배양에 대해서는 11단계를 참조하십시오.
    1. SEP를 만들려면 100mg의 L-세피압테린을 84.3mL의 DMSO에 첨가하고 와류에 의해 혼합합니다. 각각 100μL의 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다. -20°C에서 보관하십시오. 인서트 어셈블리당 500 μL 배지당 1 μL로 SEP 분취량을 사용합니다(최종 농도 100 μM).

11. 박테리아 배양 시작(선택 사항)

  1. 박테리아 대사산물이 면역 세포, 점액 및 결장 상피에 미치는 영향을 연구하려면 인서트 어셈블리의 정점 측면에 박테리아 인서트를 추가합니다. 박테리아 인서트 구성의 경우 4단계를 따르십시오. 우리는 박테리아 삽입물 사용 전날 Bacillus subtilis 를 배양했습니다.
  2. 박테리아 인서트를 사용하기 2일 전에 Miller LB를 만들고 오토클레이브합니다. LB를 만들려면 6.25g의 Miller LB와 250mL의 탈이온수를 500mL 유리 플라스크에 넣고 섞습니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 오토클레이브, RT로 식힙니다. 멸균 LB는 4°C 또는 RT에서 보관할 수 있습니다.
  3. 박테리아 삽입물을 사용하기 전날 글리세롤 스톡에서 Bacillus subtilis 박테리아 재배를 시작합니다.
  4. 박테리아 배양을 시작하려면 멸균 50mL 원뿔형 튜브 내부의 냉동 글리세롤 스톡에서 Bacillus subtilis 를 Miller LB 10mL에 접종합니다. 글리세롤 스톡이 해동되지 않도록 하십시오.
  5. 멸균 200μL 팁을 사용하여 글리세롤 스톡에서 소량의 박테리아를 선택합니다. 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 있는 10mL의 LB에 팁을 배출합니다.
  6. SEP를 사용하는 경우 20μL의 SEP 스톡으로 치료를 시작합니다(최종 농도는 100μM여야 함). 50mL 원뿔형 튜브 스타터 배양액의 10mL 박테리아 배양액에 직접 첨가합니다.
  7. Bacillus subtilis를 220rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 8시간 동안 배양합니다. 하루가 끝날 때 SEP의 두 번째 처리를 추가합니다 - 박테리아가 있는 LB 10mL에 최종 농도 100μM에 20μL의 SEP를 추가합니다.
  8. 220rpm, 37°C에서 하룻밤 배양합니다. 다음날 아침 Bacillus subtilis 가 포함된 10mL의 LB에 20μL의 SEP의 세 번째 처리를 추가하고 박테리아 삽입물을 할 준비가 될 때까지 계속 흔듭니다.

12. Flipwell에 박테리아 삽입물 추가(옵션)

  1. 4단계에서 설명한 대로 박테리아 삽입물 구성을 수행합니다. 11단계에서 설명한 대로 박테리아 배양을 수행합니다.
    참고: 별도의 세포 배양 캐비닛을 사용할 수 있는 경우 가장 효과적입니다. 그렇지 않으면 세포 배양 캐비닛 내부의 작업 영역을 반으로 나눕니다. 박테리아와 세포 배양을 분리하여 유지하십시오. 세포 배양물을 세포 배양 인큐베이터로 되돌려서는 안 됩니다. BSC는 멸균하고 이 방법을 수행한 후 24시간 이상 UV에 노출되어야 합니다.
  2. 아래 단계에 대해 두 쌍의 멸균 겸자를 사용하십시오. 아래의 모든 단계는 BSC에서 수행되어야 합니다.
  3. 집게를 사용하여 미리 만들어진 멸균 24웰 인서트를 포장에서 들어 올립니다. 인서트를 멸균 페트리 접시 안에 넣고 뚜껑을 덮습니다.
  4. 필요한 박테리아 삽입물의 수에 대해 반복합니다. Flipwells가 있는 페트리 접시를 인큐베이터에서 BSC로 옮기고 박테리아 삽입물과 함께 접시의 반대쪽에 따로 보관합니다.
  5. 박테리아 삽입물을 허용하기 위해 Flipwell의 정점(상단) 측면에서 300μL의 DMEM 배지를 꺼냅니다. FCI 스택의 상단에 약 200μL를 남겨 둡니다. 페트리 접시 뚜껑을 인서트 어셈블리 위에 놓습니다.
  6. 50-100μL의 B.subtilis 배양액을 24웰 박테리아 삽입물에 첨가합니다. 박테리아 삽입물의 외벽과 가장자리를 흘리거나 오염시키지 않도록 주의하십시오. OD600은 배양의 성장 단계를 모니터링하기 위해 복용할 수 있습니다.
  7. 멸균 겸자를 사용하여 배양액이 있는 박테리아 삽입물을 들어 올려 Flipwell 상단 내부에 조심스럽게 삽입합니다. 암을 돌려 FCI 스택의 가장자리에 걸어 놓습니다. 두 번째 멸균 겸자 세트로 스택을 잡습니다.
  8. 나머지 FCI 스택에 대해 반복합니다. 페트리 접시를 덮고 BSC 내부에서 3시간 동안 휴식을 취합니다. 인큐베이터 내부로 가져오지 마십시오.
  9. 3시간 후 멸균 겸자를 사용하여 Flipwell에서 박테리아 삽입물을 제거합니다. 나머지 인서트 어셈블리에 대해 이 과정을 반복합니다. 박테리아 삽입물을 버리십시오.
    알림: 기관의 생물학적 유해 폐기물 처리 정책과 안전 및 보건 지침에 따라 박테리아 및 박테리아 삽입물을 폐기하십시오. 박테리아 성분이나 박테리아 자체는 검사되지 않았습니다.
  10. 점막, 상피 및 면역 세포 구획의 변화를 분석하려면 막을 세척하고 이미징을 준비하십시오.
  11. Flipwell 상단에서 DMEM 미디어를 흡인합니다. 500 μL의 멸균 PBS로 세척합니다. 집게를 사용하여 페트리 접시에서 FCI 스택을 들어 올려 새 페트리 접시로 옮깁니다.
  12. 플립웰을 뒤집어 페트리 접시 테두리 위에 걸어두세요. 멤브레인을 500μL의 멸균 PBS로 세척합니다.
  13. 보관이 필요한 경우 FCI 스택을 50mL 원추형 튜브 내부의 멸균 PBS에 단기간(30분-하룻밤) 보관합니다.
    참고: 다음에 어떤 이미징 방법을 사용할 것인지, 그리고 전자 현미경과 형광 항체 라벨링 모두를 위해 멤브레인을 반으로 자르는지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.

13. 주사 전자 현미경(SEM)을 위해 Flipwell 분해

참고: SEP/박테리아 처리 후 결장 상피 세포 및 대식세포의 형태학적 변화를 조사하기 위해 막을 고정 완충액에 고정한 다음 주사 전자 현미경(SEM)을 위해 Flipwells를 분해했습니다. PFA는 고정제로 사용되었습니다. 그러나 글루타르알데히드도 사용할 수 있습니다. 선호하는 고정 완충액, 특정 탈수 단계 및 초기 고정 완충액 농도에 대해 현미경 코어에 문의하는 것이 중요합니다. 보관이 필요한 경우 멤브레인을 고정 완충액에 보관할 수 있습니다. 작업은 BSC 외부에서 수행할 수 있습니다. 이미징 코어가 멤브레인을 접착하는 경우 멤브레인을 반으로 자르고 양면을 별도로 이미지화하도록 배치할 수 있습니다.

  1. 용매 방지 마커를 사용하여 FCI 스택의 플라스틱 측면에 사용된 셀 유형에 대한 기호 코딩으로 라벨을 붙입니다. 또는 멤브레인에 점, 확인 표시 또는 x로 직접 라벨을 붙여 사용된 세포 유형에 라벨을 붙입니다.
  2. Flipwell을 분해하지 않고 50mL 원추형 튜브 안에 넣습니다. 스택을 잠길 수 있을 만큼 4% PFA를 추가합니다. 밤새 4% PFA를 보관하십시오.
    1. 4% PFA(메탄올 프리)를 만들려면 파라포름알데히드 40g을 1x PBS 800mL에 녹입니다. 0.4% PFA를 만들려면 4g의 파라포름알데히드를 800mL의 1x PBS에 용해시키거나 100mL의 4% PFA를 1x PBS에 100mL의 4% PFA를 첨가하여 1x PBS로 1:10으로 희석합니다.
  3. 더 긴 보관을 위해 PFA를 0.4%로 교환하십시오. 보관 기간과 완충액에 대해서는 현미경 코어에 문의하십시오.
  4. 플립웰을 분해하려면 양손으로 잡고 스택의 접착된 각 부분을 비틀어 떼어냅니다. 스택은 두 부분으로 분해됩니다: 한 부분에는 멤브레인이 있고 다른 부분에는 멤브레인이 없는 인서트가 됩니다. 멤브레인이 없는 인서트를 폐기하십시오.
  5. 멤브레인이 있는 인서트를 돌리고 멤브레인이 위를 향하도록 내려놓습니다. 멤브레인 가장자리에 작은 점 또는 x로 멤브레인을 표시하여 어느 쪽에 어떤 세포 유형이 있는지 알 수 있습니다.
  6. 집게로 벽으로 인서트를 잡습니다. 메스 칼날로 멤브레인을 조심스럽게 잘라내고 500μL-1mL의 0.4%-4% PFA 용액이 담긴 1.7mL 튜브 또는 작은 유리병 안에 넣습니다.
  7. 탈수 단계 및 이미징을 위해 현미경 코어에 제출합니다. 탈수 단계는 Beamer etal 7에 설명되어 있습니다.
  8. PFA 또는 기타 고정액은 조직에서 규정한 유해 폐기물 처리 정책과 건강 및 안전 지침에 따라 폐기하십시오.

14. 공초점 현미경을 위해 Flipwell을 분해하는 큰 물방울 방법

참고: 멤브레인을 염색하고 이미지화하는 새로운 방법이 만들어졌습니다. 공동 배양 인서트 스택은 50mL 원추형 튜브 내부에서 수행된 초기 고정, 투과화 및 차단 단계를 통해 손상되지 않은 상태로 유지되었습니다. 면역형광 표지 및 공초점 현미경을 사용하여 멤브레인의 양면을 이미지화했습니다. 하룻밤 배양 단계에는 새로 명명된 12웰 플레이트 방법이 사용되었고, 분해된 인서트의 바닥을 염색하기 위해 큰 액적 방법이 사용되었습니다. 컨포칼 Z-스택은 멤브레인으로 양면을 이미징하는 데 사용되었습니다. 스테인된 멤브레인은 두 개의 원형 유리 커버슬립 사이에 끼워졌고, 끼워진 어셈블리는 상업적으로 만들어진 원형 챔버의 두 금속 링 사이의 중간에 배치되어 이미지를 촬영했습니다. 다광자 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 상용 이미징 소프트웨어와 함께 사용되었습니다.

  1. 멤브레인을 세척하려면 공동 배양 인서트 스택을 50mL 원뿔형 튜브에 직접 넣고 멸균 PBS 15mL를 추가하거나 각 면을 별도로 세척합니다(아래 설명).
  2. DMEM을 흡인하고 정점 쪽에 멸균 PBS 300μL를 추가합니다. PBS를 흡인하고 페트리 접시에서 스택을 조심스럽게 제거합니다.
  3. Flipwell을 뒤집고 FCI 스택의 현재 위쪽을 향하는 RPMI에 300μL의 PBS를 추가합니다. PBS를 흡인합니다.
  4. 용매 저항성 마커를 사용하여 스택의 상단과 하단에 라벨을 붙여 어느 쪽에 어떤 세포 유형이 있는지 알 수 있습니다.
  5. Flipwell을 50mL 멸균 원추형 튜브 안에 넣습니다. 멸균 4% PFA 15mL를 초기 고정 완충액으로 10분 동안 첨가합니다. 하룻밤 배양이 필요한 경우 PBS에 0.4% PFA 15mL로 교환하고 뚜껑을 덮고 밤새 그대로 둡니다.
  6. 면역염색을 진행하려면 큰 액적 방법을 위한 벤치 공간을 만드십시오.
    10 x 14인치 플라스틱 랩을 떼어내고 모서리에 벤치에 테이프로 붙여 표면을 매끄럽게 만듭니다.
  7. 200μL 피펫을 사용하여 200μL의 PBS로 큰 물방울을 만듭니다. 인서트 어셈블리를 비틀어 인서트로 분리합니다.
  8. 용매 저항성 마커를 사용하여 멤브레인의 한쪽 가장자리 가까이에 작은 점을 배치하여 염색 및 이미징에 사용되는 세포 유형을 알 수 있습니다.
  9. 멤브레인이 있는 인서트에 여전히 잔여 접착제가 있는 경우 인서트 바닥에서 잔여 실리콘 개스킷을 제거합니다. 이는 아래 단계에서 인서트가 수직으로 유지되도록 하기 위해 수행됩니다.
  10. FCI 스택(THP-1 셀 포함)을 200μL의 큰 PBS 방울 위에 조심스럽게 배치합니다. 결장 상피 세포가 있는 윗면에 투과화 완충액 200μL를 첨가하고 10분 동안 유지합니다.
    1. 투과화 완충액을 준비하려면 PBS에 0.1% v/v Triton-X100을 사용합니다.
  11. PBS 200μL를 흡인하고 첨가합니다. 이 세탁을 2회 반복합니다. 250μL의 차단 완충액으로 새 액적을 만듭니다.
    1. 차단 완충액을 만들려면 1x PBS 5mL(최종 5% 혈청)에 250μL의 정상 염소 혈청을 첨가합니다. Triton-X100 15 μL(최종 0.3% v:v)를 추가합니다. 잘 섞고 4°C에서 1-2일 동안 보관합니다.
  12. 인서트를 차단 버퍼 위에 놓습니다. 실온에서 30분 동안 차단합니다. 정점 쪽에서 PBS를 흡인하고 인서트 상단에 200μL의 차단 완충액을 추가합니다. 이제 멤브레인의 양면이 밤새 항체 염색을 할 준비가 되었습니다.

15. 면역형광(IF) 염색

참고: 염색은 12웰 플레이트 방법을 사용하여 밤새 수행하거나 큰 액적 방법을 사용하여 벤치에서 수행됩니다.

  1. 멤브레인의 양면을 4°C에서 밤새 염색하거나 RT의 벤치에서 염색하는 데 사용할 필요한 항체를 준비합니다. PBS의 1% BSA에서 모든 항체를 1:100으로 희석합니다. 또는 제조업체의 권장 사항에 따라 염색을 최적화하여 이상적인 농도와 항체 희석 완충액을 결정하십시오.
  2. 큰 물방울 방식
    1. 벤치 위에 플라스틱 랩을 사용하여 큰 직사각형을 만들고 모서리를 테이프로 붙입니다. 플라스틱 위에 희석된 항체 200μL를 피펫팅하여 큰 물방울을 만듭니다. 인서트 멤브레인을 큰 물방울 위에 놓습니다.
    2. 인서트 상단에 200 μL의 1차 Ab를 추가합니다. RT에서 2시간 동안 배양합니다.
  3. 12웰 플레이트 방법
    1. 밤새 12웰 플레이트 방법을 사용하는 경우 삽입물 상단에 300μL의 1차 항체를 추가합니다.
    2. 12웰 플레이트의 웰에 300μL의 1차 항체를 추가합니다. 물방울 위에 있는 12웰 플레이트 웰 내부에 인서트를 놓습니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 밤새 4°C에 두십시오.
  4. 염색이 완료되면 멤브레인의 양면을 PBS로 세척합니다. 피펫과 200μL 팁을 사용하여 인서트의 바닥면을 200μL의 PBS로 3회 조심스럽게 헹굽니다. 인서트 상단의 경우 상단에 PBS 200μL를 추가하고 흡인한 다음 세척을 3회 반복하여 세척합니다.
  5. 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 2차 항체(사용된 특정 항체에 대해서는 재료 표 참조)를 준비하거나 PBS 또는 기타의 1% BSA에서 1:1000 희석합니다. 2차 항체 염색은 어둠 속에서 이루어져야 합니다. 판지 상자나 캐비닛 서랍을 사용하여 빛이 없는 환경을 조성하세요.
  6. 큰 액적 방법 또는 12웰 플레이트 방법을 사용하여 새로운 멸균 플레이트를 준비합니다. 어두운 환경에서 RT에서 2시간 동안 배양합니다. 15.4에 설명된 대로 세척합니다.

16 : 공초점 이미징을 위한 준비

  1. 멤브레인이 단계 14에 설명된 대로 아직 라벨링되지 않은 경우, 세포 유형 위치를 알기 위해 라벨링합니다. 아무 위치에나 용제성 마커로 작은 표시(점, x, 체크 무늬 등)를 배치합니다(가장자리 선호).
  2. 보관 용기에서 둥근 덮개 슬립을 조심스럽게 제거하고 벤치 표면에 부드럽게 놓습니다.
  3. PBS에서 DAPI를 1:100 희석으로 희석합니다. 물방울 디스펜서로 DAPI를 분배하려면 커버 슬립 중앙에 1-3개의 물방울을 추가합니다. 그렇지 않으면 DAPI 1-3방울을 커버 슬립 중앙에 피펫으로 넣습니다.
  4. 집게로 인서트를 잡습니다. 메스 칼날로 테두리/하단 가장자리 주위로 원을 그리며 멤브레인을 조심스럽게 잘라냅니다. 멤브레인이 벤치에 떨어지지 않도록 하십시오. 플라스틱 인서트를 벤치에 내려놓고 집게로 멤브레인을 잡고 메스 칼날로 최종 섬유를 잘라냅니다.
  5. 인서트를 DAPI 위에 놓습니다. 멤브레인 상단에 DAPI 1-3방울(1:100 희석)을 분배하여 멤브레인 양쪽에 DAPI가 있도록 합니다.
  6. 두 번째 라운드 커버 슬립을 손가락으로 들어 올립니다(PPE 착용). 커버 슬립이 매우 깨지기 쉽기 때문에 집게를 사용하지 마십시오.
  7. 두 번째 커버 슬립을 첫 번째 커버 슬립 위에 맞추고 멤브레인 위에 조심스럽게 내립니다.
  8. 용매성 마커를 사용하여 세포 유형/방향을 코딩하는 데 필요한 경우 커버 슬립 면에 조심스럽게 라벨을 붙입니다(선택 사항). 멤브레인에 라벨이 붙어 있는 경우 이 단계를 건너뜁니다.
  9. 이미징할 커버슬립의 수와 사용 가능한 금속 링의 수에 따라 상업적으로 제작된 금속 링 사이에 커버슬립을 장착하여 이미징을 위해 둥근 커버슬립을 함께 고정하거나 이미징할 때까지 어둠 속에 보관합니다.
  10. 이미지를 촬영하려면 셀 챔버의 금속 링 사이에 멤브레인이 있는 커버 슬립을 장착하고 공초점 현미경 홀더에 놓습니다. 원형 커버 슬립을 이미지화하는 데 필요할 수 있는 홀더를 확인하기 전에 공초점 현미경 코어에 문의하십시오.
  11. 이미지를 촬영할 준비가 되면 각 샌드위치를 알루미늄 호일로 싸서 시설로 가져갑니다.
  12. Z-스택 기능을 사용하여 사용된 형광단에 따라 적절한 파장을 사용하여 멤브레인의 각 면을 개별적으로 스캔합니다. 두 번째 면을 뒤집고 이미지화합니다. 커버슬립을 보관하려면 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.

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결과

장내 세균, 결장 상피 및 대식세포의 Flipwell 공동 배양의 생물학적 관련성을 결정하기 위해 우리는 대조군 DMSO와 비교하여 산화질소 9,10,11의 생산을 촉진하기 위해 아르기닌 대사 조절제인 세피압테린(SEP)으로 공동 배양을 처리했습니다. 우리는 면역형광(IF) 현미경과 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 공동 배양의 각 구성 요소에 대한 SEP 처리의 효과를 결정했습니다. 염색은 상피 마커 단백질 CK20 및 점막 단백질 MUC2의 증가로 나타난 바와 같이 SEP 처리 후 장 상피 구획에서 점액 분비의 극적인 증가를 보여주었습니다(그림 1). 우리는 또한 SEP 처리가 M1 대식세포 마커 CD80의 수준을 증가시키는 동시에 M2 대식세...

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토론

시험관 내에서 장 점막 구조를 재현하기 위해 장내 세균, 점액 생성 결장 상피 세포 및 대식세포의 층화 층으로 구성된 간단한 공동 배양 시스템을 설계했습니다. 이 다중 공동 배양 시스템을 통해 우리는 박테리아 분비체, 장 상피 및 대식세포 사이의 누화가 면역원성 재프로그래밍 및 점막 방어 메커니즘 유도에 미치는 영향을 연구할 수 있었습니다.

3D 플립웰을 만들 때 중요한 주의 사항 중 하나는 조립품을 멸균 환경에서 만든 다음 세포를 파종하기 전에 며칠 동안 UV 멸균을 해야 한다는 것입니다. 우리는 살균 과정을 완료하기 위해 기능성 UV 조명이 장착된 BSL2 캐비닛을 활용했습니다. 초기 멸균 단계 동안 멸균된 도구와 70% 에탄올이 설명된 대로 사용되었습니다. 시공 단계에서 여러 번의 시도 끝에 일관된 실리콘 접착 비드가 달성되어 재현성이 향상됩니다. 이 기술을 연습하고 추가 인서트 스택을 준비하는 것...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 저자는 이로써 법이 허용하는 최대 범위 내에서 명시적이든 묵시적이든 모든 보증을 부인합니다. 어떠한 경우에도 저자는 법령, 계약, 불법 행위 또는 기타 법적 이론에 따라 Flipwells 건설 시 도구 사용, BSL 시약, 세포주, 박테리아 배양, 혐기성 챔버의 혐기성 환경에서 Flipwell 시스템 사용으로 인해 또는 이와 관련하여 발생하는 특별, 우발적, 간접적, 징벌적, 다중 또는 결과적 손해에 대해 책임을 지지 않습니다. 이러한 책임 제한에는 여기에 명시적으로 설명되지 않은 불특정 Flipwell 사용 방식이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.

감사의 글

주 저자는 후루타 사오리 박사의 뛰어난 멘토링 기술, 장거리에서의 지속적인 지도와 지원, 환상적인 학습 기회를 촉진하는 능숙하고 지속적인 프로젝트 설계에 진심으로 감사를 표합니다. 저자는 또한 미생물학 전문 지식과 지도를 해준 Vandana Sharma 박사와 THP-1 대식세포 제조에 대해 Veani R. Fernando 박사에게 감사를 표합니다.  또한 저자는 전자 현미경 시설의 Andrew Kleinhenz 박사와 William T. Gunning 박사, ET 이미징에 대한 건설적인 제안을 해준 톨레도 대학 계측 센터의 Cassandra Zamora와 Kristin Kirschbaum에게 감사를 표합니다. 이 작업은 톨레도 대학교 보건 과학 캠퍼스, 의과 및 생명 과학 대학, 암 생물학과에서 SF에 대한 스타트업 펀드의 지원을 받았습니다. SF에 대한 오하이오 암 재검색 보조금(프로젝트 #: 5017); 의학 연구 협회(톨레도 재단, #206298) SF 상; SF에 대한 미국 암 학회 연구 학자 보조금(RSG-18-238-01-CSM); SF에 대한 국립 암 연구소 연구 보조금(R01CA248304).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4% PFA (시약 및 용액 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
10ml 혈청학적 피펫코 닝4488
12 웰 TC 플레이트, 그리고 nbsp; 코스타코 닝3513
15ml 원뿔 튜브, 스펙트라튜브알칼리 사이언티픽C2715
200 & 마이크로; l 팁 USA 사이언티픽1111-1700
24웰 인서트 - 24웰 플레이트, PET 0.4 및 마이크로용 배양 인서트; m 브랜드테크 사이언티브782710
3D 플립웰은 미리 만들어졌고, UV 멸균 처리되었으며;실험실에서 만들어
4% PFA (시약 및 용액 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
50 mM 세피아프테린 스톡 (SEP, 시약 및 용액 조리법 참조)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
50ml 원뿔관그레이너 바이오-원227261
5ml 혈청학적 피펫코 닝4487
70-95% 에탄올(에틸 알코올)디콘 랩스04-355-151
알루미늄 호일피셔 사이언티브01-213-100
동물 먹이 주사기, 20게이지 1.5인치 길이, 단회용 피셔 사이언티브01-208-87
항체 희석 버퍼 (시약 및 용액의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
아토플루어 세포 챔버 서모피셔 사이언티픽A7816
오토클레이브 테이프피셔 사이언티브15-901-111
글리세롤 스톡 내 바실루스 서브틸리스 wt (3A1T) 균주박균 유전 자원 센터 (https:// bgsc. org/
바이오그립 핑크 니트릴 파우더 프리 라텍스 프리 장갑최고 품질 제조P2810
차단 버퍼 (시약과 용액 - PBS의 10% 정상 염소 혈청 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
차단 버퍼 (Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
브라이트필드 현미경(니콘 또는 동등) 이클립스 Ts2니콘TS2
카코-2 세포ATCCHTB-37
세포 배양 인큐베이터, 37° C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)에펜도르프6734010015
원심분리기 (에펜도르프, 원심분리기 5804/5804 R 또는 동등한 제품에펜도르프22622501
원심분리관 50ml 스펙트러튜브알칼리 사이언티픽C2750
12웰 플레이트, PET, 0.4 및 마이크로용 배양 인서트; M, 불임브랜드텍 사이언티픽, BRAND 인서트 2in1, 바이오 인증782730
DAPI 벡타쉴드 장착 매체벡터 연구소H-1000
깊은 페트리 접시 바닥, 100 x 25mm 딥 폴리스티렌 쌓을 수 있는 페트리 접시, 멸균  USA 사이언티픽8609-0625
드럼몬드 피펫 에이드 XP드럼몬드와 nbsp;4-000-101
50ml 원뿔 튜브용 스윙 버킷 로터가 장착된 Eppendorf 5804 원심분리기에펜도르프22622501
핀셋, 스테인리스 스틸, 멸균 고용멸균, 2세트VWR82027-438
겸자, 스테인리스 스틸, 멸균 고용멸균, 2세트, 검체 겸자VWR82027-438
유리병 500ml코닝 4980-500
헤마세포계 (커버 슬립이 있는 노이바우어)써모피셔 사이언티브50-312-90
HT-29-MTX-E12 세포밀리포어 시그마12040401
면역펜 (선택 사항)피셔 사이언티브4021761EA
케블라 기반 또는 기타 자르기 방지 장갑 (선택 사항)철물점 또는 아마존
실험실 테이프 또는 배송 테이프피셔 사이언티픽  159015R
층류 후드 1300 시리즈 A2 BSC 클래스 II서모피셔 사이언티픽1375
UV 라이트가 있는 층류 후드 SterilGARD베이커 컴퍼니SG403A-HE
마커 용매 방지VWR52877-310 또는 95042-566
Caco-2 세포용 배지(DMEM 고포당 기반, Reagents and Solutions의 레시피 참조)in 에서 설명; 문자 메시지
HT-29 세포용 배지(DMEM 고포도당, Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
THP-1 세포용 배지(RPMI, Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7 ml, 멸균  알칼리 사이언티픽C3017-ST
마이크로 원심분리기 튜브써모피셔3451
밀러 LB 매체 (시약 및 용액의 레시피 참조)시그마-올드리치그리고 nbsp; L3522
니들 노즈 플라이어, 2세트철물점 또는 아마존
니트릴 파우더 프리 라텍스 프리 장갑 Aurelia Amazing중과학92885
페트리 접시 뚜껑, 멸균 팔콘 페트리 접시 멸균 100x15 mm 스타일코닝 주식회사351029
포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) (100 ng/μ l, Reagents and Solutions의 레시피 참조) 인비보젠TLRL-pma
피펫 팁 (10 & 마이크로; l, 200 & micro; l, 1000 & micro; l) PurePoint 또는 이에 상응하는 기관알칼리 과학  ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
비닐 랩식료품점
순수성 작업 콜라겐제 용액(100 및 마이크로; g/mL)고급 바이오매트릭스5005-100ML
라운드 커버 슬립 #1 1온스 (코닝 플로트 글라스 또는 피셔브랜드)코닝 또는 피셔브랜드50143822 또는 12-546-2 25CIR-2
메스 칼날, 멸균, 일회용 모펙 또는 깃털 #10AJ136 또는 2975#10
세피아프테린 (SEP, 100 및 마이크로; M, Reagents and Solution의 레시피 참조)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
진동 인큐베이터는 220rpm 37°로 설정되었습니다; C에펜도르프 뉴브런즈윅 사이언티픽M12990080
실리콘 접착제 록타이트 클리어 실리콘 IDH 또는 3M 마린 등급 실리콘 밀봉제, 코끝이 있는 클리어록타이트 또는 3M1745658 아니면 PN08019
싱글 채널 피펫 Eppendorf Research Plus, 200 및 마이크로; l에펜도르프
단일 채널 피펫(10 및 마이크로; l, 200 & micro; l, 1000 & micro; l)에펜도르프2231001122
분광광도계 나노드롭원C써모피셔 사이언티브13-400-519
멸균된 탈이온수   그리고 nbsp;
칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충 세린(PBS)피셔 사이언티브그리고 nbsp; BSS-PBS-1X6
주사기 3ml 또는 루어록 팁 5mlBD309585 아니면 309603
THP-1 세포ATCCTIB-202
전송 피펫, 멸균피셔브랜드13-711-20
트리톤 X-100밀리포어 시그마X100
트리판 블루 용액VWR97063-702
트립신-EDTA 0.25%써모피셔 사이언티브25200-056
LintGuard 안티-스탯 폴리쉴드로 Kimwipes Professional을 닦아줍니다킴벌리-클라크34120
<강>1차 항체: 
반인간 CD163앱캠156769
반인간 CD68노부스 바이오로지컬스NB100-683-0.1 mg
반인간 CD80, E3Q9V세포 신호 전달 기술15416
반인간 CK20 라이프 테크놀로지PA5-82875
반인간 MUC2 (996/1)서모피셔MA5-12345
<강>2차 항체:
Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG (CD80 및 CK20용)서모피셔A11008
Alexa Fluor 594 염소 항생쥐 IgG (MUC2 및 CD68 또는 CD163용)서모피셔A11005
<강>시약 및 용액:  그리고 nbsp;
<강>카코-2 중형:
DMEM 혈당 고(4.5g/L)과 1% (v:v) GlutaMax 써모피셔 사이언티브35050061
FBS 10% (v:v) 열 비활성화시그마F2242-500ML
비필수 아미노산 1% 카코-2 매개체써모피셔 사이언티브11140076
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
<스트롱>HT-29-MTX 미디엄
DMEM 혈당 고(4.5g/L)과 1% (v:v) GlutaMax 써모피셔 사이언티브35050061
FBS 10% (v:v) 열 비활성화시그마F2242-500ML
HEPES (최종 농도 10 mM)써모피셔 사이언티브15630080
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
<강>THP-1 중간:
FBS (10% v:v) 열로 불활성화된 태아 소 혈청시그마 F2242-500ML
포도당 (최종 농도 4.5 g/L)써모피셔 사이언티브A249001
글루타맥스 1% (v:v)  최종 농도 2 mM써모피셔 사이언티브35050061
HEPES (최종 농도 10 mM)써모피셔 사이언티브15630080
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI)-1640 중형써모피셔 사이언티브11875119
피루브산나트륨 (최종 농도 1 mM)써모피셔 사이언티브11360070
<강>순수 콜라게나제 작용 용액 (1:30 100 및 마이크로 희석; g/ml):
퓨레콜 3 mg/ml 1:30에서 100 및 미세 용량; g/ml 고급 바이오매트릭스5005-100ML
멸균된 탈이온수
<강>L-세피아프테린 스톡 용액 (50 mM):
L-세피아프테린 (SEP)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
<스트롱>포르볼-마이리스테이트 아세테이트 스톡 용액(PMA, 5 mg/mL)인비보젠TLRL-pma
BSA 1% 소 혈청 알부민 시그마-올드리치5470
DMSO 시그마 D2650
밀러 라인배커시그마-올드리치그리고 nbsp; L3522
2차 항체와 같은 종의 정상 혈청시그마 NS02L-1ML
파라포름알데히드시그마-올드리치441244

참고문헌

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
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