Method Article

박테리아, 장 및 면역 세포의 독성 및 면역 조절 요법을 위한 비동기 시스템 개발을 위한 3D 플립웰 엔지니어링

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 3D Flipwell 엔지니어링 및 활용을 안내하는 주요 단계와 함께 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 공동 배양 인서트 스택을 조립하고 장 점막 환경을 모델링하기 위해 장내 세균, 장 상피 및 대식세포의 층화 층을 공동 배양하는 데 활용하는 방법을 설명하고 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역 세포 분극화 및 장 점막 항상성에서 박테리아 분비체의 역할을 연구하기 위해 우리는 상업적으로 이용 가능한 인서트를 연속 스택 형식으로 사용하여 3차원 공동 배양 모델을 개발했습니다. 우리는 이 시스템을 3D Flipwells라고 부르고 박테리아, 결장 상피 및 면역 세포를 층층에서 성공적으로 공동 배양하여 장 점막 미세 환경을 요약했습니다. 이 공동 배양 시스템은 막의 한쪽에 결장 상피 세포를 파종하고 다른 쪽에 미분화 비부착 단핵구를 파종할 수 있게 하여 전분화된 대식세포를 분리하고 재도배할 필요 없이 단일 공동 배양 내에서 결장 상피 분극화, 점액 형성, 단핵구-대식세포 분화 및 분극화의 동시 진행을 허용합니다. 이 시스템은 구성하기 쉽고, 쉽게 구할 수 있는 몇 가지 재료와 도구만 필요합니다. 우리는 산화질소 합성효소(NOS)의 보조 인자인 BH4 (테트라하이드로비옵테린)의 내인성 전구체인 세피압테린(SEP)에 대한 공동 배양 성분의 반응을 분석하여 그 유용성을 테스트했습니다. 우리는 3D Flipwell의 SEP 처리가 장내 세균에 의한 생물막 형성, 결장 상피에 의한 점액 생성 및 대식세포의 전면역원성 분극화를 유도한다는 것을 입증했습니다. 이는 SEP가 서로 다른 세포 구성 요소 간의 누화를 통해 점막 방어 메커니즘의 활성화를 촉발했음을 나타냅니다. 면역 세포 재프로그래밍으로 이어지는 점막 통신의 역할을 조사하고 새로운 면역 조절 요법을 스크리닝하기 위한 이 공동 배양 시스템의 유용성을 평가하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역 세포-장내 미생물 군집 누화는 다양한 질병 치료의 효능에 큰 영향을 미칩니다. 이러한 누화는 숙주 대사 이상, 식이 변화, 질병 발현 및 약리학적 치료를 포함하되 이에 국한되지 않는 외부 자극에 의해 현저하게 변형됩니다. 이러한 변화는 미생물총합 구성의 불균형을 초래할 수 있으며, 이를 세균불균형이라고 합니다 1,2,3.

장내 미생물과 숙주 면역 세포 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 장 점막 환경을 요약하기 위해 여러 그룹에서 정교한 공동 배양 시스템이 개발되었습니다. Kim et al.4 에 의해 개발된 Gut-on-Chip 시스템에서 특수 흡수성 기질5을 사용하는 보다 복잡한 어셈블리에 이르기까지, 이러한 공동 배양 시스템은 구축이 간단하지 않으며 공동 배양 기질에 의한 흡수로 인해 분비된 성분의 전체 스펙트럼을 유지할 수 없습니다. 따라서 Noel et al. 따라서 상대적으로 제작하기 쉬운 장 점막을 모델링하기 위....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D 플립웰 엔지니어링

  1. 모든 작업은 세포 배양 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다. 모든 소모품을 캐비닛 안에 넣으십시오.
  2. 페트리 접시 덮개를 열고 따로 보관하십시오. 보호 케이스에서 메스 칼날을 열고 페트리 접시 바닥 가장자리에 놓습니다. 무균성을 보장합니다.
    주의 : 메스 칼날을 조심스럽게 다루어야 합니다. 필요한 경우 절단 방지 섬유 강화 장갑을 사용하여 손을 보호하십시오.
  3. 12웰 상업용 인서트의 멸균 보호 포장을 엽니다. 무균성을 보장합니다. 멸균 핀셋 세트를 가져 가십시오. 인서트를 부드럽게 잡고 포장에서 꺼냅니다.
  4. 바닥이 위를 향하도록 인서트를 잡습니다. 다른 손으로 멸균 메스 칼날을 잡고 인서트까지 가져옵니다.
  5. C자형 동작을 사용하여 가장자리의 멤브레인을 뚫고 메스 칼날을 인서트 바닥 주위로 부드럽게 밀어 플라스틱 벽에 가깝게 유지합니다.
  6. PET 멤브레인을 잘라내고 두 번째 핀셋 세트를 사용하여 멤브레인을 제거합니다. 멤브레인을 버리십시오.
  7. 메스 칼날을 사용하여 흰색 멤브레인 부스러기를 긁어 인서트의 가장자리와 가장자리를 청소합니다. 새로 준비된 인서트를 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

장내 세균, 결장 상피 및 대식세포의 Flipwell 공동 배양의 생물학적 관련성을 결정하기 위해 우리는 대조군 DMSO와 비교하여 산화질소 9,10,11의 생산을 촉진하기 위해 아르기닌 대사 조절제인 세피압테린(SEP)으로 공동 배양을 처리했습니다. 우리는 면역형광(IF) 현미경과 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 공동 배양의 각 구성 요소에 대한 SEP 처리의 효과를 결정했습니다. 염색은 상피 마커 단백질 CK20 및 점막 단백질 MUC2의 증가로 나타난 바와 같이 SEP 처리 후 장 상피 구획에서 점액 분비의 극적인 증가를 보여주었습니다(그림 1). 우리는 또한 SEP 처리가 M1 대식세포 마커 CD80의 수준을 증가시키는 동시에 M2 대식세.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시험관 내에서 장 점막 구조를 재현하기 위해 장내 세균, 점액 생성 결장 상피 세포 및 대식세포의 층화 층으로 구성된 간단한 공동 배양 시스템을 설계했습니다. 이 다중 공동 배양 시스템을 통해 우리는 박테리아 분비체, 장 상피 및 대식세포 사이의 누화가 면역원성 재프로그래밍 및 점막 방어 메커니즘 유도에 미치는 영향을 연구할 수 있었습니다.

3D 플립웰을 만들 때 중요한 주의 사항 중 하나는 조립품을 멸균 환경에서 만든 다음 세포를 파종하기 전에 며칠 동안 UV 멸균을 해야 한다는 것입니다. 우리는 살균 과정을 완료하기 위해 기능성 UV 조명이 장착된 BSL2 캐비닛을 활용했습니다. 초기 멸균 단계 동안 멸균된 도구와 70% 에탄올이 설명된 대로 사용되었습니다. 시공 단계에서 여러 번의 시도 끝에 일관된 실리콘 접착 비드가 달성되어 재현성이 향상됩니다. 이 기술을 연습하고 추가 인서트 스택을 준비하는 것.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 저자는 이로써 법이 허용하는 최대 범위 내에서 명시적이든 묵시적이든 모든 보증을 부인합니다. 어떠한 경우에도 저자는 법령, 계약, 불법 행위 또는 기타 법적 이론에 따라 Flipwells 건설 시 도구 사용, BSL 시약, 세포주, 박테리아 배양, 혐기성 챔버의 혐기성 환경에서 Flipwell 시스템 사용으로 인해 또는 이와 관련하여 발생하는 특별, 우발적, 간접적, 징벌적, 다중 또는 결과적 손해에 대해 책임을 지지 않습니다. 이러한 책임 제한에는 여기에 명시적으로 설명되지 않은 불특정 Flipwell 사용 방식이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주 저자는 후루타 사오리 박사의 뛰어난 멘토링 기술, 장거리에서의 지속적인 지도와 지원, 환상적인 학습 기회를 촉진하는 능숙하고 지속적인 프로젝트 설계에 진심으로 감사를 표합니다. 저자는 또한 미생물학 전문 지식과 지도를 해준 Vandana Sharma 박사와 THP-1 대식세포 제조에 대해 Veani R. Fernando 박사에게 감사를 표합니다.  또한 저자는 전자 현미경 시설의 Andrew Kleinhenz 박사와 William T. Gunning 박사, ET 이미징에 대한 건설적인 제안을 해준 톨레도 대학 계측 센터의 Cassandra Zamora와 Kristin Kirschbaum에게 감사를 표합니다. 이 작업은 톨레도 대학교 보건 과학 캠퍼스, 의과 및 생명 과학 대학, 암 생물학과에서 SF에 대한 스타트업 펀드의 지원을 받았습니다. SF에 대한 오하이오 암 재검색 보조금(프로젝트 #: 5017); 의학 연구 협회(톨레도 재단, #206298) SF 상; SF에 대한 미국 암 학회 연구 학자 보조금(RSG-18-238-01-CSM); SF에 대한 국립 암 연구소 연구 보조금(R01CA248304).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% PFA (시약 및 용액 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
10ml 혈청학적 피펫코 닝4488
12 웰 TC 플레이트, 그리고 nbsp; 코스타코 닝3513
15ml 원뿔 튜브, 스펙트라튜브알칼리 사이언티픽C2715
200 & 마이크로; l 팁 USA 사이언티픽1111-1700
24웰 인서트 - 24웰 플레이트, PET 0.4 및 마이크로용 배양 인서트; m 브랜드테크 사이언티브782710
3D 플립웰은 미리 만들어졌고, UV 멸균 처리되었으며;실험실에서 만들어
4% PFA (시약 및 용액 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
50 mM 세피아프테린 스톡 (SEP, 시약 및 용액 조리법 참조)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
50ml 원뿔관그레이너 바이오-원227261
5ml 혈청학적 피펫코 닝4487
70-95% 에탄올(에틸 알코올)디콘 랩스04-355-151
알루미늄 호일피셔 사이언티브01-213-100
동물 먹이 주사기, 20게이지 1.5인치 길이, 단회용 피셔 사이언티브01-208-87
항체 희석 버퍼 (시약 및 용액의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
아토플루어 세포 챔버 서모피셔 사이언티픽A7816
오토클레이브 테이프피셔 사이언티브15-901-111
글리세롤 스톡 내 바실루스 서브틸리스 wt (3A1T) 균주박균 유전 자원 센터 (https:// bgsc. org/
바이오그립 핑크 니트릴 파우더 프리 라텍스 프리 장갑최고 품질 제조P2810
차단 버퍼 (시약과 용액 - PBS의 10% 정상 염소 혈청 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
차단 버퍼 (Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
브라이트필드 현미경(니콘 또는 동등) 이클립스 Ts2니콘TS2
카코-2 세포ATCCHTB-37
세포 배양 인큐베이터, 37° C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)에펜도르프6734010015
원심분리기 (에펜도르프, 원심분리기 5804/5804 R 또는 동등한 제품에펜도르프22622501
원심분리관 50ml 스펙트러튜브알칼리 사이언티픽C2750
12웰 플레이트, PET, 0.4 및 마이크로용 배양 인서트; M, 불임브랜드텍 사이언티픽, BRAND 인서트 2in1, 바이오 인증782730
DAPI 벡타쉴드 장착 매체벡터 연구소H-1000
깊은 페트리 접시 바닥, 100 x 25mm 딥 폴리스티렌 쌓을 수 있는 페트리 접시, 멸균  USA 사이언티픽8609-0625
드럼몬드 피펫 에이드 XP드럼몬드와 nbsp;4-000-101
50ml 원뿔 튜브용 스윙 버킷 로터가 장착된 Eppendorf 5804 원심분리기에펜도르프22622501
핀셋, 스테인리스 스틸, 멸균 고용멸균, 2세트VWR82027-438
겸자, 스테인리스 스틸, 멸균 고용멸균, 2세트, 검체 겸자VWR82027-438
유리병 500ml코닝 4980-500
헤마세포계 (커버 슬립이 있는 노이바우어)써모피셔 사이언티브50-312-90
HT-29-MTX-E12 세포밀리포어 시그마12040401
면역펜 (선택 사항)피셔 사이언티브4021761EA
케블라 기반 또는 기타 자르기 방지 장갑 (선택 사항)철물점 또는 아마존
실험실 테이프 또는 배송 테이프피셔 사이언티픽  159015R
층류 후드 1300 시리즈 A2 BSC 클래스 II서모피셔 사이언티픽1375
UV 라이트가 있는 층류 후드 SterilGARD베이커 컴퍼니SG403A-HE
마커 용매 방지VWR52877-310 또는 95042-566
Caco-2 세포용 배지(DMEM 고포당 기반, Reagents and Solutions의 레시피 참조)in 에서 설명; 문자 메시지
HT-29 세포용 배지(DMEM 고포도당, Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
THP-1 세포용 배지(RPMI, Reagents and Solutions의 레시피 참조)본문에 설명되어 있습니다
마이크로 원심분리기 튜브, 1.7 ml, 멸균  알칼리 사이언티픽C3017-ST
마이크로 원심분리기 튜브써모피셔3451
밀러 LB 매체 (시약 및 용액의 레시피 참조)시그마-올드리치그리고 nbsp; L3522
니들 노즈 플라이어, 2세트철물점 또는 아마존
니트릴 파우더 프리 라텍스 프리 장갑 Aurelia Amazing중과학92885
페트리 접시 뚜껑, 멸균 팔콘 페트리 접시 멸균 100x15 mm 스타일코닝 주식회사351029
포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) (100 ng/μ l, Reagents and Solutions의 레시피 참조) 인비보젠TLRL-pma
피펫 팁 (10 & 마이크로; l, 200 & micro; l, 1000 & micro; l) PurePoint 또는 이에 상응하는 기관알칼리 과학  ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
비닐 랩식료품점
순수성 작업 콜라겐제 용액(100 및 마이크로; g/mL)고급 바이오매트릭스5005-100ML
라운드 커버 슬립 #1 1온스 (코닝 플로트 글라스 또는 피셔브랜드)코닝 또는 피셔브랜드50143822 또는 12-546-2 25CIR-2
메스 칼날, 멸균, 일회용 모펙 또는 깃털 #10AJ136 또는 2975#10
세피아프테린 (SEP, 100 및 마이크로; M, Reagents and Solution의 레시피 참조)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
진동 인큐베이터는 220rpm 37°로 설정되었습니다; C에펜도르프 뉴브런즈윅 사이언티픽M12990080
실리콘 접착제 록타이트 클리어 실리콘 IDH 또는 3M 마린 등급 실리콘 밀봉제, 코끝이 있는 클리어록타이트 또는 3M1745658 아니면 PN08019
싱글 채널 피펫 Eppendorf Research Plus, 200 및 마이크로; l에펜도르프
단일 채널 피펫(10 및 마이크로; l, 200 & micro; l, 1000 & micro; l)에펜도르프2231001122
분광광도계 나노드롭원C써모피셔 사이언티브13-400-519
멸균된 탈이온수   그리고 nbsp;
칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충 세린(PBS)피셔 사이언티브그리고 nbsp; BSS-PBS-1X6
주사기 3ml 또는 루어록 팁 5mlBD309585 아니면 309603
THP-1 세포ATCCTIB-202
전송 피펫, 멸균피셔브랜드13-711-20
트리톤 X-100밀리포어 시그마X100
트리판 블루 용액VWR97063-702
트립신-EDTA 0.25%써모피셔 사이언티브25200-056
LintGuard 안티-스탯 폴리쉴드로 Kimwipes Professional을 닦아줍니다킴벌리-클라크34120
<강>1차 항체: 
반인간 CD163앱캠156769
반인간 CD68노부스 바이오로지컬스NB100-683-0.1 mg
반인간 CD80, E3Q9V세포 신호 전달 기술15416
반인간 CK20 라이프 테크놀로지PA5-82875
반인간 MUC2 (996/1)서모피셔MA5-12345
<강>2차 항체:
Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG (CD80 및 CK20용)서모피셔A11008
Alexa Fluor 594 염소 항생쥐 IgG (MUC2 및 CD68 또는 CD163용)서모피셔A11005
<강>시약 및 용액:  그리고 nbsp;
<강>카코-2 중형:
DMEM 혈당 고(4.5g/L)과 1% (v:v) GlutaMax 써모피셔 사이언티브35050061
FBS 10% (v:v) 열 비활성화시그마F2242-500ML
비필수 아미노산 1% 카코-2 매개체써모피셔 사이언티브11140076
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
<스트롱>HT-29-MTX 미디엄
DMEM 혈당 고(4.5g/L)과 1% (v:v) GlutaMax 써모피셔 사이언티브35050061
FBS 10% (v:v) 열 비활성화시그마F2242-500ML
HEPES (최종 농도 10 mM)써모피셔 사이언티브15630080
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
<강>THP-1 중간:
FBS (10% v:v) 열로 불활성화된 태아 소 혈청시그마 F2242-500ML
포도당 (최종 농도 4.5 g/L)써모피셔 사이언티브A249001
글루타맥스 1% (v:v)  최종 농도 2 mM써모피셔 사이언티브35050061
HEPES (최종 농도 10 mM)써모피셔 사이언티브15630080
펜 연쇄상구균 1% (v:v)시그마F2242-500ML
로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI)-1640 중형써모피셔 사이언티브11875119
피루브산나트륨 (최종 농도 1 mM)써모피셔 사이언티브11360070
<강>순수 콜라게나제 작용 용액 (1:30 100 및 마이크로 희석; g/ml):
퓨레콜 3 mg/ml 1:30에서 100 및 미세 용량; g/ml 고급 바이오매트릭스5005-100ML
멸균된 탈이온수
<강>L-세피아프테린 스톡 용액 (50 mM):
L-세피아프테린 (SEP)경력 허난화학 주식회사CAS#: 17094-01-8
<스트롱>포르볼-마이리스테이트 아세테이트 스톡 용액(PMA, 5 mg/mL)인비보젠TLRL-pma
BSA 1% 소 혈청 알부민 시그마-올드리치5470
DMSO 시그마 D2650
밀러 라인배커시그마-올드리치그리고 nbsp; L3522
2차 항체와 같은 종의 정상 혈청시그마 NS02L-1ML
파라포름알데히드시그마-올드리치441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

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