방법 논문

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

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DOI:

10.3791/68704

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2025년 8월 26일

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

이 논문에서

요약

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

초록

녹아웃 마우스를 만드는 방법은 일반적으로 (1) 기증자 암컷으로부터 배아 수집, (2) 체외에서 접합체에 유전자 구조물을 미세 주입, (3) 유사 임신 암컷의 난관으로 외과적으로 이식하는 세 가지 주요 단계를 포함합니다. 이 과정에는 기증자 암컷뿐만 아니라 정관 수술을 받은 수컷과 가짜 임신한 암컷도 포함되기 때문에 상당한 수의 동물이 필요합니다. 더욱이, 마우스 접합체의 세포질이나 전핵에 미세주입하면 바늘 막힘, 높은 탄력성으로 인한 막 투과성 문제, 배아 사멸 가능성과 같은 문제가 발생합니다. Nepa21과 같은 고급 전기천공기의 개발은 난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD)으로 알려진 방법을 통해 단일 단계에서 표적 유전자 녹아웃을 가진 마우스를 생성할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이 기술은 임신 후 0.7일에 CRISPR-Cas 성분(Cas9 단백질 및 가이드 RNA)을 임신한 여성의 난관에 미세 주입한 다음 생 체 내 전기천공을 통해 이러한 성분을 접합체에 직접 전달하는 것입니다. I-GONAD 절차에 따라 임신한 마우스는 표적 유전자 녹아웃이 있는 새끼를 낳고 출산합니다. 이 기사에서는 마우스에서 I-GONAD 방법을 구현하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공하여 기존 녹아웃 마우스 생성 기술에 대한 보다 효율적이고 접근 가능한 대안을 제공합니다.

서론

질병의 유전적 기초를 이해하는 것은 질병의 병인과 병인의 기초가 되는 분자 메커니즘을 식별하는 데 중요합니다. 이 연구의 핵심 단계는 인간 질병을 시뮬레이션하는 표적 유전자 녹아웃을 갖춘 동물 모델을 개발하는 것입니다. 생쥐는 인간과의 일반적인 게놈 유사성, 작은 크기, 짧은 수명 및 높은 번식력으로 인해 이러한 연구에 특히 가치가 있습니다. 마우스 모델은 기초 연구와 전임상 테스트 모두에 중요합니다1.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 녹아웃 마우스를 만들기 위해 연구자들은 일반적으로 가이드 RNA와 Cas9 뉴클레아제의 복합체를 접합체에 주입하여 표적 DNA에 이중 가닥 절단을 일으켜 세포의 복구 시스템을 활성화하여 절단 부위에 돌연변이를 일으킵니다 1,2. 접합체에 대한 미세 주입은 이러한 목적을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 이 방법에는 기증자 암컷으로부터 배아를 분리하고, 유전자 구조물을 접합체에 미세 주입하고, 외과적으로 가짜 임신 암컷의 난관으로 이식하는 등 몇 가지 단계가 필요합니다. 결과적으로 기증자 암컷, 정관 수술을 받은 수컷, 가짜 임신 암컷을 포함하여 많은 수의 동물을 유지해야 합니다. 또한 접합체를 분리하려면 기증자 암컷의 안락사가 필요합니다. 따라서 3R(Replacement, Reduction, Refinement)3의 원칙에 따라 동물 사용을 최소화하는 프로토콜이 바람직합니다.

Nepa21 시스템의 사용과 같은 전기천공 기술의 발전은 난관 핵산 전달을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD)4으로 알려진 기술을 사용하여 단일 단계에서 표적 유전자 녹아웃 마우스를 생성할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. Super Electroporator NEPA21 Type II는 4단계 다중 펄스 전기천공 시스템을 사용하여 높은 배아 생존력을 유지하면서 높은 전기천공 효율을 보장합니다. I-GONAD는 임신 후 0.7일 후에 CRISPR-Cas 성분(Cas9 단백질(500-600ng/μl) 및 가이드 RNA(80-100ng/μl))을 임신한 쥐의 난관에 미세 주입한 후 생체 내 전기천공을 통해 이러한 성분을 접합체에 직접 전달하는 것을 포함합니다5. I-GONAD 절차 후, 임신한 마우스는 표적 유전자 녹아웃 6,7,8을 가진 새끼를 낳습니다. 이 방법의 효능은 원하는 표적에 따라 다르지만 표준 미세 주입 기반 기술(약 50%)과 비슷합니다9,10. 또한 I-GONAD는 잠재적으로 다른 종의 게놈 편집에 적용될 수 있습니다.

이 기사에서는 녹아웃 마우스를 생성하기 위해 I-GONAD 방법을 구현하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 예를 들어, 마우스 염색체 6의 ROSA26 게놈 유전자좌를 표적으로 삼아 그 효과가 입증되었습니다. 이 유전자좌는 후속 번역 없이 구성적 전사를 거치기 때문에 선택되었습니다. 따라서 이 유전자좌에 돌연변이를 도입하는 것은 결과 새끼의 건강에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 낮습니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 상트페테르부르크 주립대학교 동물 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 131-03-5, 2022년 10월 11일). 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용 가이드에 설명된 지침을 엄격히 준수했습니다. 일반적인 실험실 근친 교배 계통 CD1 마우스는 러시아 과학 아카데미(IPAC RAS)의 생리학적 활성 화합물 연구소의 집단 사용 센터에서 얻었습니다. 생후 2-3개월(평균 체중 27-30g)의 암컷 CD1 마우스를 2.5-4개월(평균 체중 35-37g)의 수컷 CD1 마우스와 짝짓기를 위해 사용하였다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 설계 및 형질감염 준비

  1. CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design 또는 CRISPOR와 같은 전산 분석 도구를 사용하여 선택한 관심 유전자를 표적으로 하는 잠재적인 sgRNA 서열을 식별합니다.
    참고: 소프트웨어는 전체 유전자에 걸쳐 잠재적인 sgRNA 서열을 식별할 수 있으며 출력에서 여러 변이를 제안합니다. 이러한 도구는 가장 최적의 sgRNA 옵션을 제안하고 필요한 경우 사용자가 식별된 모든 변이 중에서 선택할 수 있도록 합니다. 선택할 때 다음 기준을 고려하십시오.
    1. 엑손 근접성: 원하는 돌연변이 지점에 최대한 가까운 엑손에 위치한 서열을 선택합니다. 더 나은 결과를 얻으려면 대체 스플라이스 이소형을 고려하고 가장 많은 이소형에 존재하는 표적 서열을 선택하십시오. 정확한 엑손 선택을 위해 게놈 브라우저(예: Ensembl)를 고려하십시오.
    2. 표적 이탈 고려 사항: 도구의 점수 시스템을 사용하여 잠재적인 표적 이탈 효과를 분석하고 예측된 표적 이탈 활동이 가장 낮은 시퀀스를 선택합니다.
      참고: CHOPCHOP 또는 Synthego와 같은 계산 도구는 엑손 근접 및 오프 타겟 효과를 평가하는 데 매우 효과적이며 정확한 게놈 편집을 위한 최적의 sgRNA 서열을 식별하는 데 도움이 됩니다. 가이드 RNA를 설계할 때 사용 중인 마우스 계통에서 관심 유전자의 특정 서열을 고려하는 것이 중요합니다. 일부 마우스 계통(예: C57Bl, CBA, C3H)의 경우 전체 게놈 서열을 사용할 수 있습니다. 이러한 데이터를 사용할 수 없는 경우, 계획된 편집 영역에서 표적 유전자의 예비 시퀀싱을 수행하는 것이 바람직할 수 있습니다. 다형성으로 인해 발생하는 가이드 RNA의 단일 불일치는 편집 효율성을 저하시킬 수 있습니다. ROSA 26 마우스 게놈 유전자좌는 sgRNA 서열인 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAGA-3'로 표적화되었습니다.
  2. 표 1에 설명된 대로 sgRNA 템플릿 PCR 증폭을 위한 프라이머 세트를 주문합니다.
    참고: gRNA는 sgRNA 또는 crRNA:tracrRNA 듀플렉스로 다른 곳에서 주문할 수 있습니다.
  3. 선형 dsDNA 템플릿을 생성합니다.
    1. 표 1에 표시된 대로 마스터 믹스를 준비합니다. 마지막에 중합효소를 첨가하고 안정성을 유지하기 위해 마스터 믹스를 얼음 위에 보관합니다.
    2. 다음 조건에서 PCR을 실행합니다. 초기 변성: 95°C에서 30초; 30 사이클: 95 °C에서 20 초 (변성), 55 °C에서 20 초 (어닐링), 72 °C에서 15 초 (확장); 최종 연신율: 72°C에서 2분; 4°C에서 유지합니다.
  4. 추가 체 외 전사(IVT) 반응에 PCR 반응 혼합물을 사용합니다.
    1. 표 2에 표시된 대로 IVT 마스터 믹스를 준비하고 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다. 일관된 온도 제어를 위해 열순환기를 사용하십시오.
    2. 2μL의 DNase I을 첨가하고 37°C에서 30분 더 배양하여 DNA 주형을 제거합니다.
    3. 반응 혼합물을 75°C에서 5분 동안 배양하여 DNase I을 비활성화합니다.
    4. 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIZOL 시약을 사용하여 RNA를 정제합니다.
      참고: TRIZOL 시약 및 DNAse1, 그 용액 또는 부산물의 폐기는 지정된 화학 폐기물 용기에 넣어야 합니다.
    5. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다(한 반응의 일반적인 수율은 3-5μg). A260/A280 및 A260/A230 비율을 확인하십시오. A260/A280은 2.0 이상이어야 하며 A260/A230 비율도 2.0 이상이어야 합니다(단백질이나 유기 용매에 의한 오염이 없음을 의미). sgRNA는 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
  5. 형질감염을 위한 RNP 혼합물 준비
    1. 형질감염 혼합물은 Cas9 단백질과 sgRNA의 혼합물인 RNP 복합체로 구성됩니다. RNP 믹스를 준비하려면 다음 단계를 따르십시오.
    2. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 1M Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 100mM로 희석하고 기공 크기가 0.022μM인 주사기 필터를 사용하여 여과하고 10μL 부분으로 분취한 다음 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
    3. 뉴클레아제가 없는 튜브에서 최종 농도의 다음 성분의 형질감염 혼합물을 준비합니다: 500ng/μL spCas9 뉴클레아제, 80ng/μL sgRNA, DEPC 처리수로 희석된 10mM Tris-HCl.
      참고: 프로토콜의 적절한 효율성을 보장하려면 고농도의 RNP 혼합 성분이 필요합니다.
    4. 형질감염 혼합물을 37°C에서 10분 동안 배양하여 RNP 복합체를 형성합니다.
    5. 혼합물을 단일 I-GONAD 세션에 적합한 소량(2μL)으로 분취합니다.
    6. I-GONAD 세션 동안 분취량을 4°C로 유지합니다. 혼합물은 안정성을 유지하기 위해 각 I-GONAD 전기천공 세션을 위해 신선하게 준비됩니다.
      참고: RNP 혼합물은 최적의 활동과 효율성을 보장하기 위해 각 I-GONAD 세션에 대해 신선하게 준비해야 합니다.

2. 난관 핵산 전달 을 통한 게놈 편집을 위한 암컷 마우스의 준비

  1. 암컷 마우스의 짝짓기 및 선택: CD1 암컷 마우스를 단일 주택 CD1 수컷 마우스와 밤새 짝짓습니다. 아침에 암컷 쥐에 교미 플러그가 있는지 확인하십시오. 교미 플러그가 있는 암컷을 선택하고 추가 절차를 위해 새 새장으로 옮깁니다.
    참고: 유전적 모자이크를 최소화하기 위해 유전자 구조물을 전달하는 최적의 시간은 단일 세포(접합체) 단계10에서 짝짓기 후 0.7일입니다. 이는 대략 교미 플러그가 감지된 날의 오후 16:00에 해당합니다. 이 단계에서 난관을 해부하면 접합체는 팽대부에 남아 있지만 적운 세포를 가지고 있음을 알 수 있습니다. 특히, 난구 세포는 전기천공 중에 외인성 핵산이나 단백질을 흡수할 수도 있습니다. 예를 들어 짝짓기 후 10시간에 절차를 더 일찍 수행하면 난구 세포가 여전히 접합체를 단단히 둘러싸고 있어 접합체로 핵산의 효율적인 전기영동 전달을 방해할 수 있습니다. 호르몬 자극을 받은 쥐는 난모세포를 과도하게 생성하여 유산으로 이어질 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  2. 수술 기구 준비: 멸균 상태를 보장하기 위해 모든 스테인리스 스틸 수술 기구를 오토클레이브합니다.
  3. 마우스의 마취 및 준비: 선택된 암컷 마우스의 무게를 측정하고 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물을 사용하여 복강내 주사 를 통해 마취합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
    1. 적절한 마취를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 반사의 상실에 대해 마우스를 모니터링합니다. 시술 중 체온을 유지하기 위해 마취된 마우스를 가열 패드 위에 올려 놓습니다. 동물용 연고를 바르고 마취 중 마우스의 눈이 건조해지지 않도록 보호하십시오.

3. 수술 절차

  1. 70% 에탄올을 사용하여 마우스의 등쪽(등) 부위를 소독합니다.
  2. 허리 부위에 0.7cm 세로 피부 절개를 합니다.
  3. 절개 부위를 70% 에탄올에 적신 화장솜으로 닦고 절개 부위 주변의 털을 제거합니다.
  4. 가위 끝을 살짝 벌려 옆으로 밀어 절개 부위를 1.3cm까지 늘립니다.
  5. 복강에 접근하기 위해 복막에 작은 절개(0.7cm)를 조심스럽게 만듭니다.
  6. 가위 끝을 살짝 벌린 상태에서 옆으로 밀어 절개 부위를 1.1cm까지 확장합니다.
  7. 난소에 부착된 지방 패드를 찾아 난소, 난관, 자궁이 선명하게 보일 때까지 겸자를 사용하여 부드럽게 당겨 빼냅니다.
  8. 용기 클램프를 사용하여 지방 패드를 제자리에 고정합니다.
  9. 정밀한 조작을 위해 입체 현미경으로 난관을 시각화합니다(그림 1).
  10. 스트리퍼 피펫터를 사용하여 주입 혼합물 2μL를 플라스틱 모세관에 넣습니다.
    참고: 원래 IVF 클리닉에서 배아 조작을 위해 설계된 플라스틱 모세관이 있는 스트리퍼 피펫터는 I-GONAD 절차에서 배아 이식 및 CRISPR/Cas9 구조물 전달을 포함한 여러 응용 분야를 지원할 수 있습니다. 피펫터는 정밀 액체 디스펜서 역할을 합니다. 일회용 유연한 모세혈관과 함께 사용하면 멸균이 가능하고 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 플라스틱 모세혈관은 섬세한 조직에 덜 외상적이기 때문에 난관에 형질감염을 위한 RNP 혼합물을 주입하기 위해 유리보다 바람직합니다. 유리 모세관과 달리 일회용 플라스틱 모세관은 삽입 전에 날카로운 모서리를 매끄럽게 하기 위해 화염 연마가 필요하지 않아 준비 시간과 손상 위험이 줄어듭니다.
  11. 마이크로 가위를 사용하여 팽대부의 상류에서 몇 밀리미터 떨어진 난관 벽에 작은 절개(0.2cm)를 만듭니다.
  12. 플라스틱 모세관이 있는 스트리퍼 피펫터를 절개 부위에 조심스럽게 삽입하고 주입 혼합물을 난관으로 배출합니다.
    알림: 전기천공술의 효율성에 영향을 미칠 수 있으므로 난관에 공기가 들어가지 않도록 하십시오.
    이를 방지하려면 사출 플라스틱 모세관에 필요한 것보다 더 많은 사출 혼합물을 채우고 완전한 주입을 피하십시오. 플라스틱 모세혈관은 누두막 이식과 누두부와 팽대부 사이의 직접 난관 벽 박리에 적합합니다. 직접 난관 벽 절개 방법은 난관과 누두를 덮고 있는 얇은 활액낭막을 통한 초기 절개가 필요하기 때문에 누두 이식보다 외상이 적을 수 있습니다. CD1 마우스에서 이 막은 혈관이 고도로 형성되어 있어 절단하면 경미한 출혈이 발생할 수 있으며, 이는 가시성을 방해하고 RNP 혼합물의 미세 주입을 복잡하게 만들 수 있습니다.
  13. 난관에서 플라스틱 모세관을 부드럽게 제거합니다.

4. 전기천공 및 봉합

  1. 전면 패널의 스위치를 눌러 전기천공기를 켭니다.
  2. 전기천공 매개변수 설정: 포링 펄스: 전압: 50V, 펄스 길이: 5m, 펄스 간격: 50ms, 펄스 수: 3, 감쇠율 - 10%, 극성: +/-; 전송 펄스: 전압: 10V, 펄스 길이: 50ms, 펄스 간격: 50ms, 펄스 수: 3, 감쇠율 - 40%, 극성: +/-; 현재 제한: 생체 내.
  3. 핀셋형 전극을 사용하여 난관을 조심스럽게 잡고 전기천공기의 kΩ 버튼을 눌러 저항 값을 확인합니다. 저항이 350-400 Ω의 최적 범위 내에 유지되도록 전극이 충분히 압축되었는지 확인하십시오.
    알림: 이것은 온전한 난관이 두 전극 사이에 끼워져 있을 때 두 전극 사이의 거리를 조정하여 달성할 수 있습니다.
    1. 저항을 측정한 직후 시작 버튼을 눌러 전기천공을 시작합니다. 이 단계는 CRISPR-Cas 구성 요소를 접합체로 효율적으로 전달하는 데 중요합니다4. Ω 버튼에 "종료" 신호가 표시될 때까지 기다리십시오. 측정 프레임에 표시된 값을 기록해 둡니다.
      알림: 임피던스 값은 전압 값의 약 250-400 Ω/150-250 mA여야 실행 가능성과 전송 효율 사이의 최적의 균형을 보장합니다. 이 균형을 유지하려면 이 단계가 최적 범위를 넘어 저항을 크게 감소시킬 수 있으므로 일부 프로토콜에서 권장되는 Dulbecco의 변형 인산염 완충 식염수(DPBS)에 적신 젖은 종이로 난관 부위를 덮지 마십시오. 저항이 감소하면 전압이 250mA 이상으로 상승하여 세포 사멸로 이어질 수 있습니다.
  4. 한쪽 난관에서 전기천공을 완료한 후 생식관을 복강에 조심스럽게 다시 넣습니다. 4-0 폴리글리콜산 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
  5. 두 번째 난관에서 수술과 전기천공술을 반복합니다. 완료되면 생식관을 복강으로 되돌리고 위에서 설명한 대로 절개 부위를 봉합합니다.
  6. 시술 후 모니터링: 마우스를 따뜻한(37°C) 깨끗한 케이지에 넣고 회복을 위해 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
    참고: 수술 후 케이지당 두 마리의 마우스가 들어 있는 케이지에 마우스를 보관합니다. 한 마리의 쥐만 수술을 받은 경우 반려 암컷 마우스를 제공하십시오. 이러한 관행은 수술용 마우스의 불필요한 스트레스를 줄이고 보다 자연스러운 사회적 환경을 조성하는 데 도움이 됩니다.

5. 유전형 분석

  1. 프라이머 디자인
    1. 유전자형 분석을 위해 길이가 300-600bp 사이인 PCR 산물을 증폭하도록 프라이머를 설계합니다. 프라이머는 약 60°C의 용융 온도(Tm)와 함께 길이가 18-21뉴클레오티드여야 합니다.
    2. 2차 구조나 프라이머 이량체를 형성하는 서열은 피하십시오. PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 등과 같은 소프트웨어 도구를 사용하여 프라이머 품질을 보장합니다.
    3. 마우스 게놈 데이터베이스에 대해 BLAST 검색을 수행하여 프라이머 특이성을 확인하고 비특이적 증폭을 피합니다11.
      참고: 다음 프라이머는 표적 서열의 유전자형 분석을 위해 설계되었습니다: 포워드 프라이머: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; 역방향 프라이머: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', 예상 PCR 산물 길이: 320bp 및 Tm 62°C. Sanger 시퀀싱의 경우 Cas9 절단 부위에서 150-200bp 떨어진 곳에서 어닐링하는 시퀀싱 프라이머를 설계합니다.
  2. DNA 추출을 수행합니다. 신속한 DNA 추출을 위해, Hotshot 분리 프로토콜12 가 가장 간단한 것이다.
    1. 귀 펀치를 사용하여 마우스의 귀에서 작은 조직 조각(약 2mm)을 수집합니다.
    2. 용해 완충액 100μL(25mM NaOH, 0.2mM EDTA, pH = 12)를 첨가합니다.
    3. 95°C에서 60분 동안 배양하고 20분마다 혼합물을 소용돌이치게 합니다.
    4. 100 μL의 중화 완충액(40 mM Tris-HCl, pH = 5)을 넣고 완전히 소용돌이치게 합니다.
    5. PCR을 위한 최종 준비물 1-5μL를 사용합니다.
  3. PCR 증폭 및 시퀀싱. 표 3에 설명된 대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 교정 DNA 중합효소를 사용하여 높은 충실도를 보장합니다. 마스터 믹스를 필요한 수의 튜브에 분취하고 게놈 DNA를 추가합니다.
    참고: 항상 야생형 DNA 샘플을 시퀀싱 분석을 위한 대조군으로 포함하십시오.
  4. ROSA26 유전자형 분석을 위해 PCR을 실행합니다. 다음 조건이 사용되었습니다: 초기 변성: 95°C에서 30초; 28 사이클: 95°C에서 20초(변성), 62°C에서 20초(어닐링), 72°C에서 20초(확장); 최종 연신율: 72°C에서 2분; 4°C에서 유지합니다.
    참고: 제공된 프로토콜은 1.1.2단계의 프라이머를 사용하여 ROSA26 유전자좌 단편(추정 크기 320bp) 증폭에 대해 정확합니다. 보다 구체적이고 정확한 증폭을 위해 증폭 주기 수를 28-30으로 제한하십시오.
  5. 시퀀싱 및 분석
    1. 얻은 PCR 단편의 Sanger 시퀀싱을 수행합니다(단계 5.4).
    2. 시퀀싱 결과 분석
      참고: 성공적인 형질감염은 시퀀싱 크로마토그램에서 뉴클레아제 절단 부위 근처에 추가 DNA 서열이 출현하여 식별할 수 있는 모자이크 동물을 생성합니다. EditCo ICE 분석 또는 TIDE13 과 같은 계산 도구를 사용하여 게놈에서 정확한 인델을 식별하고 정량화합니다.
      1. ICE 분석을 사용하려면 얻은 Sanger 염기서열 분석 파일(편집이 없는 wt 마우스 PCR 산물 서열의 경우 대조군 .ab1 파일, 실험 마우스 PCR 산물 서열의 경우 실험 .ab1 파일)을 업로드하고 가이드 RNA 서열을 입력한 다음 CRISPR 실험에 사용되는 뉴클레아제를 선택하기만 하면 됩니다.
        참고: ICE 분석 도구는 전체 편집 효율성을 계산하고 샘플에 존재하는 모든 다양한 유형의 편집의 프로필과 상대적 풍부도를 결정합니다.
      2. TIDE를 사용하려면 가이드 RNA 서열을 입력하고, 얻은 Sanger 시퀀싱 파일(편집이 없는 wt 마우스 PCR 산물 서열의 경우 제어 .ab1 파일, 실험 마우스 PCR 산물 서열의 경우 실험 .ab1 파일)을 업로드하고 매개변수를 선택합니다(경우에 따라 고급 설정은 10bp보다 큰 인델을 찾는 데 도움이 될 수 있음).

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결과

전기천공이 성공하면 실험 마우스는 (1) 소수의 새끼를 낳고 (2) 일부 동물은 게놈에 다른 인델을 갖게 됩니다. 유전자형 프라이머가 잘 설계되고 PCR 프로그램이 최적이면 PCR 산물은 원하는 크기의 하나의 투명 밴드로 아가로스 겔에 존재합니다. 뉴클레아제가 표적 DNA를 성공적으로 절단하면 얻은 동물은 모자이크가 될 가능성이 높으며 게놈에 다양한 인델을 갖게 됩니다. EditCo ICE 분석 또는 TIDE와 같은 계산 도구를 사용하여 게놈에서 정확한 인델을 찾았습니다. 입력으로 sgRNA spacer 서열, 야생형 대조군 마우스 PCR 산물 서열의 크로마토그램 파일, 얻어진 실험 마우스 PCR 산물 서열의 크로마토그램 파일을 사용합니다. 결과적으로 프로그램은 인델 변이 분포, 대조군과 실험 프로브 간의 불일치 수준, 절단 부위 근접에서의 서열 정렬(EditCo ICE 분석을 사용하는 경우)을 보여주는 다이어그램을 표시해야 합니다(

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토론

I-GONAD 방법을 사용하여 녹아웃 마우스를 생성하는 효율성은 기존 미세 주입 기술과 비슷합니다. 그러나 전통적인 방법에는 기증자 암컷으로부터 접합체를 분리하고, 미세 주사를 수행하고, 유사 임신한 암컷의 난관에 배아를 이식하는 작업이 포함됩니다. 대조적으로, I-GONAD 방법은 게놈 편집 성분을 임신한 암컷의 난관에 직접 전달하여 접합체 분리 및 이식의 필요성을 제거함으로써 이 과정을 단순화합니다. 제시된 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 마우스 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 돌연변이의 성공적인 도입을 입증함으로써 I-GONAD 방법의 효과를 강조합니다. 이 기술의 개선을 통해 성공적인 I-GONAD 절차를 위한 가장 중요한 단계는 전기천공 중에 올바른 저항 및 전압 설정을 달성하고 유전자 구조물을 주입하는 동안 공기가 난관으로 들어가지 않도록 하는 것입니다.

저항 값은 세포 생...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 상트페테르부르크 대학 연구 공원, 분자 및 세포 기술 센터에 감사드립니다. 시퀀싱은 상트페테르부르크 주립대학교 과학 공원의 분자 및 세포 기술 자원 센터에서 ABI 3500 xL 유전자 분석기(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 저자는 문서 편집 및 제출에 도움을 준 Maria Rubel에게 감사드립니다. 이 연구는 상트페테르부르크 주립대학교(연구 프로젝트 ID: 129658320)의 자금 지원을 받았으며 Luibov Shkodenko는 러시아 과학 재단(프로젝트 25-26-00247)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5– 5 uL 피펫 써모 사이언티픽4642020
1.5 mL 튜브압타카1003/G
100-1000 uL 피펫 & nbsp;써모 사이언티픽4642090
200 uL 튜브악시겐PCR-02-C
20-200 uL 피펫 & nbsp;써모 사이언티픽4642080
2-20 uL 피펫 & nbsp;써모 사이언티픽4642060
4x 젤 로딩 다이바이오랩믹스D-3002
아가로스AppliChemA8963,0500
DNase I, RNase 없는 (1 U/μ L)써모피셔EN0521
dNTP 세트, 100 mM 솔루션써모 사이언티픽R0181
DreamTaq 그린 DNA 중합효소 (5 U/μ L)써모 사이언티픽EP0713
둘벡코 s 수정 인산염 완충 식염수시그마 올드리치D8537
에디트코 ICE 분석https://ice.editco.bio/#/2025년 4월 6일 접속
EDTA 0.5M 용액, pH = 8AppliChemA4892,0500
앙상블그리고 nbsp; https://www.ensembl.org/index.html2025년 6월 9일에 접속함
에티듐 브로마이드바이오랩믹스에트브르-10
아이 젤 점안액 " 오프타젤"URSAPHARM204604
겔 문서화 시스템 ChemiDoc XRS+바이오-래드1708265
실리코 PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr그리고 nbsp; 2025년 6월 9일에 접속함
통합 DNA 기술 https://eu.idtdna.com2025년 6월 9일에 접속함
미세수술 가위메딘 우랄M124
NEPA21 전기공공기네파 유전자NEPA21CUY652P2.5X4 전극
NTP 집합, 100 mM 해법써모 사이언티픽R0481
올리고뉴클레오타이드에브로겐직접 주문, 표준 탈염 정제
옵티-MEM I 환원 혈청 배지써모피셔31985070
펄프라이머https://perlprimer.sourceforge.net버전 1.1.21.
Phusion 고충도 DNA 중합효소 (2 U/μ L)써모 사이언티픽F530L
피펫 10 uL 팁울플라스트HT-10-960
피펫 1000 uL 팁울플라스트HT-1000-576
피펫 200 uL 팁울플라스트HT-200-960
전원 공급 장치 엘프-4"DNA 기술PS-400 신규
RNAse/DNAse 자유수인비트로젠10977049
식염수 용액팬에코P011n
SE-1 흉측 전기영동 시스템헬리콘SE-1
수산화나트륨시그마-올드리치S5881-500G
Step100 DNA 사다리바이오랩믹스S-8100
입체현미경 SMZ1000니콘5-363376
스트리퍼 마이크로피페터쿠퍼 서저리MXL3-STR
스트리퍼 팁오리지오MXL3-125
외과용 주사기 KMIZ4A1- 0,6× 20
겸자 봉합메딘 우랄M302.2
겸자 봉합메딘 우랄M303
봉합 실 POLYCON Nfigure-materials-10톤조스 95234
SYNTHEGO 녹아웃 가이드 디자인 https://design.synthego.com/#/2025년 6월 9일에 접속함
T100 증폭기바이오래드10014822
T7 RNA 중합효소 써모 사이언티픽EP0111
TBE 10배 버퍼바이오랩믹스TBE-500
타이드 https://tide.nki.nl/2025년 6월 4일 접속 & nbsp;
트리스 하이드로클로라이드쑤저우 야쿠 과학SYS-S0005-0.5
트리즈마 염산염 용액시그마 올드리치T2663
트리졸 시약인비트로젠15596026
트루컷 Cas9 단백질인비트로젠A36499
범용 가위메딘 우랄M147
자일라진Interchemie Werken de AdelaarIX2
졸레틸버박 연구소2000443714739.00

참고문헌

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