방법 논문

재조합 거미 실크 섬유 생산을 위한 손으로 그리기 및 습식 방적의 최적화 및 평가

DOI:

10.3791/68714

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2025년 7월 29일

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1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

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요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 방적을 위한 재조합 실크 단백질의 가용화를 최적화하기 위한 다양한 방법 세트를 제공합니다. 손으로 그리는 것으로 회전성을 테스트합니다. 자동화된 습식 방사로 길고 연속적인 섬유를 생산합니다. 섬유 또는 섬유 내부의 형태, 분자 정렬, 기계적 거동 및 단백질 2차 구조 함량을 비교 평가합니다.

초록

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거미줄은 고강도, 고확장성 또는 이들의 조합으로 인해 높은 인성을 얻을 수 있는 기계적 특성으로 유명합니다. 전형적인 암컷 구체 짜기 거미는 7가지 유형의 실크를 생산하며, 각 실크는 일반적으로 유형별 단백질로 방적되고 뚜렷한 생존 기능을 위해 기계적으로 조정됩니다. 재조합 거미줄 생산은 이러한 재료를 얻을 수 있는 유망한 경로를 제공하여 대량의 천연 실크를 얻는 데 따른 문제를 우회하고 예를 들어 부위 지향적 돌연변이 유발 또는 융합 단백질 구성을 통해 단백질 맞춤화를 허용하는 이점을 제공합니다.

제시된 프로토콜에서 우리는 손으로 그리는 것과 습식 방적 접근법 모두를 통해 방적에 대한 단백질 적합성을 평가하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 적절하게 정제된 동결건조 단백질 분말부터 시작하여 초기 가용화 단백질 상태를 최적화하여 고농도 "스피닝 도프" 상태를 제공하는 방법이 자세히 설명되어 있습니다. 다음으로, 방적 공정의 일부로 사후 스핀 드로우를 사용하여 섬유 거동을 조절하는 방법에 대한 논의를 포함하여 손으로 드로잉 및 습식 방적 접근 방식을 비교합니다. 생성된 실크 섬유를 특성화하고 섬유 직경과 균일성을 평가하기 위한 광학 현미경을 포함하여 어떤 방적 조건이 가장 유익할 가능성이 높은지 결정하기 위한 일반적인 워크플로가 자세히 설명됩니다. 섬유 내에서 달성되는 (초)분자 정렬 정도를 추정하기 위한 편광 현미경; 강도, 확장성, 영률 및 인성을 평가하기 위한 인장 시험; 및 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광현미경을 사용하여 섬유 내 단백질 2차 구조화를 평가합니다.

이 프로토콜은 선방형(포장) 실크의 반복 및 비반복 도메인을 기반으로 하는 여러 가지 다른 재조합 거미줄 단백질에 적합한 것으로 입증되었습니다. pyriform 실크; 및 aciniform, pyriform 및/또는 major ampullate(dragline) 실크를 포함하는 융합 단백질. 개별 단백질의 거동에 맞게 조건과 매개변수를 변경하고 기능적 결과의 차이를 달성할 수 있는 몇 가지 강조된 단계를 통해 더 넓은 적용 가능성이 제공됩니다.

서론

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거미는 거미줄 구성, 먹이 포획, 알 보호 등 다양한 특수 작업을 위해 실크를 생산합니다1. 거미줄은 가장 잘 알려진 천연 및 합성 재료2를 능가하는 뛰어난 기계적 특성을 나타내며, 다양한 산업 및 생물 의학 응용 분야를 위한 엔지니어링 및 강화된 거미줄 재료 생산을 위한 상당한 노력을 촉발합니다. 거미줄을 형성하는 단백질인 Spidroin은 비반복적인 N-말단 및 C-말단 도메인3으로 둘러싸인 비교적 크고 반복적인 도메인으로 구성되며, 일부 실크 유형의 고유한 기계적 특성은 반복 도메인 4,5,6 내에서 짧은 모티프의 반복과 연결되어 있습니다. 수확에 적합한 일관된 누에치 형태로 대량의 실크를 생산하는 상업적으로 재배되는 뽕나무 누에(Bombyx mori)와 달리 거미는 본질적으로 제한된 양의 실크를 생산하는 식인 및 영토 유기체이므로 농업 생산 및 수집에 어려움을 초래합니다7. 이러한 한계를 감안할 때, 재조합 거미줄 생산은 적용을 위한 충분한 양의 거미줄을 통제 가능하게 얻을 수 있는 보다 실현 가능하고 지속 가능한 대안으로 개발되었습니다.

재조합 거미줄을 생산하려면 단백질 발현에 적합한 숙주를 선택해야 합니다. 거미줄은 박테리아 8,9, 효모10,11, 곤충 세포12, 식물13,14, 포유류 세포15,16 등 다양한 숙주 시스템에서 발현되었으며, 대장균이 가장 일반적으로 사용되는 숙주 시스템입니다. 최대 700kDa에 도달할 수 있는 스피드로인의 고분자량7은 전장 구조체의 발현에 중요한 과제를 제시합니다. 천연 거미줄과 비교하여 비슷하거나 향상된 특성을 가진 재조합 거미줄을 생산하기 위해 사용되는 주요 전략은 제한된 수의 반복 단위(비반복 도메인 유무에 관계없이)를 가진 구조, 다양한 실크 유형의 조합으로 구성된 키메라 및 비실크 단백질과 융합된 하이브리드 실크와 같은 잘린 변이체의 발현입니다. 예를 들어, 재조합 주요 앰플레이트 스피드로인(284.9kDa)은 대사적으로 조작된 대장균에서 성공적으로 발현되었으며, 생성된 실크는 천연 메이저 앰플레이트 실크9와 유사한 기계적 특성을 나타냈습니다. 또한, 피리형 스피드로인의 2개 반복 단위와 선포형 스피드로인의 2개 반복 단위로 구성된 조작된 실크 섬유는 천연 편모형 실크와 유사한 구성 피리폼 또는 선방형 실크보다 우수한 확장성을 입증했습니다17.

또한 재조합 단백질 생산을 통해 기능성 펩타이드 또는 단백질 세그먼트를 실크 단백질에 간단하게 통합할 수 있어 특정 응용 분야에 맞는 특성을 가진 생체 재료를 제조할 수 있습니다. 예를 들어, RGD 세포 결합 모티프와 주요 앰플레이트 스파이드로인에서 파생된 유전자 조작 실크의 유전적 및 화학적 융합은 섬유아세포 접착 및 증식을 현저하게 향상시키는 필름을 초래했습니다18. 별도의 연구에서, 선방형 스피드로인의 두 반복 단위와 주요 앰플레이트 스피드로인의 C-말단 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 융합된 신경 성장 인자-β(NGF) 결합 모티프로 구성된 하이브리드 실크 구조물이 뉴런 유사 세포 성장 및 분화를 지원하는 것으로 입증되었습니다19.

재조합 실크 단백질의 성공적인 발현 및 정제가 주어지면, 의도된 응용 분야(20,21)에 따라 하이드로겔, 필름, 섬유, 나노입자, 폼 및 스폰지와 같은 다양한 형태로 가공될 수 있다. 인조 실크 섬유 생산을 가능하게 하기 위해 거미의 매우 복잡하고 엄격하게 규제되는 천연 섬유 방적 공정의 특정 측면을 모방한 방적 방법이 개발되었습니다. 천연 주요 증폭식 실크에서 스피드로인은 주요 증폭선의 상피 세포에 의해 생성되고 고농도(최대 50%(w/v))22로 내강 내에 용해성 상태로 저장되어 수성 회전 도프를 형성합니다. 방사 도프가 방적 덕트를 통해 이동함에 따라 덕트의 좁아짐과 섬유 인발 과정 모두에서 pH, 이온 농도, 수분 함량 및 전단력의 변화를 경험하여 액체 실크 단백질이 고체 섬유로 변형되도록 유도합니다23,24. 따라서 재조합 실크 단백질을 고농도로 가용화하거나 현탁시켜 방사 도프를 형성할 수 있는 적절한 용매를 식별하는 것은 인공 섬유 방사 공정에서 중요한 첫 번째 단계입니다.

실크 단백질 방적 도프의 제형화를 위해 광범위한 용매가 사용되었으며, 용매의 선택은 섬유 형성 및 기계적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다25,26. 결과적으로, 결과 섬유 특성을 최적화하려면 도프 용매 선택을 신중하게 고려하는 것이 필수적입니다. 방사 도프는 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올(HFIP)27, 헥사플루오로아세톤(HFA)28, 트리플루오로아세트산(TFA) 및 2,2,2-트리플루오로에탄올(TFE)26의 혼합물, 포름산29 및 인산나트륨/트리스 완충액(30)과 같은 유기 또는 수성 용매를 사용하여 제형화될 수 있다. 단백질 용해도는 일반적으로 pH, 이온 강도 및 농도와 같은 요인의 영향을 받기 때문에 적절한 도프 용매를 식별하려면 일반적으로 다양한 용매의 체계적인 평가, pH 및 단백질 농도 최적화, 경우에 따라 최적의 방사 도프 조건을 결정하기 위한 용매-물 혼합물 사용이 포함됩니다. 또한, 점성이 높은 도프 용액은 방사 중 유체 흐름을 방해할 수 있는 반면, 점성이 부족한 도프는 일반적으로 섬유 형성에 적합하지 않기 때문에 방사 도프의 점도는 방사 공정 전에 평가해야 하는 중요한 매개변수입니다31,32. 가혹한 스핀 도프 조건을 사용하면 장기간 노출되면 단백질 구조가 변경될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 친환경 원료 용매 개발은 여전히 활발한 연구 분야로 남아 있습니다.

손으로 그리는 것과 습식 방적은 재조합 실크 섬유 방적의 두 가지 일반적인 방법입니다. 각 방법을 사용하여 생산된 섬유의 기계적 특성은 방사 조건 자체와 방사 후 가공 모두에 크게 의존합니다. 드로우 스피닝이라고도 하는 핸드 드로잉은 일반적으로 피펫 팁, 겸자 또는 핀셋을 사용하여 정제된 단백질 용액에서 섬유를 추출한 후 공기 건조 및 특성화 33,34,35,36,37을 수행하는 간단한 섬유 생산 방법입니다. 핸드 드로잉은 다양한 실크 섬유 형성 조건을 신속하게 스크리닝하고 일반적으로 결과 섬유 기계적 거동을 분류하는 탁월한 접근 방식을 제공하지만, 이 기술은 길은(즉, 수 미터 길이) 연속 섬유로 쉽게 확장할 수 없습니다. 대안으로 우리는 일반적으로 물과 에탄올 또는 메탄올 9,15,31,38,39,40의 혼합물로 구성된 수성 또는 유기 용매인 응고조에 방사 도프를 일정한 속도로 연속적으로 압출하는 습식 방사를 사용합니다 . 방사 도프를 응고조에 담그면 빠른 단백질 탈용매화가 발생하여 연속 섬유가 형성됩니다24. 그 후, 섬유는 압출 속도와 일치하여 AS(as-spin) 섬유를 제공하거나 일반적으로 향상된 기계적 특성을 갖는 PS(post-spun) 섬유를 제공하기 위해 사후 스핀 인발을 거쳐 일정한 속도로 응고조에서 인발됩니다. 사후 스핀 드로우는 일반적으로 공기, 용매 또는 용매 침지 후 원래 길이의 2-8배 비율로 섬유를 늘리는 것을 포함하며, 각 매개변수는 특정 기계적 특성 15,17,31,38에 기여합니다.

이 프로토콜은 손으로 그리는 방법과 습식 방적 방법에 중점을 두지만 이러한 방법을 상황에 맞게 배치하는 것이 중요합니다. 수성 및 유기 조건 모두에서 재조합 거미줄에 대해 전기방사 방법이 보고되어 섬유 매트, 정렬된 섬유 및 원사를 생산할 수 있으며 섬유는 일반적으로 직경41에서 나노미터 규모입니다. 이는 나노 규모 섬유의 잠재적 이점을 제공하며, 일반적으로 역학 및 물 호환성을 개선하기 위해 β 시트 구조로의 변형을 유도하기 위해 스핀 후 처리를 수행해야 하는 미크론 규모의 섬유가 필요한 경우 해당 문제를 제공합니다. 미크론 규모의 폭과 두께의 멀티미터 재조합 거미줄 리본은 유기 용매42에서 건식 방사에 의해 얻어졌으며, 스핀 도프 단계에서 금속 이온 혼입이 역학을 개선한다는 최근 입증이 있습니다43. 미세유체 기반 방적(44)은 3D 프린팅 기술과 천연 방사구(45)를 모방하도록 설계된 마이크로니들 방사구의 최근 조합을 포함하여, 고도로 제어 가능한 재조합 실크 섬유 방적에 적합하다. 실크(또는 실크와 유사한) 섬유 생산에 적합한 것으로 보고된 다양한 방법에도 불구하고, 본 프로토콜은 이러한 방법이 우리 손에서 여러 가지 다른 재조합 실크 변종으로 번역될 수 있는 것으로 입증되었고 생체 재료 개발 및 비교 평가를 위한 다루기 쉬운 출발점을 제공하기 때문에 손으로 그리기 및 습식 방적에 의한 재조합 실크 섬유 생산을 자세히 설명합니다.

섬유 방사 및 수집 후 광학, 기계 및 분광 기술의 조합이 일상적으로 사용되어 방사 후 특성을 특성화합니다. 각 방법은 섬유 형성 과정과 재료 성능과의 상관관계에 대한 주요 통찰력을 제공합니다. 여기에서 우리는 실크 섬유 특성 및 성능에 대한 주요 정보를 제공하는 다른 많은 방법론이 있다는 점에 주목하면서 이러한 방법의 하위 집합에 중점을 둡니다. 광학 현미경은 섬유 형태를 평가하는 데 사용되며, 동일하고 다양한 조건 모두에서 방적된 섬유의 직경을 비교할 수 있습니다 17,31,38,46. 이 기술은 후속 특성화 전에 결함이나 이상이 있는 섬유 세그먼트를 식별하고 제거하는 데에도 중요합니다. 또한, 편광 현미경은 더 높은 수준의 정렬이 일반적으로 향상된 기계적 특성과 연관되어 있기 때문에 섬유 내의 분자 정렬 정도를 평가하는 데 사용될 수 있습니다 17,26,47. 기계적 특성화는 인장 테스트를 통해 수행되며, 응력-변형률 곡선을 측정하고 활용하여 인장 강도, 신축성, 영률 및 인성과 같은 매개변수를 정량화하여 구조 또는 생물 의학 응용 분야에서 섬유 적합성을 평가하는 데 필수적인 정보를 제공합니다 17,33,48. 여기에서 다루는 마지막 기술인 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광현미경은 단백질 2차 구조, 특히 섬유 안정성과 기계적 강도에 중요한 역할을 하는 β시트 형성 정도를 조사하는 데 적용됩니다17,46,49. 이러한 기술은 함께 재조합 생산된 실크 섬유의 형태, 구조 및 기계적 거동에 대한 포괄적인 이해를 제공합니다.

프로토콜

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이 프로토콜에서 우리는 시작점이 동결건조된 실크 단백질 분말이라고 가정합니다. 이것은 우리 연구에서 가장 일반적으로 재조합 거미줄 단백질일 것입니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 제공되며, 다음 5단계 각각은 아래에 자세히 설명되어 있습니다: (1) 스피닝 도프 준비 및 최적화; (2) 실크 섬유 손으로 그리거나 습식 방적; (3) 광학 현미경에 의한 섬유 직경 및 형태학적 평가; (4) 인장 시험에 의한 기계적 평가; 및 (5) FTIR 분광현미경에 의한 2차 구조 평가.

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그림 1: 재조합 거미줄 단백질 섬유 생산, 수집 및 특성화를 위한 프로토콜의 주요 단계에 대한 개략적 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 방사 도프 준비 및 최적화

참고: 섬유 방사 도프 용액의 최적화를 위해 다양한 농도의 재조합 거미줄 단백질을 다양한 용매에 가용화하여 도프 용액을 제조하십시오(표 1). 단백질을 용해시켜 침전물이 없고 투명한 도프 용액을 제공하는 용매만 섬유 방사 시도에 사용해야 합니다.

  1. 용매 준비
    1. 8:1:1 TFA/TFE/H2O를 만들려면 TFA 800 μL, TFE 100 μL 및 100 μL의 유형 1 초순수를 흄 후드 내부의 유리관에 측정합니다. 모든 구성 요소를 철저히 혼합하십시오. 유리관에 뚜껑을 덮고 파라필름으로 덮어 휘발성 성분의 증발을 방지합니다.
      알림: 섬유 방적을 위해 항상 새로운 용액을 준비하십시오.
      주의: TFA와 TFE는 부식성이 강하고 휘발성이 높으며 TFE는 가연성 및 독성이 있으므로 주의해서 취급하십시오. 장갑, 실험실 가운, 보안경 등 적절한 PPE를 착용하여 피부와의 접촉 및 흡입 가능성을 방지하십시오.
    2. 3:1:1 TFA/TFE/H2O를 만들려면 흄 후드 내부에서 TFA 300 μL, TFE 100 μL 및 1 유형 초순수 100 μL를 유리관에 옮기고 성분을 혼합합니다. 유리관에 뚜껑을 덮고 파라필름으로 덮어 휘발성 성분의 증발을 최소화합니다.
      알림: 섬유 방적을 위해 항상 새로운 용액을 준비하십시오.
    3. 7:3 HFIP/H2O를 만들려면 700 μL의 1,1,1,3,3,3-헥사플루로로-2-프로판올(HFIP)과 300 μL의 1형 초순수를 혼합하여 1 mL 용액을 만듭니다. 필요할 때 용액을 새로 준비하십시오.
      주의 : 흄 후드 내부에서 HFIP를 취급하고 흡입이나 피부 접촉을 피하십시오.
    4. 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 만들려면 비커에 탈이온수 800mL를 취하고 인산이수소칼륨 1.199g(KH2PO4-MW. 136. 09g/mol) 및 7.173g의 인산이염기칼륨(K2HPO4-MW. 174.18g/mol)이 들어 있습니다. 모든 성분을 철저히 혼합하고 NaOH 또는 HCl을 사용하여 용액의 pH를 조정합니다. 탈이온수로 부피를 1L까지 채우고 실온에 보관합니다.
    5. 10mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)을 만들려면 1.21g의 Tris-염산염(MW. 157.60g/mol)을 800mL의 탈이온수에 용해시킵니다. NaOH를 사용하여 pH를 조정하고 탈이온수로 최종 부피를 1L까지 채웁니다. 용액을 실온에서 보관하십시오.
    6. 20mM Na-아세테이트 완충액(pH 5.0)을 만들려면 450mL의 탈이온수에 0.55g의 아세트산나트륨(MW. 82.03g/mol)과 0.02M(6mL)의 아세트산을 녹입니다. 탈이온수로 부피를 500mL까지 채우고 실온에 보관합니다.
    7. 1M 구연산염 인산염 완충액(pH 7.0)을 만들려면 11.69g의 인산수소이나트륨(Na2HPO4-MW. 141.96g/mol)과 1.85g의 구연산(MW. 192.12g/mol)을 400mL의 탈이온수에 녹입니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 용액의 pH를 조정하고 탈이온수를 사용하여 최종 부피를 500mL로 조정합니다.
    8. 98% 포름산-CaCl2 용액을 만들려면 총 100mL 용액에 대해 98mL의 포름산과 2mL의 탈이온수를 혼합하여 포름산을 98%로 희석합니다. 이제 4 g의 CaCl2 를 100 mL의 98% 포름산 용액에 첨가하여 4% w/v 포름산-CaCl2 용액을 제조합니다. 용액을 실온에서 보관하십시오.
      참고: 표 1을 참조하십시오. 단백질을 용해시켜 침전물이 없고 투명한 도프 용액을 제공하는 용매만 섬유 방사 시도에 사용해야 합니다.
  2. 섬유 방적 도프 용액의 제조
    1. 원하는 농도(예: 100μL의 용매에 10%(w/v) 용액의 경우 10mg)에 따라 동결건조된 거미줄 단백질의 무게를 측정하고 적절한 부피의 용매(예: 10%(w/v) 농도의 경우 100μL)과 혼합합니다.
    2. 단백질 분말이 용매에 완전히 용해될 때까지 혼합물을 소용돌이치십시오.
    3. 거미줄 단백질의 용해도는 용매와 단백질 종류에 따라 다르므로 낮은 단백질 농도(10% w/v)로 시작하여 필요에 따라 점차적으로 농도(25-30% w/v)를 높입니다.
    4. 단백질이 완전히 용해된 후 도프 용액의 점도를 정성적으로 평가합니다. 도프 용액의 점성이 충분하지 않은 경우 투명하고 점성이 있는 용액이 얻을 때까지 단백질 농도를 점차적으로 높입니다. 물을 참조 표준으로 사용하십시오.
용매단백질 농도(% - w/v)참조
8:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 2519
3:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 3026
7:3 HFIP/H2O15 – 3031
50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)10 – 2550
10 mM Tris-Cl 완충액(pH 8.0)10 – 2034
20 mM Na-아세테이트 완충액(pH 5.0)10 – 2549
1 M 구연산염 인산염 완충액(pH 7.0)10 – 2551
98% 포름산 – CaCl220 – 2552

표 1: 섬유 방적 도프를 제조하기 위한 권장 용매 및 단백질 농도.

2. 섬유 방적 및 수집

참고: 손으로 그리는 개략적인 그림은 그림 2 를 참조하고 아래에 자세히 설명된 다양한 습식 방사 장치 구성은 그림 3 을 참조하십시오.

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그림 2: 거미줄 섬유의 손으로 그린 그림. (A) C자형 종이 프레임을 준비하여 왼쪽에 투명 테이프, 오른쪽에 양면 테이프로 유리 슬라이드에 부착하여 왼쪽에서 오른쪽으로 섬유 인발이 가능합니다. (B) 투명 테이프 위에 회전하는 도프 한 방울을 놓고 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 C자형 프레임의 개구부를 가로질러 양면 테이프에 단일 섬유를 손으로 그립니다. (C) 섬유는 좌우 테이프를 사용하여 유리 슬라이드의 종이 프레임에 고정됩니다. (D,E) 스핀 도프에 효과적으로 용해된 재조합 거미줄에 대한 대표적인 (D) 손으로 그리는 공정 및 (E) 테이프로 고정되기 전에 생성된 섬유의 시연. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 거미줄 섬유의 습식 방적. 모든 경우에, 회전하는 도프는 유리 밀폐 주사기에 넣고 주사기 펌프를 사용하여 금속 뭉툭한 끝 바늘(즉, 방사구)을 통해 응고조(예: 95% 에탄올)로 일정한 속도로 압출됩니다. (A) 방적된 섬유는 롤러 1에 수집되어 컴퓨터 제어 하에 압출 속도와 일치하는 속도로 회전합니다. (B) 공기 중 스핀 후 스트레칭은 롤러 1을 가로질러 섬유를 안내하고 롤러 1 속도의 배수로 회전하는 롤러 2에 모아 수행됩니다(예: 2x 인발 비율의 경우 속도의 두 배). 유사하게, 섬유는 롤러 1에서 롤러 3으로 섬유를 안내(용매 수조에 침지하고 롤러 1과 동일한 속도로 회전)하여 섬유를 롤러 2로 안내하기 전에 (롤러 1 및 3의 속도의 배수로 회전)하여 용매 침지 후(예를 들어, 주어진 실크에 적합한 40% 에탄올, 물 등) 후에 섬유를 생산할 수 있습니다(C); 또는 (D) 롤러 1에서 롤러 3(용매 수조에 담그고 롤러 1과 동일한 속도로 회전)으로 섬유를 안내한 다음 롤러 4(또한 용매에 담그고 롤러 1 및 3의 속도의 배수로 회전)로 유도하여 용매에 넣은 후 롤러 2(롤러 4의 속도와 일치하는 속도)에 수집합니다. 모듈식 구성은 섬유 방사 조건의 다양한 순열을 쉽게 테스트할 수 있음을 의미하며, 여기에 개략적으로 표시된 4가지에 국한되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 손으로 그리기
    1. 1cm x 0.5cm(l x w) 창이 있는 C자형 용지 프레임을 준비하고 유리 슬라이드 위에 놓습니다(그림 2). 접착 테이프를 사용하여 용지 프레임의 윗부분을 슬라이드 유리판에 고정합니다. 용지 프레임의 한쪽 팔에 투명 테이프를 부착하여 도프 용액 증착을 위한 소수성 표면을 만들고 섬유 고정을 위해 반대쪽 팔에 양면 테이프를 부착합니다.
    2. 실온(22 ± 2°C)에서 투명 테이프에 10-20μL의 회전 도프 용액을 증착합니다.
    3. 200μL 플라스틱 피펫 팁을 도프 용액 방울에 담그고 일정한 속도(~6mm/s)로 용액에서 수직으로 빼내어 용액에서 섬유를 빼낼 수 있습니다.
    4. 손으로 당긴 섬유를 프레임 창을 가로질러 안내하고 양면 테이프에 부착합니다. 섬유를 실온에서 자연 건조시킨 다음 추가 테이프로 섬유의 양쪽 끝을 고정합니다.
    5. 후속 특성화를 위해 종이 프레임을 가로지르는 섬유 부분에 초점을 맞춥니다.
  2. 습식 방적
    1. 여기에 자세히 설명된 장치가 이전 반복에 비해 향상된 모터 제어 기능을 갖는 습식 방사 장치를 구축합니다31,38.
      1. 스테퍼 모터 세트를 부착하기 위해 수직으로 고정되고 적절한 구성으로 가공되는 단단한 금속 장착 플레이트를 제작합니다( 그림 3 참조). 각 모터 장착에는 장착 플레이트 후면에 스테퍼 모터를 안전하게 볼트로 고정할 수 있도록 뚫은 구멍(즉, 적절한 간격과 크기의 구멍 4개)과 모터 샤프트가 통과할 수 있도록 다섯 번째 구멍이 필요합니다.
      2. 1.8° 스텝, 45N∙cm의 유지 토크, 24mm 길이, 5mm 직경의 샤프트, 15mm 길이의 "D" 컷, 39mm 본체, 1.50A 정격 전류, 2.3위상 저항의 바이폴라 스테퍼 모터를 선택하십시오.
      3. https://github.com/raineylab/MotorController.git 에 상세히 설명된 바와 같이 여러 스테퍼 모터 컨트롤러에 연결된 라즈베리 파이에 대해 파이썬으로 코딩된 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하는 다양한 실크 섬유 유형(17,53,54)에 대해 이전에 사용된 것과 같은 각 모터의 속도 및 회전 방향을 제어하는 시스템을 개발한다.
      4. 회전을 위해 주어진 회전 구성에서 사용되는 각 모터를 가공된 금속 실린더( 그림 3의 위치 1 및 2에 있는 경우 직경 6cm, 길이 8cm, 양쪽 끝에 직경 9cm의 홈이 있는 롤러는 롤러 중앙에서 직경 6cm로 가늘어짐), 그림 3의 위치 3과 4에서 길이 7cm; 예를 들어, 샘플 구성은 그림 4 를 참조하십시오.
      5. 방사구(그림 3)의 경우, 제어된 속도로 스핀 도프를 응고조로 압출하는 주사기 펌프에 장착된 무딘 끝(내경 0.127mm)이 있는 영구적으로 부착된 금속 바늘이 있는 0.25mL 유리 주사기를 사용합니다.
    2. 도프 용액을 실온에서 30분 동안 20,000-21,000 × g 에서 원심분리하고 섬유 방사를 위해 상청액을 수집합니다.
      알림: 습식 방사 중 압출 바늘이 막히는 것을 방지하기 위해 잔류 미립자를 제거하십시오.
    3. 방사구 역할을 하는 주사기에 50-80μL의 회전 도프 용액을 넣습니다.
    4. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 압출을 600μL/h의 속도로 설정합니다.
      참고: 주어진 단백질 방사 도프 조건에 대한 섬유 형성을 가능하게 하기 위해 압출 속도를 조정하고 최적화합니다.
    5. 응고조(95% 에탄올/5% 탈이온수, v/v)를 준비합니다.
    6. 도프 용액이 들어 있는 주사기의 바늘이 응고조에 잠기도록 주사기 펌프를 배치합니다.
    7. 롤러를 방적 장치에 부착하고 모터 제어 소프트웨어를 사용하여 롤러 속도를 조정한 다음 주어진 방적 구성에 필요한 모터를 켭니다.
      알림: 롤러 1의 회전 속도를 압출 속도와 일치시킵니다. 400 μL/h 또는 600 μL/h의 압출 속도는 롤러 1의 경우 6 rpm 또는 9 rpm에 해당합니다. 스핀 후 드로우가 제공되는 경우 롤러 2-4 중 하나 이상이 그에 따라 더 빠르게 회전하도록 설정해야 합니다.
    8. 주사기 펌프를 시작하고 핀셋을 사용하여 다음 방법 중 하나로 응고조에서 형성되는 섬유를 안내합니다.
      1. AS 섬유를 수집하려면 응고조에서 형성된 섬유를 수집을 위해 첫 번째 롤러(압출 속도와 동일한 속도)로 안내합니다.
      2. 공기 중에서 스핀 후 스트레칭을 수행하려면 롤러 2의 회전 속도를 롤러 1의 배수로 설정합니다. 롤러 1 주위를 고리치지 않고 롤러 1 위로 응고된 섬유를 안내하고 롤러 2에 모으십시오.
        알림: 2배의 스핀 후 드로우 비율은 롤러 2의 회전 속도가 롤러 1의 두 배가 되어야 합니다. 3배, 트리플; 등등.
      3. 용매에 담근 후 스핀 후 스트레칭을 수행하기 위해, 용매 수조에 원하는 용매(예: 탈이온수, 2:3 v/v 에탄올/H2O 등)를 채우고, 용매 수조에서 롤러 1 주위(압출 속도와 일치하는 회전 속도), 롤러 3 주위(롤러 1과 동일한 회전 속도)로 응고조로부터 섬유를 유도하고, 공기 중의 롤러 2에 섬유를 수집합니다(롤러 1 및 3보다 빠른 속도로 회전).
        참고: 롤러 1 및 3에 대한 롤러 2의 회전 속도는 2.2.8.2단계와 같이 스핀 후 드로우 비율을 결정합니다.
      4. 용매에서 스핀 후 스트레칭을 수행하려면 용매 수조에 원하는 용매(예: 탈이온수, 2:3 v/v 에탄올/H2O 등)를 채우고 응고조에서 섬유를 롤러 1 주위(압출 속도와 일치하는 회전 속도), 용매 수조의 롤러 3 주위(롤러 1과 동일한 회전 속도) 주위, 용매 수조 내 롤러 4 주위(롤러 1 및 3의 회전 속도의 배수)로 유도하고 수집합니다 공기 중 롤러 2의 섬유(롤러 2와 일치하는 회전 속도).
        참고: 롤러 1 및 3의 회전 속도에 대한 롤러 2 및 4의 회전 속도는 2.2.8.2단계와 같이 스핀 후 인발 비율을 결정합니다.
        습도와 온도가 섬유 거동에 미치는 영향을 피하기 위해 통제된 환경 조건에서 섬유를 수집합니다. 상대 습도 ~ 28.2 ± 2.4%, 온도 ~ 28.0 ± 2.2 °C를 목표로 합니다.

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그림 4: 거미줄 섬유의 습식 방적의 주요 단계. (A) 스핀 도프 압출을 응고 욕조로 돌출한 후 섬유 수집(왼쪽의 빨간색 직사각형은 도프 압출에 사용되는 바늘을 강조 표시하고 오른쪽의 빨간색 직사각형은 습식 방적 실크 섬유의 경로입니다. (B) 공기 중에서 회전 후 스트레칭을 받는 섬유의 그림(눈을 안내하는 빨간색 직사각형). (C) 물에 잠긴 후 섬유의 탈수 후 스트레칭 그림(눈을 안내하는 빨간색 직사각형). (D) 롤러에 수집된 연속 재조합 실크 섬유(예: 빨간색 화살표의 스풀 섬유). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 섬유의 광학 현미경 평가

  1. 광섬유 장착
    1. 3 x 2cm 직사각형 종이에서 1 x 1cm 정사각형을 잘라내어 C자형 용지 홀더를 만듭니다(그림 5).
    2. 테이프를 사용하여 C자형 홀더를 유리 현미경 슬라이드에 부착합니다.
    3. C자형 용지 홀더의 1cm 간격 양쪽에 양면 테이프 2장을 붙입니다.
    4. 수집된 롤러에서 섬유를 제거하고 약 2cm 길이의 세그먼트를 자릅니다.
      알림: 재료 변형이나 기타 특성 변경을 방지하기 위해 섬유를 다룰 때 과도한 힘을 가하지 마십시오.
    5. 광섬유 세그먼트를 양면 테이프 상단에 놓고 광섬유 장축이 홀더의 하단 가장자리와 평행하게 정렬되도록 합니다(그림 5).
    6. 양면의 양면 테이프 위에 마스킹 테이프로 광섬유를 고정합니다.
    7. 마스킹 테이프를 추가로 부착하여 용지 홀더 바닥을 유리 슬라이드에 단단히 고정하여 사용할 때까지 섬유가 움직이지 않도록 합니다.
    8. 이미징 및 인장 시험에 사용할 때까지 장착된 섬유를 슬라이드 보관 상자에 보관하십시오.
  2. 직경 결정 및 결함 평가
    1. 광학 현미경을 사용하여 장착된 섬유를 검사합니다. 먼저, 섬유의 전체 길이를 선별하여 네킹, 꼬임, 부풀어 오르거나 이중 섬유와 같은 눈에 보이는 결함이 있는지 확인합니다. 결함이 관찰되면 해당 섬유를 기계적 테스트에서 제외하십시오.
    2. 결함이 없는 것처럼 보이는 섬유의 경우 섬유의 장축을 따라 10배 배율로 세 장의 현미경 사진을 찍습니다.
    3. ImageJ55 소프트웨어를 사용하여 섬유 직경 측정:
      1. ImageJ에서 분석 메뉴로 이동하여 배율 설정 (보충 파일 1 - 보충 그림 S1)을 선택합니다. 현미경의 교정 설정에 따라 눈금을 조정하고 측정 단위를 마이크로미터(μm)로 설정합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S2).
      2. 선 도구를 사용하여 섬유의 한쪽 가장자리에서 다른 쪽 가장자리까지 걸쳐 있는 섬유의 장축에 수직인 직선을 그립니다.
      3. 각 현미경 사진에 대해 섬유를 따라 6개의 서로 다른 영역에서 섬유 직경을 측정합니다.
      4. 각 선을 그린 후 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 섬유 직경을 표시합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S3).
  3. 편광 현미경을 통한 분자 정렬의 정성적 평가
    1. 편광 현미경을 사용하여 광학 현미경으로 직경 및 결함 평가 후 섬유 내의 분자 정렬을 평가합니다.
      1. 회전 가능한 스테이지, 고정 분석기 슬라이더 및 90° 회전 가능한 편광판이 장착된 도립 광학 현미경을 사용하여 섬유를 검사합니다.
      2. 입사면 편광에 대해 약 45° 각도로 광섬유를 배치하여 복굴절로 인한 밝기를 최대화하여 분자 구조의 가시성을 향상시킵니다.
      3. 이러한 조건에서 섬유의 이미지를 촬영하여 복굴절을 평가합니다.
        참고: 복굴절이 높으면 분자 구조가 잘 정렬되었음을 나타내는 반면, 복굴절이 낮거나 없으면 더 비정질적이거나 무작위로 배향된 구조를 나타냅니다.

figure-protocol-5
그림 5: 거미줄 섬유를 유리 슬라이드에 장착하여 C자형 종이 홀더와 일련의 테이프 층을 사용하여 다운스트림 분석을 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 인장 시험

참고: 실크 섬유의 정확한 평가에 적합한 인장 시험 장치는 상대적으로 저렴한 비용으로 쉽게 생산될 수 있습니다25,56. 간단히 말해서, 테스트 중인 C자형 프레임에서 각 섬유의 각 끝을 단단히 잡을 수 있도록 한 쌍의 스테인리스 스틸 클램프를 제작합니다(예: 그림 6). 이 클램프 중 하나를 분석 저울에 놓인 추에 부착하고 다른 하나는 주사기 펌프에 부착합니다. 주사기 펌프는 설정된 변형률 속도로 일정하게 당길 수 있도록 구성되어야 합니다. 분석 저울은 시간의 함수로 기록된 중량/질량 데이터 수집을 위해 컴퓨터와 인터페이스되어야 합니다.

figure-protocol-6
그림 6: 인장 시험을 위한 준비 단계를 보여주는 개략도. (A) 섬유가 있는 용지 홀더(구성은 그림 5 참조)를 유리 슬라이드에서 분리하고 추에 부착된 클립을 사용하여 수직으로 장착합니다. (B) 이 가중 클램프는 분석 저울에 배치되고 종이 홀더의 상단 부분은 주사기 펌프에 단단히 고정된 막대에 부착된 클램프에 고정됩니다. 인장 테스트를 시작하기 전에 용지 홀더를 중간에서 수평으로 절단합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 응력-변형률 곡선 데이터 수집
    1. 섬유 직경을 측정한 후 집에서 만든 장치를 사용하여 동일한 섬유에 대해 인장 테스트를 수행합니다(그림 6).
      1. 유리 슬라이드에서 섬유를 고정하는 C자형 종이 프레임을 분리하고 추에 부착된 클램프에 고정합니다(그림 6A).
      2. 분석 저울을 데이터 로깅/제어 소프트웨어에 연결하고 워크벤치 로 이동합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S4).
      3. 시작 버튼을 클릭하여 균형 제어 소프트웨어에서 실험을 설정합니다. 메시지가 표시되면 실험 이름을 입력합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S5).
      4. 분석 저울이 비어 있는지 확인하고 섬유가 있는 가중 클램프를 그 위에 놓습니다.
      5. 용지 프레임의 상단을 주사기 펌프에 연결된 cl에 부착하고 용지 홀더의 한쪽을 잘라 섬유가 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다(그림 6B).
        알림: 두 clamps가 서로 평행하고 광섬유가 clamp 10mm의 게이지 길이에서 clamp 내 중앙에 있습니다.
      6. 저울을 용기하여 분동의 질량을 0으로 만들고 클램프를 선택하고 주사기 펌프의 실행 버튼을 누르고 저울 제어 소프트웨어에서 확인 을 클릭합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S6).
      7. 섬유가 끊어지면 주사기 펌프의 중지를 누르고 밸런스 제어 소프트웨어(보충 파일 1 - 보충 그림 S7)의 예 버튼을 눌러 측정된 무게를 시간의 함수로 기록합니다.
      8. 처리를 위해 스프레드시트 또는 기타 적합한 데이터 처리 소프트웨어 패키지로 데이터를 전송합니다. 중량 대 시간 데이터 로그를 클립보드에 복사하여 제공된 기계 테스트 스프레드시트(보충 파일 2)에 붙여넣거나 데이터를 텍스트 파일로 내보내고 적절한 구문 분석을 통해 가져옵니다.
  2. 응력-변형률 곡선 데이터 처리
    참고: 다음 프로토콜은 Microsoft Excel(보충 파일 2)에서 사용하기 위해 형식이 지정된 기계 테스트 스프레드시트를 기반으로 합니다.
    1. 실험 매개변수가 올바른지 확인합니다(C 열).
    2. 질량 기록을 시간의 함수로 스프레드시트에 추가합니다( F열의 "순 질량"). 스트레칭이 시작되기 전에 기록된 질량 값이 있는 경우 데이터를 위쪽으로 이동하면서 해당 셀을 삭제하여 이러한 값을 제거합니다. 섬유가 끊어진 후 기록된 질량 값이 있는 경우 이러한 데이터 셀을 삭제합니다.
    3. 총 인덱스 수가 F열에서 측정된 총 질량 값 수와 일치하도록 1씩 증분을 추가하여 E 열의 인덱스 값을 자동 채웁니다.
    4. 순 질량을 0g에서 시작하여 각 순 질량 값에서 초기 순 질량을 빼고 이 차이에 -1을 곱하여 스트레칭 실험 중에 증가하도록 순 질량의 크기를 조정합니다(G 열).
    5. 측정 지수에 주사기 펌프의 당김 속도와 기록된 질량 측정 사이의 시간 지연을 곱하여 각 측정에서 섬유 길이의 변화를 계산합니다(H 열).
    6. 섬유 길이의 변화를 원래 길이로 나누어 엔지니어링 변형률을 계산합니다(열 I).
      참고: 이 계산은 엔지니어링 변형률을 mm/mm 단위로 제공합니다. 엔지니어링 변형률 값을 %로 변환하려면 열 I 의 값에 100%를 곱합니다.
    7. 확장성을 최대 엔지니어링 변형률 값(셀 T3)으로 기록합니다.
    8. 질량을 g에서 kg으로 변환하고 표준 중력(9.81m/s2; 열 J).
    9. 주어진 신장도에서 결정된 힘을 섬유 단면적으로 나누어 엔지니어링 응력(Pa)을 계산하고 10-6 을 곱하여 MPa로 변환합니다(열 K).
    10. 관찰된 최대 응력을 극한 응력(셀 U3)으로 기록하고 파단 응력을 섬유 파단 전에 기록된 최종 응력 값으로 기록합니다(셀 V3).
    11. 각 측정 후 곡선 아래 면적을 계산하기 위해 사다리꼴 법칙을 사용하여 인성을 얻기 위해 응력-변형률 곡선 아래 면적을 계산합니다(열 L). 이 영역을 합산하여 인성을 찾습니다(셀 W3).
    12. LINEST 함수를 사용하여 응력-변형률 곡선의 초기 선형 영역의 기울기를 결정하여 영률(MPa)을 계산합니다. 103 (셀 X3)을 곱하여 GPa로 변환합니다.

5. 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광현미경

  1. 광학 현미경을 위해 준비된 슬라이드의 바닥에 두 번째 유리 슬라이드를 테이프로 붙여 FTIR용 샘플을 준비합니다.
  2. 광학 이미지 및 FTIR 스펙트럼 수집
    1. 감지기 듀어에 액체 질소를 채워 감지기를 냉각시킵니다.
    2. FTIR 기기 제어 소프트웨어를 엽니다.
    3. View and Collect 창(보충 파일 1 - 보충 그림 S8)에서 Collection 탭을 열고 Collection Mode를 ATR로 설정하고 Detector를 Cooled(보충 파일 1 - 보충 그림 S9)로 설정합니다.
    4. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 홀더를 스테이지에 놓습니다.
    5. 상단 조명을 100으로 설정하고 조리개와 하단 조명을 0으로 설정합니다.
    6. 시야의 중심과 초점면의 위치를 제어하기 위해 소프트웨어의 물리적 조이스틱 또는 디지털 조이스틱을 사용하여 샘플의 광학 현미경 이미지에 대한 시야 중심을 광섬유에 초점을 맞춥니다.
    7. 수집 모드를 맵으로 설정합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S8).
    8. 맵 뷰 - 영역 도구를 사용하여 이미징 및 측정할 영역을 선택합니다. 커서를 클릭하고 드래그하여 현미경 사진 미리보기에서 스펙트럼을 획득할 영역을 지정합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S8). 이미지의 각 원은 해당 위치에서 획득한 하나의 스펙트럼을 나타냅니다. 필요한 경우 지정된 상자 가장자리 위에 커서를 놓은 다음 클릭하고 원하는 위치로 드래그하여 이 상자의 가장자리를 변경합니다. 사각형 내에서 클릭하고 드래그하여 전체 상자를 변환합니다. Stage, Aperture 및 Display(보충 파일 1 - 보충 그림 S10)에서 상자의 영역과 데이터 포인트 수를 수정합니다.
    9. 현미경 사진 미리보기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모자이크 캡처 를 선택하여 이미지를 저장합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S8).
    10. 현재 압력 프로파일 드롭다운 메뉴를 클릭하여 ATR 압력을 설정합니다. 단백질 섬유의 경우 섬유의 손상을 최소화하기 위해 2% 압력(즉, 가능한 가장 낮은 ATR 압력)을 사용합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S8).
    11. ATR FTIR 팁을 삽입합니다.
    12. 수집 버튼(보충 파일 1 - 보충 그림 S8)을 클릭하여 배경 스펙트럼을 획득한 다음 선택한 각 지점의 스펙트럼을 획득합니다. 수집이 완료되면 데이터가 새 창에 표시됩니다.
  3. 다운스트림 분석을 위한 데이터 준비
    1. 히트 맵 또는 현미경 사진을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 해당 위치에서 획득한 스펙트럼을 봅니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S11).
    2. 분석할 스펙트럼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복사(Supplemental File 1 - Supplemental Figure S11)를 선택합니다.
    3. 화면 상단의 Windows 표시줄을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 창(보충 파일 1 - 보충 그림 S11)을 선택합니다.
    4. 새 창이 열리면 화면 상단의 붙여넣기 버튼을 클릭합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S11).
    5. 동일한 접근 방식을 사용하여 분석에 필요한 다른 스펙트럼을 복사 하여 이 창에 붙여넣습니다 .
    6. Ctrl 키를 누른 상태에서 원하는 각 스펙트럼을 클릭하거나 드롭다운 메뉴에서 원하는 스펙트럼을 강조 표시하여 스펙트럼 또는 스펙트럼을 강조 표시합니다.
    7. 다른 이름으로 저장을 클릭하고 파일을 .spa 파일로 저장하여 분광계 제어 소프트웨어에서 데이터를 분석하거나 .csv로 저장하여 다른 소프트웨어 패키지의 데이터를 분석합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S12).
  4. 기기별 소프트웨어를 사용한 2차 도함수 분석
    1. 기기별 스펙트럼 처리 및 분석 소프트웨어 패키지에서 분석할 스펙트럼을 엽니다.
    2. % 투과율과 흡광도 모드 간에 변환하려면 Ctrl+A (% 투과율에서 흡광도로) 또는 Ctrl+T (흡광도에서 % 투과율로)를 사용합니다.
    3. 보기 | 한계 표시(또는, Ctrl+D)(보충 파일 1 - 보충 그림 S13A). Amide I(1,700-1,600cm-1) 및 amide II(1,600-1,500cm-1) 밴드를 보려면 특히 시작 및 끝 X축 한계를 적절한 웨이브 번호로 설정합니다. 둘 이상의 스펙트럼을 분석하는 경우 모든 스펙트럼에 적용을 선택합니다. 확인(보충 파일 1 - 보충 그림 S13B)을 클릭합니다.
    4. 2차 도함수를 플로팅하려면 프로세스 | 파생어... 을 클릭하고 드롭다운 메뉴(보충 파일 1 - 보충 그림 S14A)에서 두 번째를 선택합니다. 세그먼트 길이가 5이고 세그먼트 사이의 간격이 5인 Norris 도함수를 선택합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S14B). 2차 도함수 스펙트럼의 최소값은 원래 흡광도 스펙트럼 내의 성분 피크와 일치합니다.
      1. 스펙트럼이 너무 시끄러워서 최소값을 평가할 수 없는 경우 프로세스>자동 스무딩 (보충 파일 1 - 보충 그림 S15)을 클릭하여 스펙트럼을 매끄럽게 합니다. 그런 다음 2차 도함수를 계산하고 최소값을 찾습니다.
    5. 단백질 2차 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 참조 테이블(예: 표 2)을 사용하여 2차 도함수 최소값의 파수를 2차 구조의 특징적인 밴드 위치에 연관시킵니다.
  5. 기기별 분석 소프트웨어를 사용한 피크 디콘볼루션
    1. 5.4.3단계와 같이 디스플레이 영역을 디콘볼루트할 영역으로 설정합니다. 이 영역만 디콘볼루트됩니다.
    2. 기준선은 다음 방법 중 하나를 사용하여 선택한 스펙트럼 영역을 수정합니다.
      1. 프로세스 | 자동 기준선 수정(보충 파일 1 - 보충 그림 S16); 또는
      2. 프로세스 | 기준선 수정(보충 파일 1 - 보충 그림 S17A)을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 선형을 선택하고 디콘볼루션 목적으로 보정할 영역의 하한과 상한을 지정하는 두 점을 클릭하고 드래그하여 위치 스펙트럼에서 기준선을 보정할 스펙트럼 영역을 지정합니다. 그런 다음 두 번째 드롭다운 메뉴에서 창에 추가를 선택하고 추가 버튼(보충 파일 1 - 보충 그림 S17B)을 클릭합니다.
    3. 기준선 보정된 스펙트럼을 선택한 상태에서 분석 | 피크 해상도... 을 클릭하여 피크 분해능 창을 엽니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S18).
    4. 화면 왼쪽의 선택 막대를 사용하여 분석할 스펙트럼과 곡선을 선택합니다.
    5. 피크 찾기 탭에서 감도 설정이 낮고 FWHH 설정이 2인 가우시안/로렌츠를 선택한 다음 피크 찾기 버튼을 클릭합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S19).
    6. 피크 버튼을 클릭하여 피크를 설명하는 테이블을 엽니다.
      1. 물리적으로 합리적인 것보다 더 많은 피크가 선택된 경우, 분석을 위해 정확한 수의 피크를 얻을 때까지 피크 삭제 를 클릭합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S20). 예를 들어, 아미드 I 영역의 경우 일반적으로 5-11개의 피크가 문헌에 보고됩니다(표 2).
      2. 피팅 후 모든 피크가 양수인지 확인하려면 피크 편집을 클릭하고 높이 최소값을 0으로 설정합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 각 피크에 대해 반복한 다음 확인 을 반복하여 편집 창을 닫습니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S21).
      3. 최종 디콘볼루션에 있어야 하는 특정 파수가 있는 경우 피크 편집을 클릭하고 고정을 선택하여 값 상자에 지정된 파수로 피크 중심을 고정하거나 하한 및 상한 상자를 사용하여 범위를 제공합니다. 확인을 클릭하여 이러한 설정을 지정된 피크에 적용합니다.
        참고: 이 단계에서는 2차 도함수 분석 중에 발견된 피크 위치 또는 유사한 실크 샘플 유형에 대해 이상적으로 주석이 달린 FTIR 2차 구조의 참조 테이블에서 피크를 사용하는 것이 가장 좋습니다(예: 표 2).
    7. 피 크 맞춤 버튼을 클릭합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S22).
      1. 피크 피팅 알고리즘이 성공적으로 수축되지 않으면 피크 맞춤을 다시 클릭하여 피크를 반복적으로 계속 피팅합니다.
    8. 피크... 버튼을 클릭하여 위치, 높이, FWHH 및 적합한 모든 피크의 면적에 대한 정보를 얻습니다.
      1. 이러한 피크는 클립보드를 클릭하여 클립보드에 복사하여 다른 창이나 파일에 붙여넣을 수 있습니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S23).
      2. 추가 버튼 옆에 있는 창 선택 드롭다운 메뉴에서 대상을 선택하여 피크와 스펙트럼을 다른 창으로 복사합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S24).
      3. 모두 선택 버튼을 클릭하고 파일 | 다른 이름으로 저장을 클릭하여 피크와 스펙트럼을 .spa 및/또는 .csv 파일로 저장합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S25).
    9. 참조 테이블을 사용하여 각 구성 요소 피크를 2차 구조에 연결합니다. 할당된 모든 피크의 총 면적에 대해 주어진 2차 구조에 해당하는 피크(들)의 상대 면적은 해당 2차 구조를 갖는 단백질의 비율을 제공합니다.
  6. 타사 소프트웨어를 사용한 다운스트림 분석을 위한 데이터 준비
    1. 통합 문서를 열고 데이터 | 파일에 연결 | 텍스트/CSV 메뉴 항목(보충 파일 1 - 보충 그림 S26). 파일 탐색기 에서 원하는 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
    2. 플롯할 열을 강조 표시하고 플롯 | 기본 2D | 라인 메뉴 항목(보충 파일 1 - 보충 그림 S27).
    3. x축을 두 번 클릭하고 스케일 탭을 사용하여 Amide I 피크에 맞게 범위를 조정합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S28).
    4. 데이터에 노이즈가 매우 많은 경우 분석 | 신호 처리>Smooth>Open 대화 상자... 메뉴 항목(보충 파일 1 - 보충 그림 S29A).
      1. 재계산 옵션을 자동으로, 방법을 Savitzky-Golay로, 창의 점들을 5로, 경계 조건을 없음으로, 다항식 순서를 2로 설정합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S29B).
      2. 확인을 클릭하여 처리합니다.
  7. 타사 소프트웨어를 사용한 2차 도함수 분석
    1. 분석 | 수학 | 차별화 | 대화 상자 열기... 메뉴 항목(보충 파일 1 - 보충 그림 S30).
    2. 재계산 옵션을 자동으로 설정하고, 파생 순서를 2로 설정하고, 도함수 곡선 플롯 옵션을 선택한 다음 확인(보충 파일 1 - 보충 그림 S31)을 클릭합니다.
    3. 결과 2차 도함수 곡선의 노이즈가 매우 높으면 5.7.1단계를 따릅니다. 5.7.2, 차별화 대화상자의 부드러움 탭에서 Savitzky-Golay Smooth를 선택합니다.
    4. 5.4.5에서와 같이 2차 도함수의 최소값에 있는 파수를 2차 구조에 연관시킵니다.
  8. 타사 소프트웨어를 사용한 피크 디콘볼루션
    1. 아미드 I 흡광도 스펙트럼의 플롯을 클릭한 후 분석 | 피크 및 베이스라인 | 피크 분석기 | 대화 상자 열기... 메뉴 항목(보충 파일 1 - 보충 그림 S32).
    2. 목표 - 피크 맞춤(Pro) 대화상자에서 재계산 옵션을 자동으로 설정하고 피크 맞춤을 선택한 후 다음을 클릭합니다. (보충 파일 1 - 보충 그림 S33A).
    3. 기준선 모드 대화 상자에서 기준선 모드 매개변수를 직선으로 설정하고 다음(보충 파일 1 - 보충 그림 S33B)을 클릭합니다.
    4. 기준선 처리 대화 상자에서 기준선 자동 빼기를 선택하고 지금 빼기 버튼을 클릭한 다음 다음(보충 파일 1 - 보충 그림 S33C)을 클릭합니다.
    5. 피크 찾기 대화상자에서 자동 찾기 활성화를 비활성화하고 추가를 클릭합니다.
      1. 맞춤할 피크가 있는 스펙트럼의 플롯이 포함된 창을 두 번 클릭합니다.
      2. 2차 도함수(단계 5.7.4) 또는 참조 테이블(예: 표 2)에서 관찰된 최소값을 기반으로 피크를 선택합니다.
      3. 완료를 클릭한 후 다음(보충 파일 1 - 보충 그림 S33D)을 클릭합니다.
    6. 피 크 맞춤(Pro) 대화 상자에서 현재 피팅 결과에서 보고서 생성 을 선택하고 맞춤을 클릭합니다. 그 다음에는 마침 (보충 파일 1 - 보충 그림 S33E)이 이어집니다.
    7. 워크북의 PeakProperties1 탭을 평가하여 각 피크의 중심, 통합 영역 및 FWHM을 확인합니다(보충 파일 1 - 보충 그림 S34). 단계 5.5.9에서와 같이, 각 성분 피크를 2차 구조 유형에 연관시키고, 그 2차 구조를 가진 단백질 구조의 백분율을 평가한다.
파수 범위(cm-1)숙제
1605년−1615년Tyr 측쇄/응집된 β가닥
1616년−1621년응집된 β가닥/분자내 β시트 [약함]
1622년−1627년분자간 β시트 [강함]
1628년−1637년분자 내 β 시트 [강함]
1638년−1646년랜덤 코일/확장 체인
1647년−1655년랜덤 코일
1656년−1662년α 헬리스
1663년−1696년회전
1697-1703분자간 β시트 [약한]

표 2 : Hu et al.57의 여러 연구에 대한 비교 평가를 기반으로 한 Bombyx mori 실크에 대한 Amide I 영역 진동 밴드 할당.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이상적인 회전 가능한 도프 용액은 투명하고 침전물이 없으며 점성이 있는 용액으로, 단백질이 완전히 용해되었음을 나타냅니다(그림 7A). 반대로, 불완전한 용해는 유백색 현탁액 또는 눈에 보이는 침전물을 초래합니다(그림 7B,C). 완전한 단백질 용해에 필요한 시간은 용매의 함수에 따라 다르며, TFA/TFE/H2O 혼합물과 같은 일부 용매는 일반적으로 30분 시간 간격 내에 단백질을 완전히 용해시키는 반면, HFIP와 같은 다른 용매는 가끔 소용돌이와 함께 하룻밤 교반이 필요할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 7: 스피닝 도프 용액 최적화. (A) 단백질을 완전히 용해시킬 수 있는 용매는 투명하고 점성이 있는 회전 가능한 도프 용액을 제공합니다. 최적이 아닌 용매 선택에 의한 단백질의 부분 용해 또는 현탁은 (B) 일반적으로 눈에 보이는 침전물이 있는 지나치게 점성 상태 또는 (C) 유백색 현탁액을 초래할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2E 는 대표적인 손으로 그린 섬유를 보여주고 그림 4D 는 스풀링된 습식 방사 섬유를 보여줍니다. 다운스트림 분석 전에 광학 현미경은 섬유 품질을 평가하는 데 필수적입니다. 다운스트림 분석에 적합하고 두 가지 다른 조건을 사용하여 방적된 습식 방사 재조합 실크 섬유의 대표적인 광학 현미경 사진(샘플 습식 방사 구성은 그림 3 참조)이 그림 8에 나와 있습니다. 광학 현미경(그림 8A)에 의해, 이러한 섬유는 균일한 직경을 나타내며, 스핀 후 드로우를 적용할 때 감소된 직경이 명백합니다(즉, 40% 에탄올(4x-EtOH)에서 4x 비율로 연신된 방적(AS) 대 방사 후). 편광 현미경에서 더 큰 대비를 초래하는 더 큰 복굴절(그림 8B)은 스핀 후 드로잉 공정의 결과로 섬유의 향상된 분자 정렬과 일치합니다. 마지막으로, 평가된 섬유의 일부에서 결함이 관찰될 가능성이 높으며, 이로 인해 특정 섬유 세그먼트가 다운스트림 분석에 적합하지 않다는 점에 유의해야 합니다. 그림 9에는 이러한 두 가지 예가 나와 있습니다.

figure-results-2
그림 8: 습식 방사 재조합 거미줄 섬유의 대표적인 광학 현미경 사진. AS 상태의 섬유와 에탄올(EtOH)의 4x 스핀 후 스트레칭에 따른 섬유는 광학 현미경(왼쪽 열) 및 편광 현미경(오른쪽 열)으로 관찰된 키메라 피리형-선방형 실크 구조물(Py2W2)에 대해 설명됩니다. 이미지는 Ghimire et al.17의 허가를 받아 복제되었습니다. 스케일 바 = 30 μm. 약어: AS = as-spun; EtOH = 에탄올. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 9: 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있는 잠재적인 섬유 결함의 예. (A) "부풀어 오른" 결함의 예. (B) "네킹" 결함의 예. 스케일 바 = 20 μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

주어진 섬유 세그먼트에 결함이 존재하지 않는지 확인하고 직경 결정(프로토콜 섹션 3.2)에 따라 인장 테스트를 수행할 수 있습니다(예: 그림 6). 다양한 조건을 사용하여 방적된 키메라 재조합 거미줄에 대해 얻은 대표적인 응력-변형률 곡선이 그림 10에 나와 있습니다. 방사 조건에 따라 생성된 섬유는 부서지기 쉬운 섬유(AS 상태)부터 AS 상태와 유사한 강도를 가진 고신장성(2x-공기 상태), 훨씬 더 강하고 덜 신장성 있는 섬유(4x-EtOH 상태)까지 다양합니다. 기계적 거동을 명확하고 엄격하게 평가하려면 여러 섬유 세그먼트와 방사 섬유 배치를 평가해야 한다는 점에 유의해야 합니다.

figure-results-4
그림 10: 다양한 조건에서 방적된 섬유의 대표적인 응력-변형률 곡선. 섬유는 방사 상태(AS) 또는 자동화된 방사 후 연신(인발 비율 및 연신 조건(공기 대 용매) 표시)을 사용하여 생산을 통해 분석되었습니다. Ghimire et al.(2024)17의 허가를 받아 수정된 그림. 약어: AS = as-spun. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마지막으로, 섬유 상태 2차 구조는 ATR-FTIR 분광현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 방법론에 의해 획득된 일반적인 실크 섬유 스펙트럼(그림 11A,B)은 넓은 아미드 A 피크(~3,300 cm-1 중심), 아미드 I 피크(~1,600-1,700 cm-1) 및 아미드 II 피크(~1,500-1,600 cm-1)를 포함하는 특징적인 단백질 밴드를 가질 것입니다. 여기에서는 아미드 I 영역의 평가에 중점을 둡니다(예: 그림 11C,D). 2차 도함수 분석은 아미드 I 피크의 주요 성분을 식별하는 수단으로 유용하며(그림 11E,F), 정량적 피크 디콘볼루션(그림 11G-J)에 대한 신뢰성을 제공하여 주어진 조건에서 방적된 실크 섬유에서 관찰된 2차 구조 유형의 비율을 평가하고 비교할 수 있습니다.

figure-results-5
그림 11: FTIR 스펙트럼 및 2차 구조 분석. (A,B) (A) 방적(AS) 상태에서 습식 방사에 의해 생성된 Py2W2 섬유의 FTIR 스펙트럼 및 (B) 에탄올에 4 방사 후 스트레치를 통합합니다. (C,D) FTIR 스펙트럼의 Amide I 영역은 각각 A와 B에 표시됩니다. (E-F) 표시된 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산된 C와 D에 각각 표시된 아미드 I 영역의 2차 도함수입니다. (G-J) (G 및 I) OMNIC 또는 (H 및 J) OriginPro 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행된 Amide I 피크 디콘볼루션은 패널 G 및 I는 C 및 H 및 J to D에 해당하는 디콘볼루션입니다. 약어: FTIR = 푸리에 변환 적외선; AS = 방적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

개별 기술을 넘어 2차 구조화, 기계적 성능 및 (초)분자 배향 데이터의 상관 관계는 일반적으로 결과 재료에 대한 다양한 방사 매개변수의 영향을 이해하고 방사 공정을 합리적으로 최적화하는 데 필수적입니다. 예를 들어, 그림 11에 표시된 FTIR 디콘볼루션에서 키메라 실크에 대한 AS와 4×-EtOH 조건을 비교하면 아미드 I 밴드에 대한 상당한 β-시트 기여는 두 조건 모두에 대해 명확하지만 디콘볼루션 방법에 관계없이 AS 상태에 비해 방사 후 스트레칭 상태에 대한 전체 2차 구조의 더 큰 비율을 차지합니다(예: 그림 11G,H 대 그림 11I,J). 이는 AS 상태보다 4×-EtOH 조건에서 관찰된 실질적으로 더 높은 강도(그림 10)와 AS 상태에 비해 4×-EtOH 조건에서 분자 정렬의 개선(그림 9)과 일치합니다. 그림 10에 표시된 조건 범위를 포괄하는 자세한 특성화 및 분석은 이전에 보고되었습니다17. 따라서 우리는 여기에서 전체 분석을 요약하지 않고 대신 이 쌍별 비교를 사용하여 이 세 가지 데이터 클래스가 서로 보완적이고 단독으로 있는 한 가지 기술보다 섬유 거동에 대한 훨씬 더 포괄적인 이해를 개발할 수 있는 방식을 보여줍니다.

보충 파일 1: 섬유 직경 측정, 기계적 데이터 처리, FTIR 데이터 수집 및 처리를 묘사하는 보충 그림 S1-S34가 포함된 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 질량 대 시간 데이터에서 주요 기계적 특성(즉, 응력, 변형률, 영률 및 인성)을 결정할 수 있는 스프레드시트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

재조합 단백질 생산은 다양한 형식의 재료를 제조할 수 있는 흥미로운 잠재력을 가능하게 하며, 최근의 발전은 이러한 단백질 기반 재료가 더 광범위한 산업적 사용에 가까워지고 있음을 의미합니다58. 여기에서는 재조합 실크의 섬유 생산에 초점을 맞추었는데, 이는 토착 섬유질 거미줄과 직접적인 관련이 있는 재조합 실크의 형식이기 때문입니다. 실크 섬유는 천연 거미줄의 유명한 기계적 특성과 지속 가능한 고성능 섬유를 생산할 수 있는 잠재력으로 인해 수많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있다고 선전되어 왔습니다32. 제안된 응용 분야는 고성능 직물에서 에너지 흡수 재료, 개인 위생 제품, 의료 용도에 이르기까지 다양합니다58,59. 웨어러블 형식 또는 전기 전도성이 향상되는 기타 상황에서의 거미줄 기반 장치 및 재료도 생물 의학 및 더 넓은 응용 분야 모두에 대해 활발히 탐구되고 있습니다60. 따라서 거미줄 기반 소재의 개발, 최적화 및 맞춤화에 대한 광범위한 관심이 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 새로운 재조합 실크 단백질의 준비 후 또는 이미 방사 가능한 것으로 확립된 재조합 실크의 재료 특성을 조절하기 위해 신속한 섬유 생산을 목표로 하는 일련의 절차를 간략하게 설명합니다.

사용되는 방사 방법에 관계없이, 본원에 자세히 설명된 바와 같이 용매/완충액 조건 및 단백질 농도의 스크리닝을 통해 스핀 도프 생산을 가능하게 하는 조건을 결정하는 것이 중요합니다. 궁극적인 목표는 "생산적인" 방사를 방해하는 응집체 또는 기타 불용성 종으로 경로를 벗어난 자가 조립 없이 섬유로 빠르게 전환할 수 있도록 충분히 높은 농도에서 단백질을 가용화하는 것입니다. 이것은 전형적으로 투명하고 상대적으로 점성이 있는 용액이며, 미셀/나노입자(26,61) 및/또는 액체-액체상 분리(62)와 같은 자체 조립된 종을 포함할 가능성이 높다. 이 프로토콜은 다양한 스핀 도프 및 스피닝 구성의 반복적인 평가를 통해 성공적인 섬유 스피닝을 달성할 수 있기 때문에 스핀 도프 상태를 포괄적으로 평가하는 방법을 자세히 설명하지 않습니다. 스핀 도프 상태에 대한 상세한 분자 및 초분자 통찰력은 점도계, 광산란, 원자외선 원형 이색성 분광법, 핵자기 공명 분광법 및/또는 전자 현미경과 같은 기술을 통해 달성될 수 있습니다26. 또한 재조합 단백질 자체는 스피닝에 대한 거동을 향상시키기 위해 변형될 수 있으며, 구형 비반복 N-및 C-말단 도메인을 포함하는 것이 스피드로인 용해도를 증가시키는 방법의 한 예라는 점에 유의해야 합니다32. 요컨대, 적절한 스핀 도프 식별 없이는 스피닝 조건의 비교 테스트를 진행할 수 없습니다.

하나 이상의 스핀 도프 조건이 확인되면 핸드 드로잉은 실크 섬유 특성을 평가할 수 있는 신속한 경로를 제공합니다. 생산적인 손으로 그리기 위해서는 훨씬 적은 양의 도프가 필요하기 때문에 훨씬 더 적은 질량의 순수 단백질이 필요하므로 이는 자동화된 습식 방사 접근 방식의 탁월한 전구체입니다. 이것은 또한 상이한 스피드로인(33)의 섬유질 특성을 직접 비교하는 매우 다루기 쉽고 간단한 방법을 제공하며, 소량의 단백질로 섬유 생산이 상대적으로 간단하다는 이점이 있습니다. 이는 습식 방사에 필요한 더 높은 수율을 얻기 위한 단백질 발현 및 정제 프로토콜의 최적화가 가장 유망한 스피드로인에 집중될 수 있음을 의미합니다. 물론 단점은 손으로 그리는 것이 긴 연속 섬유나 상당한 양의 섬유를 유선형 방식으로 생산하는 데 적합하지 않다는 것입니다.

충분한 단백질이 주어지면 습식 방사는 길고 연속적인 섬유의 간소화된 생산에 이점을 제공합니다32. 뿐만 아니라 섬유 특성은 방사 공정을 통해 쉽게 조절될 수 있습니다. 예를 들어, 스피닝 도프 조건을 선택하면 섬유 역학을 개선할 수 있는 하나의 명확한 경로를 제공합니다. 예를 들어, ~60kDa 재조합 선방형 실크 단백질의 경우, 다른 모든 스피닝 매개변수가 일정하게 유지된 상태에서 한 스핀 도프에서 다른 스핀 도프로 변경하면 섬유 확장성이 극적으로 변화했습니다26. 이것은 차례로 방사 전에 스핀 도프에서 선방형 스피드로인이 조립되는 방식과 관련이 있었으며, 스핀 도프에서 자체 조립된 나노입자의 향상된 균질성은 개선된 섬유 역학과 상관관계가 있었습니다. 주어진 섬유 유형에 대해 드로우 비율이 최적화되어야 한다는 점에 주목하는 사후 스핀 드로우의 통합은 또한 일반적으로 개선된 분자 정렬 및 예를 들어 섬유를 강화하는 β-시트 결정체로의 향상된 변환의 일부 조합을 통해 실크 섬유 역학을 개선합니다32. 마지막으로, 스핀 후 드로잉 단계에서 다양한 조건을 사용하면 섬유 특성을 조절할 수 있는 수단이 제공됩니다. 드로잉 직전 또는 도중에 용매 노출은 섬유의 기계적 및 구조적 특성을 실질적으로 변화시킬 수 있으며17,38, 다른 스피드로인은 서로 다른 용매 선호도 및 허용 오차를 가질 수 있습니다(예를 들어, 재조합 선방형 섬유는 물 호환성이 매우 높습니다26,31 대 재조합 피리폼 섬유는 물에서 수축을 겪습니다38 질량 기준으로 단백질의 절반 미만임에도 불구하고 aciniform spidroin의 물 호환성을 나타내는 키메라 pyriform-aciniform spidroin의 섬유대 17).

설명된 프로토콜은 재조합 거미줄의 방사성 및 섬유 특성을 평가하고 최적화하기 위한 고도로 맞춤화 가능하고 다양한 접근 방식을 제공합니다. 모든 경우에 결과 섬유 특성을 일관되고 강력하게 분석하고 비교해야 합니다. 여기에서는 편광 현미경, 인장 시험 및 FTIR 분광현미경을 포함한 광학 현미경을 이러한 목적을 위한 기술의 "표준 툴킷"으로 사용할 것을 제안합니다. 결과 섬유에 대한 이해를 넓히기 위해 추가적인 생물물리학 및 재료 특성화 기술을 적용할 수 있지만, 이 기술 세트는 형태학, 원섬유 내 정렬/이방성, 기계적 성능 및 단백질 2차 구조화의 주요 특성에 대한 탁월한 범위를 제공합니다. 특히, FTIR 분광현미경은 실크 섬유 2차 구조화를 평가하는 비교적 간단한 수단을 제공하고 편광 현미경은 달성된 향상된 분자 정렬의 정도에 대한 추론을 허용하지만, 고체 NMR 분광법(63,64), X선 회절(64), 편광 라만 분광현미경(65) 및/또는 비선형 광학 현미경(54)과 같은 다른 방법론은 완전한 구조-역학 관계 해명을 위해 실크 섬유 내의 결정화도, 정렬 및 구조화를 보다 포괄적으로 평가하기 위해 고려해야 합니다. 다른 유형의 단백질66에 대한 습식 방사의 적합성을 감안할 때, 우리는 이 프로토콜이 재조합 실크를 넘어 일반적으로 적용될 것으로 예상합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan K. Rainey는 주식 또는 주식 및 자금 보조금을 포함하는 3DBioFibR Inc.와의 관계를 보고합니다. 다른 저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업에 대한 자금은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 디스커버리 보조금(X-QL에 대한 RGPIN-2020-06083 및 JKR에 대한 RGPIN-2023-05912), 국방부/NSERC 보충 자료(JKR에 대한 DGDND-2023-05912), 3DBioFibR Inc와 협력하여 NSERC 얼라이언스 보조금(JKR에 대한 ALLRP-578541-22) 및 NSERC 연구 도구 및 기기 보조금. AG는 Molly Appeal Donors의 지원으로 자금을 지원하는 박사 수준의 노바스코샤 대학원 장학금(NSGS-D)과 Dalhousie 의과대학 2024 대학원 학생을 받았습니다. HB는 NSERC가 자금을 지원하는 Vanier Canada 대학원 장학금, Killam Predoctoral Scholarship(레벨 2) 및 NSGS-D를 받았습니다. SE는 NSERC 박사 대학원 장학금(PGS-D), NSERC/국방부 추가 자금 상, Walter C. Sumner 기념 펠로우십을 받았습니다. 저자는 Sophie Haverstock과 Emily Smith의 기술 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,1,1,3,3,3-헥사플루로프로판올(HFIP)Thermo Fisher Scientific445820500프 준비에 사용,
루어 팁 시멘트 바늘이 있는 1725LTSN 주사기 해밀턴81100습식 방적에 사용
2,2,2-트리플루오로에탄올(TFE)시그마-알드리치T63002-500G도프 준비에 사용
수 에탄올피셔 사이언티픽BP28184고조에 사용 
아세트산피셔 사이언티픽A38-212도프 준비에 사용
저울틀러 토레도 XS105 이중 범위인장 시험 장치
염화칼슘(CaCl2)Sigma-AldrichC-3881도프 준비에 사용
연산 Millipore Sigma77-92-9마약 준비에 사용
컴퓨터라즈베리 파이라즈베리 파이 4 모델 B 습식 방사 장치 - 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 스테퍼 모터를 제어할 수 있는 기능을 제공합니다.
인산수소이나트륨(Na2HPO4)Millipore Sigma7558-79-4도프 준비에 사용
름산 피셔 사이언티픽A118-500도프 준비에 사용
유리 슬라이드 Millipore SigmaS8902-1PAK섬유 장착에 사용
염산(HCl)EM 과학HX0603-53도프 준비에 사용
MCT-A 냉각 검출기 - Thermo Fisher Scientific840-199300섬유 2차 구조의 FTIR 평가
마운팅 플레이트 자체제작습식 방사 장치
NEMA 17 생체극성 스테퍼 모터STEPPERONLINE17HS15-1504S-X1습식 방사 장치 참고: 스핀 후 스트레칭을 수행하는 데 여러 모터가 필요합니다
Nicolet iN10 FTIR 분광현미경Thermo Fisher Scientific- 912A0604섬유 2차 구조의 FTIR 평가
Nicolet iN10 매핑 스테이지Thermo Fisher Scientific840-198800섬유 2차 구조의 FTIR 평가
Nicolet iN10 전동 스테이지 조이스틱 Thermo Fisher Scientific840-199800섬유 2차 구조의 FTIR 평가
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350Thermo Fisher Scientific840-194800 섬유 2차 구조의 FTIR 평가
OMNIC Picta ver. 1.7.224Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR 기기 제어 소프트웨어
OMNIC ver. 9.11.745Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR 기기별 데이터 처리 및 분석 소프트웨어
광학/편광  현미경Zeiss CanadaAxio Observer A1도립 광학 현미경
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196타사 FTIR 데이터 처리 및 분석 소프트웨어
인산이수소칼륨(KH2PO4)Fisher ScientificP285-10도프 제조에 사용
염기성 칼륨(K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500도프 제조에 사용
전원 공급 장치ALITOVEALT-1205습식 방사 장치 - 12V 5A 전원 공급 장치 어댑터 컨버터 AC 100-240V 입력(5.5x2.5mm DC 출력 잭 포함) - 참고: 최적의 성능을 위해 각 모터에 별도의 전원 공급 장치가 필요할 수 있습니다
세트산나트륨 Sigma-AldrichS2889-1KG도프 준비에 사용 수
산화나트륨(NaOH)Millipore Sigma1310-73-2도프 준비에 사용 스
피닝 롤러 사내에서습식 방사
스테퍼 모터 케이블XMSJSIYB0BD5FV3R2습식 방사 장치 - 스테퍼 모터 컨트롤러에서 스테퍼 모터로 연결 제공
스테퍼 모터 컨트롤러(Pi HAT)AdafruitDC & 라즈베리 파이용 스테퍼 모터 HAT식 방사 장치 모터 컨트롤러 순열 1 - 참고 ~46rpm의 제한된 모터 회전 속도
스테퍼 모터 컨트롤러(USB)PoluluTic T249습식 방사 장치 모터 컨트롤러 순열 2 - 46rpm보다 빠른 회전이 필요할 때 사용
주사기 펌프KD ScientificModel 100인장 시험 장치 및 습식 방사 장치
트리플루오로아세트산(TFA)Millipore SigmaTX1276-7도프 준비에 사용
Tris-hydrochloride EMD Millipore9310-500GM원약 준비에 사용
USB 허브AcasisB07Q3TYF15 습식 방사 장치 - 48W 전원 공급 USB 허브 - ACASIS 10포트 USB 3.0 데이터 허브 - 개별 온/오프 스위치 및 12V/4A 전원 어댑터 포함 USB 분배기 - Raspberry Pi와 Tic T249 스테퍼 모터 컨트롤러 간의 인터페이스
도 무 응 분석 메 구 포. - 인산이. 아 제작 에 사용 습

참고문헌

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Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
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