신경 수리 및 기능 회복 연구를 위한 마우스 좌골신경 절단/봉합 절차

Summary

이 프로토콜은 성체 등뿌리 신경절 뉴런을 이용한 말초 신경 재생을 연구하기 위해 쥐에서 좌골신경 절단 및 봉합 모델을 설명합니다. 이 연구는 신경 손상 후 축삭 재생, 근육 재신경 재생, 기능 회복에 대한 생체 내 분석을 가능하게 합니다.

Abstract

신경 수리는 축삭 손상 후 기능 회복에 매우 중요합니다. 그러나 중추신경계(CNS)의 성숙한 뉴런은 내재적 성장 능력 저하와 적대적인 환경 때문에 손상 후 축삭 재생 능력이 제한적입니다. 반면, 말초 신경계(PNS)의 뉴런은 강력한 재생 능력을 보입니다. 그중 성인 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런은 말초 신경 손상 후 효과적으로 재생하는 능력으로 특히 잘 알려져 있어, 신경 수리의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 모델입니다. 여기서는 '루프-비포 랜섹션'이라 불리는 수정된 미세봉합 기법을 설명하는데, 마우스에서 좌골신경 절단 및 봉합 모델을 생성하고 축삭 재생 분석을 진행합니다. 행동 평가와 근육 재신경 자극도 기능 회복을 평가하는 데 입증되었습니다. 좌골신경 절단 및 봉합 후 동물은 처음에는 행동 결함을 보이지만, 보통 부상 후 30일경에 완전한 회복이 관찰됩니다. 손상 부위에 축삭 융합을 촉진하는 약물을 적용하면 기능 회복이 크게 가속화됩니다. 이 모델 시스템은 생체 내 포유류 신경 수리 메커니즘을 조사하는 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

축삭 손상은 뇌 및 척수 손상의 흔하고 심각한 결과로, 외상성 손상, 신경독소 또는 신경 연결성을 방해하고 축삭 재생을 저해하는 신경학적 장애에 의해 자주 발생합니다 ^1,2. 모든 신경세포는 재생 능력을 가진 것이 아니며, 절단된 축삭 수리에 매우 중요합니다. 축삭 재생 속도는 뉴런의 고유한 성장 잠재력, 단백질 합성 효율, 세포골격 역학, 미엘린 잔해 제거, 성장 인자의 가용성 등 여러 요인에 의해 영향을 받습니다 ^3,4.

성체 포유류 중추신경계(CNS)에서는 축삭 손상이 재생 능력 저하를 초래하는데, 이는 주로 내재적 성장 촉진 인자의 부족과 억제성 외재 신호의 존재로 인해 발생합니다 ^1,5. 반면, 말초 신경계(PNS)의 축삭은 말초 신경세포의 고유한 자기 수리 메커니즘과 재생 촉진 프로그램의 빠른 재활성화 덕분에 손상 후 강력한 재생 능력을 가지고 있습니다. 손상 시 축삭의 원위 구절이 신경 체세포에서 분리되어 월러식 퇴행을 겪는데, 이는 축삭 해체와 단절이 특징입니다 ^6,7. 교세포가 축삭과 미엘린 잔해를 효율적으로 제거하는 것은 성공적인 재생에 필수적이며, 이는 축삭 성장을 방해할 수 있는 흉터 형성을 방지합니다 ^3,8. 이 과정은 손상된 축삭의 세포골격 재형성과 함께 근위 절단부의 재성장을 지원하고 표적 재신경 신경을 촉진합니다. 이 사건들은 부분적으로 겹치는 단계에서 발생하며, 이 과정에서 ATF3와 c-Jun과 같은 전사인자의 손상 유도 활성화가 재생성 유전자 발현 프로그램을 촉진합니다 ^4,9,10.

재생 축삭 융합은 축삭 손상 후 신경 연결성을 회복하는 효율적인 메커니즘을 나타냅니다¹¹. 이 과정은 1967년 가재(Procambarus clarkii)에서 처음 기술되었으며, 이후 Caenorhabditis elegans¹⁷을 포함한 여러 종^13,14,15,16에서 문서화되었습니다. 포유류에서 축삭 융합에 대한 직접적인 증거는 제한적이지만, 융합 유도 전략이 신경 복구를 향상시키는 데 성공적으로 사용되었습니다¹¹. 특히, 화학물질인 퓨소겐 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 막 재밀봉을 촉진하며, 포유류 모델(18,19,20,21,22,23,24)에서 말초 신경 및 척수 손상 후 기능 회복을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 최근 연구 결과에 따르면 글루타티온 과산화효소(GPX) 고갈이 C. elegans²⁵에서 축삭 융합을 촉진하기에 충분함을 보여줍니다. 마찬가지로, Gpx4 조건부 녹아웃 마우스나 GPX 억제제 ML162 치료를 받은 쥐는 좌골신경 절단 후 기능 회복이 가속화되었으며, 이는 축삭 융합 강화를 통해 가능할 수^{있습니다.}

좌골신경은 감각, 체성 운동, 자율신경 운동 축삭으로 구성된 혼합 신경^입니다. 쥐²⁷에서는 L4 및 L5 척수 분절에서, 쥐²⁸에서는 L3 및 L4 분절에서 발생한다. 접근성과 해부학적 일관성 덕분에 좌골신경 손상은 말초 신경 재생 연구에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나가 되었습니다^29,30. 이 모델들은 축삭 성장과 기능 회복에 영향을 미치는 내재적 신경 기전과 외부 환경 요인 모두를 조사할 수 있게 합니다 ^3,4,9. 좌골신경 압박을 신경과학에서 실험적 패러다임으로 사용한 것은 19세기 후반으로 거슬러 올라갑니다. 신경 압박 모델 외에도, 신경 절단은 축삭 재생과 기능 회복 연구에 널리 사용됩니다. 그러나 쥐에서 고전적인 좌골신경 절단 후 봉합하는 방식은 신경의 크기가 작고 조직이 약하기 때문에 쥐보다 재현성과 신뢰성이 떨어지는 경우가 많습니다.

"루프 전-절단(loop-before-transection)"이라 불리는 수정된 좌골신경 절단 및 봉합 모델을 사용하여 재현 가능한 좌골신경 절단 및 봉합 모델을 성공적으로 생성하였다²⁵. 이 방법은 절단 전에 봉합사를 미리 삽입하여 절단 후 신경 조작을 없애 기계적 스트레스를 줄이고 수술 기법에 따른 변동성을 최소화합니다. 중간 정도의 GPX 조절은 마우스 좌골신경 완전 절단 후 기능 회복에 기여하는 것으로 나타났다²⁵. 좌골신경 절단(SNT)/봉합 병변에 저농도 ML162(0.25 μM)³², GPX 억제제, 폴리에틸렌글리콜(PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24의 공동 치료는 핀 프라이크, 발 결함 비대칭, 발가락 ^{확장 검사로} 평가된 행동 점수를 성공적으로 향상시켰^습니다.34. 포유류 배근신경절(DRG) 뉴런의 절단된 원위 축삭 조각이 3일 이내에 퇴화하여 신경근 접합부(NMJ^)6,35가 손상되고, 재생 DRG 뉴런이 근육을 재신경 신경으로 재조정하여 기능을 회복시킵니다. SNT/봉합-ML162/PEG 공동 치료군은 수술 후 3일째 초기 시점에서 신경 지배 NMJ와 향상된 행동 점수를 보여, 신경근 기능의 조기 회복을 나타냈다²⁵.

여기서는 쥐에서 위에서 관찰된 '루프-선-절단(loop-before-transection)' 미세봉합법과 약물 투여법을 설명한다. 절단된 쥐 신경을 신속히 복구할 수 있는 기존 PEG 융합 프로토콜^{이 수정되었습니다}. 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 처음에 시험관 내에서 절단된 가재 내측 거대 축삭(MGA)의 외부 재결합을 촉진하는 것으로 보고^{되었습니다.} PEG 융합 프로토콜은 쥐 좌골신경의 압착-절단 손상이 포함된 시험의 25%-30%에서 행동 결과를 개선했으나, 초기 시점³⁴에서는 기능 회복이 관찰되지 않았습니다. 이후 개선에서는 내인성 막 밀봉 개념이 도입^{되었습니다.} 신경 손상 후 신속 형상류 수리는 신경 보호 효과가 있어 신경퇴행을 예방합니다. ^Ca-2+에 의해 유도된 막 소포의 축적이 이 밀봉 과정을 촉진합니다³⁸. 완전한 신경 절단은 아소솔마뿐만 아니라 병변 부위의 내막, 회음막, 외핵막도 파괴합니다. 외신경 피스의 미세봉합은 근위와 원위 신경 절단부를 정렬합니다. 봉합 단계에서^Ca-2+-프리 저장성 식염수를 사용하면 막에 묶인 소포 형성이 줄어들어 내막 및 주위 소포가 열린 상태를 유지하고 외신경 봉합사에 의해 가까이 비합할 수 있습니다. 이후 Ca2⁺ 함유 식염수를 투여하면 소포 축적을 유도하여 남은 형질체 교란을 봉인한다¹⁸.

이 프로토콜에서는 성체 FVB 마우스(8-10주)와 C57BL/6 마우스를 사용했으며, 균주 특이적 차이는 관찰되지 않았습니다. 쥐의 좌골신경은 둔근 아래 약 1-2mm 지점, 허벅지 중간 높이에 위치하며, 쥐보다 현저히 얇고 연약하여 해부 및 봉합 시 더 높은 수술적 정밀도가 필요합니다. 기능 회복을 저해할 수 있는 신경 과도한 스트레칭이나 과도한 조작을 피하는 주의가 필요합니다. 이 방법은 신경을 완전히 절단하여 근위와 원위 절단 사이에 물리적 틈을 만드는 것을 포함합니다. 이 틈은 직접적인 축삭 재생을 방해하기 때문에, 성공적인 회복은 일반적으로 미세수술이나 신경 이식이 필요합니다.

쥐의 좌골신경은 쥐보다 더 얇고 섬세하기 때문에 더 높은 수술적 정밀도가 요구됩니다. 미세봉합술은 흔히 사용되지만, 과도한 조작이나 반복적인 바늘 삽입으로 인해 의도치 않게 추가적인 외상을 초래할 수 있습니다³⁹. 이러한 한계는 변동성을 초래하고 새로운 치료 전략 평가를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 따라서 봉합으로 인한 신경 손상을 최소화하면서 일관된 수술 결과를 달성하는 것이 신경 절단 모델에서 기능적 회복을 신뢰성 있게 평가하는 데 필수적입니다. 이 '루프-선-절개' 방법을 사용하여 재현 가능한 좌골신경 절단 및 봉합 모델을 생성하고, PEG와 ML162 이중 치료가 기능 회복에 미치는 효과를 평가하였습니다. 전반적으로, 광범위한 사용에도 불구하고 마우스 좌골신경 절단 모델은 신경의 크기가 작고 취약하기 때문에 기술적인 어려움을 안겨줍니다. 여기서 설명하는 이 수정된 봉합법은 기계적 손상을 최소화하는 재현 가능하고 표준화된 미세수술 프로토콜에 대한 중요한 필요를 해결합니다.

Protocol

모든 동물 시술은 텍사스 대학교 샌안토니오 보건과학센터의 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침(프로토콜 번호: 20200082AR)에 따라 수행되었습니다. 여기서 설명한 JoVE 실험 절차에는 성체 수컷과 암컷 FVB 쥐(8-10주, 20-25g)가 사용되었습니다. C57BL/6 마우스(8-10주, 20-25g)는 정식 실험 이전에 실시된 예비 실습 수술에만 사용되어 다루기 및 봉합 정밀도를 최적화하였습니다. 이 실습 세션들은 '루프-선-전-절단(loop-before-transection)' 절차가 두 균주에서 유사한 결과를 보였음을 확인했으며; 따라서 이 원고에 제시된 모든 공식 데이터는 FVB 마우스에서 얻은 것입니다. 총 10마리의 FVB 쥐(수컷 5마리, 암컷 5마리)가 좌골신경 절개 수술을 위해 처음에 포함되었고, 이후 ML162 + PEG 치료를 받았습니다. 한 동물은 선천적 해부학적 변이를 보였는데, 좌골신경이 절단 부위 전에 두 개의 주요 가지로 갈라져 수술이 불완전하고 분석에서 제외되었다. 따라서 행동 및 조직학적 분석은 9마리의 동물에 대해 수행되었습니다(n = 9). 남녀 모두 재생 및 행동 회복에서 유사했으며, 성별 특이적 차이는 관찰되지 않았습니다. 추가로 한 마리의 마우스는 신경 절단 없이 이중 봉합 관통(가짜 대조군)을 시행하여 봉합 절차가 행동 결과에 미치는 잠재적 영향을 평가했습니다. 성별 간 재생 반응에서 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않았습니다. 동물들은 12시간의 밝고 어둠 주기가 있는 표준 환경에서 75°F, 40%-60% 상대습도에서 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 수용되었습니다. 수컷과 암컷 쥐를 모두 사용했으며, 수컷과 암컷 동물 간에 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않았습니다. 수술은 SomnoSuite 저유량 마취 시스템의 이소플루란 마취 하에 시행되었습니다. 행동 검사는 수술 후 2일차부터 실시되었으며, 해당 도표에 표시된 4, 7, 10, 14, 18, 22, 27일차에도 반복되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 좌골신경 절절/봉합 및 약물 치료

1. 동물을 가열된 패드 위에 올려놓아 좌골신경을 입체 해부 현미경으로 관찰할 수 있게 합니다(그림 1A).
2. SomnoSuite 저유량 마취 시스템을 사용해 쥐를 마취합니다.
   참고: 수술 시작 전에 발가락 꼬임에 대한 반사 반응이 없어 마취 깊이를 확인하세요. 각막 건조를 방지하기 위해 수의사 안과 연고를 눈에 바르세요.
3. 허벅지와 주변 털을 밀어주세요.
   참고: 면도한 털과 떨어진 털은 가능한 한 깨끗하게 제거하세요. 그렇지 않으면 털이 10-0 나일론 봉합사에 달라붙어 좌골신경을 오염시킬 수 있습니다. 남은 모발은 면도 후 실험실 테이프나 스카치 테이프를 사용해 부드럽게 제거하여 수술 부위를 깨끗하게 유지할 수 있습니다. 수술 부위를 70% 에탄올, 베타딘으로 차례로 닦고, 마지막으로 70% 에탄올로 오토클레이드 면화를 사용해 닦아냅니다.
4. 대퇴골을 찾아 미세한 수술용 가위로 허벅지 중간 높이, 약 ~1mm 뒤쪽, 평행하게 약 1.0cm(범위 0.8-1.2cm) 크기의 작은 피부 절개를 합니다.
   1. 대둔근을 부드럽게 당겨 밑에 있는 대퇴이두근을 노출시키세요. 그 다음 가위 끝을 사용해 자르지 않고 대퇴이두근의 앞뒤 머리를 부드럽게 분리하여 좌골신경 절곡 아래의 좌골신경을 노출시킵니다. 이 단계들은 현미경이 아닌 직접 시각 관찰 하에 수행됩니다.
5. 미세 박리 겸자를 사용해 좌골신경을 몸 밖으로 빼내어 수술을 원활하게 합니다(그림 1A).
   참고: 겸자를 테이프로 고정하여 일정 수준 이상 퍼지지 않도록 하여 좌골신경 손상을 최소화하세요. 겸자 끝을 좌골신경 아래에 놓고, 쥐 허벅지를 받침점으로 삼아 좌골신경을 위로 들어 올립니다. 봉합을 용이하게 하기 위해 신경을 필요한 만큼만 들어 올리고, 긴장을 주거나 바깥쪽으로 당기는 것을 피하세요. 과도한 신장은 축삭이나 주변 구조물을 손상시킬 수 있습니다.
6. 현미경을 노출된 좌골신경에 집중하세요. 이 단계부터 현미경을 사용해 15단계를 진행하세요(그림 1A).
7. 10-0 나일론 봉합사로 좌골신경을 두 배 침투합니다(그림 1B,C). 무삭제 통제를 위해 1-8단계로 가세요. 신경 절단 검사는 Step 1-11로 가세요.
   참고: 두 개의 관통이 약 1 신경 폭(~0.7 mm) 간격으로, 의도된 절단 부위 양쪽에 대칭적으로 위치했습니다. 이 간격은 근위와 원위 절단 부위의 올바른 정렬을 보장하면서 병변에 가해지는 기계적 스트레스를 최소화했습니다. 봉합사로 좌골신경 중심을 관통하여 두 개의 관통이 정확히 평행하도록 합니다. 10-0 봉합사는 작고 매우 가는 핀셋으로 조절해야 합니다. 30일간의 관찰 기간 동안 우수한 인장 안정성과 최소한의 조직 반응성을 제공해 비흡수성 10-0 나일론이 사용되었습니다. 이 물질은 쥐와 쥐의 미세수술 신경 복구 모델에 널리 사용된다^18,31. 흡수성 봉합사는 기능 회복 전에 절단된 신경 절단 부위의 정렬에 영향을 줄 수 있어 사용되지 않았습니다. 수술자에 따른 변동성을 최소화하기 위해, 모든 수술은 입체현미경 아래에서 광범위한 미세수술 실무를 거친 후 단일 전문 외과의가 수행했습니다. '루프-프포 랜섹션' 방법은 절단 후 신경 조작을 없애 변동성을 더욱 줄여 동물 간 일관된 정렬과 장력을 보장합니다. 이는 상당한 연습과 높은 수준의 제어 능력을 요구합니다. 동물 수술을 수행하기 전에 초보자들은 치실 같은 미세한 합성 실을 사용해 봉합 동작을 연습하여 입체 현미경 아래에서 손재주와 조절력을 키우는 것이 도움이 될 수 있습니다.
8. 나일론 봉합사로 조심스럽게 매듭을 지으세요.
9. 노출된 좌골신경을 근육층 아래에 넣고 4-0 나일론 봉합사로 피부를 봉합하세요.
10. 10-0 나일론 봉합사로 좌골신경을 이중 침투해도 마우스 행동에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하세요.
    참고: 이를 확인하기 위해, 절단 없이 이중 봉합 관통을 받은 쥐들은 실험군에서 사용된 동일한 행동 검사, 즉 핀 찔림, 발 결함 비대칭, 발가락 퍼짐 등을 받았습니다. 이 쥐들은 일관되게 미수술형 야생형 대조군과 동등한 만점을 기록했으며, 이는 봉합 시술만으로는 좌골신경 기능에 지장이 없음을 나타냈다.
11. 두 개의 10-0 나일론 봉합사 사이 중간 지점에서 메스를 사용해 좌골신경을 절단합니다(그림 1D).
    참고: 변동성을 최소화하기 위해 모든 수술은 동일한 훈련된 실험자가 표준화된 절차를 사용하여 수행했습니다. 또한, '절단 전 루프(loop-before-transection)' 설계는 절단 후 신경 조작을 피함으로써 변동성을 최소화하여 모든 동물의 봉합 위치와 장력을 일관되게 유지합니다. 봉합선의 위치는 동물 간 균일성을 보장하기 위해 해부 현미경으로 확인되었습니다.
12. 겸자를 치워.
13. 칼슘 클로라이드 없이 조제한 Ca+-프리 인산염 완충 식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.4)로 절단 신경을 세척합니다.
    참고: 절단된 신경 절단부를 칼슘 없는 PBS로 약 10-20초간 헹구어 혈액을 깨끗하게 하고 조기 봉합을 예방하세요. 봉합은 정렬과 조직 생존 가능성을 유지하기 위해 1-2분 이내에 신속하게 완료해야 합니다.
14. ^Ca-2+ 프리 PBS는 조직으로 흡수하여 제거하세요.
15. 나일론 봉합사로 조심스럽게 매듭을 묶으세요(그림 1E). 약물 치료가 계획되지 않았거나 필요하지 않으면 20단계로 진행하세요.
    참고: 미세 봉합에는 표준 사각 매듭이 사용되었으며, 두 개의 반대 방향 송기를 세밀한 겸자로 부드럽게 조인 형태로 입체현미경 아래에서 사용했습니다. 봉합사로 연결된 두 개의 절단된 축삭은 원래 형태에 가까운 형태로 돌아갑니다. 절단된 혈관의 재연결은 근위와 원위 신경 절단이 올바르게 정렬되었음을 시각적으로 확인할 수 있습니다. 시술 중 조직은 창백함이나 압박 없이 신선하고 촉촉해 보여야 합니다. 봉합사를 너무 꽉 묶지 마세요. 혈관이 붕괴되거나 신경이 변형될 수 있습니다. 최종 매듭을 묶기 전에 신경 말단이 긴장 없이 근사적으로 맞춰져 있는지 확인하세요. 필요하다면 신경을 당기지 않고 자연스러운 정렬을 돕기 위해 부드럽게 자세를 바꿔 주세요. 과도한 긴장은 신경종이나 섬유화 위험을 높일 수 있습니다.
16. 주사기를 사용해 PBS로 희석한 DMSO에 ML162 0.25 μM을 봉합한 좌골신경에 주입합니다. 봉합된 좌골신경을 약물에 1분간 담가둡니다.
17. ML162는 멸균 면봉으로 흡수하여 제거하세요.
18. PEG 500 mM을 증류수에 넣고, 37°C로 미리 예열한 채 주사기를 사용해 봉합한 좌골신경에 주입합니다. 봉합된 좌골신경을 약물에 1분간 담가둡니다.
    참고: 500 mM의 PEG는 운전실에서 고체화될 수 있는 밀도가 높은 용액입니다. 작동 중에는 PEG가 액체 상태를 유지하도록 주사기를 가열된 패드 위에 올려놓으세요. PEG는 인접한 지질 이중층 사이의 물 분자를 제거함으로써 막 융합을 촉진하는 것으로 여겨지며, 이를 통해 막 접촉과 자발적 융합을 가능하게 합니다. 정확한 분자 메커니즘은 아직 연구가 진행 중이지만, 이 접근법은 말초 신경 손상 모델에서 축삭 연속성을 촉진하고 기능 회복을 촉진하는 것으로 입증되었습니다.
19. PEG는 휴지로 흡수하여 제거하세요.
20. 봉합한 신경을 Ca²⁺ 함유 PBS로 세척합니다(PBS에 1 mM CaCl₂; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM 인산 완충제, pH7.4).
21. Ca²⁺ 함유 PBS를 조직으로 흡수하여 제거합니다.
22. 노출된 좌골신경을 근육층 아래에 넣고 4-0 나일론 봉합사로 피부를 봉합하세요.
23. 마취에서 회복한 동물을 다시 케이지로 돌려놓으세요.
    참고: 피부 봉합 후 수술 부위는 진통제가 포함된 국소 항생제 연고로 치료되었습니다. 각 동물은 의식을 회복해 흉골 누워 있을 때까지 온열 패드에서 모니터링되었습니다. 동물들은 개별적으로 수용되었으며, 운동 기능이 완전히 회복된 후에야 그룹으로 돌아갔습니다. 수술 환경은 층류 후드 하에 유지되지 않았지만, 모든 수술 기구는 멸균되었고, 장갑 낀 손과 멸균 도구를 사용한 무균 기법으로 시술이 이루어졌습니다.

2. 행동 검사 - 핀프릭

참고: 부상 후 높은 역치의 기계적 민감성 반응성을 평가하기 위해³³.

1. 쥐를 철망 그리드에 넣고 30분 동안 자유롭게 돌아다니며 새로운 환경에 익숙해지게 하세요.
2. 뒷발의 족저면의 가장 측면 부분은 5개의 영역(A에서 E)으로 나뉘었습니다. 아우스터리츠(사이즈 000)를 동측 발바닥 표면에 부드럽게 발라주세요. 핀 프릭은 가장 바깥쪽 발가락(영역 A)에서 뒤꿈치(영역 E)까지 두 번 붙였습니다.
   참고: 피부를 침투하지 마세요.
   참고: 동물이 두 개의 바늘 자극에서 발을 빠르게 떼면 반응이 긍정적이라고 간주되었습니다. 이 영역에서는 1등급을 받았고, 다음 영역에서는 최대 5등급으로 테스트되었습니다. 만약 어느 지원서도 긍정적인 반응을 얻지 못하면 전체 점수는 0점이 되었습니다. 같은 동측 측면의 복재부를 양성 대조군으로 사용하세요. 항상 긍정적인 반응을 이끌어낼 것입니다.

3. 행동 테스트 - 발 부차(FF) 비대칭성

참고: 좌골신경 축삭이 더 근위 근육에 얼마나 잘 신경을 지배하는지 측정하기 위해³⁴.

1. 동물들이 우리 위에 올려진 철망 격자 위에서 자유롭게 돌아다니며 환경에 적응할 수 있도록 하세요. 한 시험은 뒷다리당 총 50걸음으로 구성되어 있습니다.
2. 동물들이 실수할 때 점수를 얻는다. 점수 기준은 다음과 같습니다.
   점수 1: 부분 과실. 다리가 완전히 허벅지까지 빠지기 전에 뒤로 당겼다.
   점수 2: 전과입니다. 완전히 사타구니까지 떨어졌어요.
3. 수술 후 각 시점마다 부상당한 동물과 부상하지 않은 동물의 뒷다리를 합치는 복합 발 결함 점수를 계산합니다.
   복합 발 실력 점수 = (# 부분 실수 x 1) + (# 전면 실점 x 2)
4. 복합 발 장애 점수를 50(총 보수/사지)으로 나누어 각 뒷다리의 과상 비율을 구합니다.
   % 발 실수 = 복합 발 실수 점수/50 (총 스텝) x 100%
5. 손상된 뒷다리의 발 결함을 온전한 뒷다리의 발 결함 비율에서 빼면, 수술 후 시점에서 각 동물의 비대칭 점수를 산출합니다.
   발 잘못(FF) 비대칭 점수 = %FF(사지가 온전함) - %FF(부상당한 사지)

4. 행동 테스트 - 발가락 벌림

참고: 신경 손상 후 운동 회복 평가를 위해. 이전 연구에 따르면, 좌골신경 손상 후 운동 기능 회복을 감지하기 위해 발가락 확장 운동 검사가 보행 분석보다 더 민감하다³⁰.

1. 동물을 천으로 부드럽게 덮고 꼬리를 들어 뒷발을 잘 관찰하세요.
   참고: 대안: 쥐의 목덜미를 부드럽게 잡고 꼬리를 고정한 뒤 뒤집어 쥐가 몸을 꿈틀거리게 하여 발가락 움직임을 관찰하세요.
2. 발가락 벌림 점수는 다음과 같이 부여합니다:
   점수 2: 완전 퍼지고. 모든 발가락이 최소 2초 동안 완전하고 넓으며 지속적으로 벌어지는 것으로 정의됩니다.
   점수 1: 중간 확산. 전체 확산 점수에 도달하지 못하는 모든 움직임. 약간 떨리거나 부분적으로 움직이세요.
   점수 0: 스프레딩 없음. 전혀 움직이지 않았다.
   참고: 모든 행동 평가(핀 찔림, 발 실패, 발가락 벌림)는 치료 그룹에 눈이 가린 실험자가 재확인하였습니다. 동물들은 이전 연구(Ko 외 ²⁵)에서 사용한 설계에 따라 수술 당시 무작위로 치료 그룹에 배정되었으며, 이 연구에는 네 가지 실험 조건(봉합 단정, PEG, ML162, ML162 + PEG)이 포함되었습니다. 본 글에서는 ML162 + PEG 그룹의 데이터를 독립적으로 분석하면서도 원래의 실험적 엄밀성을 유지하고 있습니다.

5. 조직학을 위한 조직 관류 및 처리

1. 동물을 심하게 마취하고 좌심실 을 통해 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 경심 관류를 시행합니다.
2. 완전한 혈액 배출을 위해 오른쪽 심방을 절개하세요.
3. 수집된 조직을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 4°C에서 하룻밤 동안 담가 고정 시켰습니다.
4. 고정된 조직을 PBS로 세 번 세척한 후, PBS 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
5. 조직을 4°C에서 30% 자당에 담가 크라이오프로텍트하여 하룻밤 동안 진행합니다.
6. 조직을 OCT 화합물에 박고 냉동한 후 12 μm 두께로 크라이오스탯을 사용해 절개합니다.
7. 조직 블록은 -80°C에, 냉동절부는 -20°C에 보관하여 사용 전까지 보관하세요.
8. 좌골신경 수집만을 위한 경우, 혈액 함량이 말초 조직의 면역 염색 품질에 유의미한 영향을 미치지 않으므로, 관류는 생략합니다.

Results

이전 PEG 융합 프로토콜¹⁸ 은 일관된 수술 결과를 유지하고²⁵번 봉합으로 인한 신경 손상을 최소화하도록 수정되었습니다. 절단 전에 신경을 관통하도록 봉합사를 삽입함으로써, 절단 후 핀셋으로 꼬집거나 바늘로 찌르는 손상을 최소화할 수 있었습니다. 신경을 관통하는 봉합사를 묶는 것이 기능에 미치는 영향을 시험하기 위해, 봉합사는 온전한 신경을 두 번 통과시키고 매듭을 지었습니다(그림 2A, SNT 없는 봉합사). 신경을 관통한 봉합사는 수술 후 30일 후 확인했을 때 신경에 흉터가 남지 않는 것으로 관찰되었습니다(그림 2A, SNT 없는 봉합). SNT 없이 봉합만 받은 쥐는 모든 행동 검사에서 완벽한 점수를 받아, 봉합사에 의한 신경 침투가 신경 기능에 영향을 미치지 않음을 나...

Discussion

신경 절단 모델을 이용한 신경 재생 연구는 마우스 좌골신경에서 널리 수행되고 있습니다^31,39. 하지만 크기가 작고 질감이 부드러워서 수술 도구로 부드럽게 다루기 어렵고, 봉합 시 조직이 찢어지기 쉽습니다. 과도한 조작이 수반되는 미세봉합 과정은 신경 변형과 외상을 초래할 수 있습니다. 불필요한 기구 자극을 최소화하더라도, 봉합된 신경의 과도한 움직임은 여전히 정렬 불균형을 초래하여 초기 기능 회복을 방해할 수 있습니다. 이러한 변수들은 절단 모델에서 실험 결과의 일관성과 신뢰성을 저해하여, 재현성을 보장하고 신경 손상을 최소화하는 외과적 접근법의 필요성을 강조합니다.

이 수술 절차는 외과의사의 개입을 최소화하면서 변수를 조절하도록 설계되었습니다. 이 수술 절차를 설계할 때 다음과 같은 고려사항이 고려되었습니다: (...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 겸자	두모스타르-생물학	11295-51	양손에 하나씩. 10-0 나일론 봉합사를 잡으려면 두 명이 필요합니다.
10-0 나일론 봉합사	데메테크	NL761000,4F0P
4-0 나일론 봉합사	매트릭스 위저드	0197
항베타 튜불린	R& D 시스템즈	MAB1195
반 NF-200	밀리포어 시그마	N4142
Austerlitz 크기 000			핀프리크 검사에 대해
CF488 결합-알파-분가로톡신	바이오티움	00005
해부 가위	켄트 사이언티픽
미세 봉합 가위	켄트 사이언티픽
홍채 겸자	켄트 사이언티픽
K& H 소형 동물 가열 패드	K& H 반려동물 제품
ML162	밀리포어 시그마	SML2561
쥐 수술 키트	켄트 사이언티픽
바늘 홀더	켄트 사이언티픽
폴리에틸렌글리콜(PEG)	밀리포어 시그마	P5413
SCG10	노부스 바이오로지컬스	NBP1-49461
솜노스위트	켄트 사이언티픽		이소플루란 마취를 위해
스플리터 겸자			좌골신경을 노출시키는 데 사용되었습니다.