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방법 논문

간 세포의 약물 유발 노화는 M2 대식세포 분극화를 촉진합니다: 티로신 키나제 억제제 관련 간독성에 대한 시사점

899 조회수

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DOI:

10.3791/68725

⸱

2025년 10월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

이 논문에서

요약

여기에서는 SASP 기반 대식세포 분극화를 통해 라파티닙과 네라티닙으로 인한 간독성을 연구하며, 이는 전통적인 독성 테스트를 넘어 더 깊은 기계론적 이해를 제공합니다. 이 접근법은 노화 간세포가 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 이는 장기적인 약물 효과를 평가하고 약물 유발 간독성을 관리하기 위한 새로운 치료 표적을 발견하는 데 특히 유용합니다.

초록

라파티닙과 네라티닙은 HER2 양성 전이성 유방암 치료용으로 승인된 티로신 키나제 억제제(TKI)이지만 간독성으로 인해 임상적 사용이 제한됩니다. 간세포 내에서 시토크롬 P450 효소는 이러한 약물의 반응성 대사산물을 생성하여 DNA 손상, 미토콘드리아 기능 장애 및 산화 스트레스를 유발하여 간세포 손상을 유발합니다. 이 세포 스트레스는 노화 관련 분비 표현형(SASP)이라고 하는 전염증 및 조직 리모델링 인자의 분비를 동반하는 성장 정지 상태인 간세포 노화를 유발합니다. SASP는 간 미세 환경을 크게 수정하고 면역 세포 행동에 영향을 미치며 조직 손상을 악화시킵니다. 우리는 라파티닙과 네라티닙이 HepG2 간 세포주에서 노화 및 SASP를 유도한다는 것을 보여줍니다. 또한, 이러한 노화 세포의 SASP는 RAW264.7 대식세포의 M2 유사 분극화를 촉진합니다. M2 대식세포는 항염증 반응 및 조직 복구와 관련이 있지만 과도하거나 장기간의 활동은 조직 손상 및 섬유증을 유발할 수 있습니다. 우리의 연구 결과는 TKI 유도 간세포 노화 및 SASP가 면역 반응을 조절하고 유방암 환자의 간 독성에 기여할 수 있는 메커니즘을 강조합니다. 이는 간 독성을 줄이고 치료 결과를 개선하기 위해 노화 세포 또는 SASP 인자를 표적으로 삼는 것이 중요하다는 점을 강조하며, 효과적인 선생 치료제를 식별하는 것이 중요한 연구 초점이 됩니다. TKI 유도 간 세포 분비체가 대식세포 분극화에 미치는 영향을 입증하는 문헌 보고는 없습니다.

서론

소분자 티로신 키나제 억제제(TKI)인 라파티닙과 네라티닙은 전이성 유방암 치료제로 2007년과 2017년에 FDA 승인을 받았습니다1. 이러한 약물은 특정 유방암에서 과발현되는 수용체 티로신 키나아제인 인간 표피 성장 인자 수용체 2, HER22를 억제하는 것으로 알려져 있습니다3. 임상적 성공에도 불구하고 라파티닙과 네라티닙은 부작용, 특히 간독성과도 관련이 있습니다 4,5. 상승된 아미노전이효소 수치로 나타나는 급성 간 손상은 라파티닙 또는 네라티닙으로 치료를 받는 환자의 약 14%에서 발생합니다6. 간 독성은 주로 CYP3A4/5 7,8인 시토크롬 P450(CYP) 효소를 포함하는 이러한 약물의 간 대사에 기인합니다. 이들 효소는 친전자성이고 반응성이 높은 퀴논-이민 중간체의 형성을 촉매합니다 9,10. O-탈킬화 라파티닙, N-탈레킬화 라파티닙, N-하이드록시 라파티닙, O-탈킬화 네라티닙 및 N-탈메틸화 네라티닙을 포함한 이러한 반응성 대사산물은 세포 거대분자와 공유 부가물을 형성하여 정상적인 세포 기능을 방해하고 궁극적으로 간 손상을 초래할 수 있습니다11.

라파티닙과 네라티닙의 반응성 대사산물은 또한 세포 노화의 주요 유발 요인인 산화 스트레스를 유도할 수 있습니다12. 세포 노화는 성장이 멈췄지만 대사적으로 활발한 상태로, 다양한 전염증성 사이토카인, 성장 인자 및 프로테아제의 분비를 특징으로 합니다. 이 분비 표현형은 노화 관련 분비 표현형(SASP)13,14,15로 알려져 있습니다. SASP는 주변 미세 환경에 심각한 영향을 미쳐 종종 염증과 조직 리모델링을 촉진할 수 있습니다. 암 치료의 맥락에서 SASP는 암 줄기 세포 집단을 풍부하게 하고 종양 생존에 유리하도록 면역 반응을 수정할 수 있습니다16. 또한 염증성 사이토카인은 조직 손상을 악화시킬 수 있습니다. 우리는 라파티닙과 네라티닙으로 치료받은 환자에서 간 손상이 부분적으로 TKI 유발 노화 및 전염증성 SASP 생성에 의해 기여한다고 추측했습니다.

우리의 실험은 라파티닙과 네라티닙이 간 세포에서 활성 산소종(ROS) 생성을 유도하여 DNA 손상과 미토콘드리아 기능 장애를 유발하여 세포 노화를 유발한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 노화는 대식세포 분극화에 영향을 미칠 수 있는 SASP 인자를 방출함으로써 라파티닙/네라티닙 유발 간독성에 기여할 수 있습니다.

대식세포는 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, 기능적 표현형은 다양한 자극에 반응하여 변화할 수 있습니다17,18. 고전적인 M1 대식세포 표현형은 일반적으로 TNF-α 및 IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 포함한 전염증 반응과 관련이 있으며 일반적으로 급성 염증의 마커로 간주됩니다19,20. 대조적으로, M2 대식세포 표현형은 섬유증, 조직 복구21, 면역 억제 및 만성 염증에 대한 반응22,23과 관련이 있습니다. SASP의 염증성 사이토카인은 대식세포 분극화에 영향을 미쳐 M1 대식세포가 M2 유사 표현형으로의 전환을 촉진할 수 있습니다23. 이러한 분극화의 변화는 면역 미세 환경에 중요한 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 면역 억제, 종양 진행 및 조직 구조의 리모델링으로 이어질 수 있습니다.

라파티닙과 네라티닙에 의해 유도된 대식세포 편극화를 조사하기 위해 면역학 연구에 일반적으로 사용되는 쥐 대식세포 유사 세포주인 RAW264.7 세포주를 사용했습니다24,25. RAW264.7 세포는 BALB/c 마우스에서 유래하며 염증, 식균 작용 및 면역 반응을 연구하는 데 널리 사용됩니다25. 그들은 지질다당류(LPS)를 포함한 다양한 자극에 반응하며 대식세포 기능, 사이토카인 생산 및 암 생물학을 연구하는 데 특히 유용합니다26. 이 연구에서는 인간 간암 세포주인 HepG2를 환자에게서 관찰된 간독성 효과를 모방하기 위해 라파티닙과 네라티닙으로 처리되었습니다. HepG2 세포주는 인간 기원과 간세포 암종 계통으로 인해 약물 대사 및 간독성 연구 모델로 자주 사용됩니다27. HepG2 세포를 TKI로 처리한 후, 컨디셔닝된 배지를 수집하여 RAW264.7 세포에 첨가했습니다. 후속 대식세포 표현형 변화를 모니터링하여 치료가 전염증성 M1 표현형에서 면역억제성 M2 표현형으로의 전환을 유도하는지 여부에 초점을 맞췄습니다.

약물 유발 간독성은 일반적으로 세포독성 분석, 염증 표지자 평가 및 동물 모델 사용을 통해 연구됩니다. 이들과 비교하여 노화 관련 분비 표현형(SASP) 인자를 통해 TKI 라파티닙 및 네라티닙 유도 간독성과 대식세포 분극화에 미치는 영향을 조사하는 방법은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 우리의 방법은 약물 유발 노화 간 세포에 의해 생성되는 SASP 인자와 선천성 면역 사이의 연관성을 확립하며, 이는 조직 리모델링, 만성 염증 및 발암과 더 연결될 수 있습니다 28,29,30,31. 기존의 독성 스크리닝은 간과 면역 세포 사이의 단기적인 상호 작용을 포착하는 데 도움이 될 수 없으며, 특히 만성 약물 노출의 맥락에서 간 염증 및 섬유증에 대한 TKI의 장기적인 영향을 밝힐 수도 없습니다. SASP 성분을 식별하기 위해 적절한 단백질체학 접근법과 결합할 때 이 기술은 TKI 유발 간 독성의 예측 바이오마커를 식별하고 이를 완화하기 위한 치료 개입 설계를 알리는 데 도움이 될 수 있습니다 29,30,31.

구현을 위해 연구자는 설명된 대로 간 및 면역 세포주와 공동 배양 또는 조절된 배지 시스템을 활용하고 노화의 바이오마커와 M1 및 M2 대식세포를 평가해야 합니다. 이 방법은 약물 유발 급성 또는 만성 간 손상의 평가 또는 암 치료의 표적 외 효과를 최소화하기 위한 전략을 탐색하는 데 가장 효과적입니다 29,30,31.

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프로토콜

1. 세포 배양

  1. 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 MEM(Modified Eagle Medium) 고포도당과 5% CO 2 및 37°C에서 10% FBS가 포함된 RAW264.7 세포가 포함된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM) 고포도당에서 HepG2 세포를 배양하고 3일마다 새로 고칩니다.
    알림: 곰팡이 또는 박테리아 오염이 없는 한 항생제 사용을 권장하지 않습니다. RAW264.7 세포는 매우 빠르게 성장하므로 2일 후에 계대되어야 합니다.

2. MTT 분석

  1. 세포 계수 및 세포 도금
    1. 완전한 성장 배지(MEM + 10% FBS)의 세포 배양 인큐베이터에서 60mm 배양 접시에서 HepG2 세포를 성장시킵니다.
    2. 세포가 약 80% 합류하면 성장 배지를 제거하고 1 mL의 1x PBS로 빠르게 세척한 다음 600 μL의 0.5x 트립신을 첨가합니다. 5-6분 동안 배양합니다.
      참고: 모든 단계는 BSL 2 세포 배양 캐비닛에서 수행해야 합니다.
    3. BSL 내부에 1.2mL의 완전 성장 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다 2.
      참고: 과도한 트립신화를 방지하려면 추가된 트립신 부피의 두 배인 완전 배지를 추가해야 합니다.
    4. 세포 현탁액을 5mL 미세 원심분리기 튜브(MCT)에 넣고 실온(RT)에서 3-4분 동안 180g (1000rpm)에서 원심분리하여 펠릿으로 내려갑니다.
    5. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁한 다음 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 혼합한 다음 현미경 아래에서 혈구계를 사용하여 계수합니다.
    6. 다음으로, HepG2 세포를 웰당 5000-7000개의 세포로 96웰 플레이트에 플레이트하고, 각 약물 용량에 대해 3회씩 완전한 성장 배지에 플레이트하고, 인큐베이터에 12-16시간 동안 보관합니다.
      참고: 약물 처리의 경우 세포 융합성은 50-60%여야 하며 이 단계는 후드 내부에서 수행되어야 합니다.
  2. 약물 치료
    1. 후드 내부의 스톡 농도(각각 30mM 및 3.5mM)에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 점진적으로 증가하는 라파티닙 및 네라티닙의 작동 농도를 준비합니다. 최종 농도는 성장 배지(MEM + 5% FBS)에서 라파티닙의 경우 1, 2.5, 5, 10, 15, 25, 50 μM이고 네라티닙의 경우 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM입니다. 두 약물 모두에 대해 하나의 무치료 대조군을 유지하십시오.
    2. 세포가 포함된 96웰 플레이트에서 이전 배지를 버리고 약물과 함께 100μL의 배지를 첨가하고 인큐베이터 내부에서 48시간 동안 배양합니다.
  3. 염색 및 정량화
    1. 48시간 후, 10μL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 염료(MTT; 5mg/mL)를 첨가하고, 각 웰의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하고, 보라색 결정이 나타날 때까지 인큐베이터 내부에서 최소 2시간 동안 배양한다.
      참고: 염료를 약물 함유 배지에 직접 첨가하고 세포를 염료와 함께 4시간 이상 배양하지 마십시오.
    2. 배양 후 염료를 제거하고 각 웰에서 100μL의 DMSO에 결정을 녹이고 15분 동안 배양한 후 595nm에서 광학 밀도(OD)를 취합니다.
      알림: 이 단계는 후드 외부에서 수행할 수 있습니다.

3. SA-β 갈락토시다제 분석

  1. 약물 치료
    1. 플레이트당 40 x 104 개의 세포의 밀도로 35mm 접시에 HepG2 세포를 플레이트 3세트, 라파티닙용 1개, 네라티닙용 1개, 처리되지 않은 대조군 1개로 플레이트합니다.
      참고: 세포 계수 및 도금 단계는 2.1단계에 설명된 대로입니다.
    2. 5mM 작업 스톡에서 1μL의 라파티닙과 3.5mM 메인 스톡에서 1.43μL의 네라티닙을 2mL의 배지에 첨가하여 라파티닙과 네라티닙의 최종 농도 2.5μM(아치사량)을 만듭니다.
      참고: 치사율 이하의 약물 용량은 MTT 분석의 세포 생존 그래프에 따라 선택됩니다.
    3. 접시에서 이전 배지를 제거하고 500μL의 1x PBS로 한 번 세척한 다음 약물 함유 배지(후드 내부)를 추가하고 인큐베이터 내부에서 48시간 동안 보관합니다.
  2. 고정 및 염색
    1. 48시간 후, 약물을 제거하고 500μL의 1x PBS로 한 번 빠르게 세척한 후 1.5mL의 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 1x PBS에 넣고 RT에서 10분 동안 고정합니다.
    2. 고정 후 플레이트를 1mL의 1x PBS로 두 번 세척하고 고정액이 올바르게 제거되었는지 확인합니다. 1.5mL의 염색 용액(40mM 구연산/Na-인산염 완충액, 5mM K4[Fe(CN)6], 5mM K3[Fe(CN)6], 150mM NaCl, 2mM MgCl 2, 1mg/mL X-gal을 고압멸균수에 넣고 CO2 없이 37°C에서 8시간 동안 배양합니다.
      참고: 잠복기는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. HepG2의 경우 잠복기는 8시간을 초과해서는 안 됩니다.
    3. 염색 후 플레이트를 1mL의 1x PBS로 빠르게 두 번 세척하고 epi-fluorescence 현미경으로 20x 및 40x 배율로 명시야 이미지를 캡처합니다. 각 치료 그룹에 대해 최소 4-5개의 필드를 캡처합니다.
      알림: 고정액 및 염색액의 양은 플레이트 크기에 따라 다르며 모든 단계는 후드 외부에서 수행될 수 있습니다.
  3. 이미지 정량화
    1. 한 필드에서 사진을 찍고 총 셀 수와 파란색 신호를 표시하는 셀을 계산합니다. 파란색 신호가 있는 셀의 백분율을 수동으로 계산합니다. 최소 4개의 이미지를 계산하고, 평균을 취하고, 스프레드시트 그래프에 표시하고, t-검정을 수행합니다.

4. ROS 감지

  1. 세포 도금 및 약물 처리
    1. 35mm 유리 바닥 접시에 HepG2 세포를 플레이트당 40 x 10 4개의 밀도로 3세트로 플레이트화합니다: 라파티닙용 1개, 네라티닙용 1개, 처리되지 않은 대조군 1개.
      참고: 세포 계수 및 도금 단계는 2.1단계에 설명된 대로입니다.
    2. 3.1단계에서 설명한 것과 동일한 치료 전략을 따릅니다.
  2. 염색 및 이미징
    1. 48시간 처리 후, 2μM 세포 ROX 딥 레드 시약(5mM 스톡), 1μM Mito Tracker Green(1mM 스톡)을 30분 동안 첨가하고 500nM 핵 염색 염료 Hoechst(500μM 스톡)로 대조염색합니다.
      알림: 후드 내부에 염료를 첨가해야 하며 빛에 직접 노출되지 않도록 해야 합니다. 역염색은 다른 염료를 투여하는 동안 핵 염색 염료 Hoechst를 첨가하여 수행됩니다.
    2. 30분 후 염료를 제거하고 1x PBS로 세척하여 과도한 염료를 제거하고 100배 배율(각각 오일 에머젼, 640nm, 488nm 및 405nm 여기 파장)의 공초점 현미경으로 이미지를 촬영합니다.
  3. 이미지 정량화
    1. Fiji ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포 ROX 빨간색의 신호를 정량화하고 이를 처리되지 않은 대조군의 신호와 비교합니다. MitoTracker 녹색을 사용하여 신호가 미토콘드리아에서 시작되었음을 나타냅니다. 평균값으로 막대 그래프를 그린 후 t-검정을 수행합니다.

5. 컨디셔닝 미디어(CM) 수집

  1. HepG2 세포를 2.5μM의 라파티닙 또는 네라티닙으로 48시간 동안 처리합니다(이 실험을 제외하고 3.1단계와 유사한 처리 전략, 60mm 접시에 70 x104 개 세포를 플레이트).
  2. 48시간 후, 약물을 제거하고 500μL의 1x PBS로 한 번 세척합니다.
  3. 노화의 최대 날(약물 치료 48시간 후)에 48시간 동안 약물 처리된 세포와 처리되지 않은 대조군에 4mL의 무혈청 MEM 배지(FBS 또는 기타 보충제 없음)를 추가합니다.
    참고: 무혈청 배지의 부피는 플레이트 크기에 따라 다릅니다.
  4. 다음으로, 컨디셔닝 배지라고 하는 모든 세크릿톰을 포함하는 무혈청 배지를 수집하고 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관합니다.
    참고: CM을 수집한 후 죽은 세포 및 기타 세포 파편을 제거하기 위해 2800g(4000rpm)에서 5분 동안 원심분리해야 합니다. RAW264.7 세포는 일반적으로 DMEM에서 배양되지만 CM은 HepG2 배양 조건에 따라 MEM에서 수집됩니다. 호환성을 유지하기 위해 RAW264.7 배양 전에 컨디셔닝된 배지를 무혈청 DMEM과 1:1 비율로 혼합해야 합니다.

6. RAW264.7의 M1/M2 편광

  1. 셀 도금
    1. 트립신화 단계를 제외하고 2.1단계에서 설명한 대로 세포 계수 및 세포 도금을 따릅니다. RAW264.7 세포를 트립신화하는 동안 600-700μL의 0.5x 트립신을 첨가하고 인큐베이터에서 15-20분 동안 배양하고, 트립신을 중화하기 위해 2mL의 성장 배지(DMEM + 10% FBS)를 첨가하고 60mm 접시에 70 x104 세포를 3세트로 플레이트합니다: 라파티닙, 네라티닙 및 1개의 처리되지 않은 대조군.
  2. RAW264.7 유도
    1. 일반 성장 배지를 제거하고 1 mL의 1x PBS로 한 번 세척한 다음 해당 CM을 48시간 동안 추가합니다.
      참고: RAW264.7 세포는 DMEM에서 성장하므로 CM을 추가하기 전에 무혈청 DMEM으로 1:1 비율로 컨디셔닝해야 하므로 세포를 MEM에 유지하면 스트레스가 발생하여 결과가 저하될 수 있습니다. CM(무혈청 배지)에서 RAW264.7을 48시간 동안 배양하는 것도 스트레스를 유발할 수 있습니다. 이 경우 데이터를 수집하기 전에 24-30시간 배양을 수행할 수 있습니다.
    2. 배양 후, CM을 버리고 1x PBS 1mL로 세척한 다음 각 플레이트에 600μL의 트립신을 첨가하고 10분 동안 배양한 다음 RT에서 3분 동안 180g(1000rpm )에서 펠릿으로 내려갑니다. 단백질 정제를 위해 펠릿을 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관합니다.
      참고: 트립신화 시간은 세포 유형에 따라 다르며 180g 이상에서는 원심분리를 권장하지 않습니다.
  3. 단백질 분리 및 웨스턴 블로팅
    1. 방사면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액과 프로테아제 억제제 칵테일을 100:1 비율로 혼합하여 용해 완충액을 준비합니다. 용해 완충액을 세포 펠릿에 첨가하고 재현탁한 다음 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 용해 완충액의 부피는 세포 팔레트의 크기에 따라 달라지며 용해는 후드 외부에서 수행할 수 있습니다. 펠릿이 -80°C에서 보관되는 경우 먼저 얼음 위에서 펠릿을 해동하고 짧게 회전시킨 다음 잔류 매체를 제거합니다.
    2. 배양 후, 세포 용해물을 20,000g에서 4°C에서 30분 동안 회전시킵니다. 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯을 진행하거나 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다.
    3. 단백질 35-40μg을 채취하여 단백질 샘플을 준비하고, 1x 로딩 염료를 첨가하고, 95°C에서 5-6분 동안 가열하고, SDS-PAGE(10% 및 12% 아크릴아미드 겔)를 90V에서 실행한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다.
    4. 참고: 웨스턴 블롯에 대한 자세한 내용은 Joubert et al.32를 참조하십시오.
    5. 항-NOS2 및 항-ARG1 항체를 사용하여 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 현상액, iNOS(M1) 및 아르기나제1(M2)을 각각 사용하여 블롯을 현상하여 M1 및 M2 분극 마커의 발현을 확인합니다.
      참고: 1차 항체, 항-NOS2 및 항-ARG1 모두에 대한 농도는 1:1000이고 2차 항토끼 항체는 1:10,000입니다.
  4. LPS 및 IFN-γ를 이용한 대식세포 분극화
    1. 플레이트 70 x 104 RAW264.7 셀을 두 개의 60mm 접시에 담습니다.
      참고: 도금 절차는 6.1단계와 유사합니다.
    2. 12-16시간 후, 4μL의 1μg/mL 지질다당류(LPS, 스톡 농도는 1mg/mL)와 1.33μL의 33ng/mL 인터페론-γ(IFN-γ, 스톡 농도는 100μg/mL)을 4mL의 성장 배지(DMEM + 10% FBS)에 혼합하고 사전 도금된 RAW264.7에 첨가하여 하나의 유도되지 않은 대조군을 유지합니다.
    3. 48시간 후, 트립신화를 통해 세포 펠릿을 수집하고, 단백질을 분리하고, 웨스턴 블롯을 실행하고, 항-iNOS 및 항-ARG1 항체를 사용하여 각각 iNOS(M1) 및 ARG1(M2)의 발현을 확인합니다.
      알림: 모든 세포 배양 폐기물 및 생화학적 폐기물은 생물학적 위험 쓰레기통에 폐기하고 적절하게 고압멸균한 다음 폐기해야 합니다.

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결과

간세포 암종(HepG2) 세포에 대한 TKI 라파티닙과 네라티닙의 영향과 대식세포에 대한 다운스트림 측분비 효과를 평가하기 위해 일련의 분석이 수행되었습니다. HepG2 세포를 다양한 농도의 라파티닙 또는 네라티닙으로 처리하고, MTT 분석을 사용하여 48시간에 세포 생존력을 측정하였다(그림 1A,B). 생존 곡선을 기반으로 추가 실험을 위해 2.5μM의 치사 이하 선량을 선택했습니다.

이 농도는 미토콘드리아 특이적 염료 MitoTracker Green과의 공동 염색에 의해 확인된 CellROX Deep Red 염색에서 알 수 있듯이 미토콘드리아 ROS의 상당한 증가를 유도할 수 있었습니다(그림 2

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토론

현재 연구는 TKI 처리 HepG2 간 세포에서 수집한 조건화된 배지를 통해 대식세포 분극화에 대한 라파티닙 또는 네라티닙 치료의 간접적인 효과를 탐구합니다. RAW264.7 대식세포를 활용하여 ARG1의 상향 조절로 표시되는 바와 같이 조건화된 배지에 노출될 때 M2 표현형을 관찰합니다. 형태학적으로, 처리된 대식세포는 특징적인 확대되고 길쭉한 모양을 나타내어 M2 유사 상태의 유도를 더욱 뒷받침했습니다. 아래에서는 프로토콜의 중요한 단계, 잠재적인 수정 사항, 문제 해결, 제한 사항 및 기존 방법과의 비교에 대해 설명합니다.

가변성은 노화 및 SASP 생성 정도에 영향을 미칠 수 있으므로 TKI에 대한 일관된 투여 및 노출 시간을 유지하는 것이 중요합니다. ROS 및 SA-β-갈락토시다제 활성의 정확한 측정은 노화 유도를 확인하는 데 중요합니다28,29<...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 인프라 지원을 해준 Shiv Nadar Institution of Eminence에 감사를 표합니다. 이 연구는 과학기술부 보조금 CRG/2022/003242의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HepG2 세포주NCCS부착 세포주
RAW264.7 세포주NCCS부착 세포주
DMEM (덜바코의 변형 이글 미디엄)히미디어AT066고혈당, 파우더
MEM (변형 이글 미디엄)깁코611100-053가루
PBS(인산염 완충 식염수)히미디어TS1101가루
트립신-EDTA 용액히미디어TCL007용액
FBS (태아 소 혈청)히미디어RM1112액체
MTT 다이히미디어TC191가루
라파티닙셀렉켐S2111가루
네라티닙케이맨 케미컬 컴퍼니18404가루
DMSO(디메틸 설폭사이드)와 nbsp;히미디어TC185용액
포름알데히드 랭켐F0080용액
글루타알데히드시그마-알드리치340855용액
구연산 모노하이드레이트, 퓨어히미디어GRM229가루
인산나트륨 이염산성 무수수산나트륨;히미디어MB024가루
페로시안화 칼륨, K4[Fe(CN)6]피셔 사이언티픽  P-236-500
페리시안화물 칼륨, K3[Fe(CN)6]피셔 사이언티픽  P-232-500
나클SRL41721가루
MgCl2 육수화물히미디어GRM-1068가루
엑스-갤SRL45904가루
지지방다당류시그마-알드리치L6529
인간 재조합 인터페론-감마;히미디어CF040-20MCG
셀 ROX 진적색 시약서모피셔 사이언티브C10422
호에스트(Hoechst)인비트로젠, 서모피셔 사이언티브H3570가루
미토트래커 그린인비트로젠, 서모피셔 사이언티브1842298가루
항-ARG1 항체선호도DF6657해액, 계산 MW - 35kDa, 관측 MW - 65kDa
항-NOS2 항체클라우도 클론 코퍼레이션PAA837Hu01해결책, 계산 MW - 130kDa, 관측 MW - 65kDa
항-iNOS 항체선호도용액, 계산 MW - 130kDa, 관측 MW - 120kDa
항-GAPDH 항체바이오바라티 생명과학 Pvt.LtdBB-AB0060용액
항토끼 항체케이맨 케미컬 컴퍼니10004301용액
니트로셀룰로오스 막 & nbsp;머크 밀리포어 주식회사  HATF00010 (제품 번호)
펨톨루센트TM플러스 HRPG 생명과학 786-003
60mm 접시너키150462
96웰 플레이트, 그리고 nbsp;너키165306
세포 배양 인큐베이터  써모피셔 사이언티브371
현미경 1. LEICA 역현미경   그리고 nbsp; 2. 니콘 콘포컬 현미경  1. DMIL LED  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 2. Ti2E, A1R그리고 nbsp; 두 모델 모두 모델 번호입니다
아이브라이트 이미징 시스템인비트로젠, 서모피셔 사이언티브CL1500 (모델 번호)
번호판 독자기바이오-RADiMark 마이크로플레이트 리더
원심분리기와 nbsp;써모피셔 사이언티브소르발 ST 8R (모델 번호)

참고문헌

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