방법 논문

인간 차등적으로 발현된 유전자 목록을 사용하여 다운스트림 경로 농축 분석 및 표적 우선 순위 지정 수행

DOI:

10.3791/68732

⸱

2025년 10월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Biology, Brigham Young University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 작업은 벌크 RNA 시퀀싱 실험에서 사례와 대조군 샘플을 비교하여 생성된 세포 내 신호 전달 경로의 프로필을 기반으로 치료 표적을 예측하고 우선 순위를 지정하는 R 스크립트인 Pathway2Targets 알고리즘을 실행하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 관련 소프트웨어 설치, 설정 검증 및 edgeR을 사용한 차등 발현 분석을 포함하여 RNA 시퀀싱 데이터에서 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 다단계 계산 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 그런 다음 신호 전달 경로 영향 분석(SPIA) 알고리즘을 활용하여 통계적으로 유의미한 경로를 예측하는 방법을 보여줍니다. 결과에 대한 신뢰도를 보장하기 위해 위양성 결과를 줄이기 위한 중요한 경로(p < 0.05)에 중점을 둡니다. 기존 유전자 세트와 달리 이러한 경로는 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 반영하여 세포 주기, 면역 반응 및 신진대사와 같은 세포 과정에 대한 기계론적 통찰력을 제공합니다. 그런 다음 API(애플리케이션 프로그래밍 인터페이스)를 통해 OpenTargets.org 데이터베이스와 인터페이스하는 Pathway2Targets 알고리즘을 사용하여 이러한 경로를 분석합니다. 이 알고리즘은 식별된 경로 내에서 알려진 약물 표적에 점수를 매기는 동시에 실시간으로 진행 상황을 제공하는 새로운 가중치 접근 방식을 통합합니다. 런타임은 경로 복잡성과 표적 밀도에 따라 달라집니다. 출력은 두 개의 순위 파일로 구성됩니다. 첫 번째 파일에는 예측된 약물 표적 목록과 가중 점수가 포함되어 있고 두 번째 파일에는 관련 치료제에 대한 다양한 세부 정보로 구성됩니다. 이 파이프라인은 질병 특이적 유전자 발현 프로필의 맥락에서 약물 가능한 표적 및 치료법의 우선순위 지정을 용이하게 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

벌크 RNA 시퀀싱을 통해 사례 세포 집단과 대조군 세포 집단에서 수천 개의 유전자에 대한 발현 수준을 비교할 수 있습니다. 실험은 일반적으로 적어도 삼중의 샘플, 이상적으로는 생물학적 복제를 포함하도록 설계되지만 기술적 반복으로 충분할 수 있습니다. 이 설계는 생물학적 가변성을 고려하고 이상치 샘플의 영향을 줄입니다. 이러한 발현 패턴의 분석은 관심 있는 질병이 정상적인 세포 과정에 미치는 영향에 대한 자세한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 관련 치료법의 예측을 가능하게 할 수 있습니다.

벌크 RNA 시퀀싱 데이터의 전처리에는 일반적으로 시퀀싱 리드의 품질 관리(반복, 시퀀싱 어댑터, GC% 등), 리드 트리밍 및 어댑터 제거, 리드 매핑/정량 1,2,3 및 차등 발현 분석 4,5,6이 포함됩니다. 다행스럽게도 이러한 단계 7,8,9와 관련된 수동 작업을 줄이기 위해 다양한 분석 프로세스가 자동화되었습니다. 전처리가 완료된 후 일반적으로 수행되는 다운스트림 분석에는 유전자 온톨로지를 사용한 기능적 과잉 표현 분석, 신호 전달 경로 농축 및 스플라이싱 변이가 포함됩니다. 이러한 다운스트림 분석은 유전자 목록 단독보다 더 높은 수준의 세분성에서 차등 발현 결과의 해석을 요약하고 용이하게 합니다.

잘 정의된 질병 유형 또는 하위 유형에 대해 기존 치료법의 용도를 변경하는 것을 목표로 다양한 도구가 개발되었습니다. 이는 의도한 질병에 대한 다중 오믹스 데이터 유형에 대한 알고리즘을 훈련함으로써 달성됩니다. 불행하게도, 의도된 질병의 특이성과 민감도를 개선하려는 이러한 노력은 종종 보다 일반적인 상황에서 도구를 사용하는 것을 차선책으로 만듭니다10,11. 또 다른 도구 세트는 유전자 발현 프로파일이 유전자 발현의 기존 시그니처12,13 또는 현재 치료제의 정량화된 효과와 일치하는 경우에 보다 광범위하게 적용할 수 있습니다14,15. 그러나 이러한 보다 광범위하게 적용 가능한 도구는 종종 광범위한 질병에 걸쳐 특이성과 민감도를 감소시키거나 오래된 데이터로 훈련되었습니다.

대조적으로, Pathway2Targets 알고리즘은 이전에 B 세포 림프종, 치주염, 에스트로겐 양성 유방암, 삼중 음성 유방암 및 치쿤구니야 바이러스 16,17,18,19,20,21에서 잠재적인 치료 표적을 예측하기 위해 적용되었습니다. 이러한 연구 결과는 이 도구가 강력하고 생물학적으로 관련된 표적을 예측할 수 있음을 보여줍니다. 놀랍게도 Pathway2Targets는 삼중 음성 유방암에 대한 392개의 잠재적 약물 표적을 예측했으며 그 중 60개는 임상 시험에서 테스트되었습니다. TBNC에 대한 828개의 개별 약물이 테스트되었으며 37개가 테스트되었습니다17. 림프종 연구에서 이 알고리즘은 915개의 약물을 예측했으며 그 중 461개는 FDA 승인을 받았습니다19.

현재 작업의 목적은 명령줄에서 프로그램을 실행하는 방법에 대한 보다 설명적인 지침에 액세스함으로써 이점을 얻을 수 있는 더 많은 연구자가 최근에 개발된 Pathway2Targets 알고리즘을 효과적으로 사용할 수 있도록 하는 계산 프로토콜을 설명하는 것입니다(그림 1). Pathway2Targets는 차등 발현 데이터, 유전자-질병 연관성, 임상시험 정보, 공개 표적 데이터(22), 경로 정보 및 기타 지표를 결합하여 주어진 조건에 대한 표적을 예측합니다. 중요한 것은 이 알고리즘이 고유하고 사용자 정의 가능한 가중치 체계를 통합하여 사용자가 질병 연관성 수, 신호 전달 경로 수, 고유 약물 수, 임상 시험의 각 단계에서 치료제 수 등과 같이 분석에서 강조하고 싶은 ~20개의 표적 관련 지표를 결정할 수 있다는 것입니다.23. 이 프로토콜의 예시 사용 사례로서, 기존 대장암 데이터 세트24를 재분석할 것입니다.

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프로토콜

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이 연구에서 분석된 벌크 RNA 시퀀싱 데이터는 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스(NCBI 유전자 발현 옴니버스 및 서열 읽기 아카이브)25,26에서 획득되었습니다. 따라서 원래 데이터 수집자는 정보에 입각한 동의한 인간 피험자로부터 이러한 샘플을 윤리적이고 적절하게 수집하도록 보장했습니다.

1. R 소프트웨어 다운로드 및 설치

  1. CRAN(Comprehensive R Archive Network) https://cran.r-project.org/mirrors.html 에서 적절한 링크를 클릭하여 R(버전 4.0 이상)을 설치하고 0-Cloud 옵션을 사용한 다음 컴퓨터 운영 체제에 적합한 지침을 따릅니다. 이 프로세스는 일반적으로 5-10분이 소요됩니다.
  2. https://posit.co/download/rstudio-desktop/ 에서 R Studio(버전 2024 이상)를 설치한 다음 다운로드 페이지의 지침을 따릅니다. RStudio를 설치하는 데는 일반적으로 ~10분이 소요됩니다.
    참고: RStudio 설치는 코드 실행을 단순화하고, 구문 강조 표시를 제공하고, 패키지 관리를 용이하게 하고, 사용자가 출력을 시각화하는 데 도움이 되는 통합 개발 환경을 제공하므로 선택 사항이지만 적극 권장되며, 이는 R에 익숙하지 않은 사용자에게 특히 유용합니다.

2. 관련 도구용 R 스크립트 다운로드 및 설치

  1. GitHub 리포지토리 https://github.com/bpickett/Pathway2Targets 에서 다음과 같은 필요한 R 스크립트를 다운로드합니다. 이 URL은 참고용입니다.
  2. 아래 링크를 사용하여 스크립트를 다운로드합니다. SPIA 버전 1.0( 원시 파일 다운로드를 클릭하여 다운로드): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd(커밋 ID: 60fcd46); Pathway2Targets버전 3.1( 원시 파일 다운로드를 클릭하여 다운로드): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R(커밋 ID: 8e4c7c8)

3. 관련 도구에 대한 R 라이브러리 다운로드

  1. R을 실행하는 동안(RStudio 또는 터미널 창에서) 다음 명령을 입력하여 소프트웨어를 실행하는 데 필요한 추가 R 라이브러리를 다운로드하고 설치합니다.
    1. RStudio 프로그램을 시작합니다. 기본적으로 콘솔 패널은 RStudio의 왼쪽 하단 모서리에 있습니다. 콘솔 패널 창 내의 아무 곳이나 클릭하면 하단의 화살표 ">" 기호 뒤에 입력 커서가 나타납니다.
    2. 콘솔 영역에 다음 명령을 복사하여 붙여넣고 Enter 키를 누릅니다.
      install.packages(c("RCurl", "stringr", "jsonlite", "httr")). 
      성공적으로 설치되면 "다운로드한 바이너리 패키지가 ....에 있습니다"라는 상태 메시지가 나타납니다.
    3. 다음 명령을 복사하여 콘솔 패널 영역에 붙여넣고 Enter 키를 누릅니다.
      BiocManager::install(c("SummarizedExperiment", "EnrichmentBrowser", "biomaRt", "org.Hs.eg.db")).
      성공적으로 설치되면 "다운로드한 바이너리 패키지가 ....에 있습니다"라는 유사한 메시지가 나타납니다.
      참고: 첫 번째 라이브러리 세트(단계 3.1.1)는 일반적인 R 라이브러리로 구성되고 두 번째(2.1.2)는 BioConductor 라이브러리로 구성됩니다. 따라서 명령을 별도로 입력해야 합니다. 이러한 라이브러리의 적절한 버전은 컴퓨터에 설치된 R 버전에 따라 자동으로 다운로드되어야 합니다. 이러한 각 명령을 완료하는 데 ~5분이 걸립니다.

4. 파일 처리

  1. ARMOR 소프트웨어(또는 이와 유사한 소프트웨어)에서 생성된 이전에 계산된 edgeR 생성 미분 표현식 출력 파일(RDS 형식)을 로컬 컴퓨터에 다운로드합니다. 이 파일의 이름은 일반적으로 edgeR_dge.rds입니다.
  2. edgeR(또는 유사한 차등 발현)의 결과를 수동으로 검토하여 결과의 생물학적으로 관련된 해석을 시작합니다. 이렇게 하려면 최소한 수정된 p-값 < 0.05와 잠재적으로 로그2 배율 변화 값의 절대값 > 1.5로 필터링합니다. 소프트웨어를 테스트하는 경우 샘플 edgeR_dge.rds 파일은 Zenodo에서 찾을 수 있습니다: https://doi.org/10.5281/zenodo.15186609
    참고: 이러한 필터링된 결과에 남아 있는 유전자를 검토하면 사례 샘플과 관련된 표현형의 기본 분자 메커니즘(들)을 설명하기 시작할 수 있습니다(대조군 샘플과 비교). 빠르게 불러올 수 있는 유전자 기호의 수가 상대적으로 적기 때문에 편견 없는 방식으로 유전자 목록을 해석하는 능력은 극히 어렵다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 따라서 신호 전달 경로 분석은 필터링된 유전자가 세포에서 서로 상호 작용 및/또는 통신하는 방식을 기반으로 요약하는 유용한 방법입니다.
  3. 대량 RNA-seq 데이터를 전처리하는 데는 분석 중인 데이터 세트의 크기에 따라 몇 시간에서 며칠의 컴퓨팅 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 .rds 파일을 컴퓨터의 다운로드 폴더에 저장합니다. 이 .rds 파일 형식은 사람이 읽을 수 없습니다.

5. SPIA 경로 농축 알고리즘 실행

  1. R을 사용하여 실행하는 경우 GitHub 또는 Supplementary Coding File 1에서 R 스크립트를 사용합니다. edgeR_dge.rds 파일이 다운로드 폴더에 있다고 가정하고 다음 명령을 입력합니다
    Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd ~/Downloads/edgeR_dge.rds
    1. edgeR_dge.rds 파일이 다른 폴더(또는 디렉터리)에 있는 경우 이 명령을 다음과 같이 바꿉니다.
      Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd
  2. RStudio를 사용하여 실행하는 경우 GitHub 또는 Supplementary Coding File 2의 R 스크립트를 사용합니다.
    참고: R 언어에서 코드 줄 앞에 해시 태그 # 기호를 추가하면 일시적으로 비활성화됩니다. 스크립트는 원래 RStudio 대신 명령줄 환경에서 실행되도록 설계되었습니다. 특정 코드 줄을 활성화하거나 비활성화하는 것이 입력 파일에 대한 설정을 재구성하는 가장 쉬운 방법입니다.
    1. 파일 메뉴에서 파일 열기 옵션을 클릭한 다음 스크립트 이름을 선택하여 R Studio에서 SPIA_Code.Rmd 스크립트를 엽니다. R Studio 코드 창에서 기본적으로 왼쪽 상단 패널에 있습니다.
    2. 파일의 모든 코드 줄을 선택하고 코드 창 위와 오른쪽에 있는 실행 단추(또는 선택한 줄 실행) 단추를 클릭합니다. 성공적으로 실행하면 다음과 유사한 이름이 생성됩니다.
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      다운로드 디렉토리에서. 이 파일에는 통계적으로 유의미한 신호 전달 경로가 포함됩니다
    3. 통계적으로 유의미한 결과가 있는 파일을 스프레드시트로 열어 수동으로 검토합니다. 이 파일의 내용은 차등적으로 발현되는 유전자에 의해 유의하게 표현되는 기본 세포내 신호 전달 캐스케이드를 요약하는 데 도움이 될 것입니다.
      참고: 중요한 경로의 계산을 완료하는 데는 분석 중인 데이터 세트의 신호 강도에 따라 ~30분에서 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 프로그램이 실행 중일 때 실시간 진행 상황 메시지는 콘솔 창에서 지속적으로 업데이트됩니다. 자주 업데이트되는 메시지는 프로그램이 성공적으로 작동하고 있음을 보여줍니다. 이 단계에서 발생하는 작업에 대한 자세한 설명은 GitHub 리포지토리에서 찾을 수 있습니다 https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    4. 샘플 입력 파일을 사용하는 경우 이 단계의 출력 파일은 다운로드 폴더에서 찾을 수 있으며 이름은
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv.
      이 명명 스타일은 입력 파일 이름, 수행 중인 프로세스 및 출력을 반영합니다. 이렇게 하면 둘 이상의 파일이 처리되는 경우 파일을 식별할 때 혼동을 피할 수 있습니다.
    5. 아래 설명된 대로 다른 매개변수를 조정합니다.
      1. 이 라이브러리의 SPIA 알고리즘에 대한 기본 매개변수는 1,000개의 순열입니다. 결과에 대한 신뢰도를 높이려면 순열을 2,000개로 늘립니다. perm = 2000을 원하는 순열 수로 변경하여 이 스크립트의 84행과 85행의 순열 수를 조정합니다. 아래 설명된 대로 다른 매개변수를 조정합니다.
      2. padj.method = 'BH'를 제거하여 84행과 85행의 p-값 보정 접근 방식을 조정합니다. 이것은 p-값을 수정하지 않으므로 위양성 결과가 더 가능성이 높아질 수 있습니다.

6. SPIA 출력에서 Pathway2Targets 대상 우선 순위 알고리즘 실행

  1. R을 실행하는 경우 GitHub 또는 Supplementary Coding File 3의 R 스크립트를 사용합니다. 다음 명령을 사용하여 이 알고리즘을 호출합니다
    Rscript --vanilla Pathway2Targets.R
  2. R Studio를 사용하여 실행하는 경우 GitHub 또는 Supplementary Coding File 4의 R 스크립트를 사용합니다. 파일 메뉴에서 파일 열기 옵션을 클릭한 다음 스크립트 이름을 선택하여 R Studio에서 Pathway2Targets.R 스크립트를 엽니다.
    1. RStudio 코드 창(왼쪽 상단 패널)에서 22행의 파일 이름을 SPIA 결과 파일 이름(예: 예제 데이터에서)으로 바꾸십시오.
      infile <- "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv"
    2. 파일의 모든 코드 줄을 선택하고 코드 창 위와 오른쪽에 있는 실행 버튼을 클릭합니다. 실시간 진행 상태 메시지는 오른쪽 하단 패널에 계속 표시됩니다. 성공적으로 실행하면 (유사)라는 파일이 생성됩니다.
      "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv"       다운로드 디렉토리에서. 파일의 이름 지정 스타일은 입력, 프로세스 및 출력을 반영합니다
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23
      _10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      는 해당 파일에 대한 입력입니다.
      참고: 이 단계는 유의미한 p-값을 갖는 신호 전달 경로의 수, 이러한 중요한 경로의 유전자 산물 수 및 알려진 약물 표적인 유전자 산물의 수에 따라 1시간에서 몇 시간이 소요될 수 있습니다.
  3. Pathway2Targets 알고리즘의 일부 매개변수를 조정할 수 있습니다. 특히 승수 값(스크립트의 31-38행)을 조정하여 각 메트릭에 대한 가중치 체계를 사용자 지정합니다. 이 단계에서 발생하는 작업에 대한 자세한 설명은 해당 GitHub 리포지토리에서 찾을 수 있습니다. https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    참고: 참고로, 이 예에서 수백 개의 개별 표적으로 구성된 132개의 경로로부터 잠재적 약물을 식별하는 데 완료하는 데 약 2시간이 걸립니다. 이 메트릭을 기반으로 총 컴퓨팅 시간을 추정하는 것이 합리적입니다.

7. 우선순위가 지정된 표적 및 치료제에 대한 결과 파일 열기

  1. 우선 순위가 지정된 대상 및 해당 메트릭이 있는 파일이 생성됩니다. 샘플 입력 파일의 경우 Downloads 폴더에 있는 다음 이름의 출력 파일을 사용합니다.
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"타임스탬프"_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv
    1. 이 파일은 기본적으로 사용자 지정 가중치 메트릭을 기반으로 내림차순으로 정렬된 대상으로 정렬됩니다. 출력 파일을 수동으로 검토하여 결과가 생물학적으로 관련이 있고 표적이 평가 중인 표현형에 논리적인지 확인합니다.
  2. 우선 순위가 지정된 치료법 및 해당 메트릭이 포함된 파일도 생성됩니다. 샘플 입력 파일의 경우 Downloads 폴더의 출력 파일을 사용합니다.
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"타임스탬프"_SPIA_Results.csv-Treatments.tsv
    1. 마찬가지로, 이 출력 파일은 기본적으로 가중치 메트릭을 기반으로 내림차순으로 정렬된 다양한 표적(단계 7.1.1)에 대한 치료제와 함께 정렬됩니다. 기본 생물학적 시스템에 대한 충분한 배경 지식을 사용하여 파일을 수동으로 검토하여 추가 실험이 정당한지 여부를 결정합니다. 많은 표적이 시중에 나와 있는 하나 이상의 치료제의 영향을 받기 때문에 여러 치료제가 동일한 가중 지표를 가질 수 있을 것으로 예상됩니다.

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결과

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프로토콜의 1-3단계에 설명된 설정은 SPIA 및 Pathway2Targets 알고리즘의 후속 실행을 가능하게 하는 데 필요합니다. 각 단계가 끝나면 소프트웨어의 성공적인 설치를 확인하는 메시지가 생성됩니다. 4단계는 제공된 예제 파일, 다른 기존 파일을 포함할 수 있는 기존 차등 발현 결과 세트를 다운로드하거나 사용자 지정 RNA 시퀀싱 데이터 세트를 전처리하는 것으로 구성됩니다. 4단계의 주요 요구 사항은 워크플로에서 edgeR을 차등 표현식 알고리즘으로 사용하고 결과가 rds 파일 내에 SingleCellExperiment 개체로 저장된다는 것입니다.

SPIA 알고리즘(보충 코딩 파일 1 및 보충 코딩 파일 2

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 1-3단계는 특히 다운스트림 소프트웨어를 성공적으로 실행하기 위한 기본 R 소프트웨어, 스크립트 및 종속성을 설치하는 것과 관련이 있습니다. 필요한 R 라이브러리의 자세한 목록을 사용할 수 있습니다(보충 표 4). 프로토콜의 4단계에는 차등 표현식 분석의 출력이 포함된 R 데이터(.rds 형식) 파일을 검색하는 작업이 포함됩니다. 이 단계의 공통 소프트웨어에는 edgeR6, DESeq24 및 limma5가 포함됩니다. 다음 매개변수를 사용하여 rds 형식의 edgeR 출력과 호환되도록 이 워크플로를 구성했습니다: 백만 개당 log2 수를 사용한 정규화(log = TRUE), 정규화를 위해 고려할 전사체 길이 오프셋(offset = dge0$offset), 보유할 유전자 필터링(min.count = 10...

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공개 사항

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BEP는 Pythia Biosciences의 지분을 보유하고 있습니다. 현재 작업을 위해 외부 자금을 확보하지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

캠퍼스 고성능 컴퓨터 환경에 액세스하는 동안 전문 지식과 지원을 해준 Brigham Young University의 연구 컴퓨팅 사무국에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Pathway2Targets R 스크립트브리검 영 대학교 (피켓 연구소)버전 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R
R 소프트웨어종합 R 아카이브 네트워크(CRAN)버전: 4.4.3https://cran.r-project.org
R 스튜디오 데스크톱 소프트웨어가설버전: 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/
SPIA R 스크립트브리검 영 대학교 (피켓 연구소)버전: 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd

참고문헌

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