종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

요약

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

초록

암 면역 요법의 효능은 제1형 기존 수지상 세포(cDC1)에 의한 고형 종양에 대한 세포독성 T 세포 반응의 모집 및 활성화에 의존합니다. 그러나 암 면역요법을 위한 cDC1 생성은 낮은 세포 수율, 기능적 이질성, 종양 미세 환경(TME)의 면역 억제에 대한 감수성 등 상당한 한계에 직면해 있습니다. 우리는 최근 암세포를 면역원성 cDC1 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 면역 요법 양식을 개발하여 암세포가 종양 항원을 cDC1로 제시하고 다클론 세포독성 T 세포 반응과 지속적인 전신 항종양 면역을 유도할 수 있도록 했습니다. 여기에서, 우리는 암세포에서 최소 cDC1 특이적 유전자 조절 네트워크-PU.1, IRF8 및 BATF3(총칭하여 PIB라고 함)를 과발현시킴으로써 TME 내에서 cDC1 유사 세포를 생성하는 다루기 쉬운 프로토콜을 설명하고, 형질도입된 세포와 부모 세포의 혼합물을 피하 이식합니다. PIB 과발현은 종양 세포에서 조혈 마커 CD45 및 전문 항원 제시 복합체 MHC 클래스 II의 점진적인 획득을 유도하여 생체 내 cDC1 재프로그래밍을 위한 세포 표면 판독 역할을 합니다. 시험관 내 재프로그래밍 과정과 비교할 때, 생체 내에서 YUMM1.7 마우스 흑색종 모델의 재프로그래밍은 더 빠른 동역학과 더 높은 효율성을 입증했습니다. cDC1 유사 세포는 처음 3일 이내에 숙주 면역 세포를 모집하고 9일까지 3차 림프 구조를 형성함으로써 TME의 빠른 리모델링을 유도했습니다. 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포는 최소 9일 동안 종양에서 지속되었지만 15일째에는 검출되지 않았습니다. 여기에 설명된 생체 내 cDC1 재프로그래밍 프로토콜은 "면역-냉" 종양을 "면역-온선"으로 효과적으로 변환하는 다루기 쉽고 강력한 방법을 제공합니다. 전반적으로 cDC1 매개 항종양 면역의 기본 메커니즘을 연구하고 다른 암 면역요법 양식과의 시너지 조합을 밝힐 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

서론

면역관문차단(ICB), 입양세포치료(ACT) 및 백신을 포함한 암 면역요법 양식의 최근 발전은 암 치료의 지형을 변화시켰습니다¹. 흑색종에서 PD-1(programmed cell death protein 1) 및 CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4) 억제에 대한 반응률은 최대 60%에 달할 수 있습니다². 그럼에도 불구하고 흑색종 환자의 40% 이상이 ICB에 반응하지 않으며, 유방암, 현미부수체 안정 대장암, 교모세포종과 같은 면역원성이 낮은 암의 반응률은 5% 미만으로 유지되어 임상적 격차를 강조합니다 ^3,4,5. 광범위한 임상 성공의 주요 장벽은 종양 미세 환경(TME) ^내에서 효율적인 항원 제시에 의존하는 세포독성 T 세포 반응의 열악한 활성화입니다6.

기존의 1형 수지상 세포(cDC1)는 드물지만 종양 특이적 면역의 시작에 없어서는 안 될 요소로, T 세포 반응을 프라이밍하는 데 세 가지 주요 신호를 제공합니다: (1) 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및 II에 대한 항원의 전문적인 처리 및 제시, (2) CD80 및 CD86을 통한 공동 자극, (3) IL-12를 포함한 전염증성 사이토카인 신호 전달 ^7,8. 수지상 세포(DC) 하위 집합 중에서 cDC1은 종양 세포 관련 항원을 교차 제시하여 기억 CD8⁺ T 세포를 프라이밍하거나 재활성화하거나 CD4⁺ T 세포를 1형 T 헬퍼(T_H1) 세포로 분화시키는 데 탁월합니다⁹. 또한, cDC1은 종양 조직으로의 T 세포 모집을 매개하는 케모카인, C-X-C 모티프 케모카인 리간드 9 및 10(CXCL9/10)의 주요 생산자입니다 10,11,12,13. 지난 몇 년 동안 수많은 연구에서 종양 거부 반응 및 ICB 또는 ACT에 대한 효과적인 반응이 종양 내 cDC1의 존재와 밀접한 상관관계가 있음을 강조했습니다^12,13. 따라서 cDC1은 암 면역 요법의 매력적인 표적으로 발전했으며 고유한 기능을 성공적으로 활용하면 상당한 번역 잠재력을 가질 수 있습니다.

cDC1을 생성하는 현재 방법은 CD34⁺ 전구 세포 또는 만능 줄기 세포로부터의 혈액 분리 또는 분화를 기반으로 합니다 14,15,16. 우세한 임상 전략은 혈액에서 자가 DC 하위 집합의 혼합물을 분리하고 재주입 전에 성숙한 면역원성 프로그램을 유도하기 위해 톨 유사 수용체 작용제 또는 전염증성 사이토카인으로 생체 외에서 자극하는 데 의존합니다¹⁶. 그러나 이러한 전략은 열악한 세포 성숙, TME의 면역억제 장벽 및 cDC1의 작은 비율만 존재하는 주입된 DC 혼합물의 하위 집합 이질성으로 인해 제한됩니다⁷. 더욱이, 암 면역요법이나 백신 접종을 위해 cDC1만 분리하는 것은 말초 혈액에서 매우 낮은 수치(<0.3%)로 인해 어렵습니다¹⁶. 또한 cDC1은 사이토카인 및 NOTCH 신호 전달을 사용하여 CD34⁺ 전구 세포 또는 유도 만능 줄기 세포에서 생산될 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 복잡하고 긴 프로토콜을 필요로 하며 DC 하위 집합^17,18,19의 적은 수와 이질적인 집단을 산출합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 생체 내 재프로그래밍은 cDC1의 표현형, 전사 및 기능적 특성과 유사한 cDC1 유사 세포를 생성하기 위한 암 면역 요법에 적합한 전략을 제공합니다²⁰. cDC1 특이적 최소 유전자 조절 네트워크인 PU.1, IRF8 및 BATF3(총칭하여 PIB라고 함)의 과발현을 통해 섬유아세포, 간질 세포 및 암세포는 점차적으로 cDC1 유사 세포로 재프로그래밍되어 종양 항원 처리 및 MHC 클래스 I 및 II에 대한 제시, CD80 및 CD86을 통한 공동 자극 신호 전달, CXCL9/10 및 IL-12를 포함한 사이토카인/케모카인 분비를 가능하게 합니다^20, 21,22,23. cDC1 재프로그래밍은 면역억제와 무관하게 생체 내에서 인간 이종이식편 전반에 걸쳐 더 빠르고 효율적으로 진행되어 성숙한 면역원성 시그니처를 갖는 cDC1 유사 세포를 생성했습니다²⁰. 동계 흑색종 종양에서 우리는 cDC1 유사 세포가 TME를 리모델링하고, 3차 림프 구조(TLS)의 형성을 유도하고, 다클론 T_H1 및 세포독성 기억 T 세포를 모집 및 확장하여 장기적인 전신 면역을 유도하는 것을 관찰했습니다²⁰. 마지막으로, 우리는 아데노바이러스 벡터의 종양내 주사에 의한 암세포의 cDC1 유사 세포로의 제자리 재프로그래밍을 기반으로 하는 새로운 암 면역 요법 양식을 개발했습니다²⁰. 이러한 발견은 cDC1의 기능적 특성을 활용할 수 있는 새로운 암 면역 요법 양식으로서 cDC1 재프로그래밍의 임상 번역을 위한 길을 열어줍니다.

여기에서, 우리는 생체 내 cDC1 재프로그래밍을 기반으로 TME 내에서 cDC1 유사 세포를 생성하기 위한 다루기 쉬운 프로토콜을 제시합니다. PIB를 암세포에 렌티바이러스 전달하고 형질도입된 암세포와 형질도입되지 않은 부모 암세포의 정의된 혼합물로 후속 이식을 통해 TME 내에서 제어된 암세포 부분의 생 체 내 재프로그래밍이 가능합니다. 또한, 이 방법은 바이러스 벡터의 in situ 전달 효율에 의해 제한되지 않습니다²⁰. 우리는 동계 흑색종 모델인 YUMM1.7을 예로 사용하여 효율적인 렌티바이러스 벡터 생산, 기능적 적정 및 생체 내 cDC1 재프로그래밍을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 우리는 종양 해리 후 유세포 분석을 통해 생체 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포를 분석하기 위한 실험 설정 및 게이팅 전략을 자세히 설명합니다. 또한 종양 절편의 냉동 보존, 절편 및 면역형광 염색을 수행한 후 공초점 현미경을 수행하여 TME의 변화를 평가하는 단계를 제공합니다. 마지막으로, 종양 성장과 생존을 측정하여 cDC1 유도 면역을 모니터링하는 방법을 다룹니다. 이 다루기 쉽고 확장 가능한 접근 방식은 연구자에게 생체 내 cDC1 재프로그래밍을 통한 조합 치료 전략을 평가하고, 암 모델 전반에 걸쳐 TME 및 TLS 신생 발생의 변화를 특성화하거나, 항원 제시 또는 사이토카인/케모카인 분비와 같은 다양한 면역 경로의 발현을 수정하는 대규모 스크린을 수행하고, 항종양 면역에 미치는 영향을 밝힐 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다.

프로토콜

동물 실험 절차는 스웨덴 농업위원회의 승인을 받은 후 스웨덴 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 시약 준비

1. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM) 완전 배지를 제조하려면 10%(v/v) 소태아 혈청(FBS), 1mM 피루브산나트륨, 100U/mL 페니실린(Pen), 2mM 글루타민 대체물 및 100mg/mL 스트렙토마이신(Strep)을 첨가합니다.
2. RPMI 1640 완전 배지를 준비하려면 10%(v/v) FBS, 2mM 글루타민 치환물, 1mM 피루브산나트륨, 50mM 2-메르캅토에탄올, 100U/mL 펜 및 100mg/mL 연쇄상구균을 첨가합니다.
3. DMEM/F12 완전 배지를 준비하려면 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 1mM 피루브산나트륨, 0.1mM 비필수 아미노산, 100 U/mL 펜 및 100 mg/mL 연쇄상구균을 첨가합니다.
4. 1mg/mL 폴리에틸레니민(PEI)을 준비하려면 유리 비커 또는 원추형 튜브에 PEI 분말 100mg을 멸균 탈이온수 100mL에 녹입니다. 비커를 마그네틱 교반기에 놓고 실온(RT)에서 저어주어 완전히 녹을 때까지 소용돌이를 만듭니다. pH를 6.9-7.1로 조절하고 염산(HCl)/수산화나트륨(NaOH)을 적가하고 0.22μm PES 멤브레인 필터를 통해 용액을 여과합니다.
5. 1mM 부티르산나트륨을 제조하려면 멸균 탈이온수 10mL에 1.10mg을 녹입니다.
6. 8 mg/mL 폴리브렌을 제조하려면 80 mg의 폴리브렌 분말을 멸균 탈이온수 10 mL에 녹입니다.
7. FACS 완충액을 제조하려면 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% FBS 및 1mM EDTA를 첨가합니다.

2. 렌티바이러스 생산

1. 예열된 DMEM 완전 배지 9mL에 세포 1mL를 첨가하여 HEK 293T 세포를 해동하고 세포를 350× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 20mL의 DMEM 완전 배지에 재현탁하고 5% CO₂와 함께 37°C에서 150mm 플레이트에 세포를 배양합니다.
2. HEK 293T 세포가 80-90% 컨플루언도에 도달하면 확장 및 분할합니다. 세포를 분할하려면 PBS로 한 번 세척하고 트립신 5mL를 첨가하여 플레이트에서 분리한 다음 5%_CO2와 함께 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
3. 5mL의 DMEM 완전 배지로 세포를 수집하고 350× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 형질감염 48시간 전에 새로운 150mm 플레이트에 1:6으로 분할합니다.
   참고: 렌티바이러스 생성 세포주의 품질은 높은 역가를 생산하는 데 매우 중요합니다. 세포가 95% 컨플루언트를 초과하지 않도록 하고 <30% 컨플루멘트에서 시드하지 마십시오.
4. 48시간 후 또는 세포가 70-80% 컨플루언도에 도달하면 50mL 원추형 튜브에서 형질감염 혼합물을 준비합니다. 다음 전달 플라스미드를 사용한다: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-전사 인자 PU.1, IRF8, BATF3, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 형광 형질 유도 리포터로서 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 포함하는 폴리시스트로닉 렌티바이러스 벡터; 또는 2) SFFV-eGFP, 다중 클로닝 부위 및 eGFP를 갖는 대조군 렌티바이러스 벡터; 또는 3) mCherry를 발현하는 렌티바이러스 벡터인 SFFV-mCherry. 10μg의 전이 플라스미드, 7.5μg의 패키징 플라스미드 psPAX2 및 2.5μg의 엔벨로프 플라스미드 pMD2.G를 첨가합니다. 튜브에 Opti-MEM을 채워 총 부피 2mL에 도달합니다. 마지막으로, 형질감염 시약 PEI(1mg/mL 스톡에서) 60μL를 형질감염 혼합물에 첨가합니다.
   참고: 렌티바이러스 벡터 SFFV-eGFP는 렌티바이러스 매개 면역원성을 설명하기 위해 재프로그래밍 실험을 위한 형질도입 대조군으로 사용되는 반면, SFFV-mCherry는 형광 표지 암세포주를 생성하는 데 사용됩니다.
5. 형질감염을 1분 동안 완전히 혼합하고 RT에서 15분 동안 배양하여 DNA-지질 복합체를 형성합니다.
   참고: Confluncy는 바이러스 역가에 큰 영향을 미칩니다. 70% 미만의 컨플루언션으로 세포를 형질감염하면 플라스미드를 받는 세포가 적기 때문에 바이러스 역가가 낮아집니다.
6. HEK 293T 세포의 배지를 흡인하고 펜/스텝 없이 멸균 여과된 FBS 10%와 함께 DMEM 10mL를 추가합니다.
7. 형질감염 혼합물을 150mm 플레이트에 적가하고 5% CO₂와 함께 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.
8. 형질감염 후, 배지를 1mM 부티산나트륨이 보충된 20mL의 DMEM 완전 배지로 교체하고 5%_CO2와 함께 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 부티르산나트륨은 클래스 1 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제이며 히스톤 과아세틸화를 유도하여 HEK 293T 세포에서 유전자 발현을 향상시킬 수 있으며, 이는 염색질 구조를 열고 바이러스 패키징 및 전달 플라스미드의 전사를 촉진합니다. 형질감염 효율은 형광현미경을 사용하여 eGFP 발현을 확인하여 평가할 수 있습니다.
9. 형질감염 후 48시간 및 60시간 후에 렌티바이러스 함유 상청액을 50mL 원추형 튜브에 수집합니다. 첫 번째 수집 후, 두 번째 수집을 위해 150mm 플레이트당 12mL의 예열된 DMEM 완전 배지를 추가합니다. 수집물을 4°C에서 보관하고 0.45μm 저단백질 결합 PES 필터를 통해 여과하고 결합합니다.
10. 바이러스를 농축하려면 37g의 렌티바이러스 함유 배지를 38.5mL Open-Top Thinwall Polypropylene Tubes에 피펫팅합니다. 벤치 저울을 사용하여 튜브의 무게를 측정합니다.
    참고: 렌티바이러스 함유 배지의 부피가 아닌 무게를 측정하면 무게가 균형을 맞추기 위해 더 높은 정밀도를 제공합니다. 초원심분리기의 손상을 방지하기 위해 튜브의 무게는 균형이 잘 잡혀 있어야 합니다.
11. 튜브를 초원심분리 버킷에 넣고 뚜껑을 닫은 다음 버킷을 스윙 버킷 로터에 넣습니다. 25,000 × g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다.
12. 원심분리 후 버킷에서 튜브를 제거하고 상층액을 흡인합니다.
    참고: 동일한 튜브를 반복적으로 채우고 총 3번의 원심분리 라운드에 사용하여 튜브당 더 큰 렌티바이러스 펠릿을 생산할 수 있습니다.
13. Open-Top Thinwall Polypropylene Tubes를 실험실 물티슈 또는 이와 유사한 흡수성 재료 위에 5분 동안 거꾸로 놓아 과도한 액체가 펠릿을 배출하고 건조되도록 합니다.
14. HEPES 또는 PBS가 보충된 얼음처럼 차가운 DMEM 200μL를 각 펠릿에 첨가합니다. 미세 원심분리기 튜브를 50mL 원추형 튜브에 넣고 뚜껑을 닫아 멸균 상태를 유지합니다.
15. 재현탁을 허용하기 위해 펠릿을 4°C에서 밤새 배양합니다.
16. 재현탁된 펠릿을 분취하여 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
    참고: 반복적인 동결-해동으로 인한 역가 손실을 방지하려면 더 작은 분취량 (예: 50-200 μL)을 사용하십시오.

3. 기능성 바이러스 적정

참고: 형질도입된(eGFP⁺) 대 형질도입되지 않은(eGFP^-) 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 최적의 바이러스 용량을 결정하기 위해 렌티바이러스의 각 배치에 대해 이 단계를 반복해야 합니다.

1. 적절한 배양 배지(예: DMEM/F12 완전 배지의 YUMM1.7 쥐 흑색종 세포주)에서 암세포를 해동하고 확장합니다.
   참고: 세포는 재프로그래밍 실험 전에 적어도 한 차례의 분열을 거쳐야 합니다. 세포의 계대는 실험 간에 유사해야 합니다.
2. 종양 형성 하루 전, 배양 배지를 흡인하고 PBS로 한 번 세척한 다음 100mm 플레이트 또는 150mm 플레이트당 2mL 또는 5mL의 트립신을 첨가하여 암세포를 상승시킵니다. 5% CO₂ 와 함께 37°C에서 5-10분 동안 배양하고 100mm 또는 150mm 플레이트당 각각 8mL 또는 5mL 완전 배지를 50mL 원뿔형 튜브에 추가하여 세포를 수집합니다.
3. 세포를 350× g 에서 5분 동안 원심분리하여 트립신을 제거하고 완전 배지에 재현탁합니다.
4. 10μL의 세포 분취량을 취하고 10μL의 트리판 블루를 첨가한 다음 혈구측정기를 사용하여 생존 세포의 수를 계산합니다.
5. 6 × 10⁵ 개의 세포를 12mL의 완전 배지가 들어 있는 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 12μL의 8mg/mL 폴리브렌을 세포 현탁액에 첨가하여 8μg/mL의 작동 농도에 도달합니다.
6. 세포 현탁액 2mL를 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다.
   참고: 필요한 경우 세포 수를 6-웰 플레이트당 1.2-1.8 x 10⁶ 으로 늘립니다.
7. 형질도입된(eGFP⁺) 세포와 형질도입되지 않은(eGFP^-) 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 최적의 부피를 결정하기 위해 각 웰에 점점 더 많은 양의 렌티바이러스를 추가합니다.
   참고: 렌티바이러스의 권장 렌티바이러스 부피를 1, 2, 4, 8, 16 및 32 μL로 삼중으로 추가합니다. 빈 대조군 렌티바이러스 벡터 SFFV-eGFP 및 SFFV-mCherry에 대한 기능적 적정을 수행합니다.
8. 세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
9. 0일째에 렌티바이러스 함유 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한 다음 5% CO₂와 함께 37°C에서 72시간 동안 배양합니다.
10. 3일째에 형광 현미경으로 세포의 eGFP 발현을 확인합니다.
    참고: 이 단계는 세포 형질도입의 신속한 검증을 제공하지만 eGFP⁺ 대 eGFP^- 세포의 정확한 비율을 결정하기 위해 3.14단계에서 유세포 분석법으로 수행된 분석을 대체하지는 않습니다.
    일부 암세포(예: B16 마우스 흑색종 세포)에서는 eGFP 신호가 낮고 형광 현미경을 사용하여 검출하기 어려울 수 있습니다. 유세포 분석으로 직접 진행하는 것이 좋습니다.
11. 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 웰당 500μL의 트립신을 첨가합니다. 5% CO₂와 함께 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
12. 1.5mL의 FACS 완충액으로 각 웰의 세포를 올리고 세포 현탁액을 5mL 폴리스티렌 튜브에 피펫팅합니다. 분취량을 취하고 혈구계와 트리판 블루 염색을 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
13. 세포 현탁액을 350×g에서 5 분 동안 원 심분리하고, 펠릿을 100μL의 FACS 완충액에 재현탁한 후 유세포 분석을 진행합니다.
14. 유세포 분석을 통해 형질도입된(eGFP⁺) 세포와 형질도입되지 않은(eGFP^-) 세포의 정확한 비율을 정량화합니다. 생체 내 테스트의 경우 1:1 비율에 가장 가까운 렌티바이러스 부피를 사용합니다.
    참고: eGFP⁺ 대 eGFP^- 세포의 비율을 정확하게 결정하려면 형질도입되지 않은 암세포를 게이팅에 대한 음성 대조군으로 포함합니다.

4. 생체 내 재프로그래밍을 위한 피하 종양 확립

1. mCherry 발현 세포를 생성하기 위해 적절한 배양 배지에서 암세포를 해동하고 확장합니다.
   참고: mCherry 발현은 유세포 분석 중에 종양의 다른 집단, 예를 들어 내인성 간질 및 면역 세포와 암세포의 구별을 용이하게 합니다.
2. 3.2-3.4단계를 수행하고 mL당 10⁵ 세포의 농도로 전체 배지에 세포를 재현탁합니다.
3. 8μg/mL의 폴리브렌과 결정된 부피의 SFFV-mCherry 렌티바이러스를 세포 현탁액에 첨가하여 >90%의 형질도입 효율에 도달합니다.
   참고: 또는 >90% 형질도입을 달성하면 세포 생존력이 손상되는 경우, 형질도입 후 72시간 후에 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 mCherry⁺ 세포를 분류하고 배양에서 분류된 세포를 확장합니다.
4. 100mm 플레이트당 5mL의 세포 현탁액(5× 10⁵ 개 세포 포함)을 플레이트하고 5% CO₂ 와 함께 37°C에서 세포를 24시간 동안 배양합니다.
5. 24시간 후, 배지를 10mL의 완전 배지로 교체하고 재프로그래밍 실험을 시작하기 전에 최소 7일 동안 5% CO₂ 로 37°C에서 배양하여 세포를 확장합니다.
6. 확장 후, 단계 3.2-3.4에 따라 이전에 결정된 부피의 SFFV-PIB-IRES-eGFP로 후속 형질도입을 위한 세포 현탁액을 준비하여 3일째에 형질도입된(eGFP⁺) 대 형질도입되지 않은(eGFP^-) 세포의 가장 가까운 1:1 비율을 초래합니다.
7. 50mL 원뿔형 튜브의 세포 현탁액에 이전에 결정된 양의 렌티바이러스와 함께 8μg/mL의 폴리브렌을 세포 현탁액에 첨가합니다. 거품이 생기지 않고 잘 섞는다.
8. 6웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 2mL의 세포 현탁액(10⁵ 개 세포 포함)을 피펫팅하고 5% CO₂와 함께 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   참고: 또는 100mm 조직 배양 플레이트에 5mL의 형질도입 배지에 세포를 플레이트합니다. 그러나 형질도입 효율은 더 큰 부피에서 감소할 수 있으며 단계 3.1-3.13에 설명된 대로 경험적으로 결정되어야 합니다.
   형질도입 과정에서 잠재적인 세포 손실을 보상하고 종양 형성 중 피펫팅 또는 주입을 위한 충분한 부피를 보장하기 위해 최소 10% 더 많은 세포를 형질도입하는 것이 좋습니다.
9. 24시간 후, 렌티바이러스 함유 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 다음 각 웰에 500μL의 트립신을 첨가하고, 5%_CO2와 함께 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
10. 광학 현미경으로 세포가 플레이트에서 완전히 해리되었는지 확인한 다음 완전한 배지와 함께 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다.
11. 세포를 350×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 펠릿 화하고, PBS로 세척한 후 350×g에서 5분 동안 다시 원심분리 합니다. 분취량을 취하고 혈구계와 트리판 블루 염색을 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
12. 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하여 mL당 2-4 × 10⁷ 세포의 농도에 도달하며, 이는 종양당 50μL의 주입량에서 1-2 × 10⁶ 세포에 해당합니다.
    참고: 중요한 것은 이러한 수치가 유세포 분석을 위해 생체 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포를 분리하기 위해 YUMM1.7 흑색종 종양에 대해 검증되었다는 것입니다. 다른 세포주 및 종양 성장 및 생존 실험과 같은 다른 실험 판독값의 경우 수치를 경험적으로 테스트해야 합니다. 종양 성장 및 생존 실험의 경우 종양당 100,000개에서 250,000개 사이의 더 낮은 세포 수가 권장됩니다.
13. 동물 실험이 수행되는 작업 영역으로 이동하여 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 세포 준비 후 시간이 지남에 따라 세포 생존력이 감소하므로 가능한 한 빨리 세포 주사를 수행하십시오.
14. 마우스당 3μL의 자일라진(20mg/mL), 27μL의 케타민(100mg/mL) 및 30μL의 PBS를 포함하는 마취 용액을 준비합니다.
15. 60μL의 마취제를 복강 내 주입하여 CD45.1 마우스를 마취합니다. 쥐를 무작위로 배정하고 체온이 떨어지지 않도록 온열 패드 위에 보관하십시오. 마취 중 안구 탈수를 예방하기 위해 아이크림을 눈에 바르십시오.
    참고: 야생형 CD45.2 대립유전자를 발현하는 생체 내 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포와 내인성 면역 세포를 구별하기 위해 CD45.1 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. 세포주가 CD45.1인 경우 C57BL/6 마우스(CD45.2)를 수용자로 사용할 수 있습니다. 마우스는 실험군 간에 성별 및 연령이 일치해야 하며 종양 형성 전에 무작위 배정되어야 합니다.
16. 모든 마우스가 완전히 마취될 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
17. 면도기를 사용하여 생쥐의 오른쪽 옆구리를 면도하십시오. 선택적으로 귀 이발기를 사용하여 표시하십시오. 해당 부위를 소독하고 남은 머리카락을 70% 에탄올로 닦아냅니다.
18. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 암세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 0.5mL 30G 주사기에 넣습니다.
19. 두 손가락을 사용하여 면도한 쥐의 옆구리 피부를 부드럽게 들어 올리고 피부가 주름을 형성하는 바늘 끝을 삽입합니다.
    알림: 바늘로 손가락에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오.
20. 피부를 풀고 한 손으로 주사기를 제자리에 고정하고 다른 손의 두 손가락을 사용하여 마우스의 피부를 늘립니다.
21. 암세포 현탁액 50μL를 천천히 주입하여 주사 부위에 타원형 돌출(피하 부종)을 만듭니다.
    참고: 돌출부가 형성되지 않으면 현탁액이 주변 피하 조직으로 누출되어 종양 형성이 일관되지 않거나 실패할 수 있습니다.
22. 시술 후 마취 후 생존을 보장하기 위해 모든 쥐가 깨어나는 것을 모니터링합니다.
23. 23 ± 2 °C와 고정된 12시간의 빛/암 주기로 제어된 온도 환경에서 마우스를 유지하고 음식과 물에 자유롭게 접근하십시오.
    참고: 종양 성장을 모니터링하려면 4.24-4.26단계를 진행하십시오. 그렇지 않으면 이 단계를 건너뛰고 다음 섹션으로 바로 진행하십시오.
24. 종양 성장을 모니터링하려면 한 손으로 마우스를 부드럽게 제지하여 종양을 명확하게 시각화할 수 있습니다.
25. 전자 캘리퍼스를 사용하여 종양의 길이(l), 너비(w) 및 높이(h)를 측정합니다. V = (l x w x h) / 2 공식을 사용하여 종양 부피(V)를 계산합니다.
26. 2-3일마다 종양 치수를 측정합니다. 종양이 인도적 종점 기준(예: 1,500mm³)을 충족하는 부피에 도달하면 윤리적 및 제도적 지침에 따라 동물을 안락사시킵니다.

5. 유세포 분석을 위한 종양 분리

1. 종양 샘플 수집을 위해 얼음처럼 차가운 RPMI 완전 배지로 가위, 겸자, FACS 완충액 및 12웰 비조직 배양 플레이트를 준비합니다.
2. 종양당 RPMI 완전 배지 3mL에 100mg/mL 콜라게나제 D 30μL와 10mg/mL DNAse I 3μL을 혼합하여 종양 소화 용액을 준비합니다(1mg/mL 콜라게나제 D 및 10μg/mL DNAse I의 작동 농도에 도달하기 위해).
   참고: 소화 효율이 최적이 아닌 경우 콜라게나제 활성을 지원하기 위해 2-5mM_CaCl2 를 첨가하십시오.
3. 격리 당일 자궁경부 탈구 또는 CO₂ 질식에 의해 마우스를 안락사시킵니다.
4. 가위와 겸자로 피하 종양을 절제하고 각 종양을 얼음처럼 차가운 RPMI가 있는 12웰 비조직 배양 플레이트의 웰에 넣습니다. 비종양 조직의 절제를 최소화하십시오.
5. 종양 샘플을 가위를 사용하여 1-2mm³ 개로 자르고, 3mL의 소화 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 조각을 수집하고, 37°C에서 200-250rpm에서 30-45분 동안 흔들면서 배양합니다.
   참고: 소화 과정을 촉진하기 위해 15분마다 소용돌이 또는 피펫을 사용합니다.
6. 소화 후, 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 혼합물을 1분 동안 세게 피펫팅합니다. 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 50mL 원추형 튜브로 여과합니다.
7. 10mL 주사기의 플런저를 사용하여 소화되지 않은 조각을 70μm 세포 스트레이너에 부수고 10mL의 RPMI 완전 배지로 스트레이너를 헹굽니다.
8. 세포 현탁액을 350 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 1mL의 FACS 완충액에 재현탁한 다음 생존 세포를 계수합니다.
9. 세포 현탁액을 5mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 350×g에서 5 분 동안 펠 릿 세포를 투여하고, FACS 완충액 100μL당 10⁶ 개의 생존 세포를 재현탁합니다.
10. 단색(SC) 및 FMO 대조군용 셀을 별도의 폴리스티렌 튜브로 분리합니다.
11. 비특이적 결합을 차단하기 위해 쥐 혈청(1:100)을 포함하는 항체 염색 마스터 믹스를 준비합니다. 분석에서 죽은 세포를 배제하기 위한 고정 가능한 생존율 염료(1:100); 및 최적 농도의 형광 표지 항체 항-CD45.1, 항-CD45.2 및 항-MHC-II. 각 샘플에 100μL의 마스터 믹스를 첨가하고 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
12. 2mL의 FACS 완충액으로 샘플을 2회 세척하고 유세포 분석을 진행합니다.
13. 형질도입된(eGFP⁺) 암세포(CD45.1-mCherry⁺)에서 게이팅하여 CD45.2 및/또는 MHC-II를 발현하는 cDC1 유사 세포의 백분율을 정량화합니다.
    참고: 이 프로토콜은 내인성 림프성 및/또는 골수 면역 세포 집단에 대한 항체로 염색 패널을 보완함으로써 생체 내 cDC1 재프로그래밍 후 종양의 면역 표현형을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

6. 공초점 현미경 분석을 위한 종양 동결 및 절편

1. 5.1 및 5.3단계에 따라 종양 분리를 준비합니다. 가위와 겸자로 피하 종양을 절제합니다.
2. 4°C에서 4°C에서 새로 준비된 4% 파라포름알데히드(PFA)에 종양을 부드럽게 흔들어 고정합니다. 조직 mm³당 1시간을 기준으로 종양 크기에 따라 고정 시간을 조정합니다.
3. 종양을 PBS의 15% 자당으로 옮기고 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 조직을 부드럽게 흔들면서 4°C에서 배양합니다. 그런 다음 동일한 조건에서 PBS에서 20% 자당으로 이동합니다.
4. 종양이 튜브 바닥에 정착하면 PBS와 OCT 화합물에 20% 자당의 1:1 혼합물에서 4°C에서 30분 동안 흔들면서 배양합니다.
5. 혼합물을 제거하고 조직을 100% OCT가 있는 크라이오몰드에 매립하고 액체 질소를 사용하여 급속 동결합니다.
   알림: 급격한 증기 팽창으로 인한 냉화 화상이나 부상을 방지하기 위해 항상 적절한 개인 보호 장비(냉동 장갑, 안면 보호대 및 실험실 가운)를 착용하십시오. 질식 위험을 피하기 위해 환기가 잘 되는 곳에서 작업하십시오.
   1. 탈수를 방지하기 위해 블록을 밀폐된 용기에 -80°C에서 보관하십시오.

7. 종양 절편의 면역형광 염색

1. 극저온 조절기를 사용하여 종양을 약 8μm 두께의 절편으로 자르고 현미경 유리 슬라이드에 장착합니다. 필요한 경우 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.
   참고: 조직 무결성을 보존하려면 극저온 조절기를 오가는 동안 종양 절단이 장착된 블록과 슬라이드를 드라이아이스 위에 보관하십시오. 절편 중에 극저온 조절기가 -20°C로 유지되는지 확인하십시오.
2. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 해동하고 RT에서 10분 동안 4% PFA 용액에 고정합니다.
3. 고정 후 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 세척합니다.
   알림: 조직이 수분을 유지하는지 확인하십시오. 이후의 모든 염색 단계에서 항상 액체로 보관하십시오. 실험을 일시 중지해야 하는 경우 슬라이드를 RT에서 PBS에 최대 3시간 동안 저장할 수 있습니다. 슬라이드를 PBS에 밤새 보관하지 마십시오.
4. 항원 회수를 위해서는 찜통에 물을 채우고 전원을 켜십시오. 탈이온수가 담긴 병과 10mM 구연산나트륨(pH 6)이 담긴 병을 찜기에 넣고 개구부를 알루미늄 호일로 덮습니다. 뚜껑을 제거하지 않고 찜기 뚜껑의 통풍구를 통해 온도계를 삽입하고 알루미늄 호일을 뚫고 온도를 모니터링하여 용액이 ~99°C에 도달하는지 확인합니다.
5. 완충액이 ~99°C에 도달하면 슬라이드를 탈이온수에 10초 동안 담근 다음 항원 회수 용액으로 빠르게 옮깁니다.
6. 슬라이드를 ~99°C에서 15분 동안 배양합니다.
7. 슬라이드를 1x PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다.
8. 소수성 장벽 Pap Pen을 사용하여 각 조직 절편을 묘사하고 조직에 추가된 액체가 누출되는 것을 방지하는 소수성 둘레를 형성합니다.
   참고: 후속 PBS 세척은 조직을 둘러싼 소수성 둘레를 방해할 수 있으며 갱신이 필요할 수 있습니다. 필요에 따라 다시 그립니다.
9. RT에서 60분 동안 150μL의 차단 완충액(1x PBS에서 5% 혈청 및 0.5% Triton X-100)으로 조직을 차단하고 투과화합니다. 모든 염색 단계에는 2차 항체의 숙주와 동일한 종의 혈청을 사용하십시오.
10. 슬라이드를 1x PBS에서 3 x 5분 동안 세척합니다.
11. 4°C에서 밤새 차단 완충액(1X PBS에서 5% 혈청 및 0.5% Triton X-100)에 20μg/mL의 1차 항-CD45 항체와 함께 조직을 배양합니다.
    참고: 다른 항체를 사용하려면 항체 농도를 경험적으로 검증하십시오.
12. 슬라이드를 1x PBS에서 3 x 5분 동안 세척합니다.
13. 조직 절편을 AlexaFluor-647과 접합한 염소 항쥐 2차 항체와 함께 차단 완충액(5% 혈청)에서 1:250 희석하여 RT에서 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: 2차 항체를 첨가한 후 형광단의 광표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
14. 슬라이드를 1x PBS에서 3 x 5분 동안 세척합니다.
15. 조직을 1μg/mL의 DAPI 및 20μg/mL의 AlexaFluor-594 접합 항체와 함께 차단 완충액(5% 혈청)에 RT에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
16. 슬라이드를 1x PBS에서 3 x 5분 동안 세척합니다.
17. 각 종양 절편에 마운팅 용액 한 방울을 추가한 다음 커버슬립에 마운팅 매체 몇 방울을 도포합니다. 커버슬립을 슬라이드에 빠르게 뒤집어 장착하고 종양 근처에 기포가 없는지 확인합니다.
18. 슬라이드를 밤새 건조시키고 공초점 현미경으로 이미지화합니다.

결과

다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍 프로토콜의 개략적 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, 우리는 cDC1 지시 재프로그래밍 인자 PU.1, IRF8, BATF3을 암호화하는 폴리시스트론 렌티바이러스 벡터 SFFV-PIB-IRES-eGFP(PIB-eGFP)를 생산한 다음 HEK 293T 패키징 세포주에서 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 생산했습니다. 렌티바이러스 매개 면역원성을 제어하기 위해 다중 클로닝 부위(MCS) 및 IRES-eGFP를 포함하지만 재프로그래밍 인자를 제외한 빈 SFFV-MCS-eGFP(eGFP) 벡터를 생산했습니다. 바이러스 생산 후, 우리는 렌티바이러스 함유 상청액을 수확하고 초원심분리에 의해 농축했습니다. 우리는 형질도입(eGFP⁺)과 형질도입되지 않은(eGFP^-) 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 양을 결정하기 위해 바이러스를 기능적으로 적정했으며, 이는 형질도입 후 3일째에 평가했습니다. 그런 다음 생성된 바이러스 양을 사용하여 -1일에 선택된 암세포주를 형질도입했습니다. 24시간 후, 세포를 채취하여 피하에 이식하여 종양을 확립했습니다. 이 전략은 형질도입된 세포가 TME 내에서 생체 내에서 cDC1 유사 세포로 재프로그래밍되도록 보장했습니다. 생착 후 표시된 시점에서 생체 내 재프로그래밍 효율을 정량화하기 위해 해리된 종양 세포의 유세포 분석을 포함한 다운스트림 분석을 위해 종양을 절제 및 처리하거나 TME의 변화를 특성화하기 위해 동결 보존된 종양 절편의 면역형광 염색을 포함했습니다.

첫째, 높은 렌티바이러스 역가의 생산을 보장하기 위해 형질감염 전에 HEK 293T 세포를 모니터링하여 70-80% 컨플루언에 도달하는 것을 목표로 하고 24시간 후 형광 현미경에 의한 eGFP 발현을 통해 형질감염 효율을 평가했습니다(그림 2A). 다음으로, 형질감염 후 48시간 및 60시간에 바이러스 함유 배지를 수집하여 초원심분리한 후 -80°C에서 분취량으로 보관했습니다(그림 2B). 그런 다음 YUMM1.7 흑색종 세포에서 eGFP⁺ 대 eGFP^- 세포의 1:1 비율을 달성하는 데 필요한 최적의 바이러스 양을 결정했습니다. 6웰 플레이트에 웰당 10개의⁵ YUMM1.7 세포를 파종하고, 렌티바이러스의 부피를 증가시키는 세포를 형질도입하고, 24시간 후에 바이러스 함유 상청액을 신선한 DMEM/F12 완전 배지로 대체했습니다(그림 2C). 3일째에 우리는 유세포 분석을 통해 eGFP⁺ 세포의 정확한 백분율을 정량화하기 전에 형광 현미경으로 eGFP 발현을 평가했습니다(그림 2C). eGFP⁺ 와 eGFP^- 세포의 비율을 정량화하기 위해 살아있는 단일 세포에서 죽은 세포와 이중항을 배제하기 위해 게이팅했습니다(그림 2D). 생산된 렌티바이러스 배치의 최적 부피는 PIB-eGFP 및 대조군 eGFP 바이러스 모두에 대해 10⁵ YUMM1.7 세포당 2 μL로 결정되었으며, 그 결과 각각 50.0 ± 0.3% 및 63.0 ± 0.9% eGFP⁺ 세포가 생성되었습니다(그림 2E).

다음으로, 생체 내 재프로그래밍 효율을 평가하기 위해 형광 표지(mCherry⁺) 암세포주(YUMM1.7-mCherry)를 생성했습니다. 이를 통해 유세포 분석에서 살아있는 mCherry⁺ 세포를 게이팅하여 암세포와 간질 또는 면역 세포를 구별할 수 있었습니다(그림 3A,B). 그런 다음 10⁵개 세포당 2μL의 PIB-eGFP 또는 대조군 eGFP 바이러스로 YUMM1.7-mCherry 세포를 형질도입하여 1:1 eGFP⁺ 대 eGFP^- 비율을 달성했습니다. CD45.1 마우스의 종양당 1.6 × 10⁶개 세포를 피하 이식하고 비교를 위해 시험관 내에서 배양할 세포의 분취량을 유지했습니다. 우리는 eGFP 또는 mCherry를 삼킨 숙주 면역 세포를 배제하기 위해 살아있는 mCherry⁺ eGFP⁺ 및 CD45.1^- 세포를 게이팅하는 유세포 분석을 통해 재프로그래밍 효율성을 평가했습니다(그림 3B). 1일에서 9일까지, 우리는 부분적으로 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포(CD45.2⁺ MHC-II^- 또는 CD45.2^- MHC-II⁺) 및 완전히 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포(CD45⁺ MHC-II⁺)를 표시하는 CD45.2 및/또는 MHC-II 발현의 점진적인 획득을 관찰했습니다(그림 3C). 우리는 생체 내 마우스 암세포의 재프로그래밍이 시험관 내 조건에 비해 9일째에 cDC1 유사 세포의 비율이 더 높다는 것을 검증했습니다(9.54 ± 1.54% CD45⁺ MHC-II⁺ in vivo 대 4.72 ± 1.1% CD45⁺ MHC-II⁺ in vitro, P = 0.018). 재프로그래밍의 동역학은 또한 4일째에 더 높은 비율의 cDC1 유사 세포를 관찰함에 따라 가속화되었습니다(8.7 ± 3.3% CD45⁺ MHC-II⁺ in vivo 대 0.3 ± 0.1% CD45⁺ MHC-II⁺ in vitro, P = 0.05), 환경 단서의 존재가 cDC1 유사 세포에 대한 더 빠르고 효율적인 재프로그래밍을 촉진함을 나타냅니다¹⁹. 시험관 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포는 15일까지 존재했지만, 생체 내 cDC1 유사 세포는 9일 동안 지속되었지만 15일까지 검출되지 않았으며, 이는 숙주 면역 체계에 의한 TME의 고갈을 시사합니다(그림 3C). 

마지막으로, 우리는 처음 9일 동안 생체 내 cDC1 재프로그래밍의 결과로 TME의 초기 변화를 특성화하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 범조혈 마커 CD45로 표시된 면역 세포의 침윤에 초점을 맞춰 생체 내 재프로그래밍 3일 및 9일 후 eGFP 및 PIB-eGFP 종양 모두에서 동결 보존 및 절편된 종양 조직의 면역형광 염색을 수행했습니다. 특히, cDC1 유사 세포는 eGFP 종양(49.6 ± 17.0 대 8.0 ± 5.8 종양 영역당 CD45 염색의 eGFP 평균 형광 강도; 그림 4A,B). 흥미롭게도 우리는 생체 내 재프로그래밍 9일 후 종양의 TME 내에서 TLS를 검출했습니다. 이는 cDC1 유사 세포가 3일 이내에 TME를 "면역 감기" 환경에서 "면역 온성" 환경으로 빠르게 리모델링할 수 있으며, 이는 이후 9일째에 TLS 형성으로 이어질 수 있음을 시사합니다.

그림 1: 암세포의 생체 내 재프로그래밍에 의해 cDC1 유사 세포를 생성하기 위한 프로토콜 개요. 비장 초점 형성 바이러스 프로모터(SFFV)의 제어 하에 폴리시스트로닉 카세트에 PU.1, IRF8 및 BATF3을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 SFFV-PIB-IRES-eGFP는 유세포 분석 및 형광 현미경으로 형질도입된 세포를 추적하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 후 HEK 293T 패키징 세포주에서 생산됩니다. 그런 다음 렌티바이러스 벡터를 초원심분리하고 기능적으로 적정하여 형질도입된 eGFP⁺ 와 형질도입되지 않은 eGFP^- 세포의 비율로 암세포를 형질도입하는 데 필요한 바이러스의 양을 결정합니다. 생체 내 재프로그래밍 실험을 위해 암세포는 -1일에 최적의 양의 렌티바이러스로 도금됩니다. 다음날, 형질도입된 GFP⁺ 와 형질도입되지 않은 GFP^- 세포의 1:1 혼합물을 세척하고 마우스의 피하 종양 형성을 위해 수집합니다. 유세포 분석법에 의해 3일째에 형질도입을 검증하기 위해 병렬 시험관 내 배양이 유지됩니다. 동물은 종양 성장과 생존을 위해 2-3일마다 모니터링됩니다. 종양은 정의된 시점에서 수집되고 유세포 분석을 위한 표면 마커 발현을 위해 해리 및 염색됩니다. 또는 면역형광 염색 및 공초점 현미경 분석을 위해 전체 조직을 고정, 냉동 보존 및 절편합니다. 생체 내 재프로그래밍 효율은 유세포 분석 분석으로 평가되는 반면, 종양 미세 환경의 변화는 공초점 이미징으로 특징지어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 을 위한 렌티바이러스의 생산 및 기능적 적정.(A) HEK 293T 세포가 ~70-80% 합류에 도달하면, 7.5μg의 psPAX2, 2.5μg의 mPD2.G 및 60μL의 1mg/mL PEI와 함께 SFFV-PIB-eGFP(PIB-eGFP) 또는 빈 렌티바이러스 벡터 대조군 SFFV-eGFP(eGFP) 중 10μg의 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 형질감염됩니다. 형질감염 후 24시간 동안 eGFP 발현을 보여주는 HEK 293T 세포의 명시야 및 형광 현미경 이미지는 성공적인 플라스미드 전달을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) 렌티바이러스를 농축하기 위한 초원심분리 워크플로우의 개략도. HEK 293T 세포의 렌티바이러스 함유 상청액을 형질감염 후 48시간 및 60시간에 수집하고, 0.45μm의 저단백 결합 PES 필터를 통해 여과하고, 벤치 스케일을 사용하여 개방형 상판 박막 폴리프로필렌 튜브에서 37g을 계량합니다. 튜브를 Swinging-Bucket Rotor에서 초원심분리하고 상청액을 흡인하고 펠릿을 5분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 펠릿을 HEPES를 함유한 얼음처럼 차가운 DMEM에 재현탁하고 밤새 배양한 후 분취하여 -80°C에서 보관합니다. (C) GFP+ 대 GFP- 세포의 1:1 비율을 달성하기 위한 최적의 바이러스 용량을 결정하기 위한 기능적 적정의 실험적 전략. 형질도입 후 72시간 후에 YUMM1.7 흑색종 세포에서 eGFP 발현을 보여주는 명시야 및 형광 현미경 이미지는 재프로그래밍 인자 및 eGFP의 성공적인 전달을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. (D) eGFP⁺ 세포의 비율을 정량화하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. 살아있는 세포는 생존율 염료 음성 집단(DAPI)에 대해 게이팅된 후 이중 배제되었습니다. (E) 1:1 GFP⁺/GFP^- 세포를 달성하기 위한 최적의 부피를 결정하기 위해 바이러스 용량을 증가시키면서 형질도입 효율의 유세포 분석 정량화. PIB-eGFP 및 eGFP 렌티바이러스 모두에 대해 10⁵ 개 세포당 2 μL 부피가 원하는 비율을 달성했습니다. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; PEI = 폴리에틸렌니민. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율성 평가. (A) 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율을 평가하기 위한 실험 워크플로의 개략도. 암세포는 처음에 mCherry를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입되어 형광 표지 세포주(YUMM1.7-mCherry)를 생성한 후 -1일에 최적화된 용량의 PIB-eGFP 렌티바이러스로 형질도입됩니다. 그런 다음 0일에 세포를 1:1 비율의 eGFP⁺/eGFP^- 세포로 피하 주사하여 CD45.1 마우스에서 종양을 확립하고 PIB 형질도입 세포가 TME 내에서 cDC1 유사 세포로 재프로그래밍되도록 합니다. 그런 다음 종양을 지정된 시점에서 분리하고, 해리하고, 유세포 분석을 사용하여 CD45.1, CD45.2 및 MHC-II에 대해 염색합니다. 이를 통해 CD45.1 숙주 면역 세포를 배제하여 CD45.2 및 MHC-II의 발현에 의한 생체 내 cDC1 재프로그래밍 효율을 정량화할 수 있습니다. 병렬 시험관 내 배양은 생체 내 재프로그래밍과 비교하기 위해 시점 전반에 걸쳐 유지됩니다. (B) 9일째의 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. 성공적으로 형질도입된 암세포를 식별하기 위해 mCherry⁺ 및 GFP⁺에서 세포를 게이팅했습니다. 숙주 면역 세포는 CD45.1⁺ 세포를 게이팅하여 제외되었습니다. (C) 유세포 분석법에 의한 YUMM1.7-mCherry 세포의 생체 내 재프로그래밍 효율(왼쪽)을 eGFP⁺ mCherry⁺ 내에서 게이팅된 CD45⁺ MHC-II⁺ 세포(완전히 재프로그래밍됨) 및 CD45.2⁺ HLA-DR^- 또는 CD45.2^- HLA-DR⁺ cDC1 유사 세포(부분적으로 재프로그래밍됨)의 백분율로 정량화합니다. 셀. 표시된 시점 동안 PIB-eGFP 형질도입된 YUMM1.7-mCherry 세포에서 CD45.2 및 MHC-II 발현의 점진적인 획득을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯(오른쪽). eGFP형질도입된 YUMM1.7-mCherry 세포를 대조군으로 사용하였고, 비교를 위해 시험관 내에서 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포를 사용하였다. (C)의 데이터는 3-5개의 생물학적 복제 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다. (C)의 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 CD45⁺ MHC-II⁺ 세포에 대해 수행되었습니다. *P < 0.05. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; TME = 종양 미세 환경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 생체 내 cDC1 재프로그래밍 후 종양 미세 환경에서 면역 침윤 분석. (A) 3일 및 9일에 PIB-eGFP- 또는 대조군 eGFP-형질도입 세포(형질도입된 세포와 부모 세포의 1:1 비율)를 피하 이식한 후 YUMM1.7 종양에서 CD45⁺ 세포를 보여주는 대표적인 공초점 이미지. 스케일 바 = 500 μm. (B) 3일 및 9일에 PIB 처리 및 대조군 eGFP 형질도입 YUMM1.7 종양에서 CD45 염색을 위한 MFI의 정량화. (B)의 데이터는 3-6개의 생물학적 복제 실험의 평균 ± SD를 나타냅니다. (B)의 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행되었습니다. *P < 0.05 및 ***P < 0.001. 약어: cDC1s = 유형 1 기존 수지상 세포; PIB = PU.1, IRF8 및 BATF3; MFI = 평균 형광 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜에서 우리는 고형 종양으로부터 암세포의 생체 내 재프로그래밍을 기반으로 cDC1 유사 세포를 생성하는 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 우리의 결과는 PU.1, IRF8 및 BATF3의 과발현이 9일까지 TME에서 cDC1 표현형의 점진적인 획득을 유도한 후 cDC1 유사 세포가 종양에서 고갈됨을 보여줍니다. 궁극적으로 이것은 3일까지 TME로의 CD45 세포 침윤이 증가하여 "면역-냉한" TME의 리모델링을 "면역-온한"으로 만듭니다.

cDC1을 생성하기 위한 현재의 프로토콜에는 말초 혈액으로부터의 자가 DC의 농축, CD34⁺ 조혈 전구 세포로부터의 분화 또는 만능 줄기 세포로부터의 분화가 포함됩니다 14,15,16,17,18,19. 그러나 이러한 방법은 불충분한 성숙, 감소된 항원 제시 및 생체 내 사이토카인/케모카인 생산 능력, 면역 억제에 대한 감수성, 높은 DC 이질성 및 생성된 세포의 수가 적다는 제한 요인을 제시합니다⁷. 여기에서는 기능 및 기계론적 연구를 위해 생체 내에서 cDC1 유사 세포의 확장 가능한 생성을 허용하는 프로토콜을 제공합니다.

이 방법을 사용하여 전사 인자 조합 PU.1, IRF8 및 BATF3의 발현이 생체 내 재프로그래밍을 유도하기에 충분한지 여부를 테스트했습니다. 이식된 유전자 변형 세포의 용량을 변경하는 것이 치료 효능에 직접적인 영향을 미치기 때문에 이 프로토콜을 사용하면 전달 효율성을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 우리는 이전에 0.15% CD45⁺ 및 MHC-II⁺ cDC1 유사 세포에 해당하는 2% 형질도입 세포가 항종양 면역을 유도하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다²⁰. 또한, 3일째에 관찰된 빠른 면역 침윤은 이 시점에서 완전히 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포의 실질적인 증가가 없기 때문에 부분적으로 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포가 생체 내에서 기능적으로 활성화됨을 시사합니다. 앞으로, 정의된 시점에서 선택된 세포 집단에서 세포 사멸을 유도하기 위해 자살 유전자를 포함하는 변형된 벡터를 사용하여 항종양 효능에서 부분적으로 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포와 완전히 재프로그래밍된 cDC1 유사 세포의 기능적 역할을 밝히는 것이 흥미로울 것입니다²⁴. 이 프로토콜은 후생유전학적 보조제와의 조합을 탐색하는 데 추가로 사용될 수 있으며, 이는 재프로그래밍 효율성을 증가시킬 수 있습니다²⁵. 마지막으로, 이 방법은 생체 내에서 다른 DC 하위 유형을 생성하도록 조정될 수도 있으며, 예를 들어 항바이러스 또는 내약 유발 반응과 같은 다양한 유형의 면역 반응을 시작합니다¹⁴. 또한 다양한 면역 세포 유형을 생성하기 위해 전사 인자 조합에 대한 바코드 스크린을 수행하는 플랫폼으로 생 체 내 재프로그래밍을 활용할 수 있습니다. 이러한 가능성은 특정 면역 하위 집합의 다양한 기능적 특성을 활용하여 치료의 유연성을 높일 수 있습니다.

이전 연구에서 우리는 면역억제 생체 내 환경이 인간 암세포를 면역원성 cDC1s로 재프로그래밍하는 것을 방해하지 않는다는 것을 입증했습니다²⁰. 이 기사에서 우리는 생쥐에서 재프로그래밍이 시험관 내보다 생체 내에서 더 빠르고 효율적이라는 것을 보여주며, 생체 내에서 관찰된 향상된 재프로그래밍이 두 종에 걸쳐 보존된 현상임을 시사합니다. 그러나 이 방법의 한계 중 하나는 초기 벡터 전달 중에 생체 내 환경이 부족하다는 것입니다. 따라서 환경 단서가 생체 내 전달 효율성에 영향을 미치는지 여부를 식별할 수 없습니다. 이것은 다른 부분을 비교하여 현장에서 결정되어야 합니다. 제자리 전달을 위해 렌티바이러스 벡터보다 더 효율적인 것으로 확인된 아데노바이러스 벡터²⁰ 는 선형, 원형 및 자가 증폭 RNA 또는 소분자 칵테일과 같은 비바이러스 부분과 비교할 수 있습니다^{2 6,27}.

우리는 이전에 cDC1 재프로그래밍이 암세포에 전염증성 사이토카인 및 림프구 모집 케모카인 분비와 전문적인 항원 처리 및 흑색종 모델^23,28에서 MHC-I 및 MHC-II에 대한 제시를 부여한다는 것을 보여주었습니다. 이로 인해 TLS 형성을 유도하여 TME가 "면역-냉기"에서 "면역-온" 상태로 리모델링되어 세포독성 이펙터 T 세포, NK 세포 및 B 세포의 침윤이 증가하고 조절 및 소진된 T 세포와 같은 면역억제 집단이 감소합니다²⁰. 환자에서 면역 요법에 대한 양성 반응은 종양 항원에 대한 지속적인 T 및 B 세포 프라이밍이 종양 특이적 항체 반응을 생성하는 종양 내 TLS의 존재와 관련이 있습니다^29,30. 앞으로 우리는 이 다루기 쉬운 생체 내 cDC1 재프로그래밍 프로토콜을 사용하여 다양한 암 유형에 걸쳐 유도된 TLS 신생 발생, TME 리모델링 및 항종양 면역의 메커니즘을 밝히고 종양 특이적 항체의 생성이 자극되는지 여부를 특성화할 계획입니다.

우리는 이전에 생 체 내 cDC1 재프로그래밍과 항-PD-1 또는 항-CTLA-4를 사용한 ICB 사이의 시너지 효과를 관찰했습니다²⁰. 이는 cDC1 재프로그래밍에 의해 생성된 "면역 핫" TME가 T 세포 수용체(TCR)-T 세포, 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 또는 종양 침윤 림프구(TIL). 이 방법의 또 다른 장점은 면역학적 수용체, 사이토카인, 케모카인 또는 림프톡신이 저항성 종양 유형의 cDC1 유사 세포에서 과발현되거나 고갈될 수 있는 대규모 편향되지 않은 조합 또는 CRISPR 스크리닝을 수행할 수 있다는 것입니다. 결론적으로, 생 체 내 cDC1 재프로그래밍은 암 면역 요법의 기계론적 연구 및 치료 혁신을 위한 유연하고 강력한 플랫폼이기 때문에 현재 프로토콜은 광범위한 과학계에 귀중한 자원을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.45 & 무; m 저단백 결합 필터, 150mL 병뚜껑 진공 필터	피셔 사이언티픽	15983297
2-메르캅토에탄올 50mM	써모피셔 사이언티픽	31350010
항마우스 CD45 단클론 항체(클론: 30-F11), 쥐 IgG2b, κ	써모피셔 사이언티픽	14-0451-82
나6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl(CD45.1)	잭슨 연구소	002014
BD 마이크로 파인 U-100 인슐린 주사기 (0.5 mL)	피셔 사이언티픽	11395751
C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	000664
콜라게나제 D	시그마 알드리치	11088882001
50ml 원뿔형 튜브와 함께 사용하기 위한 Corning Falcon 셀 스트레이너	시그마 알드리치	CLS352340
코닝 커버 안경 24 x 50mm	시그마 알드리치	CLS2975245
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 이염산염)	써모피셔 사이언티픽	D1306
DNase I	시그마 알드리치	10104159001
eBioscience 고정 가능한 생존 가능성 염료 eFluor 450	인비트로젠	65-0863-14
eBioscience IHC 항원 회출 용액 - 낮은 pH(10x)	써모피셔 사이언티픽	00-4955-58
태아 소 혈청(FBS)	써모피셔 사이언티픽	A5256701
Fluoromount-G 마운팅 매체	써모피셔 사이언티픽	00-4958-02
GFP 항체 [Alexa Fluor 594]	노부스 바이오로제스	NB600-308AF594
Gibco DMEM/영양 혼합물 F-12 (DMEM/F-12)	써모피셔 사이언티픽	31331028
Gibco MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)	써모피셔 사이언티픽	11140035
Gibco Opti-MEM I	써모피셔 사이언티픽	11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 중간	써모피셔 사이언티픽	52400025
Gibco 피루빈산 나트륨 (100 mM)	써모피셔 사이언티픽	11360070
Gibco 트리판 블루 용액, 0.4%	써모피셔 사이언티픽	15250061
글루타맥스 보충제	써모피셔 사이언티픽	35050061
염소 항쥐 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, 다클론, Alexa Fluor 488	써모피셔 사이언티픽	A-11006
HEK 293T 세포	ATTC	CRL-11268 시리즈
헥사디메트린 브롬화물(폴리브렌)	시그마 알드리치	H9268
하이클론 덜베코의 고포도당 변형 이글 배지(DMEM)	사이티바	SH30243.01
HyClone 페니실린 스트렙토마이신 100x 용액(펜/연쇄상구균)	사이티바	SV30010
HyClone 인산염 완충 식염수(PBS)	사이티바	SH30028.02
케타미놀 수의사. 주사용 용액 100 mg/mL	MSD Animal Health 스웨덴	QN01AX03
마이크로톰 블레이드 - C35	PFM 의료	207500005
마우스 항-CD45.2 (104), 표면, APC, 단클론	바이오레전드	109814
마우스 항-MHCII(M5/114.15.2), 표면, PE-Cy7, 단클론	바이오레전드	107630
일반 염소 세럼	아브캠	AB7481
일반 쥐 혈청(멸균)	아브캠	AB7488
오픈 탑 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브	Beckman Coulter 생명 과학	326823
파라포름알데히드, 16% w/v aq. soln., 메탄올 무함유	써모피셔 사이언티픽	043368.9엠
pFUW-tetO-Batf3, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Batf3	아드진	139837
pFUW-tetO-Irf8, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Irf8	아드진	139838
pFUW-tetO-Pu.1, 모노시스트로닉 카세트 인코딩 마우스 Pu.1	아드진	139839
플라스미드 pMD2.G	아드진	12259
플라스미드 psPAX2	아드진	12260
플라스미드 SFFV-eGFP(eGFP)	사내 복제	-
플라스미드 SFFV-mCherry (mCherry)	사내 복제	-
플라스미드 SFFV-PIB-eGFP,  마우스 PU.1, IRF8 및 BATF3(PIB) 를 암호화하는 폴리시스트로닉 카세트;	사내 복제	-	재프로그래밍에 사용되는 구조 및 벡터는 회사와의 재료 이전 계약에 따라 Asgard Therapeutics에서 사용할 수 있습니다
폴리에틸렌민(PEI), 선형, MW 25000, 형질감염 등급	폴리사이언스	23966
ReadyProbes 소수성 배리어 Pap Pen	써모피셔 사이언티픽	R3777
부티르산나트륨	시그마 알드리치	303410
자당	시그마-알드리치	S7903
SuperFrost Plus 접착 현미경 슬라이드	에프레디아	J1800AMNZ
티슈텍 O.C.T. 컴파운드	사쿠라 파인텍	4583
TrypLE Express 효소 (1x) 페놀 레드 없음	써모피셔 사이언티픽	12604021
TT Cryomold Intermediate, 정사각형(15 x 15 x 5 mm)	사쿠라 파인텍	4566
울트라퓨어 0.5 M EDTA, pH 8.0	인비트로젠	15575020
자이솔 수의사. 주사용 용액 20 mg/mL	VM 제약	QN05CM92
YUMM1.7 세포	안티네오