샘플링에서 데이터 독립적 획득 질량 분석법에 이르는 신경펩타이드 특성화 워크플로우

Summary

이 프로토콜은 데이터 의존적 획득-병렬 축적-연속 단편화(DDA-PASEF) 및 데이터 독립적 획득(DIA) 질량 분석법을 결합한 쥐 뇌 조직의 포괄적인 신경펩티체학 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

Abstract

내인성 신경펩타이드는 뇌 기능의 핵심 조절제로서 행동, 스트레스, 통증 및 항상성 조절에 중요한 역할을 하지만 분석은 여전히 어렵습니다. 생물학적으로 이들은 풍부도가 낮고 빠르게 분해되며 전구체 단백질에서 다양하게 처리되며 발현은 작고 국소적인 세포 집단으로 제한됩니다. 기술적으로 이들의 검출은 넓은 동적 범위, 다양한 번역 후 수정 및 질량 분석 데이터 세트의 희소 신호로 인해 복잡합니다. 이 프로토콜은 timsTOF 플랫폼에서 데이터 의존 획득(DDA) 및 데이터 독립적 획득(DIA) 질량 분석법(MS)을 모두 사용하여 Rattus norvegicus 뇌 조직에서 신경펩타이드 분석을 위한 포괄적인 워크플로를 간략하게 설명합니다. 해부, 펩타이드 추출 및 세척을 포함한 최적화된 뇌 샘플 전처리 후 나노 액체 크로마토그래피(LC)-MS는 검출 감도와 정확도를 향상시키기 위해 이온 이동성 기상 분획과 함께 수행됩니다. DDA 생성 스펙트럼 라이브러리는 Skyline에서 DIA 기반 정량화를 지원하여 신뢰도가 높은 MS2 수준 측정을 가능하게 합니다. 이 통합 워크플로는 신경펩타이드 범위를 늘리고 정량적 재현성을 향상시켜 복잡한 뇌 조직에서 신경펩타이드를 연구하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

신경펩타이드는 기능적으로 다양한 종류의 내인성 신호 분자로, 신경 통신, 신경 및 신경내분비계 기능의 중요한 조절제 역할을 합니다. 신경조절제, 호르몬 또는 보조 전달물질로 작용하는 이들은 통증 조절, 스트레스 반응, 일주기 조절, 식욕 조절 등 광범위한 생리적 과정에 영향을 미칩니다. 저분자로 합성되는 고전적인 신경전달물질과 달리 신경펩타이드는 mRNA의 번역을 통해 합성되는 큰 전구체 단백질 내에 암호화됩니다. 그런 다음 전구체 단백질 또는 프로호르몬은 단백질 분해 처리를 거쳐 활성 펩타이드를 방출하고, 이는 고밀도 코어 소포(DCV)로 포장됩니다. 자극 시 신경펩타이드는 방출되어 G-단백질 결합 수용체와의 상호 작용을 통해 일반적으로 더 느리고 더 오래 지속되는 조절 효과를 발휘합니다. 중추 및 말초 신경계 기능을 유지하는 데 있어 이들의 중요성으로 인해 이들은 강렬한 생물학적, 임상적 관심의 영역이 되었습니다 1,2,3,4,5.

관련성에도 불구하고 신경펩타이드는 분석적으로 특성화하기 어렵습니다. 짧은 서열에서 확장된 서열에 이르기까지, 종종 아미드화, 아세틸화, 인산화, 아미노산 이성질화 또는 절단과 같은 다양한 번역 후 변형(PTM)을 포함하는 매우 이질적인 구조는 질량 분석법(MS)1,6,7,8에서 이온화 및 단편화 거동의 가변성을 유발합니다 . 또한, 이들은 일반적으로 생물학적 기질 성분에 비해 낮은 농도로 존재하고 쉽게 분해되며 신경계의 복잡한 조직 내에서 공간적으로 제한된 방식으로 국한됩니다. 이러한 특징은 특히 예측 가능한 효소 소화 및 균일한 펩타이드 특성에 의존하는 전통적인 단백질체학 접근법을 사용할 때 식별 및 정량화 모두를 복잡하게 만듭니다 ^9,10,11.

여기에서는 신경펩타이드에 특히 중점을 두고 Rattus norvegicus의 뇌에서 내인성 펩타이드의 식별 및 정량화를 위한 포괄적인 전략을 제시합니다. 여기서의 워크플로우는 최적화된 뇌 샘플링 절차로 시작하여 광범위한 액체 크로마토그래피(LC) 분리로 이어지며, 트래핑된 이온 이동도 분광법(TIMS) 플랫폼 12,13,14,15,16에서 PASEF(병렬 축적-직렬 단편화)를 사용한 고분해능 MS 분석으로 마무리됩니다 . 전구체 선택 전에 이온 이동성 기상 분획(IM-GPF)을 통합함으로써 데이터 의존적 획득-PASEF(DDA-PASEF) 접근법은 전구체 분리를 개선하고 저농도 신경펩타이드의 검출을 향상시킬 수 있으며, 그렇지 않으면 1차원 DDA 워크플로우에서 놓칠 수 있는 많은 부분이 있습니다¹⁷.

DDA는 고품질 MS/MS 스펙트럼으로 인해 펩타이드 식별에 가장 일반적으로 사용되는 전략으로 남아 있지만, 저풍부도 종에 대해 편향되는 강도에 의한 전구체 이온 선택에 의존하기 때문에 본질적으로 제한됩니다 18,19,20. 더욱이, 반확률론적 샘플링은 반복 전반에 걸쳐 누락된 값으로 이어져 재현 가능한 정량화를 방해합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 DDA-PASEF 데이터를 사용하여 강력한 스펙트럼 라이브러리를 구축했으며, 이는 이후 데이터 독립적 획득(DIA) 분석에 사용할 수 있습니다. DDA와 달리 DIA는 정의된 m/z 창 내에서 모든 전구체 이온을 샘플링하여 풍부하고 희귀한 펩타이드 모두에 대한 일관된 샘플링을 보장하며, 스펙트럼 라이브러리 및 Skyline의 표적 분석과 결합할 때 민감하고 재현 가능한 MS2 수준 정량화를 가능하게 합니다21,22,23,24.

뇌 펩타이드 추출, 크로마토그래피 분리, 이온 이동성 강화 MS 획득 및 하이브리드 DDA/DIA 기반 정량화를 포괄하는 이 통합 접근 방식은 신경펩타이드의 복잡성을 염두에 두고 개발되었습니다. 데이터 손실을 최소화하면서 펩타이드 적용 범위를 최대화하여 더 간단한 DDA 기반 펩티체학의 주요 한계를 해결합니다. 따라서 우리는 포유류 뇌의 신경펩타이드 환경을 탐색하기 위한 유연하고 강력한 플랫폼을 제시하며, 이는 광범위한 실험 질문 및 조직 샘플에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Protocol

이 연구의 모든 동물 실험은 동물의 윤리적 치료 및 관리에 대한 국가 및 ARRIVE 표준을 엄격히 준수하면서 일리노이 기관 동물 관리 및 사용 위원회(23228)에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 해부 및 뇌 격리

1. 냉식염수 관류를 수행한 직후 조직 스냅 동결을 수행하여 신경펩타이드 무결성을 보존하고 분해 아티팩트를 최소화하며 다운스트림 펩티돔 분석을 위한 데이터 품질을 향상시킵니다.
2. 기관 동물 관리 지침에 따라 CO₂ 방법을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다. 심장 박동 부재와 반사 신경 부족으로 사망을 확인합니다.
3. 쥐를 바로 누운 자세로 눕히십시오. 흉강을 노출시키기 위해 절개를 합니다.
4. 심장의 좌심실에 작은 절개를 합니다.
5. 혈액과 관류액이 유출할 수 있도록 우심방에 작은 절개를 합니다.
6. 50mL의 얼음처럼 차가운 생리 용액(예: 0.9% 식염수 또는 mGBSS)으로 채워진 60mL 주사기에 부착된 크기에 맞게 절단된 플라스틱 피펫 팁을 좌심실에 삽입합니다.
7. 용액으로 동물의 몸을 관류하십시오. 날카로운 가위나 단두대를 사용하여 쥐의 목을 베십시오.
8. 뇌 위에 있는 피부와 두개골을 롱저나 가는 가위로 제거합니다.
9. 두개강에서 뇌를 조심스럽게 들어 올리고 필요에 따라 뇌신경을 절단합니다.
10. 드라이아이스에 뇌를 즉시 얼리거나 드라이아이스에 식힌 이소펜탄으로 급속 얼립니다.
11. 표지된 냉동 바이알 또는 호일로 옮긴 다음 -80°C에서 보관합니다.

2. 쥐 뇌 조직에서 펩타이드 추출

1. 전체 뇌 샘플의 경우 분석 저울을 사용하여 각 냉동 조직의 무게를 빠르게 측정합니다. 10:1(v/w) 용매 대 조직 비율을 사용하여 10% 빙초산과 1% 메탄올 물을 함유한 LC-MS 등급 용액을 사용하여 조직을 균질화합니다.
2. 균질화된 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
3. 샘플을 16,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 수집하십시오.
4. 10:1(v/w) 용매 대 조직 비율을 사용하여 펠릿을 LC-MS 등급 물에 재현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양을 반복합니다.
5. 동일한 조건(16,000 × g, 20분, 4°C)에서 다시 원심분리하고 두 번째 상청액을 수집합니다.
6. 두 상청액을 결합하고 전체 부피의 1/10을 다운스트림 처리를 위해 새 튜브로 옮깁니다. 완전히 마를 때까지 진공 농축기를 사용하여 이 분취량을 건조시킵니다. 나중에 사용할 수 있도록 나머지 추출물을 -80°C에서 보관하십시오.

3. C18 스핀 컬럼을 사용한 고체상 추출(SPE)

참고: 모든 용매는 LC-MS 등급이어야 합니다. 달리 명시되지 않는 한, 원심분리 단계는 탁상용 원심분리기를 사용하여 실 온에서 1,500×g에서 수행됩니다.

1. 시약 준비
   1. 활성화 용액(A)을 준비합니다: 물 속의 50% 아세토니트릴/50% 0.1% 포름산.
   2. 평형을 준비하고 용액(B): 물에 0.1% 포름산을 세척합니다.
   3. 용출액(C)을 준비합니다: 물 속의 50% 아세토니트릴/50% 0.1% 포름산.
2. 시료 준비
   1. 건조된 펩타이드 추출물을 200μL의 용액(B)에 재구성합니다.
   2. 샘플을 16,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
   3. SPE용 상청액을 조심스럽게 수집합니다.
3. 컬럼 컨디셔닝 및 평형
   1. 150μL의 용액(A)을 C18 스핀 컬럼에 추가합니다.
   2. 1,500 × g에서 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 3.3.1 및 3.3.2단계를 두 번 반복하여 완전한 활성화를 확인합니다.
   4. 150μL의 용액(B)을 첨가합니다.
   5. 1분 동안 원심분리합니다.
   6. 3.3.4 및 3.3.5 단계를 두 번 반복합니다.
4. 샘플 로딩 및 세척
   1. 준비된 샘플 용액 200μL를 컬럼에 로드합니다.
   2. 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 펩타이드 머무름을 최대화하기 위해 플로우스루를 컬럼에 다시 세 번 다시 로드합니다.
   4. 150μL의 용액(B)을 첨가합니다.
   5. 1분 동안 원심분리합니다.
   6. 3.4.4 및 3.4.5단계를 세 번 반복하여 유지되지 않은 오염 물질을 제거합니다.
5. 펩타이드 용출
   1. 150 μL의 용출 용액(C)을 컬럼에 추가합니다.
   2. 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 용출 단계 3.5.1-3.5.2를 한 번 더 반복합니다.
   4. 두 용출액을 결합하여 얼음 위에 보관하거나 진공 상태에서 건조하십시오.

4. LC-MS/MS 분석

1. 용액 준비(A): 물, 용액에 0.1% 포름산; (B): 아세토니트릴, 용액의 0.1% 포름산; (C): 25 fmol/μL 머무름 시간 표준(iRT) 0.1% 포름산의 물.
2. LC-MS 주입 전에 샘플을 20μL 용액(C)에 재현탁합니다.
   참고: 2개의 생물학적 샘플을 분석하고 DDA 및 DIA 실행 모두에 대해 각각 5회 주입하여 샘플당 분석법당 5번의 기술 반복이 이루어졌습니다.
3. 이동상 A는 용액(A)으로, 이동상 B는 용액(B)으로 구성되어 있으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템을 사용하여 펩타이드 분리를 수행합니다.
4. 1μL의 시료를 25개의 C18 분석 컬럼(150μm × 250mm, 1.9μm 입자, 120Å 기공 크기)에 로드하고 실행 내내 40°C로 유지합니다.
5. 다음 그래디언트 프로파일을 사용하여 600nL/min의 유속으로 LC 분리를 수행합니다. 0-5분: 2-10% B; 5-85분: 10-45% B; 85-87분: 45-50% B; 높은 유기 세척 및 재평형이 뒤따릅니다.
   참고: LC는 이온 소스를 통해 timsTOF MS에 직접 결합되었습니다.
6. DDA 분석의 경우 timsTOF MS에서 기본 적용 방법 DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime 을 사용합니다.
   1. 간단히 말해서 동적 배제가 활성화된 PASEF 모드에서 질량 분석기를 작동합니다. 각 주기를 1.1초 듀티 사이클에 걸쳐 10개의 PASEF MS/MS 스캔으로 구성하도록 설정합니다.
   2. 질량 범위를 m/z 100-1700으로 설정하고 이온 이동도 범위를 0.60 - 1.60 V·s/^cm2로 설정하여 램프 시간을 100.0ms로 사용합니다. 이온 이동도의 함수로 충돌 에너지를 20.0eV에서 59.0eV로 증가시킵니다.
7. 이온 이동성 기상 분획(IM-GPF)
   1. 0.6-1.6 V·s/^cm2 의 이온 이동도 범위를 0.6-1.0, 0.9-1.3 및 1.2-1.6 V·s/^cm2의 세 개의 겹치는 창으로 분할합니다.
   2. 이렇게 하려면 timsControl 또는 timsControl 편집기의 TIMS 설정 탭에서 이동성 시작 및 종료 값을 해당 창 값으로 변경합니다.
   3. 각 창에 대한 데이터를 수집합니다. 모든 이온 이동성 획득 창에 대해 100ms의 일정한 축적 및 램프 시간을 사용합니다.
   4. 4.6단계에서 자세히 설명된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 DDA-PASEF 모드에서 데이터를 수집합니다.
8. DIA 분석의 경우 400-1200m /z의 질량 범위에서 25m/z의 격리 창 폭을 사용합니다. DDA 분석법에서 사용되는 것과 동일한 IMEX(ion mobility experimental) 설정을 사용합니다.
   1. 추가 DIA 설정에는 1개의 MS1 램프와 사이클당 16개의 MS/MS 램프가 포함되어 총 사이클 시간은 1.8초입니다.
   2. 기본 단백질체학 DIA-PASEF 방법을 DIA 분석법 개발을 위한 템플릿으로 사용합니다. DIA 분석법을 생성한 후 Hystar의 분석법 탭에 로드합니다. DIA 모드를 활성화할 필요가 없습니다.
      참고: DIA 메서드는 성공적으로 로드되면 자동으로 등록됩니다.

5. 데이터 처리

참고: 데이터 수집 후 펩타이드 식별은 PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant 또는 유사한 플랫폼과 같은 생물정보학 도구를 사용하여 수행해야 합니다. 이 연구는 .d 형식의 원시 데이터로 작업할 수 있는 Peaks Online을 사용했습니다.

1. 데이터베이스 검색
   1. 펩타이드 검색을 위해 큐레이팅된 쥐 신호 펩타이드 데이터베이스, 쥐 프로테옴 또는 인간 프로테옴 또는 샘플 소스를 기반으로 큐레이팅된 신호 펩타이드 데이터베이스와 같은 적절한 참조 데이터베이스를 사용하십시오.
      참고: 이러한 데이터베이스는 NCBI 또는 UniProt(https://www.uniprot.org/)과 같은 신뢰할 수 있는 소스에서 얻을 수 있습니다. 데이터베이스의 단백질 또는 펩타이드만 식별됩니다. 쥐 신호 데이터는 UniProt의 "신호 펩타이드" 주석으로 쥐 단백질체를 필터링하여 선별되었습니다. Uniprot 용어에서 "신호 펩타이드" 에 의한 필터링은 프로테옴을 분비, 막 국소화 또는 구획 트래피킹에 관여하는 단백질로 좁히는 것을 의미합니다. 이 맞춤형 데이터베이스에는 5630개의 단백질이 포함되어 있습니다. 단백질 데이터베이스의 크기를 50,000개에서 5,000개로 제한하면 여러 가지 이점이 있습니다. 첫째, 무작위 펩타이드-스펙트럼 일치 가능성을 줄여 식별 신뢰도를 높여 펩타이드 할당의 정확도를 높입니다. 둘째, 데이터베이스가 작을수록 계산 효율성이 향상되어 처리 시간이 빨라지고 계산 리소스에 대한 수요가 줄어듭니다. 셋째, 보다 간결한 데이터베이스는 잘못된 발견률(FDR)을 더 잘 제어하여 보다 신뢰할 수 있고 통계적으로 강력한 단백질 식별을 가능하게 할 수 있습니다. 그러나 신뢰도 점수의 인위적인 인플레이션과 부정확한 FDR 추정을 피하기 위해 데이터베이스는 상대적으로 커야 합니다.
   2. 다음 권장 매개변수를 사용하여 프로그램 GUI에서 데이터베이스 검색을 구성합니다. 전구체 질량 오류 허용 오차: 10-25ppm; 조각 질량 오차 허용 오차: 0.01-0.05 Da; 효소 특이성: 없음(비특이적 소화); 펩타이드 길이 범위: 4-45 아미노산.
   3. 검색에 포함할 PTM 세트를 정의합니다.
   4. 데이터베이스 검색을 완료한 후 표준 전체 이동도 범위(0.6-1.6V·s/^cm2)를 포함하여 각 이온 이동도 창에 해당하는 pepxml 및 mzXML(또는 MGF) 파일을 내보냅니다.
2. 스카이라인 도서관 건설
   1. Skyline을 열고 새 문서를 만들고 Proteomics 인터페이스 가 선택되어 있는지 확인하고 달리 지정하지 않는 한 기본 설정을 사용합니다.
   2. 파일 > 가져오기 > 펩타이드 검색으로 이동합니다.
   3. Import Peptide Search Wizard(펩타이드 검색 가져오기 마법사)에서 Build(빌드)를 선택하고 관련 pepxml 파일을 추가합니다(해당 mzXML 또는 MGF 파일이 동일한 디렉터리에 있는지 확인).
   4. iRT 표준 펩타이드를 자동으로 설정하고 DIA를 워크플로로 선택한 후 다음을 클릭합니다.
   5. 라이브러리 구축 후 반복실험 간 정렬을 위한 iRT 표준으로 약 10-15개의 펩타이드를 선택합니다. iRT를 다시 보정하라는 메시지가 표시되면 확인 을 클릭하여 계속 진행합니다.
   6. Extract Chromatograms 페이지에서 Browse를 클릭하여 모든 DIA 원시 파일을 선택하고 가져온 다음 계속을 클릭합니다.
   7. 전이 설정 창에서 전구체 전하 범위를 1-5로, 제품 전하 범위를 1-3으로, 이온 유형을 ,p,y,b로 설정하고 생성물 이온 선택을 이온 2에서 마지막 이온으로 정의합니다. 기타 권장 설정: 이온 일치 허용 오차: 0.05 Da, 선택할 피크: 5.
   8. 펩타이드 설정 창에서 4.1.3에 설명된 피크 검색 설정과 일치하는 수정 사항을 설정합니다.
   9. 격 리 체계 페이지에서 격리 및 체계의 이름을 입력하고 미리 지정된 격리 창을 선택합니다. 가져오기 를 클릭하고 DIA 파일 중 하나를 로드하여 실험의 격리 창 구성을 자동으로 가져옵니다.
   10. 다음 매개변수를 사용하여 전체 스캔 획득 설정을 지정합니다. 획득 방법: DIA; 제품 질량 분석기: 중심; 격리 체계: 위에 정의된 체계를 사용합니다. 질량 정확도: 10-20ppm; 이동성 분해능: 30-50; 예측된 RT 후 5분 이내에 스캔만 사용을 활성화합니다. 선택적으로 MS1 크로마토그램을 가져와야 하는 경우 MS1 필터링 을 수정합니다. 최적의 MS1 크로마토그램 추출을 위해 적절한 질량 분석기와 분해능을 선택하십시오.
   11. FASTA를 가져오고 미끼를 생성합니다. 미끼 생성 방법: 셔플 시퀀스를 설정합니다.
   12. 효소 선택: 내인성 펩타이드 분석에서 소화는 비특이적입니다. 드롭다운 효소 메뉴에서 추가 를 선택하여 효소를 편집합니다. 효소의 이름을 설정하고, Type 을 both로 설정하고, c-terminal 을 KR로, n-terminal을 KR로 절단 하고, 반절단을 허용하고, OK를 클릭합니다. 놓친 분열을 3으로 설정합니다.
   13. 대상 FASTA 파일을 가져온 다음 마침을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 관련 단백질 페이지를 확인합니다.
   14. 스펙트럼 라이브러리가 성공적으로 생성되었고 DIA 데이터를 가져왔는지 확인합니다. 식별된 펩타이드 목록을 수동으로 검사하고 다운스트림 정량 및 정성 분석을 진행합니다.
3. 정성적 및 정량적 측정
   참고: 정성적 및 정량적 분석은 Skyline에서 수행됩니다. Skyline의 DIA 데이터 분석에 대한 자세한 내용은 https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath 를 참조하십시오.
   1. DDA 데이터가 로드된 경우 메뉴에서 설정 > 전환 설정을 선택하고 획득 방법에서 DDA를 선택합니다. 설정 > 펩타이드 설정에서 정량화를 위해 MS 1 수준을 선택합니다.
   2. DIA 데이터가 로드된 경우 설정 > 전환 설정에서 획득 방법에서 DIA를 선택합니다. 설정 > 펩타이드 설정에서 정량화를 위해 MS 2 수준을 선택합니다.
   3. View > Document Grid에서 Peptide Quantification을 선택한 다음 Export the spreadsheet를 선택합니다. DDA 결과와 DIA 결과의 스프레드시트를 결합합니다.
      참고: 스프레드시트는 모든 샘플에서 라이브러리에 있는 모든 펩타이드의 피크 면적을 요약합니다. 이 실험에서 펩타이드 피크 면적은 Pierce 머무름 시간 혼합물의 일부인 머무름 시간 표준 펩타이드 GISNEGQNASIK으로 정규화되었습니다. 표준화는 표준물질의 피크 면적에 대한 각 펩타이드의 피크 면적의 비율을 계산하여 수행되었습니다.

Results

대표적인 실험 방식은 그림 1에 나와 있습니다. 표준 이온 이동도 범위와 IM-GPF를 모두 사용하여 획득한 DDA-PASEF 데이터(그림 2)를 분석한 결과 IM-GPF 접근법에 대해 훨씬 더 높은 펩타이드 커버리지가 나타났습니다(그림 2B). 특히, 표준 DDA-PASEF 방법을 사용하여 식별된 대부분의 펩타이드는 IM-GPF 데이터 세트에서 발견된 펩타이드와 겹쳤습니다. 펩타이드 식별 범위를 최대화하기 위해 두 접근 방식의 식별을 통합하여 포괄적인 스펙트럼 라이브러리를 생성했습니다.

선별된 쥐 신호 전달 펩타이드 데이터베이스를 사용하여 DDA- 및 DIA-PASEF(그림 3)를 통해 획득한 복제 데이터 세트의 추가 데이터베이스 분석에서 두 방법 모두에 공통적인 217개의 단백질이 밝혀졌습니다. 또한 115개의 단백질이 DIA-PASEF에 의해 고유하게 식별되었고 69개는 DDA-PASEF에만 독점적이었습니다. DDA 및 IM-GPF 데이터에서 파생된 스펙트럼 라이브러리를 활용한 탐색적 분석은 DIA-PASEF가 NPAFLFQPQRF(신경펩티드 SF) 및 YGGFMRRVGRPEWWMDYQ(프로엔케팔린에서 파생됨)와 같은 신경펩타이드를 확실하게 검출할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 신경펩타이드는 피크 할당이 불량하기 때문에 해당 DDA-PASEF 데이터 세트에서 안정적으로 검출되지 않았습니다(그림 3B,C).

정량적 관점에서 그림 4A 의 산점도는 두 접근 방식 모두 동일한 펩타이드를 정량화하지만 서로 다른 이온 유형을 포착한다는 점을 감안할 때 예상대로 DDA 전구체 강도와 DIA 단편 이온 강도 사이에 중간 정도의 양의 상관관계를 보여줍니다. 그림 4B 에 표시된 선택된 펩타이드에 대한 상자 그림은 두 가지 접근 방식으로 얻은 정량적 측정의 재현성을 추가로 보여줍니다. 상자 그림은 DIA 및 DDA로 측정된 각 펩타이드의 상대적 피크 면적을 보여주며, 오차 막대는 기술 반복실험 전반에 걸친 측정 변동성을 나타냅니다. 선택된 펩타이드는 통증과 진통 조절에 중심적인 역할을 하는 프로엔케팔린(PENK) 및 프로디노르핀(PDYN)을 포함한 오피오이드 프로호르몬에서 파생됩니다.

그림 1: 쥐 뇌 조직에서 내인성 펩타이드의 식별 및 정량화를 위한 펩티체믹스 워크플로우 개요. 워크플로에는 조직 해부, 펩타이드 추출 및 정제, 기체상 분획(IM-GPF)을 사용한 LC-이온 이동성-MS(LC-IM-MS) 데이터 수집, 스펙트럼 라이브러리 생성 및 정량 분석을 수행하는 데이터 처리가 포함됩니다. 그림의 일부는 BioRender에서 생성되었습니다. 탄, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 데이터베이스 펩타이드 및 단백질 동정. (A) 서로 다른 이온 이동성 창에서 식별된 전구체, 펩타이드-스펙트럼 일치(PSM) 및 고유한 펩타이드의 총 수를 비교하는 막대 차트. (B) 모든 이동성 창에서 일반적으로 식별되는 펩타이드와 개별 창 내에서 고유하게 검출되는 펩타이드의 비율을 보여주는 원형 차트. (C,D) 전체 이동도 범위(0.6-1.6 V·s/^cm2)(C) 및 제한된 이동도 창(0.6-1.0 V·s/cm²)(D)에 대한 m/z 및 이온 이동도 차원에 걸친 이온 신호 분포를 묘사하는 히트맵. (E) DDA 및 DIA 방법을 사용하여 획득한 데이터 세트에서 식별된 단백질의 수를 보여주는 업셋 플롯으로, 공유되고 고유한 단백질 식별을 강조합니다. (F) DIA 획득 복제(상단 패널) 및 DDA 획득 복제(하단 패널)에서 확인된 프로엔케팔린 전구체에서 파생된 펩타이드를 나타내는 히트맵. Leu-엔케팔린은 4개의 DDA 복제 중 2개에서 검출되지 않았으며, 이는 DDA 기반 획득에서 잠재적인 누락값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 스펙트럼 라이브러리를 사용한 DDA-PASEF 및 DIA-PASEF 데이터의 비교 및 탐색적 분석. (A) DIA 및 DDA-PASEF 복제에 걸친 신경펩티드 SF의 머무름 시간 정렬. (B) DIA(상단) 및 DDA(하단) 데이터 세트의 PENK(212-229) 단편 이온의 EIC. (C) 높은 공용출 및 스펙트럼 품질을 입증하는 DIA 복제물의 신경펩티드 SF의 단편 이온 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: DIA-PASEF(MS2 수준)와 DDA-PASEF(MS1 수준) 간의 정량적 측정 비교. (A) 이 산점도는 DIA 및 DDA 모드를 사용하여 얻은 펩타이드 신호 강도를 비교합니다. 구체적으로, x축은 DDA의 log₁₀ 변환된 전구체 피크 영역을 나타내고, y축은 각 펩타이드에 대한 DIA의 log₁₀ 변환된 단편 피크 영역을 나타냅니다. (B) 상자 그림은 4개의 대표적인 펩타이드, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 및 PDYN 235-248의 상대적 피크 면적을 나타냅니다. 오차 막대는 기술 복제 전반에 걸친 변동성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

펩티체학에서, 특히 내인성 펩타이드를 분석할 때 천연 펩타이드 프로필을 보존하는 것은 데이터 무결성과 생물학적 해석에 필수적입니다. 냉식염수 관류는 혈액을 제거할 뿐만 아니라 뇌를 냉각시켜 내인성 프로테아제의 활성으로 인해 빠르게 발생하는 사후 단백질 분해 분해를 크게 감소시킵니다. 뇌 온도를 낮춤으로써 효소 활동이 느려지고 순환 프로테아제가 맥관 구조에서 씻겨 나가는 동시에 사후 대사 변화도 감소합니다^25,26. 얼음처럼 차가운 식염수를 주입하면 뇌의 맥관 구조에서 혈액도 씻어냅니다. 혈액에는 신경펩티드 검출을 방해할 수 있는 고농도 단백질(예: 알부민 및 글로불린)과 순환 프로테아제가 포함되어 있기 때문에 이 단계는 특히 중요합니다. 풍부한 혈액 단백질의 사후 분해는 신경펩티드 추출물의 복잡성을 증가시키고 저농도 신호를 가려서 궁극적으로 식별 및 정량화를 모두 손상시킬 수 있습니다 25,26,27. 드라이아이스 또는 냉장 이소펜탄의 급속 냉동을 통해 뇌 조직을 즉시 동결하면 효소 과정이 거의 즉시 중단됩니다. 이러한 보존은 저풍부도 및 전장 성숙 신경펩타이드를 검출하고 신뢰할 수 있는 정량화를 보장하는 데 특히 중요합니다. 이러한 단계가 없으면 펩타이드 분해로 인해 가변성이 증가하고 식별과 정량화가 모두 손상되는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 따라서 채혈, 냉관류 및 빠른 뇌 냉각은 측정 전 펩티체학 데이터의 품질, 민감도 및 재현성에 직접적인 영향을 미치는 기본 기술입니다.

쥐의 뇌에서 추출한 펩타이드를 분석한 결과 두 개의 뚜렷한 이온 이동성 기둥이 존재하는 것으로 나타났습니다(그림 2C,D). 이 현상은 서로 다른 분자 종류 또는 펩타이드의 다양한 전하 상태에 기인할 수 있습니다. 기둥이 별개의 분자 클래스에 해당하는 경우, 공용출되는 비펩타이드 종은 선택 및 단편화를 위해 펩타이드와 경쟁할 수 있습니다. 또한 전하 상태의 차이로 인해 분리가 발생하는 경우, 고전하를 띤 펩타이드를 포함하는 플럼은 더 높은 품질의 MS/MS 스펙트럼을 생성하여 보다 신뢰할 수 있는 펩타이드 식별을 용이하게 할 것으로 예상됩니다.

이를 조사하기 위해 우리는 0.6-1.0, 0.9-1.3 및 1.2-1.6 V·s/cm²의 세 가지 개별 이동성 창에 걸쳐 데이터를 수집하는 이온 이동성 분획 전략을 구현했습니다. 이러한 창은 펩타이드에 대한 표준 DDA-PASEF 실험에서 일반적으로 분석되는 전체 이온 이동도 범위에 걸쳐 있습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 검출된 전구체의 총 수는 전체 스캔 범위(0.6-1.6V·s/^cm2)에서 가장 높았지만, 0.6-1.0V·s/^cm2 창 내에서 훨씬 더 많은 수의 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)가 관찰되었습니다. 이 발견은 두 개의 기둥의 존재가 실제로 다른 분자의 간섭 때문일 수 있음을 시사합니다.

이온 이동성 기반 전구체 분획은 기존의 전체 스캔 방법에 비해 펩타이드 커버리지가 30% 증가했습니다. 전체 스캔 데이터 세트에서 식별된 펩타이드의 약 82%가 분획을 사용하여 식별된 펩타이드와 겹쳐 분획 전략의 일관성과 견고성을 강조합니다(그림 2B). 이러한 관찰을 바탕으로 이온 이동도 분획 및 전체 스캔 데이터를 사용하여 DIA-PASEF를 사용하여 신경내분비 펩타이드의 정량 분석을 위한 스펙트럼 라이브러리를 구성했습니다.

DDA 및 DIA를 통해 획득한 복제 데이터 세트의 데이터베이스 분석은 DIA에 의해 고유하게 식별된 115개의 단백질을 포함하여 DIA 데이터에서 더 많은 수의 펩타이드 및 단백질 식별을 나타냈습니다(그림 2E). 여기에는 Pro-FMRFamide 관련 펩타이드 FF 및 VF와 같은 신경펩타이드가 포함되었습니다. 대조적으로, 69개의 단백질은 DDA에 의해 독점적으로 확인되었으며, 그 중 다수는 세포 접착 및 신경 발달과 관련이 있습니다. 이러한 발견은 DDA 및 DIA 방법론이 더 넓은 펩타이드 범위를 달성하기 위해 보완적인 방식으로 적용될 수 있음을 시사합니다.

추가 분석을 통해 DIA 획득은 DDA를 사용한 내인성 펩타이드 분석에서 자주 발생하는 일부 결측값 문제를 효과적으로 해결하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, Leu-엔케팔린은 4개의 DDA 복제 중 2개에서만 검출된 반면(그림 2F, 하단 패널), 4개의 DIA 복제 모두에서 일관되게 확인되었습니다(그림 3F, 상단 패널).

정량적 단백질체학에 널리 사용되는 플랫폼인 Skyline은 DDA 및 DIA-PASEF 데이터 세트를 모두 분석하는 데 활용되었습니다²⁸. 이 소프트웨어는 스펙트럼 라이브러리 매칭, 단편 이온 공동 용출 및 머무름 시간 정렬을 통해 펩타이드 식별을 용이하게 합니다. 누락된 식별을 줄이는 DIA-PASEF의 능력을 평가하기 위해 DIA 데이터 세트에서만 독점적으로 검출된 펩타이드에 대한 정성적 평가를 수행했습니다.

그림 3D에서 볼 수 있듯이, 신경펩티드 SF는 동일한 머무름 시간 창 내의 모든 DIA 복제에서 일관되게 검출되었다. DDA 복제에서의 검출은 25분에서 45분 범위의 머무름 시간으로 상당한 가변성을 나타냈습니다(그림 3A). 신뢰도 점수가 낮은 피크 오할당을 포함하여 관찰된 불일치는 그림 3B와 같이 단편 이온 커버리지가 제한적이거나 품질이 낮기 때문일 수 있습니다. 대조적으로, 그림 3C는 신경펩티드 SF에 해당하는 단편 이온이 모든 DIA 복제에서 잘 정렬되어 신뢰할 수 있는 자동 식별을 지원한다는 것을 보여줍니다.

프로엔케팔린에서 파생된 PENK(212-229) 펩타이드에 대한 MS/MS 스펙트럼 품질을 비교한 결과 DIA-PASEF의 장점이 더욱 입증되었습니다. DIA에서 얻은 스펙트럼은 DDA에 비해 더 높은 강도와 향상된 단편 이온 품질을 나타냈으며(그림 3), 이는 특히 저농도 내인성 펩타이드를 검출하는 데 유용합니다.

정량 분석을 통해 DIA-PASEF는 DDA와 비슷한 성능으로 생물학적 복제 전반에 걸쳐 일관되고 재현 가능한 측정을 산출하는 것으로 확인되었습니다(그림 4). 또한 DIA는 MS2 수준에서 정량화를 가능하게 하여 MS1 기반 DDA에 비해 단편 이온 수준 특이성을 제공하고 펩타이드 식별에 대한 신뢰도를 높였습니다. 이러한 발견은 특히 데이터 완전성과 재현성이 중요한 경우 복잡한 생물학적 매트릭스에서 표적 신경펩티드 정량화를 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식으로 DIA-PASEF를 사용하는 것을 뒷받침합니다.

이 프로토콜은 신경펩타이드 분석 및 정량화를 위한 포괄적인 전략을 간략하게 설명합니다. IM-GPF 접근 방식은 고품질 스펙트럼 라이브러리의 구축을 용이하게 합니다. DIA-PASEF는 DDA-PASEF에 비해 향상된 재현성과 향상된 펩타이드 적용 범위를 제공하는 동시에 MS2 기반 정량화도 향상시킵니다. 두 가지 획득 전략을 결합하면 각 방법이 고유한 펩타이드 식별에 고유하게 기여하므로 전체 펩타이드 적용 범위가 증가합니다(그림 2E). 이 프로토콜의 한계는 DDA 및 DIA-PASEF 방법을 통한 스펙트럼 라이브러리 생성과 데이터 수집을 모두 지원하기 위한 충분한 샘플 재료가 필요하다는 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% 포름산 물	피셔 사이언티픽	LS118-500	LC/MS 등급
아세트산	피셔 사이언티픽	A11350	LC/MS 등급
아세토니트릴	피셔 사이언티픽	AA47138K7	LC/MS 등급
포름산	피셔 사이언티픽	PI28905	LC/MS 등급
메탄올	피셔 사이언티픽	AA47192K7	LC/MS 등급
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 스핀 컬럼	Fisher Scientific	AA47192K8
Pierce 펩타이드 머무름 시간 교정 혼합물	Thermo Fisher	A11351	LC/MS 등급
SpeedVac 진공 농축기	제네막	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	이 연구에 사용된 특정 모델은 더 이상 제조업체에서 사용할 수 없습니다. 참조 timsTOF
Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	LC/MS 등급