SCAnED - 표피 및 진피 피부 구획에서 반자동 세포 및 핵 검출을 위한 오픈 소스 피부 분할 매크로

요약

여기에서는 피부 분할을 위한 무료 ImageJ 기반 매크로인 SCAnED를 사용하여 피부 절편에서 면역 및 비면역 세포를 식별하고 정량화하기 위한 반자동 프로토콜을 제시합니다.

초록

조직 내 면역 및 비면역 세포의 공간적 분포와 세포 특이적 마커의 발현은 제 자리에서 세포 기능에 대한 필수 정보를 제공합니다. 인간의 피부는 다양한 표현형을 가진 다양한 세포로 구성된 정의된 구획이 있는 매우 복잡한 기관입니다. 다중 형광 표지를 사용하여 뚜렷한 피부 세포 집단을 결정하고 추가로 특성화할 수 있습니다. 그러나 현재 단일 세포 해상도로 표피 또는 진피 내의 세포를 실리코 분할할 수 있는 피부 샘플의 이미지 분석을 위한 비상업적 도구의 가용성은 제한적입니다. 우리는 여기에서 무료로 사용할 수 있는 도구 SCAnED(Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis)를 사용하여 피부 절편의 면역형광 염색, 공초점 현미경 및 이미지 분석을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. SCAnED 매크로를 사용하면 인간 피부의 표피 및 진피 구획 모두에서 세포와 핵을 정확하게 식별하고 분류할 수 있습니다. 우리는 세포질 및 핵과 같은 다양한 세포 및 세포 구획에서 메이커 발현의 평균 강도 수준을 결정하는 방법과 Google Colab에서 실행되는 즉시 사용 가능한 Jupyter 노트북으로 제공되는 Python 파이프라인을 사용하여 다양한 양의 이러한 마커를 발현하는 세포를 정량화하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜을 통해 경험이 없는 사용자는 피부 조직 내에서 세포 특이적 발현 프로필을 결정하고 표피 및 진피 구획 내 세포의 공간적 분포에 대한 통찰력을 제공하여 인간 피부의 복잡한 조직 구조와 세포 구성을 더 깊이 이해할 수 있습니다.

서론

세포 수준에서 피부 조직을 이해하고 표피 및 진피 구획 내에서 세포 표현형, 형태 및 국소화를 식별하는 것은 피부과 연구 및 조직병리학에서 중추적인 역할을 합니다 ^1,2. 건강한 상태에서 각질세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포를 포함하는 표피 내의 세포 구성은 염증성 피부 질환과 암에서 크게 불균형해집니다. 더욱이, 표피 아래에 위치하고 섬유아세포와 대부분의 면역 세포를 품고 있는 진피 내 세포의 표현형과 국소화는 질병에서 크게 변할 수 있습니다. 따라서 세포 및 핵 분할은 세포 수, 단백질 발현, 형태 및 공간 조직과 같은 세포 속성과 크기, 모양 및 전사 인자 발현과 같은 핵 특성을 평가하여 피부 항상성 및 질병의 이해를 돕는 데 필수적입니다 ^3,4,5.

QuPath⁶, CellProfiler⁷ 및 ilastik⁸과 같은 범용 이미지 분석 플랫폼을 사용할 수 있음에도 불구하고 이러한 도구는 피부 조직의 구조적 복잡성과 이질적인 세포 형태에 적응하기 위해 광범위한 사용자 정의 및 스크립팅이 필요한 경우가 많습니다. 표피 및 진피 구획의 자동 분할을 위해 특별히 맞춤화된 도구는 거의 없으며 사용 가능한 많은 솔루션이 상업적이며 자유롭게 액세스할 수 없습니다. 이러한 제한으로 인해 비전문가가 피부별 분석을 위한 효율적인 파이프라인을 구현하기가 어렵습니다.

여기에서는 반자동 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 조직 염색에서 이미지 분석에 이르기까지 모든 중요한 단계를 다루는 피부 조직 및 그 구획 내의 세포 및 핵 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 표피/진피 분할을 위한 E-cadherin으로 염색하고 세포/핵 검출을 위한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)으로 염색하는 것을 포함하여 피부 조직의 면역형광 염색에 대한 자세한 정보로 시작합니다. 검증 목적으로 두 가지 관심 마커인 Vimentin(VIM)과 CD90이 포함되었습니다. 재현성을 보장하기 위해 최적화된 농도( 표 1 참조)의 항체를 사용하고 레이저 강도, 노출 시간 및 해상도에 대해 일관된 설정으로 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다.

또한 Skin Compartment Analysis of Epidermis 및 Dermis의 약자인 맞춤형 ImageJ⁹ 매크로 SCAnED를 소개하고 표피와 진피 모두에서 핵과 세포의 인실리코 분할 및 검출에 필요한 모든 단계를 제공합니다. 사용자는 SCAnED 프로토콜을 진행하기 전에 간단하고 빠른 임계값 또는 딥 러닝 도구인 StarDist¹⁰ 및 훈련된 피부 모델을 사용하여 두 가지 핵 검출 방법 중에서 선택할 수 있습니다. 일반 도구와 달리 SCAnED는 피부 조직학을 위해 특별히 개발되었으며 표피 및 진피 영역의 자동 구획화와 두 영역에 걸쳐 여러 마커의 통합 정량화를 가능하게 하여 이를 능가합니다. 이는 프로그래밍이나 딥 러닝에 대한 전문 지식이 부족한 연구자에게 특히 유용하며 피부 이미지 분석에 맞춰진 즉시 사용할 수 있는 도구를 제공합니다.

우리는 또한 최대 5개의 관심 마커의 면역형광 이미지에서 세포당 평균 강도 수준을 추출하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로 Google Colab¹¹ 에서 작성 및 실행되어 Jupyter 노트북으로 공유된 획득한 단일 셀 데이터의 통계 분석을 위한 Python 코드를 제공합니다. 당사의 프로토콜과 SCAnED 매크로는 고급 면역형광 및 컴퓨팅 전문 지식이 없는 피부 연구자에게 표피 및 진피 구획에 중점을 두고 인간 피부의 세포 및 마커 발현을 라벨링하고 반자동으로 정량화할 수 있는 실용적인 도구를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 파라핀 포매 피부 절편에서 E-cadherin, VIM 및 CD90의 면역형광 표지 및 DAPI를 이용한 핵염색

참고: 프로토콜은 파라핀 포매 섹션에 대한 단계를 보여줍니다. 신선 및 냉동 조직 샘플의 경우 조직 절편을 고정하고 프로토콜의 1.3단계를 계속합니다.

1. 팬이나 오븐을 사용하여 파라핀을 녹입니다.
2. 수분 함량이 증가하는 등급별 알코올(예: 자일렌 → 100% 에탄올 → 85% 에탄올 → 70% 에탄올 → 물)을 통과하여 절편을 재수화합니다.
3. 항원에 대해 적절하게 항원 검색 단계를 수행합니다.
4. PBS에서 0.3% Triton X로 조직 절편을 투과화합니다(3 x 20분)( 표 2 참조).
5. PBS로 슬라이드를 세척합니다(1 x 5분).
6. 소수성 슬라이드 마커 펜으로 각 샘플을 둘러싸서 액체 유출을 방지하고 시약의 양을 최소화한 후 건조시킵니다.
7. 1차 항체(Abs용 완충액: PBS + 2% BSA)를 적용합니다( 표 1 및 표 2 참조). 슬라이드를 가습된 챔버 상자(젖은 상자)에 넣고 밤새 배양합니다.
8. PBS에서 0.3% Triton X로 슬라이드를 세척합니다(3 x 5분).
9. PBS로 슬라이드를 세척하여 여분의 세제를 제거합니다(1 x 5분).
10. 2차 항체와 염소 혈청을 도포합니다( 표 1 참조). 슬라이드를 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
11. PBS에서 0.3% Triton X로 슬라이드를 세척합니다(3 x 5분).
12. PBS로 슬라이드를 세척하여 여분의 세제를 제거합니다(1 x 5분).
13. 핵 염색을 위해 DAPI를 추가합니다( 표 1 참조). 슬라이드를 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
14. PBS에서 0.3% Triton X로 슬라이드를 세척합니다(3 x 5분).
15. PBS로 슬라이드를 세척합니다(1 x 5분).
16. 각 샘플에 형광 마운팅 매체 1방울(~5-15μL)을 바르고 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다(필요한 경우 기포 제거). 슬라이드를 어둠 속에서 건조시키십시오.

항체와 염료	작업 집중	희석
항-비멘틴 항체	0.8 μg/mL	1:50
항-E-카드헤린 항체	1 μg/mL	1:333
항-CD90 항체		1:1000
AF488 안티 마우스		1:500
AF568 안티 토끼		1:500
AF647 안티 마우스		1:500
DAPI	1 μg/mL

표 1: 항체 및 염료.

1. 염색 완충액
시약	최종 농축	분량
BSA	2%	1 그램
PBS	1배	50 밀리리터
합계	해당 사항 없음	50 밀리리터
2. 투과화 완충액
시약	최종 농축	분량
트리톤 X	0.30%	300 μL
PBS	1배	100 밀리리터
합계	해당 사항 없음	100 밀리리터

표 2: 솔루션 레시피.

2. 공초점 이미징

참고: 이 프로토콜의 경우 10x 대물렌즈(NA 0.4) 및 4개의 레이저 라인(405nm, 488nm, 561nm, 640nm)이 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경이 사용되었습니다.

1. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다( 그림 1의 예제 이미지 참조).
2. 다음 스캔 크기 매개변수를 사용하여 매크로를 생성하고, StarDist 모델을 훈련하고, 이미지 획득에 이상적입니다: 이미지 크기 = 4,096 x 4,096 픽셀(또는 1,273 x 1,273 미크론), 비트 심도 = 16비트, 최소 픽셀 크기 = 0.3 미크론, 신호 대 잡음비(SNR) = 최소 3.

그림 1: 피부 절편의 면역형광 염색. DAPI: 표지 핵, CD90: 섬유아세포 마커, E-cadherin: 표피 표지에 사용, VIM: VIM 발현 세포, Merge: DAPI(자홍색), CD90(파란색), E-cadherin(노란색) 및 VIM(녹색) 염색의 병합. 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. SCAnED 매크로를 이용한 영상 분석(보충 파일 1, 보충 영상 S1, 보충 영상 S2)

1. 매크로(동영상 SCAnED.mp4)를 시작합니다.
   1. 기본 설정의 Bio-Formats를 사용하여 Fiji/ImageJ에서 면역형광 이미지를 엽니다.
      알림: 이 단계에서 채널을 분할하지 마십시오.
   2. Plugins | 매크로 | SCAnED 매크로 스크립트(보충 파일 1)를 실행하고 선택하십시오.
   3. 매크로에서 제공하는 단계별 화면 지침을 따릅니다.
2. SCAnED 매크로를 사용한 표피와 진피의 인실리코 분할.
   1. 메시지가 표시되면 E-cadherin 채널을 선택합니다.
   2. 이미지 | 조정 | 임계값을 선택하고 E-cadherin 채널에 대해 확인을 클릭하여 표피 영역을 완전히 캡처합니다.
   3. 필요한 경우 ImageJ에서 플러드 채우기 도구 아이콘을 선택하고 표피의 윗부분을 클릭한 다음 확인 을 클릭하여 E-cadherin 마스크의 간격을 좁히는 플러드 채우기 단계를 확인합니다(토론 섹션의 보충 그림 S1A-E 및 문제 해결 팁).
   4. 마스크가 반전된 경우 선택 영역을 반전하라는 메시지가 표시되면 예 및 확인 을 선택합니다. 그렇지 않으면 아니요 및 확인 을 선택합니다(토론 섹션의 보충 그림 S1F,G 및 문제 해결 팁 참조).
   5. 메시지가 표시되면 DAPI 채널을 선택합니다. 표피-진피 분할 전후의 핵 이미지는 그림 2에 나와 있습니다.
3. 임계값 함수를 사용한 핵 분할
   1. 강도 수준을 자동으로 정의합니다.
4. StarDist를 사용한 핵 분할
   1. ImageJ에서 StarDist를 엽니다(그림 3).
   2. 핵 검출 모델(보충 파일 2)을 StarDist GUI에 로드합니다(그림 4). StarDist 모델을 생성하기 위한 해당 훈련 쌍은 보충 그림 S2에 나와 있습니다.
      참고: StarDist 오류가 발생하는 경우 이 모델에는 Tensor Flow 버전 1.15를 사용해야 합니다( 보충 그림 S3 참조).
   3. 먼저 핵 채널을 클릭합니다.
   4. 타일 설정을 적절하게 조정합니다(타일 수가 예상 패치 크기(256 x 256픽셀)와 일치하는지 확인합니다( 그림 3 및 그림 4 참조).
      참고: StarDist 분할은 핵 수에 따라 시간이 걸릴 수 있습니다.
5. 핵 단백질의 강도 측정 및 정량화
   참고: SCAnED를 실행하기 전에 Analyze | 측정값을 설정 하고 매개변수를 구성하여 정확하고 관련성 높은 데이터 출력을 보장합니다(그림 5).
   1. 메시지가 표시되면 예를 선택하여 핵의 마커 강도를 측정합니다.
   2. 적절한 마커 채널(최대 5개 가능)을 선택합니다.
   3. 매크로의 지시에 따라 결과를 CSV 파일로 저장합니다.
   4. 각 채널에 대해 반복합니다.
   5. 모든 채널이 처리되면 매크로의 지시에 따라 결과를 CSV 파일로 저장합니다.
      참고: 더 나은 시각화를 위해 나머지 분석을 위해 특정 피부 영역의 확대 보기를 포함했습니다(그림 6).
6. 세포 분할(세포질 영역)
   참고: 세포 분할은 핵 ROI 확장을 기반으로 하므로 핵 분할 후에 시작되어야 합니다.
   1. 임계값 함수가 핵 분할에 사용된 경우 이진 팽창을 적용합니다.
   2. StarDist가 핵 분할에 사용된 경우 처리 시간이 더 긴 확대 확장을 사용합니다( 보충 그림 S4 참조).
7. 세포질 단백질의 강도 측정 및 정량화
   1. 전체 셀의 마커 강도를 측정하려면 예를 선택합니다.
   2. 매크로의 지시에 따라 결과 CSV 파일을 저장합니다.
   3. 각 마커 채널에 대해 순서대로 반복합니다.
   4. 출력 데이터의 일관성을 유지하기 위해 핵 및 세포 측정 모두에 대해 동일한 채널 순서를 유지합니다.
   5. 매크로 메시지가 표시될 때마다 삭제 를 선택하여 표피와 진피 사이에 핵 데이터가 혼합되지 않도록 합니다. 그림 7 은 임계값 기반 세분화의 모든 단계를 보여줍니다.

그림 2: 표피 및 진피 핵의 채널 특이적 핵 분석 및 분리. DAPI의 면역형광 염색은 전체 피부에서 핵의 형태와 공간적 분포를 보여줍니다(왼쪽 이미지). DAPI로 염색된 표피 핵의 핵 채널 표현은 표피 구획 내 핵의 분포에 대한 통찰력을 제공합니다(중간 이미지). DAPI로 염색된 진피 핵의 핵 채널 표현은 진피 구획 내의 핵 분포를 시각화합니다(오른쪽 이미지). 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: "StarDist" 옵션 활용. menu/Plugins/StarDist/StarDist 2D 내에서 "StarDist 2D" 옵션의 위치를 강조 표시한 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 핵 검출 모델 사용 지침. "nuclei_detection_model.zip" 파일을 다운로드하고 찾아보기 섹션에 해당 파일 경로를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 측정 설정 구성. (A) 메뉴 내에서 측정 설정 옵션의 위치를 강조 표시하여 후속 분석을 위해 측정 매개변수를 사용자 정의할 수 있는 스크린샷입니다. (B) 측정 설정을 조정하기 위한 인터페이스를 표시하는 측정 설정 상자를 설정 하여 사용자가 데이터 수집 및 분석을 위한 매개변수를 지정할 수 있도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 특정 영역의 확대 보기. (A) DAPI(자마색)와 VIM(녹색) 염색의 병합. (B) A에서 특정 영역의 확대 보기로 피부 조직 내 VIM 발현에 대한 자세한 시각화를 제공합니다. 표피와 진피 내 핵의 형태가 다르다는 점에 유의하십시오. 스케일 바 = 100 μm (A), 20 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 임계값을 사용하여 핵 및 세포에 대한 표피 및 진피의 SCAnED 분할. (A) 전체 이미지: DAPI(자홍색)와 VIM(녹색) 염색의 병합. 상부: (B) 분리 후 DAPI와 VIM으로 염색된 표피핵의 병합. (C) 임계값을 이용한 표피핵의 마스크. (D) 표피 핵의 핵 분할은 DAPI와 VIM의 병합 위에 겹쳐져 표피 구획 내의 핵 분포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. (E) DAPI와 VIM의 병합에 오버레이된 표피 핵의 세포 분할은 선택 영역이 핵보다 크다는 것을 보여주기 때문에 임계값 및 확장을 사용하여 표피 구획 내의 핵 분포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 하부: (F) 분리 후 DAPI와 VIM으로 염색된 진피핵의 병합. (G) 임계값을 사용하여 진피핵을 마스킹합니다. (H) DAPI와 VIM의 병합에 겹쳐진 진피 핵의 핵 분할은 진피 구획 내의 핵 분포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. (I) DAPI와 VIM의 병합 위에 겹쳐진 진피 핵의 세포 분할은 진피 구획 내의 핵 분포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 추출된 단일세포 데이터의 분류 및 시각화 (보충영상 S3)

참고: 각 면역형광 마커는 두 개의 CSV 파일을 생성합니다: 하나는 표피 구획용이고 다른 하나는 진피 구획용입니다.

1. 동형대조 샘플을 사용하여 마커별 강도 임계값을 설정합니다.
   1. 제공된 Jupyter Notebook을 사용하여 SCAnED 매크로에서 생성된 CSV 출력 파일을 Google Colab으로 가져옵니다. 먼저 적절한 Jupyter Notebook(예: 보충 파일 3 또는 보충 파일 4)을 다운로드하고 Google Colab(https://colab.research.google.com/)으로 이동하여 파일을 클릭하고 노트북을 열고 파일을 선택한 다음 코드 셀을 하나씩 실행합니다. 파일 선택이라는 메시지가 표시되면 버튼을 클릭하고 .csv 파일을 업로드합니다.
   2. 각 항체에 대해 이소형 대조군에서 평균 형광 강도를 계산합니다. 각 항체에 대한 컷오프를 결정하려면 DotPlot 노트북(보충 파일 4)을 열고 해당 이소타입 대조 파일을 업로드한 다음 코드를 실행합니다.
   3. 이소형 대조군 및 특이적 항체 플롯의 점 분포에 따라 적절한 강도 임계값을 선택하여 신호(특이적 염색)에서 배경(이소형 대조군)을 분리합니다. 이러한 값을 컷오프로 사용하여 개별 세포를 마커 발현에 대해 양성 또는 음성으로 분류합니다.
2. 실험 샘플의 마커 강도를 계산된 임계값과 비교합니다.
   1. 강도 ≥ 임계값을 가진 세포를 양성으로 분류합니다.
   2. 강도 < 임계값이 있는 셀을 음수로 분류합니다.
   3. 마커 발현의 조합을 기반으로 하위 집단을 분류합니다(예: 단일 양성, 이중 양성 또는 삼중 양성 세포 집단을 식별).
3. 두 가지 유형의 플롯을 사용하여 마커 표현식의 분포와 관계를 시각화합니다.
   1. 히스토그램 코드를 실행하여 히스토그램 및 오버레이 히스토그램을 생성하여 조건(예: 대조군 대 병든 피부) 간의 강도 분포를 비교합니다(보충 파일 3 다운로드, Google Colab(https://colab.research.google.com/)으로 이동, 파일 클릭, 노트북 열기, 파일 선택, 코드 실행)(그림 8).
   2. DotPlot 코드를 실행하여 공동 발현 패턴을 평가하기 위한 유세포 분석 스타일 산점도를 시뮬레이션하는 도트 플롯을 생성합니다(보충 파일 4 다운로드, Google Colab(https://colab.research.google.com/)으로 이동, 파일 클릭, 노트북 열기, 파일 선택, 코드 실행)(그림 9).
   3. 통계 테스트를 사용하여 유의미한 차이를 추가로 분석하고 평가하기 위해 처리된 데이터를 내보냅니다.

그림 8: VIM 양성 세포의 평균 강도를 비교하는 오버레이 히스토그램. 진피 내 파란색의 건강한 샘플(H)과 주황색의 건선 샘플(P)에서 VIM 세포의 평균 강도를 비교하는 히스토그램 오버레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 도트 플롯의 이중 양수 신호. 단일 양성, 이중 양성 및 이중 음성 모집단을 더 잘 시각화하는 데 도움이 될 수 있는 이중 염색 도트 플롯의 시연. 이 실시예는 (A) 건강한 건선 피부와 (B) 건선 피부의 진피에서, 그리고 (C) 건강한 건선 피부 샘플의 표피에서 CD90과 VIM의 이중 염색을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

이전 연구에서 우리는 SCAnED를 사용하여 인간 피부 진피 내 세포에서 세포질질 단백질인 라이실 산화효소(LOX) 및 전사 인자 저산소증 유도 인자 1(HIF-1)의 세포와 발현 수준을 검출하고 정량화하는 데 성공했습니다¹² 피부 연구에 대한 이 도구의 적용 가능성을 강조했습니다.

표피 및 진피 구획의 세포와 핵을 식별하는 피부 분할 매크로의 정밀도를 추가로 평가하기 위해 파라핀 포매 건강하고 염증이 있는 건선 피부 조직 샘플을 핵 및 표피/진피의 분할을 위해 DAPI 및 E-cadherin으로 염색했습니다. III형 중간 필라멘트인 VIM과 CD90은 모두 섬유아세포와 같은 진피의 중간엽 세포에서 주로 발현되며, 일부 표피 세포도 랑게르한스 세포, 기타 면역 세포 및 멜라닌 세포와 같은 이러한 마커를 발현합니다^13,14. 만성 염...

토론

SCAnED 프로토콜은 인간 피부 조직의 면역 및 비면역 세포 모두에 대한 구획 특이적 분석을 위한 반자동 방법입니다. 이 워크플로는 E-cadherin 기반 염색 프로토콜을 통합하여 표피 및 진피 분할, DAPI 기반 핵 및 세포 검출을 가능하게 한 다음 ImageJ 기반 매크로를 사용하여 핵 및 세포의 마커 발현을 정량화합니다. 또한 추출된 단일 셀 데이터를 시각화하기 위해 Python 워크플로 분석을 통해 사용자를 안내합니다. 이 프로토콜은 유연하며 최대 5 개의 서로 다른 관심 마커의 분석을 지원합니다.

SCAnED의 강점 중 하나는 표피와 진피 부위를 구별하는 능력입니다. 세포의 구획화된 분석은 감염이나 염증 중에 특정 피부 부위로의 면역 세포 침윤을 표적으로 하는 연구에서 정확한 정량화에 매우 중요합니다. 예를 들어, 건강한 피부 샘플과 염증성 피부 질환 건선 환자의 피부를 비교한 결과, 건강한 피부의 표피에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.3% 트라이튼 X	시그마-올드리치	T9284
BSA (소 혈청 알부민)	시그마 올드리치
CD90	세포 신호 전달	D3V8A
DAPI	로슈	10236276001
탈이온수
E-cadherin	앱캠	AB1416
형광 장착 배양체	다코	S3023
염소 항생쥐 IgG1 교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488  (AF 488 안티마우스)	써모피셔 사이언티브	A-21121
염소 항생쥐 IgG2a 교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor 647 (AF 647 항생쥐)	써모피셔 사이언티브	A-21241
염소 항토끼 IgG (H+L) 교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568 (AF 568 항토끼)	써모피셔 사이언티브	A-11011
염소 혈청	애질런트 테크놀로지스 & OUML; sterreich GmbH, 다코	X0907
PBS	깁코	14190-094
비멘틴	다코	M7020
<스트롱>재료
챔버 박스(습식 박스)
커버슬립스	써모피셔
소수성 염색용 액체 밀어내기 슬라이드 마커 펜 및 nbsp;	다이도 상교	Z377821	24x50mm
Solutions
투과화 완충제(0.3% Triton X, PBS)와 nbsp;			표 2를 참조하세요
염색 버퍼(PBS에서 2% BSA)와 nbsp;			표 2를 참조하세요
Software and Datasets
공초점 레이저 주사 현미경	올림푸스	역방향 IX83을 기반으로 한 FV3000	10배 대물렌즈(NA 0.4), 4개의 레이저 라인(405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, 코히런트 )
피지 (ImageJ)		V1.54h
구글 콜랩	구글
그래프패드 프리즈앤 nbsp;	그래프패드 소프트웨어 주식회사	프리즘 10	추가 통계 분석을 위해
후광	인디카 연구소
파이썬 프로그램		파이썬 3.11.12
쿠파트	오픈 소프트웨어 (뱅크헤드, P. 외, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)	v0.5.1
스타디스트			TF1.15.0 CPU 버전 설치