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방법 논문

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

2.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68749

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2025년 7월 18일

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

이 논문에서

요약

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

초록

세 가지 중요하고 상호 의존적인 과정이 감수분열 전구 I을 정의합니다: 상동 염색체는 서로 쌍을 이루어야 하며, 상동체를 함께 묶기 위해 시냅톤말 복합체(synaptonemal complex)라고 하는 단백질 구조를 형성해야 하며(시냅시스), 상동체는 재조합을 거쳐 유전 물질을 상호 교환하여 교차(CO)를 형성해야 합니다. 이러한 과정의 오류는 조기 난소 기능 부전, 이수성, 그리고 궁극적으로 임신 상실 및 불임을 초래할 수 있습니다. 감수분열 재조합은 특히 난모세포에서 오류가 발생하기 쉬우며, 인간 난모세포의 7% 이상이 교차없이 하나 이상의 염색체 쌍을 포함하고 있으며, 난자의 20%-80% 대 정자의 2.5%-7%는 이수성입니다. 그러나 염색체 오류가 왜 그렇게 현저한 성별 불균형을 보이는지는 불분명합니다. 본 프로토콜은 태아 및 청소년 마우스에서 각각 난모세포 전구기 I 및 중기 I 염색체 확산의 준비 및 분석 방법을 설명합니다. 감수분열 전구기 I 전반에 걸쳐 중요한 염색체 역학을 추적하기 위해 이 프로토콜은 감수분열 재조합(이중 가닥 절단의 경우 RAD51, CO 중간체의 경우 MSH4, 대부분의 CO를 식별하기 위한 MLH1/MLH3) 및 시냅스(염색체 축의 경우 SYCP3, 시냅스 영역의 경우 SYCP1, 시냅스 영역의 경우 HORMAD1)에 대한 공통 마커의 면역형광 염색을 사용합니다. 또한, 이 프로토콜은 수집된 난모세포의 체외 성숙을 사용하여 metaphase I에서 쌍을 이루는 염색체(bivalents)의 수와 총 교차 수(chiasmata)를 평가합니다. 이러한 기술은 함께 여성 감수분열에서 초기 염색체 역학을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위한 포괄적이고 정량적인 프레임워크를 제공합니다.

서론

감수분열(meosis)은 반수체 배우자(halloid gamete)의 생산에 필수적인 특수 세포 분열입니다. 프로페이즈 I(prophase I) 동안, 상동 염색체(각각 코헤신에 의해 함께 유지되는 자매 염색체로 구성됨)는 세 가지 중요한 작업을 수행해야 합니다: 1) 서로를 인식하고 쌍을 이루고, 2) 측면 축 사이에 시냅톤말 복합체(SC)를 형성하여 함께 압축하고, 3) 상동 재조합을 통해 DNA를 교환하여 비자매 염색체 1,2 사이에 교차(CO)를 생성합니다. 코헤신(cohesin)에 의해 유지되는 교차 형성으로 인한 물리적 연결은 metaphase I 동안 적절한 염색체 이중배향 및 분리를 보장합니다 3,4,5.

감수분열 전단계(meiotic prophase) I은 5단계로 구성되며, 각 단계는 시냅시스6의 상태에 의해 정의됩니다. 렙토네마(leptonema, 그리스어로 얇은 실을 뜻함)에서 염색체는 축 요소(SYCP3로 표시)가 염색체 축을 따라 형성될 때 응축됩니다. zygonema (결합 된 스레드) 동안, SC (SYCP1)의 가로 요소가 축7 사이에 형성됨에 따라 동족체가 시냅스를 시작합니다. pachynema (두꺼운 실)에서 염색체는 전체 길이를 따라 시냅스되어 있습니다. 그런 다음 SC는 diplonema (두 개의 스레드) 동안 분해되어 교차 부위 (chiasmata)에만 연결된 상동체를 남깁니다. Chiasmata는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 프로그래밍된 유도로 시작되는 과정인 상동 재조합의 산물입니다. 수백 개의 DSB 중 ~10%만이 CO가 됩니다. 마우스에서 대부분(90%-95%)은 MutLγ(MLH1-MLH3)에 의해 촉진되는 클래스 I CO 경로를 통해 형성되며, 나머지 CO는 클래스 II CO 경로 8,9,10,11을 통해 MUS81-EME1에 의해 만들어집니다.

쌍(pairing), 시냅스(synapsis) 및 재조합(recombination)은 고도로 조절되고 상호 의존적인 과정입니다. 오류는 일반적으로 체크포인트 메커니즘을 트리거하여 세포 사멸로 이어집니다. 암컷의 경우, 초기 prophase I 오류로 인한 생식세포 손실은 조기 난소 기능 부전을 유발할 수 있으며, 12,13 후기 오류(예: CO를 형성하지 못하는 상동체, CO의 잘못된 배치 또는 조기 응집력 손실)는 염색체 혼성 및 이수성을 유발할 수 있습니다. 인간의 경우, 감수분열 오류는 임신 손실과 불임의 주요 원인입니다. 여성의 감수분열은 특히 오류가 발생하기 쉽습니다. 인간 난자의 약 20%-80%(정자의 2.5%-7%)는 비정상적인 염색체 수를 가지고 있으며, 대부분은 첫 번째 감수분열 14,15,16,17의 오류로 인해 발생합니다. 나이가 모계 이수성의 가장 큰 단일 원인으로 확인되었지만, 난모세포가 오류에 취약한 이유는 불분명합니다.

난모세포의 높은 오류율의 기저에 있는 요인을 이해하는 것이 중요함에도 불구하고, 전단계 I 이벤트의 조절에 대한 대부분의 지식은 남성 감수분열에 대한 연구에서 비롯됩니다. 성체 고환 물질의 작은 조각이 감수분열 및 감수분열 후 생식 세포의 모든 단계를 평가하기에 충분한 자료를 제공하기 때문에 남성 감수분열은 오랫동안 연구자들이 더 쉽게 접근할 수 있었습니다. 대조적으로, 여성의 감수 분열은 불연속적인 방식으로 발생합니다. 마우스의 경우, prophase I은 성교 후 약 14일 후부터 태아 난소에서 반동기적으로 진행되며(dpc; 그림 1A), 생식선 성 결정 직후 18,19,20. 출생 무렵, 난모세포는 배란기(생쥐의 경우) 또는 수십 년(인간의 경우) 후까지 딕셔네이트 정지에 들어갑니다 21,22,23. 결과적으로, 특정 prophase I 단계는 제한된 발달 기간 동안에만 접근할 수 있으며(그림 1A), post-prophase I 이벤트는 청소년과 성인에서 한 번에 몇 개의 난모세포에서만 발생합니다. 기술적 발전으로 포유류 난모세포 감수분열 연구가 개선되었지만, 이러한 방법은 남성 연구에 사용된 유사한 기술에 비해 여전히 어렵고 시간이 많이 걸립니다.

암컷의 감수분열 분석은 하위병기 파키텐 난모세포(sub-stages pachytene oocyte)의 제한으로 인해 더욱 복잡하며, 이는 교차(crossover) 지정 및 성숙을 연구하는 데 중요합니다. 남성 연구는 잘 특성화된 성염색체 쌍 역학과 초기, 중기 및 후기 파키네마에 대한 표지자 역할을 하는 히스톤 변이체 H1t의 존재로부터 이익을 얻습니다 24,25,26. 그러나 sub-stages pachytene 난모세포에 대한 신뢰할 수 있는 방법은 공식화되지 않았습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 초기 전단계 I부터 중기 I까지 마우스 난모세포의 시냅스 및 재조합에 대한 포괄적인 분석을 용이하게 합니다. 이 연구는 Peters et al.27 및Tarkowski28 에 의해 개발된 고전적인 염색체 확산 기술과 Hunt29 및 Sun 및 Cohen30에 의해 이러한 방법에 대한 사전 개선을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 1) 특정 prophase I 하위 단계의 농축 및 식별, 2) 한 쌍의 태아 난소당 수행된 적용 횟수 극대화, 3) 시냅스 결함 및 병소에서 chiasmata로의 재조합 평가를 위한 철저하고 접근 가능한 지표를 강조하기 위해 개발되었습니다.

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프로토콜

모든 동물 취급 및 절차는 프로토콜 2004-0063에 따라 Cornell Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인에 따라 수행되었습니다.

1. 난모세포 전단계 I 염색체 확산 슬라이드의 준비

  1. 늦은 오후에 C57BL/6J 암컷 마우스(2-6개월)와 수컷(2-12개월)의 시간 제한 짝짓기를 설정합니다. 다음날부터 매일 아침(오전 9시 이전) 암컷에게 교미 플러그가 있는지 확인하십시오. 플러그 당일 정오는 0.5 dpc로 정의됩니다.
  2. 임신한 마우스를 희생하기 전에 다음을 준비하십시오.
    1. 실내 온도 H2O로 가습 챔버를 설정하십시오.
    2. Milli-Q 물에서 30mM Tris-HCl, 50mM 자당, 17mM 구연산나트륨, 5mM EDTA, 2.5mM DTT 및 0.5mM PMSF로 구성된 10mL의 저장성 추출 완충액(HEB, 표 1 참조)을 준비합니다. DTT 및 PMSF를 추가하기 전에 50mM 붕산을 사용하여 pH를 8.2 - 8.4로 조정합니다. HEB를 신선하게 만들고 DTT를 첨가한 후 2시간 이내에 사용하십시오.
    3. 초순수 H2O 10mL에 342mg 자당을 첨가하여 100mM 자당을 준비합니다.사용하지 않을 때는 4°C에서 보관하십시오.
    4. 초순수 H2O를 표준 전자레인지에서 1분 동안 예열합니다(90 - 95 °C까지). 흄 후드 아래에 가열된 초순수 H2O를 파라포름알데히드(PFA) 0.5g에 추가합니다. 1 N NaOH 2 방울을 넣고 와류를 섞어 실온으로 식히십시오. 50mM 붕산을 사용하여 pH를 9.2 - 9.3으로 조정하고 Triton X-100을 0.15%(v/v)까지 추가합니다. 최종 부피 50mL(1% PFA 정착액)에 초순수 H2O를 첨가하고 50mL 유리 Coplin 염색 용기에 고정제를 붓습니다.
      참고: 이 프로토콜은 PFA를 준비하기 위해 거의 끓는 물을 사용하여 최적화되었습니다. 그러나 65°C 이상의 용액에서 PFA를 가열하면 분해 및 독성 연기가 방출될 수 있습니다. 또는 수조에서 초순수 H2O를 60 ° C로 예열합니다.
    5. 70% 에탄올이 함유된 깨끗한 유리 현미경 슬라이드. 소수성 장벽 PAP 펜을 사용하여 최대 3개의 사각형(약 20 x 20mm, 그림 1E 참조)을 그립니다. 한 쌍의 난소는 6개의 정사각형(또는 각각 3개의 정사각형으로 구성된 2개의 슬라이드)에 충분한 물질을 제공합니다.
  3. IACUC 지침에 따라 임신한 마우스 14.5 - 18.5 dpc를 CO2 질식 및 자궁 경부 탈구로 희생시킵니다.
    1. C57BL/6J 마우스에서 prophase I의 특정 단계를 농축하기 위한 시점은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 주어진 발달 시점에 대해, 프로페이즈 I의 각 단계에서 난모세포의 대략적인 비율은 Evans et al. (1982)31의 데이터를 사용하여 제공되었습니다. 접합자 난모세포의 경우 16.5 dpc에서 수집합니다. 17.5 DPC의 초기 파키텐; 및 mid-pachytene - 18.5 dpc의 디플로텐.
  4. 해부 가위를 사용하여 복강을 열고 자궁 뿔을 제거합니다.
  5. 태아 쥐를 자궁 뿔, 탈피 조직 및 난황낭에서 해부합니다. 태아 마우스를 100mm 페트리 접시에 1x 인산염 완충액 식염수(PBS)가 있는 넣습니다.
  6. 한 번에 한 명의 여성 태아에서 난소를 절개하고 나머지는 1x PBS로 유지합니다. IACUC 지침에 따라 태아 쥐를 참수하여 희생시킵니다. 스테인리스 스틸 표본 핀을 사용하여 몸통 복부 표면을 해부 접시의 실리콘 패드까지 고정합니다.
  7. 현미해부 가위를 사용하여 배꼽 바로 아래의 복부를 절개하고 동맥에 흠집이 나지 않도록 주의합니다. 가는 집게를 사용하여 태아의 자궁 뿔이 보일 때까지 장을 옮깁니다.
  8. 난소를 찾으려면 방광에서 신장을 향해 바깥쪽으로 각 자궁 뿔을 따라 이동합니다. 난소와 난관은 신장 바로 아래와 복막강 뒤쪽 근처에 위치한 자궁 뿔의 말단에서 작은 소구 구조로 나타납니다(그림 1B).
  9. 가는 집게를 사용하여 난소를 꼬집어 750μL의 1x PBS로 채워진 작은 시계 유리에 모읍니다.
  10. 난소를 주변 조직으로부터 절개하고 난소가 완전히 잠기도록 주의하면서 750μL의 HEB가 포함된 시계 유리에 두 난소를 배치합니다( 그림 1C 및 1D 참조). 실온에서 15분 동안 난소를 배양합니다.
  11. 35 μL의 100 mM 슈크로스를 오목한 슬라이드에 피펫팅합니다. 가는 집게를 사용하여 양쪽 난소를 HEB에서 자당으로 옮깁니다.
  12. 25G 바늘을 사용하여 난소를 슬라이드에 고정하고 두 번째 바늘인 비스듬한 아래를 사용하여 난소에서 난모세포를 밀어냅니다.
    1. 난소가 투명해지고 젤리처럼 변하면 HEB에서 난소를 제거하고 두 번째 난소로 이 과정을 반복합니다. 세포를 분산시키기 위해 용액을 부드럽게 피펫팅합니다.
  13. 슬라이드를 PFA의 코플린 염색 병에 담그고 슬라이드 가장자리를 종이 타월로 짧게 두드립니다. PFA가 각 사각형의 소수성 경계를 따라 작은 방울로 수집되면(그림 1E) 난모세포-자당 용액 5μL를 각 PFA 방울에 피펫팅합니다.
  14. 슬라이드를 앞뒤로 부드럽게 기울여 사각형 부분에 난모세포를 펴 놓습니다. 한 사각형의 솔루션이 인접한 사각형으로 넘쳐나지 않도록 주의하십시오.
  15. 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 난모세포-자당 용액이 소진될 때까지 슬라이드를 계속 만듭니다.
  16. 모든 여성 태아가 사용될 때까지 1.6-1.15단계를 반복합니다. 실온의 습한 챔버에서 슬라이드를 2시간 동안 배양합니다.
  17. 배양 후 습한 챔버를 엽니다. 대부분의(전부는 아닐지라도) 액체/정착제가 여전히 슬라이드 표면에 존재해야 하므로(각 정사각형 섹션에서 약 10μL), 슬라이드를 종이 타월로 부드럽게 옮기고 실험실 벤치에서 실온에서 슬라이드를 완전히 자연 건조시킵니다(이 프로세스는 일반적으로 현지 습도에 따라 30 - 60분 소요).
    알림: 슬라이드는 잔류 PFA 흄에 대한 잠재적 노출을 완화하기 위해 흄 후드 아래에서 공기 건조될 수도 있습니다. 이렇게 하면 건조가 약 20-30분으로 단축됩니다.
  18. 0.4% 습윤제로 슬라이드를 초순수 H2O에 2분 동안 세척합니다. 슬라이드가 완전히 건조되도록 합니다.
    참고: 이 시점에서 슬라이드는 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 특정 항원결정기는 불안정합니다(예: 당사의 경험에 따르면 MLH1은 잘 염색되지 않으며 SYCP3 염색은 동결 후 상당한 인공물이 있음). 슬라이드는 즉시 면역 염색하는 것이 좋습니다.

2. prophase I 염색체의 면역형광 염색이 퍼집니다.

  1. 1x PBS에 10%(v/v) Normal Goat Serum, 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.05% Triton X-100을 함유하는 10x 항체 희석 완충액(ADB, 표 2 참조)을 준비합니다. 필터는 0.45μm 필터를 사용하여 멸균하고 최대 2주 동안 4°C에서 보관합니다.
  2. 0.4% 습윤제가 함유된 Coplin 염색 용기에 담긴 슬라이드를 1x PBS에 10분 동안 세척합니다. 0.1% Triton X-100이 들어 있는 Coplin 염색 용기에 담긴 1x PBS에 10분 동안 슬라이드를 세척합니다. 1x ADB의 Coplin 염색 용기에 10분 동안 블록 슬라이드를 넣습니다.
  3. 선택한 1차 항체를 10x ADB로 희석합니다(항체 목록 및 해당 희석액은 재료 표 참조).
    1. 다중 면역염색을 위한 4가지 항체 조합을 준비합니다: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; 및 (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, 크레스트 35.
  4. ADB에서 슬라이드를 제거하고 여분의 액체를 두드린 다음 실온의 물이 있는 가습 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이드의 제곱 섹션당 30μL의 희석된 항체를 적용하되, 한 사각형의 항체가 인접한 사각형으로 넘쳐나지 않도록 주의합니다.
  5. 가습 챔버를 닫고 슬라이드를 실온에서 밤새 배양합니다.
  6. 다음 날 아침, 습한 챔버를 열고 슬라이드에서 희석된 항체를 두드리십시오. 2.2단계를 반복합니다.
  7. 선택한 2차 항체를 10x ADB로 희석합니다( 재료 표 참조).
    참고: 이 시점부터 슬라이드와 항체는 감광성이 있습니다. 어둠 속에서 이후의 모든 부화를 완료하십시오.
  8. ADB에서 슬라이드를 제거하고 과도한 액체를 두드린 다음 슬라이드를 실온의 물이 있는 가습실에 넣습니다. 각 슬라이드의 제곱 섹션당 선택된 희석된 항체 30μL를 적용하되, 한 제곱미터의 항체가 인접한 사각형으로 넘쳐나지 않도록 주의합니다.
  9. 가습 챔버를 닫고 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
  10. 1x PBS에 0.4% 습윤제가 함유된 Coplin 염색 용기에서 슬라이드를 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 초순수 H2O에서 0.4% 습윤제가 함유된 Coplin 염색 용기에서 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.
  11. 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 또는 이에 상응하는 핵산 염색이 있는 퇴색 방지 마운팅 배지를 소량 떨어뜨립니다. 각 슬라이드에 60mm x 24mm No. 1.5 유리 커버슬립을 놓고 여분의 액체를 조심스럽게 닦아냅니다.
    참고: 슬라이드는 투명 매니큐어 또는 고무 시멘트로 밀봉할 수 있습니다. 경화 마운트런트를 사용하는 경우 슬라이드를 밀봉할 필요가 없습니다. 슬라이드는 4°C의 슬라이드 상자 또는 폴더에 보관해야 합니다. 염색 직후 슬라이드를 이미지화하는 것이 가장 좋지만, 경험에 따르면 4°C의 어두운 곳에 보관된 슬라이드는 몇 달에서 1년 동안 신호 강도를 유지할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 슬라이드를 신호 품질의 심각한 손실 없이 몇 년 동안 -20°C에서 유지할 수 있습니다.
  12. epifluorescence microscopy를 사용하여 63x에서 세포를 이미지화합니다( 재료 표 참조). 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ의 Zen, 재료 표 참조)를 사용하여 축을 따라 모든 채널의 SC 길이와 형광 강도를 측정합니다. 중심체(CREST 또는 DAPI 밀집 영역)에서 시작하여 각 염색체 축(SYCP3)의 길이를 추적합니다.
    1. HORMAD1 및 SYCP1을 분석하기 위해 형광 신호 피크의 길이를 기록합니다. HORMAD1 또는 SYCP1 피크의 총 길이를 계산하고 염색체 축의 길이로 나눕니다.
    2. MSH4 분석을 위해 SYCP3의 각 측정에 대한 형광 신호 피크 수를 정량화합니다. 핵당 MSH4 피크의 총 수와 MLH3 피크와 겹치는 MSH4 피크의 수를 모두 기록합니다. 피크를 해당 초점 수와 비교하여 MSH4의 개수를 확인합니다.

3. 키아스마타 관찰을 위한 Diakinesis/prometaphase 준비

  1. 감수 분열 능력이 있는 난모세포의 수율을 최대화하려면 어린 암컷 마우스(25 - 28일령)를 사용하십시오.
    참고: 난모세포 채취 48시간 전에 암컷 마우스에 5IU 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 복강내 주입하여 자극을 주사하여 수율을 높일 수 있습니다. 그러나 키아스마타 분석을 위해 자극되지 않은 암컷에서 충분한 생식 소포(GV) 난모세포를 수집할 수 있습니다.
  2. 마우스를 희생하기 전에 다음 시약과 용액을 준비하십시오.
    1. M2(마우스당 3mL) 및 KSOM(마우스당 1mL)이 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 최소 1시간 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
      참고: 동결된 배지 부분 표본 튜브는 난모세포 채취 전날 저녁에 뚜껑을 풀고 인큐베이터에 넣어 약 14시간의 평형을 이룰 수 있습니다.
    2. 2.5μM 밀리논(감수분열 재개를 방지하는 포스포디에스테라제 동종효소 억제제)으로 M2 배지를 준비합니다36. 20μL의 M2 + 밀리논 5방울을 35mm 페트리 접시에 피펫팅하고 가벼운 미네랄 오일로 오버레이합니다(그림 2C).
    3. 20μL KSOM 5방울을 35mm 페트리 접시에 넣고 가벼운 미네랄 오일로 오버레이합니다(그림 2C).
      주의: 온도와 pH의 조절은 난모세포 in vitro 성숙에 매우 중요합니다. 난모세포 채취는 가열된(37°C) 탁상에서 수행해야 합니다. 모든 미디어는 사용할 때까지 인큐베이터에 보관해야 하며, 주변 공기에 대한 노출로 인한 중단을 제한하기 위해 미디어 접시를 한 번에 하나씩 제거해야 합니다.
    4. 유리 현미경 슬라이드를 70% 에탄올로 세척하고 자연 건조시킵니다. 유리 현미경 슬라이드 뒷면에 ~ 4mm x 4mm 정사각형의 5 x 5 그리드를 가볍게 채점(다이아몬드 팁 펜으로)하거나 그리기(방수 잉크로)합니다(예는 그림 2B 에 나와 있으며 그리드를 추적하는 데 사용할 수 있음).
  3. 한 번에 한 마리의 마우스에서 난모세포를 수집합니다. IACUC 지침에 따라 CO2 질식 및 경추 탈구로 암컷 마우스를 희생시킵니다.
  4. 해부 가위를 사용하여 복강을 엽니다. 가는 집게를 사용하여 장을 옮깁니다.
  5. 방광에서 신장 방향으로 각 자궁 뿔을 따라갑니다. 난소와 난관은 신장 근처의 작은 지방 패드와 관련이 있습니다.
  6. 현미해부 가위를 사용하여 난소를 제거하고 밀리논과 함께 가스가 주입된 M2 매체에 넣습니다.
  7. 현저절부 가위를 사용하여 난소에서 모든 지방 및 기타 조직(윤활낭 포함)을 제거합니다. 25G 바늘을 사용하여 전방 여포를 파열합니다.
  8. 전사 피펫을 사용하여 M2 + milrinone의 난모세포를 100mm 페트리 접시의 얇은 층에 펴고 매체가 접시의 측면에 닿지 않도록 주의합니다(그림 2C).
  9. 해부 현미경(배율 25x - 50x)을 사용하여 GV 난모세포를 시각화합니다(그림 2F). GV 난모세포는 적운-난모세포 복합체(COC)의 적운 세포와 관련될 수 있습니다. 반복적인 피펫팅으로 적운 세포를 제거합니다.
  10. 입으로 작동되는 유리 피펫(직경 100 - 150 μm; 그림 2A). GV 난모세포를 경광유가 겹쳐진 20μL 드롭의 M2 + milrinone으로 전달합니다(그림 2C). 한 방울에 30개 이상의 난모세포를 넣지 마십시오.
  11. 모든 GV 난모세포가 수집되면 가벼운 미네랄 오일로 덮인 20μL 20μL 방울 또는 3개의 M2 + 밀리논을 통과시켜 체세포를 제거합니다.
  12. GV 난모세포(가능한 한 적은 배지 포함)를 30μL KSOM 방울로 전달합니다. 5개의 KSOM 방울을 통해 난모세포를 통과시켜 밀리논을 씻어냅니다(그림 2C).
  13. 모든 GV 난모세포를 경광유가 덧씌워진 20μL KSOM 방울로 옮기며, KSOM 방울당 최대 30개의 난모세포를 주입합니다(그림 2C). 세포 배양 인큐베이터(37 °C, 5 % CO2)에 난모세포를 배치합니다.
  14. 약 5시간 동안 난모세포를 배양합니다.
    참고: GV 파괴(핵막의 소멸 및 감수분열 재개를 표시함; 그림 2G) 일반적으로 배양에서 2시간 후에 발생하지만 난모세포 성숙 속도는 마우스 균주 또는 호르몬 자극에 따라 달라질 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 배양에서 총 5 시간은 대부분의 마우스 균주에서 chiasmata spreads에 가장 최적화되어 있습니다. 너무 오래 성숙하도록 방치하면 첫 번째 감수분열 분열과 극체 압출이 발생할 수 있습니다(그림 2H).
  15. 5 - 10개의 난모세포(가능한 한 적은 KSOM 포함)를 30μL 한 방울의 저장성 용액(초순수 H2O에서 0.9% 구연산나트륨)으로 이동합니다. 저장성 용액에서 난모세포를 5 - 10분 동안 배양합니다.
  16. 산성화된 물(초순수 H2O50mL에 빙초산 8방울)을 소량 떨어뜨려 준비된 슬라이드의 사각형 중 하나에 피펫으로 넣습니다(그림 2B).
  17. 100 - 150 μm 직경의 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 하나의 난모세포를 산성화된 물방울로 빠르게 이동시킵니다. 난모세포와 함께 가능한 한 적은 저장성 용액을 전달하십시오. 동일한 피펫을 사용하여 난모세포가 슬라이드에 달라붙을 때까지 일부 액체를 제거합니다.
    참고: 난모세포 주변의 액체의 양은 매우 중요합니다. 고정 전에 난모세포가 마르지 않을 만큼 충분한 액체가 있어야 하지만, 난모세포가 슬라이드에 부착할 수 없을 정도는 아니어야 합니다.
  18. 150 μm 직경의 유리 피펫 팁으로 빠르게 전환할 수 있습니다. 신선한 Carnoy's 고정제(절대 메탄올 3:1, 빙초산 1:1)를 난모세포에 추가합니다. 고정제가 슬라이드 위로 분산되도록 합니다. 난모세포는 고정액의 산이 투명대(zona pellucida)를 용해시키고 세포가 파열됨에 따라 덜 뚜렷해지고 녹는 것처럼 보여야 합니다.
  19. 정착액의 앞쪽이 수축하기 시작하면 빠르게 2-3방울의 정착제를 더 첨가하십시오. 건조 속도를 높이기 위해 슬라이드를 부드럽게 불어줍니다.
  20. 저장성 용액의 추가 난모세포를 사용하여 3.16-3.19단계를 반복합니다.
  21. 모든 난모세포가 고정될 때까지 3.15-3.20단계를 반복합니다. 위상차 현미경을 사용하여 염색체의 확산을 확인합니다.
  22. 슬라이드가 공기 중에서 완전히 건조되면 실온에서 50분 동안 Giemsa의 ddH4O. Stain 슬라이드에 2mL의 Coplin 염색 용기에 슬라이드를 6분 동안 넣습니다.
  23. 실온에서 ddH2O로 슬라이드를 각각 3분 동안 3회 세척합니다. 슬라이드가 완전히 건조되도록 합니다.
  24. 60mm x 24mm No. 1.5 유리 커버 슬립에 Permount의 얇은 층(~60μL)을 적용합니다. 슬라이드를 커버 슬립에 뒤집어 장착하고 과도한 액체를 조심스럽게 닦아내십시오. 슬라이드를 밤새 건조시킨 후 명시야에서 63x로 이미징합니다.

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결과

pachytene-like cell의 시냅스 결함 평가
이 실험은 pachytene 난모세포의 시냅스 결함을 평가하고 prophase I 진행을 모니터링합니다(그림 3A). SYCP3(축/측면 SC 요소), SYCP1(중앙 SC 요소) 및 HORMAD1(unsynapsed/desynapsed 염색체 축)에 대한 면역염색을 통해 병기 결정 및 시냅스 평가가 가능합니다. HORMAD1는 zygonema 및 diplonema (시냅스 전과 탈synap시스 후) 동안 SYCP3와 공동 국소화합니다 37 , 38. 이러한 단계를 구별하는 것은 난모세포에서 어려울 수 있습니다. Zygonema는 갈라진 비시냅스 영역이 있는 길고 ...

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토론

포유류의 난모세포는 정모세포에 비해 특히 오류가 발생하기 쉽습니다. 난모세포의 덜 효율적인 방추체 어셈블리 체크포인트(SAC)가 이 취약점에 기여하지만, 14,52,53, Hassell과 Hunt는 다중 히트가 이수성으로 이어지며 결함 있는 재조합이 주요 요인이라고 제안합니다54. 인체 대상 연구에서는 이수성을 불충분한 교차 보장 및 차선의 교차 포지셔닝과 연관 짓는다55,56. 선도 모델에 따르면 교차 성숙은 난모세포에서 특히 비효율적이며, 이로 인해 교차 누락과 이수성 유발 패턴이 모두 발생한다고 합니다57. 따...

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공개 사항

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 프로젝트에 대한 자금은 Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development(HD112986에서 TH까지)의 K99 상으로 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 & μ; 주사기 필터밀리포어 시그마SLHAR33SB입으로 작동하는 피펫을 만들기 위해
0.5 M EDTA, pH 8.0코닝46-034-CI HEB를 위해
1mL 멸균 주사기, 25게이지 16mm 바늘피셔 사이언티브14-817-125  난소 파열을 위해
100 x 15 mm 페트리 접시VWR25384-302 
14.6cm 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫피셔 사이언티브13-678-20B 입으로 작동하는 피펫을 만들기 위해
35 x 10mm 페트리 접시코닝351008
40 mm x 0.45 mm #3 곤충학용 스테인리스 스틸 핀아마존B0CSSPW5S7해부를 위한 태아 쥐를 고정하기 위해
아세트산, 빙하피셔 사이언티브A38-212카르노이 고정액에 대해서는
교정된 미세모세관 피펫용 흡입관 조립체밀리포어 시그마A5177-5EA입으로 작동하는 피펫을 만들기 위해
B.P.I. 시계 유리NDS 테크놀로지스 1580-00또는 직경 30mm, 깊이 12mm의 배아 접시(Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)를 사용할 수 있습니다.
붕산피셔 사이언티브BP168-1HEB의 pH 조절을 위해 PFA를 사용합니다
소 혈청 알부민밀리포어 시그마A7906-100GADB를 위해
CO2 탱크인큐베이터를 위해
코닝 현미경 슬라이드밀리포어 시그마CLS294875X25L x W 75mm x 25mm, 한쪽 면은 서리가 있습니다.
코닝 현미경 슬라이드, 한쪽 면과 한쪽 끝에 서리가 낀VWR294875X25
유리 유리 직사각형. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
해부 접시전자현미경 과학70540
해리 현미경어떤 표준 모델
해부 가위, 날카로운 끝, 4.5"VWR82027-578
아주 가늘고 날카로운 팁 겸자VWR76548-836
기엠사 스테인밀리포어 시그마GS500-500키아스마 스프레드를 염색하기 위해
ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜벡터 연구소H-4000
인큐베이터CO2와 워터 재킷 기술이 적용된 표준 모델
체외수정 워크스테이션K-시스템즈열선 벤치탑이 있는 모든 모델이요
코닥 포토-플로 200 솔루션BH 사진 & 비디오1464510슬라이드 워시용
메탄올피셔 사이언티브A412-4카르노이 고정액에 대해서는
MP 생의학 코플린 염색 병피셔 사이언티브ICN17006201
일반 염소 혈청깁코16210-072ADB를 위해
파라포름알데히드, EM 등급, 정제 프릴전자현미경 과학19200
퍼마운트피셔 사이언티브SP15-100for  키아스마 스프레드용 슬라이드 장착
NucBlue 스테인이 있는 ProLong 유리 안티페이드 마운턴트써모 사이언티픽P36985면역염색 슬라이드를 장착하기 위해
실리콘 튜브, 내부 직경: 0.125", 외부 직경: 0.25"VWR89068-474입으로 작동하는 피펫을 만들기 위해
시트레이트 이하이드레이트 나트륨피셔 사이언티브S279-500HEB의 경우 저장액 용액
스테인트레이 슬라이드 스테인 시스템전자현미경 과학71396-B가습 챔버로 사용하세요. 검은 뚜껑을 사용해 면역형광 염색을 해야 합니다. 또는 불투명한 슬라이드 박스나 타퍼 바닥에 젖은 종이 타월을 깔아 가습 챔버로 사용할 수도 있습니다.
스트리퍼 팁 - 100쿠퍼 서지컬MXL3-100입으로 작동하는 피펫을 위한
스트리퍼 팁 - 150쿠퍼 서지컬MXL3-150입으로 작동하는 피펫을 위한
자당밀리포어 시그마S-8501HEB의 경우 자당 저장량 용액
트리스 베이스피셔 사이언티브BP152-5HEB를 위해
트리톤 X-100피셔 사이언티브BP151-100 PFA, ADB, 그리고 Triton-PBS를 위해
유나이티드 사이언티픽 코플린 스테인 병피셔 사이언티브S17495A광감성 2차 항체를 첨가한 후 세척과 블로킹 슬라이드를 위한 불투명 흰색 플라스틱
유나이티드 사이언티픽 유리 오목 슬라이드피셔 사이언티브S139533두께 1.3mm, 웰 수 2개
바나스 마이크로디스천 가위 5mm 직선VWR76457-358
자이스 악시오 이미지r.Z2, 콜리브리 7칼 자이스000000-2624-307
젠 블루 3.11 소프트웨어칼 자이스이미지 획득 및 분석 소프트웨어
항체
알렉사 플루어 488 AffiniPure F(ab')? 단편 염소 항생쥐 IgG, Fc 단편 특이적잭슨 면역연구소 주식회사115-546-071사용 1:1,000 희석
알렉사 플루어 488 AffiniPure F(ab')? 염소 단편 항토끼 IgG, Fc 단편 특이적잭슨 면역연구소 주식회사111-546-046사용 1:1,000 희석
알렉사 플루어 647 AffiniPure F(ab')? 단편 염소 반인간 IgG, Fcγ 조각 특이적잭슨 면역연구소 주식회사109-606-170사용 1:1,000 희석
알렉사 플루어 647 AffiniPure 염소 항기니피그 IgG, Fc 조각 특정잭슨 면역연구소 주식회사106-605-008사용 1:1,000 희석
기니피그 안티-MLH3 pAbThermo-Fisher로 맞춤 제작, 1:500 희석 비율 사용
기니피그 항-SYCP1 pAb크리스터 하움름으로부터; &wooml; g (Kouznetsova et al. 2005), 1:200 희석 비율을 사용함
인간 항중심체 단백질 pAb항체(Antibodies Inc.)15-234사용 1:1,000 희석
마우스 항-MLH1 mAbBD 생명과학550838사용 1:100 희석
마우스 항-SYCP3 mAb앱캠AB97672사용 1:1,000 희석
래빗 안티HORMAD1 pAb단백질 기술13917-1-AP사용된 1:500 희석
토끼 항MSH4 pAb아클론A8556사용 1:100 희석
래빗 항-RAD51 pAb밀리포어PC130사용된 1:500 희석
토끼 항-SYCP3 pAb앱캠AB15093사용 1:1,000 희석
로다민 레드-X (RRX) AffiniPure F(ab')? 단편 염소 항생쥐 IgG, Fc 단편 특이적잭슨 면역연구소 주식회사115-296-071사용 1:1,000 희석
로다민 레드-X (RRX) AffiniPure F(ab')? 염소 단편 항토끼 IgG, Fc 단편 특이적잭슨 면역연구소 주식회사111-296-046사용 1:1,000 희석

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시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)
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