고급 장액성 난소 암종 모델링을 위한 나팔관 상피 세포의 마우스 유래 오가노이드 라인 개발

요약

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내에서 고급 장액성 난소 암종(HGSOC) 마우스 모델의 개발을 자세히 설명합니다. 쥐 나팔관 오가노이드의 파생, 인간 HGSOC 유전학을 요약하기 위한 유전자 변형, 종양의 생체 내 발달을 위한 동계 마우스의 난소 활액낭에 도입.

초록

현실적인 환경에서 질병을 효과적으로 모델링하는 것은 다양한 병리에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 이러한 측면에서 오가노이드는 시험관 내에서 고전적인 2차원 대응물보다 더 충실한 환경을 제공합니다. 유사하게, 동계 쥐 모델을 통해 연구자들은 생체 내에서 면역 체계와 같은 보다 완전한 종양-숙주 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스로부터 고급 장액성 난소 암종(HGSOC)의 기원 세포인 나팔관 상피 세포를 추출하고 이를 1차 오가노이드 배양으로 유도하고 시험관 내 배양 및 유지에 대한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 과발현과 같은 유전 공학 기술과 CRISPR-Cas9 유전자 결실을 사용하여 이러한 계통을 변형하고 전암성 종양으로 변형시키는 방법을 설명합니다. 또한 유전 물질 추출 및 면역형광 염색을 통해 시험관 내 검증에 사용하는 방법도 보고합니다. 마지막으로, 종양 개시를 위해 HGSOC의 토착 부위인 난소 활액낭에 이러한 종양양을 효과적으로 주입하는 방법을 나타냅니다.

서론

고급 장액성 난소 암종(HGSOC)은 잘 이해되지 않고 치명적인 질병으로 남아 있습니다. 역사적으로 HGSOC 생물학 및 치료 반응을 나타내는 충실한 시험관 내 및 생체 내 모델의 부족은 발전의 주요 장벽이었습니다. 예를 들어, 다수(대다수는 아니더라도) 연구에서 HGSOC의 주요 게놈/유전적 특징을 공유하지 못하는 세포주를 사용하여 연구 결과의 관련성이 의심스러워졌습니다 1,2,3,4. 예를 들어, 일반적인 ID8 동계 마우스 모델은 난소 표면 상피(OSE)에서 파생되며 Trp53-야생형⁵입니다. 대조적으로, 전부는 아니지만 대부분의 HGSOC는 나팔관 상피(FTE)⁶에서 발생하며 HGSOC는 거의 보편적으로 TP53 돌연변이 또는 침묵합니다⁷. 이후 연구자들은 Trp53 돌연변^{이를 통합하여} 이 계통을 수정하려고 시도했지만 Trp53 돌연변이는 HGSOC 병인의 초기 사건이기 때문에 이 변형은 이 세포주의 형질전환에서 너무 늦게 발생할 수 있으며 정상적인 HGSOC 발달을 나타내지 않을 가능성이 높습니다.

지난 10년 동안 보다 현실적인 HGSOC 모델을 생성하여 이러한 상황을 바로잡으려는 시도가 이루어졌습니다. 예를 들어, 종종 병인을 제어하기 위해 Cre-재조합효소 시스템 하에서 뮬러관 계통 세포에 관련 돌연변이를 품고 있는 유전자 조작 마우스 모델(GEMM)을 통해 연구자들은 생체 내에서 질병을 더 잘 모방할 수 있습니다 ^8,9,10. 불행히도 이러한 모델은 종종 생성이 복잡하며 Cre-누출, Cre-효과 또는 "전계 효과"11,12,13과 같은 다른 문제가 있을 수 있습니다. 이와 관련하여 동계 오가노이드 모델은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 질병을 더 잘 모방하고자 하는 연구자들에게 강력한 절충안인 것으로 보입니다 14,15,16,17,18,19. 실제로 현재 사용 가능하고 사용되는 대부분의 HGSOC 모델은 2차원 모델이지만 불행히도 세포 생물학에 영향을 미치는 중요한 요소인 세포외 기질(ECM)의 복잡성을 적절하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 오가노이드는 종종 줄기 세포에서 생성되는 자체 조직화된 3D 조직으로, 페트리 접시에서 기관의 초기 구조적 및 기능적 복잡성을 재현할 수 있습니다²⁰. 이들의 생성은 일반적으로 만능인 단일 세포를 Matrigel²¹과 같은 기저막 매트릭스(BMM)에 현탁시켜 작동합니다. 시험관 내에서 이러한 모델은 2D 모델보다 생체 내 조건을 요약하는 데 비교적 더 정확합니다. 마찬가지로, 동생적 특성으로 인해 이러한 모델은 완전히 기능하는 면역 체계를 가진 마우스에 이식될 수 있어 병인 및 발달을 보다 충실하게 재구성할 수 있습니다^14,15. 이것은 가장 현실적인 종양 유전학을 가지고 있지만 면역 저하 마우스 모델에 생착이 필요한 환자 유래 이종이식에 비해 분명한 이점입니다.

이 프로토콜에서는 동계 HGSOC 오가노이드 모델을 개발하는 방법을 설명합니다. 마우스에서 추출한 원래의 야생형 FTE 오가노이드 배양액의 생성, 질병 정보 유전자형을 생성하기 위한 유전 공학, 마지막으로 완전히 발달된 종양을 생성하기 위한 난소 활액낭으로 다시 이식하는 것까지. 또한 시험관 내 오가노이드의 면역형광(IF) 염색, 주사와 같은 대규모 세포 생산을 위한 세포주의 2D 변환과 같은 일반적인 실험에 도움이 되는 몇 가지 추가 프로토콜을 포함했습니다. 이 프로토콜은 보다 현실적인 시험관 내 조건에서 HGSOC 생물학과 생체 내 종양 미세 환경에 존재하는 상호 작용을 연구하려는 특별한 의도로 유전적 구성을 제어하는 HGSOC의 오가노이드 동계 모델을 개발하려는 연구자를 대상으로 합니다.

프로토콜

모든 동물 조직 수집 및 절차는 알렉산드리아 생명 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 뉴욕주 뉴욕에 있는 NYU Langone Health의 Perlmutter 암 센터의 승인에 따라 윤리적으로 수행되었습니다.

1. 재료 준비

1. 쥐 오가노이드 배지(MOM) 준비
   1. 표 1의 항목을 결합하여 기초 배지를 준비합니다.
      참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 안정적입니다.
2. 2D 미디어 준비
   1. 재조합 쥐 EGF 50 ng/mL, 인슐린-트랜스페린-셀레늄(최종 농도 10 mg/L 인슐린, 5.5 mg/L 트랜스페린, 6.7 μg/L), 3% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL)을 DMEM(피루브산 및 고포도당 포함)에 결합합니다.
3. 소화 혼합물 준비
   1. 콜라게나제/히알루로니다제(3000 U/mL 콜라게나제, 1000 U/mL 히알루로니다제)와 DMEM(피루브산 및 고포도당 포함)을 1:10 비율로 결합합니다. 1.5mL 마이크로튜브에 1mL 분취량을 준비합니다. 분취량을 -20°C에서 보관하고 얼음 위에서 해동합니다.
   2. DNAse I(10,000 U/mL) 및 디스파아제(5 U/mL)의 일회용 분취량을 준비합니다.
   3. DMEM에서 콜라게나제/히알루로니다제의 분취량이 해동되면 DNAseI(10μL, 100단위) 및 디스파아제(25μL, 0.1단위)를 첨가합니다.
      참고: 이 소화 용액은 최대 0.5g의 종양을 소화하는 데에도 유용합니다.
4. BMM 처리
   1. BMM은 -80°C에서 장기간 보관하십시오. 동결 해동 BMM을 방지하려면 1.5mL 튜브에 1mL 분취량을 준비합니다. 분취량을 얼음 위에 2시간 동안 놓거나 4°C에서 밤새 해동합니다.
      참고: BMM은 실온(RT)에서 응고됩니다. 따라서 BMM의 튜브는 항상 얼음 위나 차가운 튜브 랙에 보관하는 것이 좋습니다. -20°C 냉동고에서 최소 2시간 동안 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하십시오.

2. 마우스 FTE에서 세포 분리

1. BMM, 예열된 TrypLE Express Enzyme 및 24웰 플레이트를 37°C에서 해동합니다(최상의 결과를 위해 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 보관). 그런 다음 해부 현미경에서 조직을 해부 및 세척하기 위한 도구, 차가운 PBS + P/S가 담긴 플레이트 및 따뜻한 소화 혼합물과 같은 작동 영역을 준비합니다.
2. 암컷 C57BL/6J 마우스를 이산화탄소 질식에 의해 안락사시킵니다. IACUC에서 요구하는 대로 2차 안락사 방법(자궁경부 탈구)을 수행합니다.
3. 난소와 나팔관을 해부 및 제거하고 4°C에서 DMEM + P-S가 들어 있는 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경을 사용하여 미세한 집게와 가위 세트로 난소에서 잔여 지방을 제거하고 난소와 자궁에서 나팔관(누두 및 원위 부대의 일부)을 분리합니다.
   알림: 미생물 오염을 방지하기 위해 도구로 마우스의 피부나 머리카락을 만지지 않도록 주의하십시오.
4. 조직을 완전한 소화 혼합물이 들어 있는 튜브로 옮기고 가는 가위를 사용하여 나팔관을 작은 조각(<0.5mm)으로 자릅니다. 37°C에서 40-50분 동안 배양합니다.
5. 해리 후, 세포를 350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 예열된 TrypLE Express 500μL를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
6. DMEM(2D 배지)에서 500μL의 3% FBS로 트립신화를 담금질합니다. 70μm 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 새 마이크로튜브에 걸러냅니다. 350g에서 5분 동안 회전시키고 상청 액을 버립니다.
7. 세포 펠릿(사용된 FT의 수에 따라 거의 보이지 않음)을 12.5μL의 오가노이드 쥐 배지에 재현탁하고 얼음 위에서 잠시 배양합니다. 얼음처럼 차가운 BMM 37.5μL와 혼합하고 전체 부피(50μL)를 예열된 24웰 플레이트의 웰 바닥에 시드합니다.
8. 플레이트를 37°C에서 최소 20분 동안 48시간 이상 두지 않고 BMM을 설정합니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮길 때 돔을 방해하지 않도록 주의하십시오.
9. 500μL의 예열된 MOM을 웰 측면 아래로 배지를 부드럽게 피펫팅하여 각 웰에 추가합니다. 손상이나 분리를 유발할 수 있으므로 돔에 직접 미디어를 추가하지 마십시오. 배양 플레이트에 뚜껑을 덮고 37°C 및 5% CO₂에서 배양합니다.

3. 쥐 FTE 유래 오가노이드의 유지

1. 미디어 변경
   1. 여과되지 않은 멸균 10μL 팁을 사용하여 플레이트가 45° 경사로 유지된 상태에서 웰 바닥에서 배지를 흡인합니다. 돔이 플레이트에서 분리되면 분리된 돔이 바닥에 있는 동안 웰 상단에서 매체를 조심스럽게 흡인합니다.
   2. 37°C로 예열된 750μL의 MOM을 천천히 첨가하고 팁을 웰의 측벽에 대고 누릅니다.
   3. 2-3일마다 또는 용지 색상이 분홍색에서 노란색으로 바뀔 때까지 용지를 교체합니다. 배지를 교체한 후 24시간 이내에 노란색으로 변하면 오가노이드를 통과할 준비가 된 것입니다.
2. 오가노이드 계대
   1. 배지를 제거하고 각 웰을 500μL의 차가운(4°C) PBS로 세척합니다. PBS를 흡인하고 500μL의 차가운(4°C) 세포 회수 용액을 BMM 돔에 직접 첨가하여 용해시킵니다. BMM이 완전히 용해될 때까지 피펫팅을 계속하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 놓고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 따뜻하게 유지합니다. 새 플레이트를 사용하는 경우 37°C에서 24시간 동안 예열해야 합니다.
      참고: 아래에 설명된 확장과 같이 2x 50μL 돔 이상을 계대하는 경우 최상의 결과를 얻으려면 얼음 위에서 배양을 30분 이상 연장해야 할 수 있습니다.
   3. 4°C에서 5분 동안 350g 에서 원심분리합니다. 펠릿을 흡인하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 500μL의 차가운 PBS로 세척합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
      알림: 저온 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 튜브를 얼음이나 차가운 선반 위에 올려 세척 사이에 식히십시오.
   4. 마지막 세척 후 350g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한 다음 예열된(37°C) TrypLE Express 효소 500μL를 첨가합니다. 피펫팅으로 인해 세포가 손실되는 것을 방지하려면 조직 배양 후드의 통풍구 그릴에 대해 튜브를 드래그하여 세포를 균질화합니다.
   5. 튜브를 37°C에서 30-60분 동안 배양합니다.
      참고: 시간은 오가노이드 유전자형 및 계대 시간에 따라 조정될 수 있으며, 일부는 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 더 긴 트립신화가 필요할 수 있습니다.
   6. 500 μL의 DMEM + 3% HI FBS를 첨가하여 세포 해리 과정을 중지하고 용액이 균질화될 때까지 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
   7. 350× g 에서 5분 동안 원심분리하고 ~20μL의 부피가 남을 때까지 상청액을 흡인합니다. 이 단계에서 펠릿을 흡인하는 것이 일반적이므로 진공 흡인기가 아닌 P20 피펫을 사용하여 남은 상청액을 수동으로 제거합니다.
   8. 100μL의 차가운(4°C) MOM에 세포를 재현탁하고 세포 농도를 측정합니다. 원하는 대로 세포 희석액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 이전에 -20°C에서 보관된 피펫 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 BMM과 혼합합니다.
      참고: MOM 대 BMM의 비율이 1:4인 2 × 10⁵ cells/mL에서 2개의 50 μL 돔을 준비하는 것이 좋습니다. 그러므로 당신은 있어야 합니다. 8 × 10⁵ cells/mL의 MOM에 25μL의 세포와 총 100μL에 대한 75μL의 BMM을 2개의 돔으로 분할합니다. 이와 같이 돔당 1 × 10⁴ 셀을 효과적으로 시드할 수 있습니다.
   9. 예열된 24웰 플레이트의 웰 중앙에 각 50μL 돔을 시드합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에 최소 30분 동안 넣어 BMM이 응고될 수 있도록 합니다. 앞서 3.1.2단계에서 살펴본 대로 37°C에서 500μL의 MOM을 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
3. 확장
   1. 오가노이드 세포 배양을 (예열된) 6웰 플레이트로 확장하려면 8 × 10⁵ 세포/mL에서 5개의 50μL 돔을 준비합니다. 총 62.5μL의 MOM에 세포를 재현탁하고 187.5μL의 얼음처럼 차가운 BMM과 혼합하고 동일한 웰에 5개의 돔을 시드합니다.
   2. BMM이 응고될 수 있도록 플레이트를 인큐베이터로 30분 동안 옮깁니다. 앞서 3.1.2단계에서 살펴본 대로 37°C에서 2mL의 MOM을 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 세포가 합류할 때까지 필요에 따라 배지를 교체합니다.
      참고: 계대를 위해 세포를 수집하려면 500μL 대신 1mL의 세포 회수 용액을 사용하고 30분 대신 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.
4. 냉동 보존
   1. 오가노이드의 장기 보관을 위해 단계 3.2.1-3.2.7에 설명된 대로 통과합니다. 그런 다음 250μL의 오가노이드 동결 배지(80% MOM, 10% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO))에 재현탁하고 냉동관으로 옮깁니다. 냉동 바이러스당 1 × 10⁵ 세포를 동결합니다.
   2. 튜브를 극저온 바이알 냉동 용기(예: Mr. Frosty)에 보관하고 -80°C 냉동실에서 식힙니다. 장기간 보관하려면 셀을 액체 질소 저장 또는 -150°C 냉동고에 보관하십시오.

4. 새로운 세포주 개발을 위한 쥐 FTE 유래 오가노이드의 유전자 변형

1. 스피오큘레이션(렌티바이러스 또는 레트로바이러스)에 의한 형질도입
   1. 25μL의 MOM과 75μL의 BMM의 혼합물을 준비하고 이를 콜드(4°C, BMM이 웰을 완전히 "적시는" 것) 48웰 플레이트의 웰 1개에 추가합니다. 세포를 파종하기 전에 BMM이 응고되도록 37°C에서 30-60분 동안 배양합니다.
   2. 오가노이드에서 유래한 단일 세포를 얻고(단계 3.2.5) BMM 위에 약 2 × 10⁴ 를 시드합니다. 200μL의 따뜻한(37°C) MOM을 넣고 37°C 및 5% CO₂ 에서 48시간 동안 배양합니다.
   3. 원하는 농도로 바이러스를 추가합니다. MOI를 실험적으로 결정합니다. 대략적인 MOI는 30% 미만이 제안됩니다.
      참고: 오가노이드는 2D 세포주에 비해 감염이 특히 어렵고 높은 바이러스 역가에서도 낮은 MOI를 예상합니다. 세포를 600× g 에서 32°C에서 60분 동안 원심분리합니다. spinoculation이 끝난 후 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
   4. 8시간 후, 배지를 제거하고 세포 위에 25μL의 MOM과 75μL의 BMM의 혼합물을 추가하여 BMM에 "끼우고" 오가노이드가 3차원에서 자연적으로 성장할 수 있도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 30-60분 동안 넣어 BMM이 응고되도록 합니다. 그런 다음 250μL의 따뜻한(37°C) MOM을 추가합니다.
   5. 세포가 합류하면 3.2단계에 설명된 대로 계대를 진행하여 세포의 전체 부피를 24웰 플레이트에서 2개의 돔으로 확장합니다.
      참고: 항생제 선택을 사용하는 경우 초기 척수 눈 관찰 후 48시간부터 시작하여 48-웰에서 직접 선택을 수행하는 것이 좋습니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하는 경우 충분한 세포를 획득하기 위해 위에서 설명한 대로 6웰 플레이트를 추가로 확장하는 것이 좋습니다. 더 길은(1시간) 트립신화 시간도 흐름에 대해 샘플을 필터링하기 전에 단일 세포를 보장하는 것이 좋습니다.
2. 전기천공 기반 CRISPR-Cas9에 의한 형질전환
   참고: 리보핵단백질(RNP) 복합체 농도 및 준비에 대해서는 IDT 상동성 지향 복구 가이드(pp. 9-11)²²를 참조하십시오. 그러나 HDR Enhancer V2는 상동 재조합이 필요한 게놈 편집에만 권장되므로 녹아웃을 위해 생략합니다.
   1. 오가노이드에서 유래한 단일 세포 현탁액을 준비합니다(단계 3.2.7). PBS로 세척하고 세포 농도를 측정합니다. 10⁴ 크기 (1 × 10⁴ 내지 9 × 10⁴ 세포) 이내의 양을 포함하는 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 350 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 10μL의 게놈 편집 완충액에 재현탁합니다. 전기천공에 >1 × 10⁴ 세포가 필요한 경우, 각 10μL에 1 × 10⁴ 내지 9 × 10⁴ 세포가 포함되도록 연속 전기천공을 위한 충분한 부피를 준비합니다.
   3. 전기천공 피펫 시스템을 사용하여 10μL의 세포 현탁액을 수집하여 기포가 유입되지 않도록 합니다. 다음 조건에서 전기천공: 1200V 전압, 20ms 펄스 지속 시간, 총 4펄스. 차가운 MOM이 있는 튜브에 세포를 넣습니다.
   4. 세포를 전기천공한 후, 전체 현탁액을 350× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 MOM 및 BMM(1:4 비율)에 재현탁하여 전기 천공 라운드당 하나의 돔을 파종할 수 있을 만큼 충분히 준비합니다(1 10⁴ 세포당 1개의 돔).
   5. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에 최소 30분 동안 넣어 BMM이 응고될 수 있도록 합니다. 앞서 3.1.2단계에서 살펴본 대로 37°C에서 500μL의 MOM을 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
3. 단일 클론 선택
   1. 단일 세포로부터 오는 클론을 얻기 위해서는, 상술한 바와 같이 세포를 계대시키되, 돔당 50 내지 100개의 세포를 시드하되 (BMM과 혼합하기 전에, 세포 현탁액 × 4 ×^{10 3} cell / mL)을 시드한다.
   2. 3일마다 MOM을 변경하십시오. 오가노이드가 적절하게 자라는지 확인하고 어떤 것이 다른 오가노이드와 잘 분리되어 있는지 확인하십시오.
   3. 오가노이드가 식별 가능한 크기(약 500μm)로 자라면, 광학 현미경을 사용하여 충분히 분리된 4-5개의 큰 오가노이드를 식별한다.
      참고: 육안으로 볼 수 있어야 하지만 오가노이드가 있는 플레이트 영역 주위에 원을 그려 가는 팁 마커로 플레이트 바닥을 표시하는 것이 도움이 됩니다.
   4. 멸균 후드에서 20μL 피펫을 사용하여 팁을 BMM에 부드럽게 삽입하고 단일 오가노이드를 흡인합니다(약 12.5μL의 부피를 흡인). 오가노이드를 500μL의 MOM이 들어 있는 1.5mL 수집 튜브에 넣습니다.
   5. 350 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 500μL의 TrypLE Express Enzyme에 재현탁합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   6. DMEM(2D 배지)에서 500μL의 3% FBS로 세포 해리 반응을 담금질하고 350×g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 매우 조심스럽게 상청액을 제거하고 12.5μL의 차가운 MOM에 재현탁하고 37.5μL의 얼음처럼 차가운 BMM과 혼합한 다음 위에서 설명한 대로 전체 현탁액을 24웰 플레이트에 단일 50μL 돔으로 시드합니다.
   7. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에 최소 30분 동안 넣어 BMM이 응고될 수 있도록 합니다. 앞서 3.1.2단계에서 살펴본 대로 37°C에서 500μL의 MOM을 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
   8. 3-4일마다 미디어를 교체하고 돔이 합류할 때 통과합니다.

5. 오가노이드에서 2D 세포주 유도

1. 전이 세포 배양
   1. 오가노이드를 계대시킨 후와 같이 단일 세포 현탁액에서 시작합니다.
   2. 6웰 플레이트를 시드하는 것처럼 진행하되(단계 3.3), 대신 사전 냉각(24시간 동안 4°C)을 사용합니다. 밤새 4°C에서 보관된 6웰 플레이트에 돔을 시드하고 플레이트를 인큐베이터에 도입하기 전에 멸균 후드에서 5-10분 동안 그대로 둡니다.
      참고: 이 단계를 통해 세포는 BMM의 ECM 구성 요소에 계속 접근하면서 2D 성장 조건을 수용하기 위해 플레이트 바닥에 부드럽게 침전될 수 있습니다.
   3. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 에서 30분 동안 배양한 다음 37°C에서 2mL의 MOM을 첨가합니다. 필요에 따라 미디어를 변경합니다.
   4. 오가노이드가 합류에 도달하면 단계 3.2.1-3.2.7에 설명된 대로 통과합니다. 남은 BMM을 제거하기 위해 웰의 최종 PBS 세척 후, 웰에 예열된 2D 배지 2mL를 추가합니다.
      참고: BMM 제거는 웰에 부착된 세포를 제거하지 않으며, 이제 2D 조건/배지에 적응하면서 웰의 나머지 부분을 자유롭게 침범할 수 있습니다.
   5. BMM에 남아 있는 세포로 단일 세포 현탁액에 도달하면 5.1.2단계를 반복하면서 세포 부피의 절반을 시드합니다. 원본 웰의 나머지 절반을 추가하여 더 많은 셀이 시드될 수 있도록 하여 합류 속도를 높일 수 있습니다.
   6. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 24시간 후에 2D 배지를 교체합니다.
      참고: BMM에서 성장한 세포는 플라스틱 기질에 익숙하지 않고 쉽게 부착되지 않기 때문에 부착되지 않은 세포가 많아야 합니다.
   7. 5.1.4단계를 반복합니다. 그런 다음 전체 부피의 세포를 4mL의 2D 배지에 재현탁하고 이전에 사용한 각 웰에 2mL를 시드합니다. 2D 미디어는 3-4일마다 교체합니다.
2. 확장을 위한 2D 세포 배양
   1. 세포가 약 80% 합류에 도달하면 첫 번째 계대를 진행합니다.
   2. 계대하려면 배지를 흡인하고 PBS 1mL로 한 번 세척한 다음 0.25% 트립신 1mL를 첨가합니다. 세포를 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
      참고: 세포주마다 부착 특성이 다를 수 있어 트립신화 기간이 달라질 수 있습니다. 다음 단계로 진행하기 전에 세포가 분리되었는지 현미경으로 확인하십시오. 세포 배양 플레이트를 손으로 부드럽게 두드리면 세포를 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   3. 모든 세포가 분리되면 DMEM + 10% FBS로 해리를 담금질하고 350× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
   4. 첫 번째 확장(80-100% 합류할 때)의 경우 1:1 분할 비율로 다시 시드합니다. 5.1.6단계를 반복하고 2-3일마다 2D 미디어를 교체합니다.
   5. 두 번째 확장(80-100% 합류)에서 37°C에서 10mL의 2D 배지에 세포를 재현탁하여 모든 세포를 100mm 접시에 시딩합니다. 5.1.6단계를 반복하고 2-3일마다 용지를 교체합니다.
      참고: 이 프로세스는 시간이 많이 걸리며 최대 한 달이 걸릴 수 있습니다. 단백질 과발현을 위해 바이러스 통합 유전자를 가진 세포주를 사용하는 경우 성장 배지에 선택된 항생제를 계속 유지하는 것이 좋습니다. 마커가 형광 단백질인 경우 가능한 한 빨리(즉, 100mm 접시 확장 종료)에 형광 활성화 세포 분류를 수행합니다.
3. 냉동 보존
   1. 이러한 세포의 저장을 위해, 단계 5.2.1-5.2.3에 설명된 대로 계대한다. 그런 다음 80% 2D 배지, 10% FBS 및 10% DMSO로 구성된 1mL의 2D 동결 배지에 ~1 × 10⁶ 세포를 재현탁하고 냉동관으로 옮깁니다. 3.5.2단계에 따라 셀을 저장합니다.

6. 오가노이드 계통 검증

1. 오가노이드에서 유전 물질 분리
   1. 단일 세포 현탁액에서 시작하여 일반적인 세포 밀도의 두 배(1 × 10⁶ cells/mL)로 두 개의 돔을 시드합니다. 3일째에 MOM을 변경합니다.
   2. 5일째에 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세척한 다음 350μL의 선호하는 용해 완충액을 돔에 직접 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양한 후 또는 BMM이 용해될 때까지 용해물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   3. 장기간 사용하려면 용해물을 -80°C에서 보관하십시오. 그렇지 않으면 선호하는 추출 기술 또는 상용 키트를 사용하여 DNA 및/또는 RNA 추출을 위한 프로토콜을 진행하십시오.
2. 면역형광(IF) 염색
   1. 세포를 준비하려면 단계 3.2.1-3.2.5에 설명된 대로 계대합니다. 37.5μL의 MOM과 112.5μL의 얼음처럼 차가운 BMM의 혼합물에 재현탁합니다(생물학적 복제 역할을 할 3개의 50μL 돔에 충분함). 3.2.6단계에 따라 3일차와 5일차에 용지를 교체합니다.
   2. 7일째에 MOM을 흡인하고 500μL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS에 예열된(37°C) 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액 500μL를 돔에 직접 추가하여 각 돔을 별도로 고정합니다. BMM이 용해될 때까지 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
   3. 와이드 보어 P1000 피펫 팁을 사용하여(사용할 수 없는 경우 일반 P1000 팁을 미세한 끝에서 약 0.5cm 절단하기만 하면 됨) 오가노이드를 4% PFA로 수집하고 부피를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 표준 피펫 팁을 사용하면 오가노이드가 파손됩니다.
   4. 오가노이드가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 2-3분 동안 기다립니다. 4% PFA를 흡인하고(오가노이드를 흡인하지 않도록 안전한 양의 부피를 남겨두면서) 500μL의 PBS를 첨가하여 오가노이드를 세척합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 3회 세탁합니다.
      참고: 오가노이드 모양을 보존하기 위해 원심분리보다 오가노이드가 바닥으로 가라앉을 때까지 기다리는 것이 바람직합니다.
   5. 장기 보관(4-6주)을 위해 오가노이드를 PBS에 4°C로 보관합니다. 염색을 진행하려면 RT에서 30분 동안 PBS + 1% Triton-X로 투과화합니다. PBS로 한 번 세척합니다.
   6. RT에서 60분 동안 PBS + 0.2% Triton-X + 4% FBS + 1% 마우스 혈청으로 차단합니다. PBS로 한 번 세척하고 튜브에 100μL의 부피를 남겨 둡니다.
   7. 항체 염색을 위한 작업 완충액을 준비합니다: PBS + 0.2% Triton-X, 0.4% FBS, 0.1% 쥐 혈청. 이 완충액은 1차 항체 및 2차 항체 모두에 작용합니다.
   8. 1차 항체 염색을 준비하려면 실제 필요한 희석액의 두 배 농축액으로 희석액을 계산합니다. 각 튜브에 남아 있는 100μL의 PBS에 100μL의 항체를 추가할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다. 예를 들어, 원래 희석액이 1:1000인 경우 100μL의 1:500 용액을 준비합니다.
   9. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 500μL의 PBS로 3회 세척합니다.
   10. 6.2.8단계에서 설명한 대로 2차 항체 염색을 준비합니다. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
       참고: 이 단계부터는 형광 항체의 광표백을 방지하기 위해 작업 영역을 알루미늄 호일/선호하는 다크 박스로 덮어야 합니다.
   11. 2차 염색이 끝나면 PBS 500μL로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하여 장착할 샘플을 준비합니다. 오가노이드가 흡인되는 것을 방지하기 위해 20μL 피펫을 사용하십시오.
   12. 와이드 보어 또는 컷 피펫 팁을 사용하여 선택한 마운팅 미디어 20μL를 추가하고 기포를 피하면서 용액을 잘 균질화합니다.
   13. 직사각형 커버 슬립의 마운팅 용액에 오가노이드 한 방울을 놓습니다. 집게를 사용하여 기포를 피하면서 방울 위에 원형 커버슬립을 놓고 RT에서 밤새 어둠 속에서 건조시킵니다. 슬라이드당 둘 이상의 샘플을 배치해야 하는 경우 동일한 슬라이드에서 이 단계를 반복합니다.
   14. 원형 커버 슬립 위에 직접 20μL의 마운팅 매체를 추가합니다. 이제 직사각형 커버슬립을 180° 뒤집어 현미경 슬라이드 위에 놓아 마운팅 "샌드위치"를 만듭니다. RT에서 최소 8시간 동안 어둠 속에서 건조시킵니다.
       참고: 슬라이드는 아래에서 위로 현미경 슬라이드, 원형 커버 슬립, 오가노이드, 직사각형 커버 슬라이드의 순서로 이루어져야 합니다. 이것은 최적의 이미징 조건을 만듭니다.

7. 마우스의 종양 모델 개발

1. 세포 준비
   1. 2D 배지에서 선택한 2D 세포 바이알 1개를 해동합니다. 이 세포가 성장하고 150mm 플레이트로 확장되도록 합니다. 세포에 항생제 선택 마커가 있는 경우 원하는 세포의 순수한 집단을 보장하기 위해 주입 전에 세포를 선택합니다.
   2. 5회 마우스 주사의 경우, 세포를 2개의 150mm 플레이트로 확장합니다. 플레이트가 80% 합류하면 5.2.2-5.2.3단계에 따라 세포를 수확합니다. 1mL의 Opti-MEM I 환원 혈청 배지에 세포를 재현탁하고 세포 농도를 측정합니다.
      참고: 각 주사에는 4개 × 10개⁶ 개 세포가 포함됩니다. 그러나 주사기의 사량을 설명하기 위해 추가 주사를 준비하는 것이 좋습니다. 이 경우 20 × 10 6^{셀 대신} 24 × 10⁶ 셀을 준비합니다.
   3. 모든 주사에 대한 전체 세포 부피를 1.5mL 튜브에 넣습니다. 보충되지 않은 Opti-MEM I에 세포 1부와 얼음처럼 차가운 BMM에 1부로 구성된 주입당 총 44μL를 준비합니다. 예를 들어, 24 × 10⁶ 세포(6회 주입)의 경우 132 μL의 Opti-MEM I 및 132 μL의 BMM에 재현탁합니다.
   4. 세포를 철저히 혼합하고 주사를 할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
2. 절차 준비
   1. 차가운 PBS로 주사기(U-100 인슐린 28G)의 사량에서 기포를 배출합니다.
   2. 1.5mL 튜브의 세포를 사용하여 바늘 내부의 전단력으로 인해 세포가 용해되는 것을 방지하기 위해 주사기를 천천히 로드하여 40μL 주사 5회를 준비합니다. 쥐가 진정될 때까지 얼음찜질을 하십시오.
   3. 주사를 위한 모든 준비가 완료되면 주사기를 가열 램프 옆에 놓아 BMM이 예열되고 점성이 높아져 주사 및 생착이 용이해질 수 있도록 합니다. 과도하게 응고된 BMM은 주사기를 제대로 통과하지 못하므로 가열 램프 바로 아래에 두지 마십시오. 일반적으로 이러한 일이 발생하지 않도록 신속하게 작업하십시오.
3. 난소에 대한 점액낭내 주사(IBI)
   1. 케타민(100mg/mL)을 사용하여 C57BL/6J 마우스를 마취합니다. 복강 주사로 체중 10g당 0.1mL를 투여합니다.
      참고: 어린 암컷 마우스는 종종 0.2mL 주사만 필요하지만 나이가 많으면 더 많이 필요할 수 있습니다. 이것은 20-40분 동안 마취를 제공하지만 진통 효과는 제공하지 않습니다.
   2. 가열 램프로 따뜻해진 케이지에 마우스를 넣습니다.
      알림: 난방 램프 바로 아래에 쥐를 두지 마십시오.amp, 꼬리 괴사 및 고열을 일으킬 수 있으므로 치명적일 수 있습니다.
   3. 첫 번째 마우스가 완전히 마취되면 무균 기술을 사용하여 복부 영역과 허벅지 위에서 C57BL/6J 마우스의 옆구리를 따라 <1cm 절개를 자릅니다. 활액낭 부위에 도달하기 전에 표피와 피하 세포를 통과해야 합니다.
   4. 난소를 조심스럽게 빼냅니다(난소에 부착된 지방 패드로 쉽게 찾을 수 있음). 준비된 주사기 중 하나를 가져다가 난소 바로 뒤의 지방 패드를 통해 난소 자체를 통해 난관 자루에 세포를 천천히 주입합니다.
      참고: 주사에 성공하면 BMM이 있는 난관 자루 풍선이 표시됩니다. 혼합물은 지방 패드 전체에 누출될 가능성이 높으며 이는 정상입니다.
   5. 난소를 활액낭에 조심스럽게 다시 넣고 수술용 스테이플을 사용하거나 재봉하여 절개 부위를 봉합합니다.
   6. 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 난방 램프를 사용하여 쥐가 수술 후 반의식이 될 때까지(>15분) 회복하는 동안 마우스를 따뜻하게 유지합니다. 다음날 마우스를 확인하여 밤새 패혈증이 발생하지 않았는지 확인합니다.

결과

HGSOC 난소암 생성 및 검증을 위한 워크플로우를 요약한 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 이 과정은 암컷 C57BL/6J 야생형 마우스로부터 나팔관 조직을 추출하는 것으로 시작됩니다(그림 2A). 적절한 수집을 위해 넉넉한 티슈 조각으로 시작하는 것이 좋습니다. 해부 현미경을 사용하면 지방, 난소 등 주변 조직을 제거하면서 원위 나팔관을 정밀하게 분리할 수 있습니다. 그림 2B에서 볼 수 있듯이 난소는 처음에는 지방으로 덮여 있지만 괴사조직 제거 후에는 노란색과 타원형이 더욱 뚜렷해집니다. 그런 다음 나팔관을 조심스럽게 풀고 다듬어 원위 부분을 분리한 후 소화를 위해 준비합니다(그림 2B).

마우스 FT...

토론

종양학 연구의 상당한 발전에도 불구하고 HGSOC는 여전히 가장 공격적인 유형의 부인과 악성 종양이며 모든 난소암 중에서 주요 사망 원인입니다^23,24. 부인과 종양학 연구가 발전함에 따라 여기에 사용되는 모델도 발전해야 합니다. 실제로, 많은 역사적 난소암 모델 세포주는 게놈 관련성, 기원 세포 불일치 또는 생체 내 조건 모방에 관한 한계를 포함한 여러 가지 이유로 이 질병을 연구하기에 차선책인 것으로 밝혀졌습니다². 이와 관련하여, 세포-기질 상호작용뿐만 아니라 시험관 내 시스템으로서의 조직 발달을 보다 정확하게 나타내는 오가노이드는 고전적인 2차원 세포 배양 기술보다 우수한 것으로 나타났습니다 14,15,25.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
칼슘, 마그네슘, 중탄산나트륨 없이 HBSS에 0.25% 트립신, 0.1% EDTA 함유	코닝	25053CI
A83-01	토크리스 생명과학	2939
고급 DMEM/F12	깁코	12-634-028
나이 C57BL/6J (여성)	잭슨 연구소	000664
올프렙 DNA/RNA 미니 키트	치아겐	80204	DNA/RNA 추출을 위해
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	통합 DNA 기술	10008100
항-Ki67 항체	앱캠	AB15580
오토클립 시스템	파인 사이언스 툴즈	12020-00	IBI 이후 상처 봉합을 위한
B-27 보충제(50배), 혈청 무첨가	깁코	17-504-001
블라스티딘 HCl (10 mg/mL) 50 mg	인비보젠	앤트-BL-05
소 혈청 알부민	시그마 올드리치	A9647
버퍼 RLT 플러스	치아겐	1053393	DNA/RNA 추출 전에 세포를 용해하는 데
셀 복구 솔루션	코닝	354253
콜라게나제/히알루로니다제가	스템셀 테크놀로지	07912
코랄라이트 594-팔로이딘 (빨간색)	단백질 기술	PF00003
커버 유리 15CIR-1	피셔브랜드	12-545-83
표지 유리 24mm 및 예리함; 40 mm-1	피셔브랜드	12-544-12
CTS(세포 치료 시스템) N-2 보충제	깁코	A1370701
다피	로슈	10236276001
소 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I(DNAse I)	시그마 올드리치	D5025
디프코 스킴 밀크	벡턴 디킨슨	232100
분산	스템셀 테크놀로지	07913
DMEM 검사에 L-글루타민, 4.5 g/L 포도당, 피루브산나트륨	코닝	10013CV
DNase I 재조합, RNase 없는 상태	로슈	04716728001
둘벡코의 인산염 완충 용액	시그마 올드리치	D8537
듀몽 #5 - 세라믹 코팅 겸자	파인 사이언스 툴즈	11252-50	난관 절리를 위해
태아 소 혈청	코닝	35-010-CV	56 & 도에서 열-비활성화; 60분간 C.
파인 가위 - 터프컷	파인 사이언스 툴즈	14058-09	난관 채취 및 IBI 절개를 위해
Geneticin 선택적 항생제(G418 황산염) (50 mg/mL)	깁코	10131027
글루타맥스 보충제 (100배)	깁코	35-050-061
염소 항토끼 IgG (H+L) 교차흡착 2차 항체, 시아닌3	인비트로젠	A10520
그라페 겸자	파인 사이언스 툴즈	11053-10	조직 취급을 위해
HEPES 버퍼	코닝	25060CI
인간 R-스폰딘 1 재조합 단백질	페프로텍	120-38
인슐린 주사기, U-100 0.5 mL 0.36 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2" )	BD	BD329461
인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS -G) (100x)	깁코	41-400-045
L-글루타민 200 mM (100x)	깁코	25-030-081
마트리젤 GFR 저저막 매트릭스	코닝	356231	BMM
마우스 EGF 재조합 단백질	페프로텍	315-09
마우스 FGF 염기성 재조합 단백질	페프로텍	450-33
마우스 노긴 재조합 단백질	페프로텍	250-38
마우스 Wnt-3a 재조합 단백질	페프로텍	315-20
N2 보완	깁코	17502048
N-아세틸시스테인 아마이드	시그마 올드리치	A0737
네온 NxT 전기천공 시스템	인비트로젠	네온1	CRISPR-Cas9 전기천공을 위한
네온 NxT 전기천공 시스템 10-μ 1채널 진공관이 장착된 L 키트	인비트로젠	N1025	전기천공용 소모품, 유전체 편집 버퍼를 포함
니코티나마이드	시그마 올드리치	N3376
일반 쥐 혈청	인비트로젠	10410
일반 쥐 혈청	스템셀 테크놀로지	13551
옵티-MEM I 환원 혈청 배지	깁코	31985070
PAX8 다클론 항체	단백질 기술	10336-1-AP
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	깁코	15-140-122
푸로마이신	시그마 올드리치	P8833
셀렉트프로스트 25mm 및 급성; 75mm 및 급성; 1.0mm	피셔브랜드	12-550-003
트리톤 X-100	피셔 바이오리에이전트	BP151
TrypLE Express 효소 (1x), 페놀 레드 없음	깁코	12-604-013
바나스 스프링 가위 - 4mm 커팅 엣지	파인 사이언스 툴즈	15019-10	난관 절리를 위해
Y27632	스템셀 테크놀로지	72304	로키나아제(ROCK) 억제제