방법 논문

제브라피쉬 이미징 및 심장 발달을 위한 맞춤형 3D 프린팅 금형

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DOI:

10.3791/68768

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2025년 8월 15일

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1Department of Biology, University of Mississippi

이 논문에서

요약

여기에서는 저렴한 광조형 3D 프린터를 사용하여 이미징 연구를 위해 제브라피쉬 배아의 재현 가능한 장착을 용이하게 하는 금형을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 제브라피쉬 배아의 심장 형태 형성을 이미징하기 위한 금형을 만들었습니다.

초록

배아 장착은 연구자들이 이미징 프로젝트를 수행할 때 직면하는 기술적 과제 중 하나입니다. 배아는 전체 이미징 기간 동안 관심 있는 조직이 현미경 대물렌즈에 접근할 수 있도록 재현 가능한 방식으로 방향을 지정해야 합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 연구자들은 점성 매체에 배아를 삽입하거나 이미징 중에 배아를 원하는 방향으로 고정하는 특수 접시와 모형을 만들 수 있습니다. 여기에서는 저렴한 광조측(SLA) 3D 프린터를 사용하여 이미징을 위해 배아를 장착할 수 있는 아가로스 우물을 만드는 재사용 가능한 금형을 제조하는 방법을 설명합니다. 이러한 아가로스 우물은 이미징을 위해 여러 배아의 방향을 지정하는 신뢰할 수 있는 수단을 제공합니다. 이 방법에는 다양한 조직, 유기체 및 이미징 문제에 맞게 쉽게 사용자 정의할 수 있는 설계 프레임워크가 포함되어 있습니다. 이 방법을 사용하여 정립 현미경과 도립 현미경 모두에서 제브라피쉬의 심장 발달을 이미징하기 위한 금형을 만들었습니다. 접근 가능한 재료와 장비를 활용함으로써 이 방법을 통해 연구원은 장착 요구 사항에 맞는 금형을 쉽게 만들 수 있습니다.

서론

온전한 동물 내의 세포 역학을 시각화하는 것은 선천성 질환의 병리와 발달 및 항상성의 기본 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이 시각화는 조직, 세포 및 세포 이하 수준뿐만 아니라 전체 유기체에 걸친 생리적 역학을 식별하기 위해 여러 공간 규모의 이미징을 포함합니다. 세포 역학을 시각화하는 데 사용되는 이미징 양식은 고정 표본의 면역형광 연구에서 살아있는 표본의 타임랩스 이미징에 이르기까지 다양합니다. 이러한 이미징 양식은 현미경 대물렌즈에 관심 영역에 접근할 수 있도록 손상되지 않은 표본을 특정 방향으로 고정해야 합니다.

제브라피쉬 배아는 광학적 투명성, 유전적 다루기 용이성, 외부 수정 및 척추동물 기원으로 인해 이미징 연구에 이상적인 모델 유기체입니다. 그러나 일관되고 재현 가능한 방식으로 특정 방향으로 제브라피쉬 배아를 장착하는 것은 지속적인 도전이었습니다. 심장 형태 형성이 서로 다른 평면에서 발생하기 때문에 제브라피쉬 배아의 심장 발달을 시각화하는 데 장착이 특히 어렵습니다1.

이미징을 위해 배아를 장착하는 문제를 해결하기 위해 여러 가지 접근 방식이 개발되었습니다. 가장 간단한 방법 중 하나는 부서지는 것을 방지하기 위해 커버슬립 사이에 테이프 층을 사용하여 두 개의 커버슬립 사이에 제브라피쉬 배아를 장착하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 도립 현미경과 정립 현미경 모두에서 이미징할 수 있습니다2. 제브라피쉬 배아는 또한 메틸셀룰로오스 또는 0.1-0.8% 저융점 온도 아가로스와 같은 점성이 높은 배지 또는 겔에 장착하여 배아를 특정 방향으로 유지할 수 있습니다 2,3,4. 이러한 저처리량 접근 방식은 많은 이미징 프로젝트에 적합합니다. 그러나 배아의 무결성을 보장하고 특정 방향을 재현 가능하게 얻는 것은 번거로울 수 있습니다. 이미징 처리량을 증가시키고 장착을 용이하게 하기 위해, 이미징 접시 5,6,7,8에서 응고된 아가로스로부터 규칙적으로 간격을 둔 웰을 생성할 수 있다. 이러한 아가로스 우물의 생성을 용이하게 하기 위해 플라스틱 금형이 생성되었습니다 9,10,11. 이러한 몰드는 표준 등쪽-복부-측면 축(10,12)을 따라 이미징에 적용될 수 있지만, 96-웰 플레이트13 또는 첫 번째 심장 박동의 검출과 같은 특정 이미징 문제를 위해 만들어지는 경우가 많다14. 특수한 경우에는 전체 이미징 접시가 생성되었습니다 5,15,16. 예를 들어, PDMS로 만들어진 미세유체 챔버(ZEBRA로 명명됨)는 이미징 및 화학 물질에 대한 배아의 노출을 용이하게 합니다17. 이러한 금형은 종종 실리콘으로 만들어지거나 루사이트10,18,19로 가공됩니다. 그러나 상대적으로 저렴한 3차원(3D) 프린터의 출현으로 아가로스 이미징 웰을 만드는 데 사용되는 맞춤형 금형 제작이 민주화되었습니다.

적층 또는 계층 제조라고도 하는 3D 프린팅은 개별 레이어(20,21)의 순차적 추가 및 융합에 의해 디지털 설계로부터 3D 객체를 생성하는 것을 포함합니다. 광조형(SLA)은 자외선(UV)을 사용하여 순차적 층(22)에서 빛에 민감한 액체 수지를 경화합니다. SLA 프린터는 비용 효율적이고 빠르며 정확도가 높으며 매끄러운 표면을 제공하는 수지를 포함하여 다양한 수지와 함께 사용할 수 있습니다16. 이 프로세스는 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어로 시작되며, 여기서 물체의 디지털 모델을 새로 설계하거나 기존 설계에서 수정할 수 있습니다. 그런 다음 디지털 모델은 인쇄 가능한 레이어로 가상으로 슬라이스됩니다. 이러한 디지털 레이어를 사용하여 3D 프린터는 레이어별로 물체를 구성합니다. 여기에서는 저가의 상용 SLA 3D 프린터를 사용하여 이미징 금형의 맞춤형 설계 및 제작을 위한 방법과 프레임워크를 제시합니다. 또한 이 프레임워크를 사용하여 도립 현미경 또는 정립 현미경에서 제브라피쉬 심장 발달의 다양한 단계를 이미징하고 측면, 등쪽 또는 복부 축을 따라 제브라피쉬 배아를 이미징하기 위한 금형을 만듭니다.

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프로토콜

여기에 설명된 프로토콜, 실험 및 결과는 동물 복지 규정 및 지침과 미시시피 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 #24-008)에 따라 수행되었습니다.

이미징을 위해 배아를 배향할 수 있는 다양한 모양의 아가로스 웰을 만들기 위해 우리는 못에 부착된 베이스를 활용하는 설계를 개발했습니다(그림 1A). 이러한 못의 모양( 그림 1A에서 보라색으로 된 못을 가리키는 화살표 참조)은 다양한 발달 단계의 배아의 방향을 지정하고 다양한 조직에 초점을 맞추도록 사용자 정의할 수 있습니다. 아래에서는 이러한 페그를 맞춤화하고 이 시스템을 사용하여 아가로스 웰을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

1. 맞춤형 이미징 금형 만들기

  1. 원하는 방향으로 배치된 표본 또는 배아의 예비 스케치를 만듭니다. 원하는 배아 방향과 사용할 현미경에 직립 또는 거꾸로 된 대물렌즈가 포함되어 있는지 여부를 고려하십시오. 또한 접시의 크기, 장착할 배아의 수, 배아 사이의 간격도 고려하십시오.
  2. FIJI23과 같은 소프트웨어 도구와 결합된 현미경을 사용하여 배아 치수(예: 길이, 너비 및 높이)를 측정합니다. 이 치수를 사용하여 배아가 못에 의해 생성된 우물에 맞는지 확인하십시오.
  3. 배아의 기하학에 해당하는 모양을 식별합니다. CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어와 함께 1.2단계의 측정값을 사용하여 샘플의 모양과 크기에 근사한 페그를 만듭니다.
    참고: 이 모양은 기본 CAD 소프트웨어 프로그램에서 미리 설계된 서로 다른 모양을 결합하고 겹쳐서 생성하거나 고급 CAD 소프트웨어 프로그램을 사용하여 모양을 새로 생성할 수 있습니다. 또한 미리 디자인된 못 중 하나를 수정할 수 있습니다(보충 파일 1 참조). 그림 1A와 같이 페그를 테이퍼링하면 관심 조직이 목표에 가장 가깝도록 배아의 방향을 잡는 데 도움이 될 수 있습니다.
  4. 페그 디자인과 기본 디자인 결합:
    1. CAD 소프트웨어 프로그램에서 미리 설계된 베이스 중 하나에 사용자 정의 설계 페그를 추가합니다(보충 파일 1). 그런 다음 고급 CAD 프로그램의 도구를 사용하여 높은 처리량 이미징을 위해 베이스 전체에 페그를 복제하고 고르게 배치합니다. 모든 못이 베이스에서 동일한 높이에 도달하는지 다시 확인하십시오.
  5. 3D 프린팅을 위한 디자인 준비:
    1. 맞춤형 금형 설계 또는 사전 설계된 금형 중 하나(보충 파일 2)를 슬라이서 소프트웨어로 전송하면 설계가 3D 프린터용 명령으로 변환됩니다.
    2. 슬라이서 소프트웨어 내에서 페그와 같은 중요한 구성 요소가 프린터 스테이지에서 멀리 떨어진 곳에 위치하도록 디자인을 회전해야 합니다. FDM(융합 증착 모델링) 프린터에서 인쇄되는 커버슬립 홀더의 경우 인쇄물을 수평으로 배치합니다.
      알림: 디자인을 회전하면 섬세한 부품이 인쇄 단계 가까이에 배치될 때 발생할 수 있는 뒤틀림을 방지할 수 있습니다.
    3. 슬라이서 소프트웨어 내에 지지대를 추가하여 인쇄 중에 금형의 섬세한 부분이 파손되지 않도록 합니다. 수동 큐레이션과 함께 소프트웨어의 중간 자동 지지대 배치 기능은 큰 간격 없이 지지대를 잘 분산시킵니다. 100% 채우기 전략은 견고한 금형을 만드는 데 사용됩니다.
    4. 모든 금형이 포함된 단일 STL 파일을 사용하거나 슬라이서 소프트웨어를 사용하여 개별 STL 파일을 함께 배열하여 여러 조각을 동시에 인쇄합니다.
  6. 인쇄
    참고: SLA 프린터는 타당성, 정밀도 및 매끄러운 표면 생성으로 인해 이미징 금형에 선호되는 3D 프린터 유형입니다. FDM 프린터는 SLA 프린터보다 가볍고 단단한 인쇄물을 생성하기 때문에 커버슬립 홀더를 만드는 데 사용됩니다.
    1. 다음 인쇄 설정으로 시작하여 거기에서 최적화합니다: 0.05mm 레이어 높이; 5 하단 레이어 수; 2.5초 노출 시간; 35초 바닥 노출 시간; 5mm 하단 리프트 및 리프팅 거리; 60mm/min 하단 리프트 속도; 80mm/min 리프팅 속도; 및 210mm/min 후퇴 속도.
      참고: 인쇄 설정은 레진 유형, 실내 온도 및 프린터 모델에 따라 다르기 때문에 사용자가 최적화해야 할 수 있습니다.
  7. 인쇄 후 금형을 물로 씻고 지지대를 제거한 다음 조직 배양 후드에 주형을 UV 광선 아래에 놓아 수지가 응고되도록 합니다.
    참고: 금형을 철저히 세척하고 경화하는 것은 수지가 벗겨지는 것을 방지하고 금형이 변형되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
    경화되지 않은 수지는 피부에 자극을 줄 수 있으므로 경화되지 않은 수지를 취급하고 금형을 청소할 때 장갑과 실험실 가운을 착용해야 합니다. SLA 프린터는 눈과 피부에 해로울 수 있는 수지를 경화하기 위해 UV 광선을 사용합니다. 프린트 챔버가 단단히 밀폐되어 있는지 확인하고 UV 광원을 직접 마십시오.

2. 3D 프린팅 금형을 사용하여 아가로스 우물을 만드는 절차

  1. 아가로스 우물 만들기
    1. E3 배지(1.578mM NaCl, 0.169mM KCl, 0.249mM CaCl2*2H2O, 0.161 mM MgSO4*7H2O)에 2%(g/mL) 아가로스를 용해시켜 아가로스 웰을 만듭니다. 화살표가 웰을 향하도록 커버슬립 바닥 접시 중앙에 금형을 놓습니다(그림 2A,B 참조). 이미징 몰드 둘레의 절반을 따라 750μL의 2% 용융 아가로스/E3를 피펫팅합니다(그림 2C 참조).
      참고: 용융된 아가로스는 점성이 없어야 하지만 기포를 생성하지 않고 피펫팅할 수 있을 만큼 충분히 냉각되어야 합니다. 우리는 30mm 커버슬립 바닥이 있는 60mm 접시를 사용하지만 정립 현미경용으로 설계된 금형의 경우 표준 60mm 접시를 사용할 수 있습니다. 스크리닝 금형에는 약간 다른 프로토콜이 사용됩니다(아래 참조).
    2. 이미징 몰드 둘레의 나머지 절반을 따라 2% 용융 아가로스/E3 750μL를 더 피펫팅합니다( 그림 2D 참조).
    3. 아가로스가 응고될 때까지 5-7분 동안 기다렸다가 투명한 액체에서 불투명한 파란색 젤로의 전환을 관찰합니다( 그림 2E 참조).
    4. 응고된 중앙 아가로스의 둘레에 용융된 아가로스의 얇은 층을 추가합니다.
      참고: 반드시 필요한 것은 아니지만 이 단계는 응고된 아가로스를 접시에 고정하고 배지로 인한 분리를 방지하는 데 도움이 됩니다.
    5. 화살표가 아가로스를 향하도록 외부 링(보충 그림 S1B)을 아가로스 몰드 어셈블리 위에 놓습니다( 그림 2F 참조).
    6. 외부 링을 부드럽게 누르고 내부 몰드를 조심스럽게 똑바로 위로 당겨 아가로스에서 분리합니다( 그림 2G 참조).
      알림: 아가로스 웰이 파손되거나 손상되지 않도록 외부 링을 너무 세게 누르지 말고 위쪽으로 당길 때 내부 금형을 비틀거나 이동하지 마십시오.
    7. 외부 링을 제거하여 커버슬립 바닥 접시에서 아가로스 웰을 드러냅니다(그림 2H).
    8. 현미경으로 아가로스 우물을 검사하여 올바른 크기와 생산량을 확인합니다.
      참고: 도립 현미경으로 이미징하려면 아가로스의 얇은 필름을 웰 바닥에서 들어 올려야 하는 경우가 많습니다. 이것은 집게로 할 수 있습니다.
  2. 스크리닝 금형 사용을 위한 수정된 프로토콜
    1. 용융된 2% 아가로스/E3를 페트리 접시에 대략 절반이 채워질 때까지 붓습니다.
    2. 못이 위를 향하도록 몰드를 잡고 용융된 2% 아가로스/E3를 막아질 때까지 피펫팅합니다(~3mL).
      참고: 피펫으로 흡입된 용융된 아가로스의 90%만 방출하여 기포가 발생하지 않도록 합니다.
    3. 기울인 동작을 사용하여 한쪽 끝을 놓은 다음 못이 있는 전체 금형을 용융된 아가로스가 들어 있는 페트리 접시에 앞면이 아래로 향하도록 놓습니다(보충 그림 S2).
    4. 아가로스를 5-7분 동안 응고시키십시오.
    5. 손잡이를 사용하여 한쪽 끝을 들어 올린 다음 다른 쪽 끝을 들어 올려 금형을 조심스럽게 제거합니다.

3. 저융점 아가로스 유무에 관계없이 아가로스 우물에 배아 장착

  1. 마운트하기 전에 200μg/mL 트리카인 용액에서 배아를 탈융모막화하고 마취시킵니다.
    참고: 심장 박동을 멈추려면 ~400μg/mL 트리카인 용액이 필요합니다.
    1. 저융점 아가로스를 사용하지 않고: 이미징 접시에 1x E3 및 트리카인(200μg/mL)을 채우고, 탈융모막화된 마취된 배아를 이미징 접시에 추가하고, 겸자를 사용하여 배아를 아가로스 웰에 배치하고 방향을 잡은 다음 이미지를 촬영합니다( 그림 2I, J 참조).
      참고: 집게는 배아를 쉽게 손상시킬 수 있으므로 직경 0.41mm의 낚싯줄을 모세관이나 피펫 팁에 삽입하고 초강력 접착제로 고정하는 배아 포커를 대신 사용할 수 있습니다24.
    2. 낮은 용융 온도 아가로스 사용:
      참고: 금형은 배아를 특정 방향으로 배치하도록 설계되었지만 낮은 용융 온도의 아가로스를 사용하여 배아를 제자리에 고정하면 이미징 중에 또는 장착된 배아가 있는 이미징 접시를 현미경으로 운반하는 동안 배아가 표류하지 않도록 할 수 있습니다. 아래 단계는 이전 프로토콜6에서 파생되었습니다.
      1. 0.1-0.8% 저융점 아가로스를 5mL의 E3 배지에 용해시키고 수조에서 65-70°C로 가열하여 저융점 아가로스 튜브를 만듭니다. 때때로 저융 온도의 아가로스가 용해될 때까지 튜브를 뒤집습니다. 저융점 아가로스 용액을 미세분리기 튜브에 분취하고 42°C로 설정된 열 블록에 놓습니다. 용액을 최소 1시간 동안 42°C로 평형화하도록 합니다.
        참고: 일반적으로 갓 만든 저융점 아가로스 용액을 사용하는 것이 좋습니다.
      2. 와이드 보어 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 단일 배아를 저융점 아가로스 용액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 저융점 아가로스 용액에 과도한 액체를 첨가하지 않으려면 배아와 바로 주변의 액체만 옮기십시오. 현재 저융점 아가로스에 있는 배아를 즉시 아가로스 우물 중 하나로 옮깁니다. 재사용을 위해 저융점 아가로스 용액을 히트 블록으로 되돌립니다.
      3. 겸자 또는 배아 포커(3.1.1단계 참조)를 사용하여 이미징을 위해 배아를 우물에 배치합니다.
      4. 다른 웰에 대해 3.1.2.2-3.1.2.3단계를 반복합니다. 이전 웰이 마르기 시작하면 p200 피펫을 사용하여 웰 위에 소량의 E3(~50-100μL)를 추가합니다.
  2. 배아가 모든 웰에 장착되고 저융점 아가로스가 응고되면 피펫을 사용하여 트리카인/E3 용액을 이미징 접시에 천천히 추가합니다.
  3. 이미징 후 집게를 사용하여 우물에서 배아를 조심스럽게 추출하고 이미징이 발달 결함을 일으키지 않도록 추가 발달을 허용합니다.
    참고: 아가로스 웰은 이미징 접시에서 제거할 수 있으며 헹구고 재사용할 수 있습니다. 시중에서 판매되는 유리 세정제로 헹구고 ddH2O로 여러 번 헹구면 커버슬립의 염분 침전물을 제거하는 데 도움이 됩니다. 잔류 유리 세정제로 인한 독성을 경험하지는 않았지만 연구원은 자신의 실험실 조건을 사용하여 이러한 결과를 확인하는 것이 좋습니다.

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결과

위의 프로토콜은 심장 융합, 심관 형성, 심장 루핑 및 챔버 형성을 포함하여 제브라피쉬의 심장 발달의 다양한 단계를 이미징하기 위한 금형을 설계하는 데 사용되었습니다. 심장 발달은 배아의 주요 해부학적 축을 따라 발생하지 않기 때문에 배아를 적절하게 배치하기 위해 못의 모양은 다양한 발달 단계에 맞게 맞춤화되었습니다. 예를 들어, 구형 노른자에 비해 수정 후 48시간(hpf)에 제브라피쉬 심장의 전방 내부 배치는 금형 V2에서 테이퍼형 가장자리가 있는 못을 생성함으로써 촉진된 경사진 배아 방향을 필요로 합니다(그림 1A,B). 몰드 V2를 활용하여 도립 공초점 현미경으로 이미징하기 위한 아가로스 웰을 생성하고, Tg(myl7:egfp) 이식유전자25를 사용하여 야생형 배아와 48 hpf에서 분심장을 나타내는 중증 pdgfrask16/sk16 돌연변이 배...

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토론

이 프로토콜에서는 이미징 연구를 위해 배아 또는 조직의 장착을 용이하게 할 수 있는 아가로스 웰을 생성하는 3D 프린팅 금형을 설계하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 금형은 정립 또는 도립 현미경으로 이미징을 위해 만들 수 있으며 이러한 맞춤형 금형을 사용하여 만든 아가로스 웰은 고정 배아의 면역형광 연구에서 살아있는 배아의 타임랩스 이미징에 이르기까지 다양한 이미징 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

이 방법은 못이 부착된 내부 플런저 모양의 베이스 몰드와 외부 링의 두 부분으로 구성된 기초를 사용합니다. 우리는 이러한 금형에 몇 가지 주요 설계 기능을 통합했습니다. 이러한 기능 중 가장 중요한 것은 내부 금형 바닥에 위치한 못입니다. 이러한 못의 모양은 다양한 모양의 아가로스 우물을 생성하도록 맞춤화할 수 있으며, 이는 이미징을 위해 재현 가능한 방식으로 배아의 방향을 지정하는 데 도움이 됩니다. 추가 설계 기능...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Bloomekatz 연구소 구성원, 특히 Sasmitha Singh과 Allison Holmes, GlyCORE 이미징 코어(P20GM130460 지원), 미시시피 대학교 IDEA 연구실, Yiwei Han 박사 및 Han 연구실, 미시시피 대학교 당과학 및 발달 생물학 커뮤니티 구성원에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 이 작업은 NIH(R15HD108782, P20GM130460)의 자금 지원으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SLA 3D 프린터ElegooMARS 2 PRO
아가로스 에이펙스 바이오리서치; 제네시 사이언티픽 20-102QD모든 브랜드를
Autodesk Fusion 360Autodesk Inchttps://www.autodesk.com/products/fusion-360/ 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어 - 고급
Axio-Zoom 정립 현미경ZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/슬라이서 소프트웨어
커버슬립 바닥 접시(30mm 바닥 웰이 있는 60mm 접시)CellvisD60-30-1.5N
F59 미오신 중쇄(모든 고속 이소형)DHSBF591:50 희석
FDM 필라멘트BambuPLA 필라멘트
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저융점 아가로스골드 생명공학카탈로그 번호: A-204-25다른 브랜드도 적합할 수 있습니다
펫 펌프Bel-ArtF37898
수지ElegooElegoo P05BB028물 세척 가능한 포토폴리머 수지 V2.0
Ricinus communis agglutinin (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (렉틴 키트)1:300 희석
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어 - 기본
트리케인 S 웨스턴 케미칼, Inc. ANADA #200-226
밀 배아 응집소(WGA)벡터 연구소#RLK-2200(렉틴 키트)1:300 희석
와이드 보어 유리 파스퇴르 피펫 듀란 휘튼 킴블(DWK)63A53WT
.로 대체할 수 있습니다. 겸 SLA 프린터용 피

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