여기에서는 분자 또는 조직병리학적 분석을 위해 절편하기 전에 조직 안정화 젤을 혈관 내강에 주입하여 인간 동맥 구조를 보존하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
작은 동맥과 세동맥을 포함하는 저항 동맥은 혈압과 조직 관류를 조절하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이러한 동맥의 기능 장애는 신경혈관 질환뿐만 아니라 고혈압, 죽상동맥경화증, 심부전과 같은 다양한 심혈관 질환을 유발할 수 있습니다. 인간 저항 동맥의 검사는 심혈관 질환 메커니즘을 이해하고 표적 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다. 이 연구는 조직 안정화 젤을 내강에 주입하여 고립된 인간 저항 동맥을 준비하고 천연 구조와 세포 무결성을 보존하는 혁신적인 방법을 제시합니다. 복부 수술을 받는 환자로부터 인간 대망 조직을 채취하고, 작은 저항 동맥(직경 100-300μm)을 주의 깊은 미세 해부에 의해 분리하였다. 그런 다음 동맥을 캐뉼라하고 배양 근 조파 챔버에서 가압한 다음 10% 중성 완충 포르말린으로 고정했습니다. 조직 안정화 젤을 캐넌트 동맥의 내강에 주입하여 3차원 구조를 보존하기 위해 응고되도록 했습니다. 동맥의 보존을 평가하기 위해 조직학적, 면역조직화학적 및 유전자 발현 분석을 수행했습니다. 조직학적 절편은 동맥의 잘 보존된 구조적 무결성과 자연적인 구조를 밝혀 잘 정의된 내피층과 평활근층을 유지했습니다. 면역조직화학적 염색은 CD31 및 α-평활근 액틴과 같은 마커의 뚜렷한 국소화를 보여주었습니다. 제자리 혼 성화는 특정 유전자 발현 패턴을 밝혀 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. 이 고급 관내 젤 주입 방법은 상당한 이점을 제공하여 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 동맥 구조, 리모델링 및 세포 상호 작용에 대한 고급 이미징 및 포괄적인 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 혈관 질환에 대한 임상 진단 및 치료 전략을 개선하여 혈관 생물학 연구를 발전시키는 데 유용한 도구를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
서론
저항 동맥은 혈류와 압력을 조절하고 고혈압, 당뇨병 및 죽상동맥경화증과 같은 상태에서 상당한 변화를 겪습니다 1,2,3,4,5. 인간 저항 동맥을 검사하는 것은 심혈관 병리를 이해하고 표적 치료법을 개발하는 데 필수적입니다 6,7,8,9,10. 혈관을 조사하는 전통적인 방법은 종종 인공물과 3차원 무결성 손실로 이어졌습니다 10,11,12,13,14,15. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 내강에 젤을 주입하여 대략적인 생체 외 및/또는 생체 내 구조를 보존함으로써 분리된 인간 저항 동맥을 준비하는 혁신적인 방법을 제시합니다.
이 내강내 젤 주입 기술은 동맥의 자연적인 구조를 유지하여 생리적 상태를 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 혈관 구조를 안정화함으로써 이 방법은 다양한 세포층에 걸친 동맥 리모델링, 세포 구조, 마이크로도메인, 이종 세포 접합 및 유전자/단백질 발현에 대한 자세한 검사를 용이하게 합니다. 이 기술은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 세포 유형 특이적 구성 요소를 연구하는 데 특히 유리합니다.
이 기술은 최근 연구16에 성공적으로 적용되어 인간 저항 동맥의 구조적 및 분자적 무결성을 보존하고 고급 이미징 및 포괄적인 분석을 용이하게 하는 효과를 입증했습니다. 이 응용 프로그램의 성공은 다른 사람들이 사용할 수 있도록 이 상세한 프로토콜을 문서화하도록 영감을 주었습니다.
이 방법 논문에서는 분리된 인간 저항 동맥을 준비하고 생체 적합성 조직 안정화 젤(Tissue Guard Gel)을 주입하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에서는 실험 방법을 설명하고 동맥 구조 평가와 다양한 세포층의 유전자 및 단백질 발현 패턴 조사를 위한 적용을 설명합니다. 인간 저항 동맥 준비를 위한 포괄적이고 재현 가능한 기술을 제공함으로써 우리는 심혈관 생물학 연구를 발전시키고 결과의 재현성을 향상시키며 심혈관 질환에 대한 새로운 진단 및 치료 접근법에 기여하는 것을 목표로 합니다.
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프로토콜
다음 실험을 수행하기 전에 인체 조직의 사용과 다음 절차가 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았는지 확인하십시오. NIH(National Institutes of Health) 임상 센터에서 임상적으로 지시된 복부 수술을 받는 환자로부터 대망 조직 수집은 NIH Institutional Review Board(NCT01915225)의 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했습니다.
1. 재료 및 장비
- 이 프로토콜에 필요한 모든 시약 및 재료에 대한 정보는 재료 표 를 참조하십시오. 자세한 내용은 필요에 따라 해당 공급업체와 관련된 매뉴얼 및 웹사이트를 참조할 수 있습니다.
2. 인간 대망 조직의 수집
- 수술팀에서 인간 대망 조직을 수집합니다.
- 차가운 Krebs Henseleit(KH) 완충액(조성: 118mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 25mM NaHCO3, 10mM HEPES, 2.0mM CaCl2 및 11.1mM 포도당)이 들어 있는 미리 냉각된 검체 용기에 조직을 얼음 위에 즉시 넣습니다.
- 조직이 완충액에 완전히 잠겼는지 확인한 다음 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 조직 생존력을 보장하기 위해 수집 후 30분 이내에 얼음 위에 밀폐된 용기에 담긴 조직을 실험실로 운반합니다.
참고: 완충액을 준비하는 동안 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정해야 합니다.
3. 인간의 작은 저항 동맥의 미세 해부
- 실험실에 도착하면 대망 조직을 차가운 KH 완충액으로 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다.
- 얼음 위의 페트리 접시에 있는 차가운 완충액에서 해부할 조직의 혈관이 더 많이 형성된 영역의 일부를 선택합니다.
- 해부 현미경으로 위치와 분기 패턴에 따라 작은 저항 동맥(직경 100-300μm)을 식별합니다.
- 식별된 동맥을 주변 지방 및 결합 조직에서 조심스럽게 분리합니다. 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 동맥을 손상시키지 않고 주변 조직을 자르고 제거합니다.
- 생존력을 유지하고 효소 분해를 방지하기 위해 해부 절차 전반에 걸쳐 분리된 동맥을 차가운 완충액에 보관하십시오.
알림: 해부하기 전에 해부 부위가 깨끗한지 확인하십시오. 현미경 대물렌즈 스케일 및/또는 카메라 소프트웨어가 다양한 배율에서 직경을 정확하게 측정할 수 있도록 적절하게 보정되었는지 확인하십시오. 일반적으로 정맥은 명확하게 보이고 동맥은 정맥 바로 옆이나 주변에 위치합니다. 동맥 벽은 정맥 벽보다 두껍습니다. 주변 조직에서 분리되면 동맥은 온전한 혈관관으로 구조를 유지합니다. 대조적으로, 정맥은 벽이 더 얇고 내강의 혈액으로 인해 종종 더 밝게 보이며 조직에서 분리되면 더 취약해지는 경향이 있습니다.
4. 배양 근 검사 챔버의 준비
- 해부된 동맥의 캐뉼라 삽입 및 가압을 위해 두 개의 유리 캐뉼라가 있는 배양 근 그래프 챔버를 준비합니다.
- 깨끗한 모세관 튜브가 있는 5mL 주사기를 준비하고 신선한 KH 완충액으로 채웁니다. 튜브를 캐뉼라의 한쪽 끝에 연결하고 기포를 남기지 않고 KH를 채웁니다.
- 챔버에 콜드 버퍼를 채우고 얼음 위에 올려 낮은 온도를 유지합니다.
알림: 근 그래프 챔버를 모방하도록 설계된 두 개의 캐뉼라가 있는 맞춤형 작은 접시를 사용할 수 있습니다.
5. 동맥의 캐뉼라 삽입 및 가압
- 미세한 겸자나 동맥보다 직경이 큰 이송 피펫을 사용하여 해부된 동맥을 근조영술실로 조심스럽게 옮깁니다.
- 나일론 봉합사(11/0 봉합사, 7겹)로 4개의 열린 매듭을 준비하고 동맥을 캐뉼라로 삽입하기 전에 각 캐뉼라에 2개를 놓습니다.
- 가는 집게를 사용하여 유리 캐뉼라에 밀어 넣어 동맥의 근위 끝을 캐뉼라에 삽입하고 두 개의 나일론 봉합사로 고정합니다.
- 주사기의 KH 완충액을 사용하여 캐뉼라 동맥을 부드럽게 세척하여 남아 있는 혈액을 제거합니다.
- 동맥의 원위 끝을 캐뉼라로 삽입하고 유사하게 고정합니다.
- 압력 및 온도 컨트롤러에 연결된 근계기 장치에 챔버를 놓습니다.
- 온도를 37°C로 설정합니다.
- 초기 관강내 압력을 10mmHg로 설정합니다.
- 60mmHg에 도달할 때까지 10분마다 10mmHg 증분씩 내강내 압력을 증가시킵니다. 배양 근 그래프 시스템에 연결된 압력 조절기를 사용하여 압력이 일관되게 유지되는지 확인하십시오.
- 마이크로 포지셔너를 사용하여 필요에 따라 가압된 동맥을 세로로 곧게 펴서 길이를 대략 생리학적 수준으로 가져옵니다.
- 컴퓨터 모니터에서 MyoVIEW 또는 기타 적절한 소프트웨어를 실행하여 디지털 캘리퍼스로 내부 및 외부 동맥 직경을 추적합니다.
- 동맥이 45분 동안 평형을 이루도록 하여 안정적인 직경을 달성하여 생리학적 치수와 톤을 유지합니다.
- 혈관 수축제(예: 60mM KCl 또는 페닐에프린) 또는 혈관확장제(예: 아세틸콜린)를 사용하여 동맥의 생존력을 테스트하고 동맥 직경의 변화를 기록합니다.
알림: 주사기로 과도한 압력을 가하면 동맥이 손상될 수 있으므로 세척할 때 주의하는 것이 중요합니다. 최소한의 버퍼를 사용하고 부드럽게 진행하십시오. 또는 동맥에 압력을 가하면서 관류 완충액을 사용하여 동맥혈을 씻어낼 수 있습니다. 동맥은 80mmHg로 가압될 수 있으며 평형 시간은 최대 1시간입니다.
6. 동맥 고정
- 평형 후 10% 중성 완충 포르말린으로 밤새 동맥을 내강 및 내강으로 고정합니다. 고정 과정에서 동맥벽과 세포 구성 요소의 구조적 무결성이 보존되도록 60mmHg의 일정한 압력을 유지하십시오.
- 고정 후 PBS로 동맥을 내강 및 경내로 헹구어 동맥과 챔버에서 잔류 고정액을 제거합니다.
참고: 연구 목적 및 분석 관심 영역에 따라 장착된 혈관은 혈관확장제 또는 혈관수축제와 같은 약리학적 제제가 있는 상태에서 고정될 수 있습니다. 이 단계에서 동맥은 최대 48시간 동안 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다. 4% 파라포름알데히드를 사용하여 동맥을 고정할 수도 있습니다.
7. 조직 안정화 젤의 제조
- 사용하기 전에 튜브에서 조직 안정화 젤을 60 ± 5 °C로 가열하여 액화하십시오.
- 액체 겔이 온도를 낮추도록 튜브를 실온(RT)에서 3-5분 동안 놓은 다음 40°C의 가열 블록에 올려 액체 겔을 10-15분 동안 유지합니다.
- 10-15인치 길이의 모세관 튜브에 연결된 3mL 멸균 주사기를 사용하여 액체 젤을 빼냅니다. 즉시 아래 주입 단계를 진행하십시오.
참고: 젤은 다양한 방법을 사용하여 액화할 수 있습니다. 제조업체의 지침을 따르는 것이 중요합니다.
8. 관내 겔 주입 및 매립
- 고정 동맥을 37°C에서 PBS로 챔버에 캐뉼라 상태로 유지합니다.
- 액체 젤로 채워진 모세관의 말단 끝을 근위 캐뉼라에 연결합니다.
- 젤을 주입하는 동안 기포가 내강을 통과하는 것을 방지하려면 첫 번째 캐뉼라에서 동맥의 근위 끝을 제거하여 기포를 빼내고 젤이 캐뉼라를 채울 수 있도록 합니다.
- 동맥을 캐뉼라에 다시 장착하고 원위 캐뉼라에서 나올 때까지 젤을 동맥 내강에 부드럽게 주입합니다.
- 즉시 챔버의 PBS를 같은 부피의 액체 젤로 교체하여 챔버를 최상위 수준까지 채웁니다.
- 약 10분 동안 온도 컨트롤러에서 장치를 분리하여 동맥이 있는 챔버를 RT에서 쉬게 하여 젤이 챔버의 내강 내부와 내강 외부에서 응고되도록 합니다. 이렇게 하면 동맥이 젤에 완전히 박혀 3차원 구조가 보존됩니다.
- 가는 집게를 사용하여 나일론 봉합사를 풀고 챔버에서 캐뉼라를 부드럽게 당겨 빼냅니다.
- 동맥을 포함하는 전체 응고된 젤을 챔버에서 70% 에탄올로 채워진 용기로 옮깁니다. 에탄올은 추가 처리까지 샘플을 보존하기 위한 유지 용액 역할을 합니다.
알림: 3방향 밸브는 젤을 주입하기 전에 기포를 쉽게 제거할 수 있습니다. 젤의 응고는 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 챔버 내의 젤을 부드럽게 만지면 확인할 수 있습니다.
9. 조직병리학
- 젤에 있는 동안 동맥을 가로로 절단하고 이 샘플을 조직 처리 기계에 넣어 제조업체의 지침에 따라 처리합니다.
- 그런 다음 조직을 매립하여 파라핀 블록을 만듭니다. 단면이 블록에서 아래를 향하도록 샘플이 "끝"으로 내장되어 있는지 확인하십시오.
- 마이크로톰을 사용하여 5μm 두께의 축 절편을 절단합니다. 절단된 부분을 접착 슬라이드에 옮깁니다.
- 절편을 60°C에서 1시간 동안 구운 다음 자일렌으로 탈랍한 다음 등급이 매겨진 알코올 세척으로 재수화합니다.
- 일상적인 조직병리학을 위해 절편을 헤마트실린과 에오신(HE)으로 염색하고 1% 산성 알코올로 구별합니다. 적절한 현미경을 사용하여 광학 현미경으로 절편을 검사하고 호환되는 카메라를 사용하여 사진을 획득합니다.
10. 면역조직화학
- 제조업체의 프로토콜에 따라 폴리머 정제 검출 시스템이 있는 자동화 시스템을 사용하여 염색을 달성합니다.
- 탈랍 용액으로 72°C에서 30초 동안 조직 절편을 탈랍한 다음 등급이 매겨진 알코올 세척액 및 세척액으로 절편을 재수화합니다.
- 에피토프 회수 용액 1에서 절편을 100°C로 20분 동안 가열하여 열 유도 에피토프 회수를 수행하고 내인성 과산화효소 활성을 소멸하기 위해 5분 동안 과산화물 블록을 적용합니다.
- 1차 항체(예: 항-CD31 또는 항-평활근 액틴)를 백그라운드 환원 항체 희석제로 희석한 적절한 농도로 적용합니다. 양 고추 냉이 과산화효소 중합체와 함께 절편을 8분 동안 배양하고 10분 동안 발색 용액으로 절편을 착색합니다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 5분 동안 대조염색합니다.
11. RNAScope 발색 in situ 혼성화
- 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 키트와 폴리머 정제 적색 검출 키트가 있는 자동화 시스템을 사용하여 염색을 수행합니다.
- 절편을 60°C에서 30분 동안 구운 다음 72°C로 가열된 탈랍 용액에서 30초 동안 절편을 탈랍합니다.
- 무수 에탄올 세척액과 세척액으로 조직을 재수화하십시오.
- 에피토프 회수 용액 2로 절편을 95°C에서 15분 동안 처리하고 절편을 효소 용액과 함께 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 표적 유전자에 대한 적절한 RNAScope 프로브와 샘플을 혼성화합니다.
- 배지 발현 하우스키핑 유전자 프로브(예: 펩티딜프롤릴 이소머라제 B)를 사용하여 적절한 RNA 풍부도와 무결성을 확인합니다.
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결과
인간 대망 조직은 임상적으로 지시된 복부 수술을 받는 환자로부터 얻었습니다. 작은 저항 동맥(직경 100-300μm)을 해부 현미경으로 주변 지방 및 결합 조직에서 꼼꼼하게 분리했습니다(그림 1A-C). 분리된 동맥을 세척하고 성공적으로 캐뉼라를 삽입한 후 가압을 위해 배양 근 그래프 챔버의 유리 캐뉼라에 장착했습니다(그림 1D-F). 동맥은 60-80mmHg로 가압되었을 때 생리적 치수와 긴장도를 유지하여 성공적인 캐뉼라 삽입을 나타냅니다. 60-80mmHg의 일정한 압력에서 10% 중성 완충 포르말린으로 동맥을 고정하면 동맥벽과 세포 구성 요소의 구조적 무결성이 보존되었습니다. 동맥은 잘 정의된 내피층과 평활근층이 있는 자연적인 구조를 유지했습니다. 생존율 시험 실험은 동맥이 60mM KCl에 노출되...
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토론
의료 영상, 수술 기술 및 연구 방법론의 발전으로 3D 혈관 구조에 대한 이해가 향상되어 진단, 수술 계획 및 연구에 혁명을 일으켰습니다 17,18,19,20. 이러한 혁신에도 불구하고 분리된 인간 저항 동맥의 3D 구조를 보존하는 것은 섬세하고 복잡한 특성으로 인해 여전히 어려운 일이며, 이로 인해 격리 및 이미징이 복잡해지고 해부학적 및 생리학적 특성에 대한 포괄적인 연구가 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 고립된 인간 저항 동맥의 천연 구조와 세포 무결성을 효과적으로 보존하는 고급 내강내 젤 주입 방법을 개발했습니다.
이 기술은 자연 동맥의 생리적 치수와 구조적 특성을 보존합니...
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공개 사항
NIAID GenAI는 원고의 초기 개요와 초안을 생성하는 데 사용되었으며, 정확성과 일관성을 보장하기 위해 인간 저자가 철저하게 작성, 검토 및 편집했습니다.
감사의 글
이 연구는 HCA의 프로젝트 번호 AI001150인 국립 알레르기 및 전염병 연구소의 교내 연구 부서에서 자금을 지원했습니다. 전 연구실 구성원인 Steven Brooks 박사와 현재 연구실 구성원인 말라리아 기능 유전체학 섹션의 Mohamed Ibrahim, Mary Jackson 및 Jian Wu에게 프로세스 중 이미지 캡처에 도움을 주신 데 감사드립니다.
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재료
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| 자동 조직 처리기 | 라이카 바이오시스템 | 히스토코어 페가수스/캣# 14048858005 | |
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