방법 논문

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

DOI:

10.3791/68775

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2025년 7월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardio & Organ Systems (COST), Biomedical Research Institute, UHasselt

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

초록

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심초음파 유도 심근내 주사(EGI)는 전임상 심근경색(MI) 모델에서 줄기 세포 치료를 전달하기 위한 최소 침습 기술입니다. 기존의 개방 흉부 접근법과 비교하여 EGI는 향상된 임상 번역성, 감소된 침습성 및 동물에 대한 생리적 영향 최소화를 제공합니다. EGI는 쥐 모델에서 잘 확립되어 있지만 쥐에 대한 적용은 해부학적 및 기술적 문제로 인해 여전히 제한적입니다. 특히, 경색 및 경색 주위 부위의 좌심실 전벽(LVAW)이 얇아지면 벽 두께가 일반적으로 사용되는 27G 또는 28G 바늘의 바늘 베벨 크기 아래로 떨어질 수 있으므로 안전하고 정확한 심근 전달이 복잡해져 심실 천공 또는 전달 실패의 위험이 증가합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 29G Spinocan 바늘을 사용하여 쥐 MI 모델에서 EGI에 대한 프로토콜을 최적화했습니다. 더 작은 직경의 더 긴 바늘을 사용하면 LVAW 두께에 관계없이 얇은 심근 조직을 정밀하게 표적으로 삼을 수 있어 손상을 최소화하고 주사 정확도를 높일 수 있습니다. 이 기술은 표준 경흉부 심초음파 플랫폼과 호환되며 개흉술이 필요하지 않아 동일한 동물에 대한 종단 연구가 가능합니다. 우리의 정제된 방법은 재생 요법이 가장 효과적인 경색 부위에 인접한 생존 가능한 심근으로 치료제를 강력하고 재현 가능한 전달을 가능하게 합니다. 안전성을 개선하고 표적 정밀도를 지정함으로써 이 접근 방식은 전임상 심장 연구의 중개 관련성을 높이고 실험실 전반에 걸쳐 표준화된 프로토콜 개발을 지원합니다.

서론

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심혈관 질환은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있으며, 심근경색(MI)은 급성 및 만성 심장 질환 모두에 중요한 원인입니다1. 약리학적 및 중재적 관리의 발전에도 불구하고 성인 인간 심장의 재생 능력은 제한되어 종종 불리한 리모델링 및 심부전으로의 진행을 초래합니다 2,3. 결과적으로 줄기세포 기반 치료법은 손상된 심근을 복구하고 심장 기능을 보존하며 임상 결과를 개선하기 위한 잠재적인 전략으로 주목을 받고 있습니다4.

강력한 전임상 모델은 이러한 치료법의 안전성, 효능 및 전달 전략을 평가하는 데 필수적입니다. 소동물 모델 중에서 쥐는 관리 가능한 심장 크기, 잘 특성화된 경색 기술, 번역 관련 심장 리모델링 반응 등 여러 가지 이점을 제공합니다5. 통상적으로, 쥐 MI 모델에서 줄기 세포의 심근내 투여는 개흉술을 통해 이루어지며, 주사 부위를 직접 시각화할 수 있다6. 그러나 이 접근 방식은 침습적이며 상당한 절차적 위험을 초래하며 종단 연구에서 반복적인 개입을 방해합니다. 또한 카테터 기반 또는 경피적 주사와 같은 임상 전달 방식과의 일치가 부족합니다7.

심초음파 유도 심근내 주사(EGI)는 실시간 영상 유도 하에 치료제의 표적 전달을 가능하게 하는 최소 침습적 대안입니다. 쥐 모델에서는 잘 확립되어 있지만 쥐 모델에서 EGI의 사용은 제한적이었습니다. EGI는 주로 대부분의 심혈관 연구가 역사적으로 지배적인 전임상 모델로서 마우스에 초점을 맞추었기 때문에 쥐보다 마우스에서 더 광범위하게 개발되었습니다8. 또한 마우스의 더 작은 크기와 심장 해부학으로 인해 초음파 유도 절차의 최적화가 가능했습니다9. 대조적으로, 쥐는 흉벽이 더 두껍고 호흡 운동이 더 커서 시술 중 안정적인 고해상도 영상을 복잡하게 만듭니다10.

고주파 초음파 기술의 발전으로 쥐에서 EGI가 가능해졌고 사용의 임상적 관련성이 향상되었습니다. 그러나 경색 부위의 좌심실 전벽(LVAW)이 얇아지는 것은 설치류에서 EGI의 주요 과제로 남아 있습니다. 쥐의 경우 벽 두께가 종종 1mm 미만으로 감소하는 반면, 표준 27G 또는 28G 바늘은 베벨 길이가 1.25-1.5mm이므로 심실 천공 또는 제대로 지시되지 않은 세포 전달의 위험이 증가합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 29G x 88mm 스피노칸 바늘을 사용하여 쥐에서 EGI 기술을 개선했습니다. 이 바늘은 경사 길이가 1mm이므로 경색 및 경색 주위 부위의 얇아진 심근에 세포를 정확하고 무외상적으로 전달할 수 있습니다. 이 절차는 고해상도 경흉부 심초음파를 사용하여 수행되므로 해부학적 랜드마크와 바늘 궤적을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

이 정제된 EGI 프로토콜은 LVAW 두께와 관계없이 급성 및 만성 MI의 쥐 모델에서 경색 주위 심근에 치료제를 표적으로 전달하기 위한 최소 침습적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이는 치료 효과를 달성하기 위해 중요한 부위인 실행 가능한 경계 구역에 주사하는 동시에 개흉 접근법에 비해 수술 부담과 회복 시간을 크게 줄입니다. 또한 반복 주사 및 후속 이미징을 포함하는 종단 연구를 지원하여 3R(Replacement, Reduction, Refinement) 원칙11에 따라 동물 수를 줄입니다. 이 프로토콜은 약리학적 제제, 유전자 치료제, 생체 재료 및 다양한 줄기 세포 유형의 전달에 적용할 수 있습니다. 쥐 모델에서 EGI를 표준화하고 임상 전달 양식과 연계함으로써 이 접근 방식은 실험실 전반에 걸쳐 재현성을 향상시키고 전임상 심장 연구의 중개 관련성을 강화합니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 UHasselt 지역 윤리 위원회(동물 실험 윤리 위원회, UHasselt, Diepenbeek, Belgium, ID202308 및 ID202497)의 승인을 받았으며 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다.

1. 장비 설정

  1. 초음파 영상 플랫폼, 통합 가온 플랫폼, 생리학 모니터링 장치 및 젤 워머를 켭니다.
    참고: EGI 시술 중 좌심실 전벽을 명확하고 충분히 자세하게 시각화하려면 약 75μm의 축 분해능을 제공하는 ≥ 15MHz 선형 어레이 변환기가 장착된 고주파 초음파 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 가슴 털을 제거하는 동안 쥐의 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 켜십시오.
  3. 적절한 변환기를 선택하고 3D 모터를 초기화하여 변환기의 전체 동작 범위를 보장합니다.
    알림: 동물의 플랫폼 난간 시스템의 마이크로 매니퓰레이터를 사용하는 것 외에도 3D 모터를 사용하면 매우 정밀한 변환기 조정이 가능하므로 필요할 때 주사 바늘과의 정렬을 용이하게 할 수 있습니다. 필요한 경우 3D 모터 없이 절차를 수행할 수도 있습니다.
  4. 이미징하기 전에 적절한 시스템 정렬을 확인하십시오. 동물 플랫폼을 제어하는 나사의 마이크로 매니퓰레이터를 중립 위치(즉, 전체 동작 범위 내에서 중앙)로 설정합니다. 동물 플랫폼 자체를 난간 시스템 중앙에 배치합니다. 변환기가 동물 플랫폼의 중앙 바로 위에 정렬되도록 변환기 장착 시스템을 배치합니다.

2. 동물 준비 및 마취

  1. 쥐의 체중을 측정하고 통증 완화를 위해 투여하는 데 필요한 부프레노르핀(0.04mg/kg)의 부피를 계산합니다.
  2. 마취 기계에 연결된 유도실에 쥐를 넣습니다. 2.5L/min의 유속으로 산소를 보충한 2% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
  3. 마취가 유도되면 쥐를 가열 패드에 옮겨 체온을 37 0.5 °C로 유지합니다. 쥐의 주둥이를 마취 시스템에 연결된 코뿔에 배치하여 적절한 마취를 유지하고, 적절한 진정을 보장하기 위해 필요에 따라 조정된 1-1.5L/min 산소가 보충된 1-3% 이소플루란의 일정한 흐름을 전달합니다.
  4. 쥐의 가슴을 면도하고 제모 크림으로 잔여 털을 제거하십시오. 제모 후 적절한 수술용 스크럽제(예: 포비돈-요오드)와 70% 에탄올을 번갈아 3회 반복하여 주사 부위를 소독합니다. 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과용 젤을 바르십시오.
  5. EGI와 관련된 불편함을 최소화하기 위해 미리 계산된 부프레노르핀 용량을 뒷다리에 근육 주사합니다.
  6. 가열 패드에서 초음파 영상 시스템의 동물 플랫폼으로 쥐를 옮깁니다. 플랫폼의 통합 노즈콘을 통해 일관된 마취 전달을 보장하여 1-1.5L/min 산소에서 1-3% 이소플루란의 일정한 흐름을 유지합니다. 쥐의 발을 플랫폼 전극에 고정하고 소량의 전극 젤을 도포하여 최적의 신호 품질을 보장합니다. 지속적인 체온 모니터링을 위해 직장 온도 프로브를 삽입합니다.
    참고: 생리학적 매개변수의 지속적인 모니터링은 이미징 및 주사 절차 전반에 걸쳐 필수적입니다. 쥐의 심박수(HR), 호흡수(RR) 및 체온은 마취 관련 합병증을 피하기 위해 허용 가능한 범위 내에 유지되어야 합니다. 일반적으로 HR은 250-400bpm 범위에 있어야 하는 반면 RR은 분당 최소 30회 호흡이어야 합니다. HR 또는 RR이 이러한 임계값 아래로 떨어지면 즉시 이소플루란 농도를 줄이고(예: 2-3%에서 1-2%로 낮추고) 동물이 적절한 위치를 유지하고 저체온증이 발생하지 않는지 확인하십시오. 매개변수가 목표 수준으로 돌아올 때까지 면밀히 모니터링하면서 점진적으로 조정해야 합니다.
  7. 이 단계에서 원하는 기준선 또는 주입 전 이미지를 획득합니다. 일반적으로 B-모드와 M 모드 모두에서 흉골주위 장축(PSLAX) 및 단축(SAX) 이미지와 4챔버 이미지가 기본 기능 및 해부학적 평가에 권장됩니다.
    참고: 일반 이미징은 그림 1A와 같이 시스템을 설정한 상태에서 수행할 수 있습니다. 주사 절차를 위해서는 동물 플랫폼을 재배치하고 그에 따라 변환기를 조정해야 합니다. PSLAX B 모드 이미징은 주입 중 안내에 사용되지만 이러한 이미지는 정확한 바늘 정렬이 필요하기 때문에 사후 기능 분석에 최적이 아닐 수 있습니다.

3. 심초음파 유도 심근내 주사 절차

참고: 이 시점부터 주입을 성공적으로 수행하려면 두 명의 작업자가 필요합니다. 작업자 A는 동물 플랫폼을 조작하고 실시간 심초음파 이미지를 모니터링하는 일을 담당하며, 작업자 B는 바늘과 변환기를 정확하게 정렬하기 위해 주입 마운트 뒤에 위치해야 합니다.

  1. 22G 가이드 바늘을 1mL 주사기에 부착하여 주입 시스템을 준비합니다. 가이드 바늘이 있는 주사기를 주입 마운트에 놓고 주입 클램프를 고정합니다.
    참고: 29G x 88mm 바늘은 피부와 근육층을 직접 뚫기에는 너무 유연합니다. 주입을 용이하게 하려면 가이드 바늘이 필요합니다.
  2. 트랜스듀서를 주입 마운트에 맞춰 바늘을 시각화할 수 있도록 합니다. 변환기 마운트를 사용하여 변환기 위치를 조정하고 고정 clamp, 필요한 경우 레일을 따라 사출 마운트를 회전하여 적절한 정렬을 달성합니다.
  3. 쥐를 움직이지 않고 변환기의 노치가 쥐의 오른쪽 어깨를 가리키도록 동물 플랫폼을 회전시킵니다(그림 1B-D). 이 설정을 통해 좌심실의 선명한 PSLAX B 모드 이미지를 얻을 수 있습니다. 가이드 바늘이 변환기의 동작 영역 내에 있는지 확인합니다. 잘못 정렬된 경우 사출 마운트를 변경하지 않고 3D 모터 시스템을 통해 변환기 위치를 조정하십시오.
  4. 올바른 바늘-변환기 정렬이 달성되면 동물 플랫폼 레일의 마이크로 매니퓰레이터 나사를 사용하여 이미징을 미세 조정합니다. 바늘과의 정렬을 유지하기 위해 변환기 위치를 유지하십시오. 이미지 품질을 최적화하기 위해 동물 플랫폼의 추가 회전 또는 변환이 필요할 수 있습니다.
  5. 경색 부위를 시각화합니다. 주사 부위의 타당성을 평가하기 위해 PSLAX B-모드 및 M 모드 이미징을 모두 사용하여 경색 범위, 국소 벽 움직임 및 벽 얇아짐을 평가합니다. 경색 코어를 나타내는 무운동 또는 심각한 저운동 영역을 식별하기 위해 16세그먼트 벽 운동 점수 접근 방식을 적용합니다.
  6. 경색 주위 영역을 식별하고 표적 주사 부위를 선택합니다. 확장기말 벽 두께가 1mm보다 큰 경색 코어에 인접한 저운동 영역을 선택하여 29G 바늘 베벨을 얕은 각도로 완전히 삽입할 수 있습니다.
  7. 레일 시스템을 사용하여 주입 마운트를 동물 플랫폼 쪽으로 전진시킵니다. 주입 마운트의 마이크로 매니퓰레이터 나사를 사용하여 바늘을 변환기의 정확한 중앙에 미세 정렬합니다.
    알림: 정확한 정렬이 중요합니다. 바늘이 변환기 중앙에 있지 않으면 주입 중에 보이지 않습니다.
  8. 피부에 구멍이 뚫릴 때까지 주입 마운트의 주입 마이크로 매니퓰레이터 나사를 사용하여 가이드 바늘을 전진시킵니다. 초음파 영상에서 바늘 끝이 보이는지 확인합니다. 바늘이 보이지 않으면 '주입' 마이크로매니퓰레이터 나사를 사용하여 바늘을 조심스럽게 집어넣고 3.7단계를 반복하여 재정렬합니다.
  9. 초음파 소프트웨어에서 바늘 가이드 기능을 활성화하여 바늘 궤적을 확인합니다. 가이드 바늘을 미리 결정된 대상 영역으로 전진시켜 바늘 경사를 좌심실 전벽(LVAW)에서 약 1-2mm 떨어진 곳에 배치합니다(그림 2A).
    알림: 과도한 출혈이나 심장 손상을 방지하기 위해 가이드 바늘로 심근에 구멍을 뚫지 마십시오.
  10. 바늘이 배치되면 작업자 A가 가이드 바늘을 바닥에서 단단히 안정시켜 초음파 화면에서 바늘을 지속적으로 시각화하도록 합니다. 동시에 작업자 B에게 주사기를 고정하는 클램프를 풀고 주사기를 제거한 다음 주사액 주사기를 준비하도록 요청합니다. 작업자 A에게 가이드 바늘을 고정된 상태로 유지하도록 지시합니다.
  11. 주사액이 들어 있는 주사기(작업자 B)에 29G x 88mm 바늘을 부착하고 주사기를 주사 마운트에 고정합니다. 고정 가이드 바늘을 통해 29G x 88mm 바늘을 수동으로 안내하고 필요한 경우 x축 평면(프로브의 왼쪽 또는 오른쪽)에서 마이크로 매니퓰레이터 나사를 사용하여 약간 조정합니다. 초음파에서 흉강에서 바늘 경사가 보일 때까지 수동으로 진행합니다.
    알림: 29G 바늘의 유연성으로 인해 흉강에 삽입하는 동안 구부러질 수 있습니다. 이를 최소화하기 위해 작업자 A는 바늘 샤프트의 외부 부분을 안정화하고 작업자 B는 바늘을 흉강으로 전진시킬 수 있습니다.
  12. 29G x 88mm 바늘이 가이드 바늘을 통과하여 초음파에서 보이게 되면 정밀도와 안전성을 높이기 위해 마이크로 매니퓰레이터 나사를 사용하여 LVAW의 심근으로 전진시킵니다. 바늘 경사가 심근 내에 완전히 위치하는지 확인합니다(그림 2B).
    알림: 심근벽 두께에 비해 29G 바늘의 경사가 상대적으로 길기 때문에 전체 경사가 심근 내에 내장되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 '이미지 고정' 기능을 사용하여 배치를 확인합니다. 초음파 깊이 보정이 정밀도에 도움이 될 수 있지만, 이 프로토콜에서는 확장기말 벽 두께가 >1mm인 주사 부위를 선택하고 바늘 끝이 심내막 경계에 접근하지만 위반하지 않음을 육안으로 확인하여 깊이를 확인했습니다(그림 2B).
  13. 주사액을 심근에 천천히 주입합니다(작업자 B). 성공적인 심근내 주사는 LVAW와 동시에 움직여야 하는 주사 부위의 밝고 조밀한 에코 발생 지점에 의해 육안으로 확인됩니다(그림 2C). 주사액의 역류를 최소화하려면 주사 완료 후 약 10초 동안 기다렸다가 바늘을 집어넣으십시오.
  14. 먼저 바늘에 찔린 부상의 위험을 최소화하기 위해 주사 마운트에서 바늘이 달린 주사기를 제거합니다. 다음으로, 동물 플랫폼에서 쥐를 조심스럽게 제거하고 가열 패드에서 회복되도록 합니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지 중요한 매개변수를 지속적으로 모니터링합니다.

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결과

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생체 내 및 생체 외 생물발광 이미징(BLI)에 의한 주입 정확도 검증
EGI의 성공과 효율성을 평가하기 위해 먼저 줄기 세포를 형질도입하여 렌티바이러스 벡터를 통해 반딧불이 루시페라제(Fluc)를 발현하여 생물발광 이미징(BLI)을 통한 생체 내 추적을 가능하게 했습니다. BLI는 사례의 86%에서 정확한 심근내 전달을 확인했습니다(n = 14). 그림 3A 는 인접한 흉강의 확산 발광으로 입증되는 지나치게 빠른 바늘 인출로 인한 부분 누출을 보여줍니다. 대조적으로, 완전히 성공적인 심근내 주사 후 좌심실 중간 정점 수준에서 강력하고 국소적인 Fluc 신호가 감지되었습니다(그...

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토론

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심근경색 후 심장을 회복시키는 재생 요법에 초점을 맞춘 전임상 연구가 진행됨에 따라 최적의 치료제 전달에 대한 장애물이 남아 있습니다12. 최소 침습 EGI 기술은 임상 경피적 전달을 더 잘 모방하고 동물 복지를 개선하며 종단 연구에서 반복 투여를 허용하기 때문에 개흉 접근법보다 점점 더 선호되고 있습니다 8,13. 그러나 쥐 모델에 대한 상세하고 표준화된 프로토콜은 부족하며 만성 경색 주위 영역에서 좌심실 전벽(LVAW)이 현저하게 얇아지면서 절차가 복잡해집니다14. 여기에서 우리는 신중한 절차적 개선을 통해 쥐 심근에서 EGI의 안전성, 정밀도 및 재현성을 크게 향상시켰습니다.

일반적인 예방 조치 및 중요한 단계<...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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형광 이미징에 도움을 주신 Kim Nijsten에게 감사드립니다. 이 작업은 플랑드르 혁신 및 기업가 정신(VLAIO) Baekeland 위임장(HBC.2021.0811)의 재정 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
21? MHz MX250 트랜스듀서후지필름 비주얼소닉스(FUJIFILM VisualSonics, Inc.)/Vevo 3100 시스템과 호환되는 고주파 초음파 변환기
3M 트랜스포어 수술용 테이프3분1527동물의 발을 동물 플랫폼에 고정하기 위해
아쿠아소닉  100 초음파 투과 젤파커 연구소 BV01-08최적의 이미지 품질을 위해 변환기와 동물 피부 사이의 적절한 음향 결합을 보장합니다.
Bupaq 0.3 mg/mL 개와 고양이용 주사용 용액리히터 제약 AG57446/4008통증 관리를 위해 투여되는 오피오이드 진통제(부프레노르핀)
이소플루텍  1000알리비라/이소플루란 기반 흡입 마취제 
멀티 보틀 젤 워머 230V파커 연구소 BV83-03-20 CE(LCD)초음파 젤을 체온으로 데워 동물의 불편함으로 인한 저체온증을 예방합니다.
Signagel 전극 젤파커 연구소 BV15-25생리학적 모니터링을 위한 신호 전도를 개선하기 위해 ECG 전극에 적용
스피노 칸 29G× 88MM브브라운4501900정밀한 심근내 주사를 위한 미세 게이지 바늘
Terumo 3액형 주사기(사전 연결된 피하 주사 바늘 포함)테루모 유럽 N.V.MDSS01S2516E심근으로의 제어된 전달을 위해 22G 가이드 바늘과 29G 주사 바늘을 장착하고 고정하는 데 사용됩니다.
THM150 생리 모니터링 장치후지필름 비주얼소닉스(FUJIFILM VisualSonics, Inc.)/시술 중 동물의 심박수, 호흡수, 체온과 같은 활력 징후를 모니터링합니다.
Veet Minima 퓨어레킷 벤키저/제모 크림 
베보 3100후지필름 비주얼소닉스(FUJIFILM VisualSonics, Inc.)/고해상도 초음파 시스템 
Vidisic 카보메룸 980 2mg/g 안과용 젤바우쉬 + 롬/각막 건조를 방지하기 위해 마취된 동물의 눈에 도포

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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