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방법 논문

쥐 채혈을 위한 안면 정맥 정맥 천자

2.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68776

⸱

2025년 9월 26일

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Dartmouth Geisel School of Medicine

이 논문에서

요약

여기에서는 란셋을 사용한 안면 정맥 천자를 통해 쥐 피험자의 최적화된 채혈 기술을 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 유세포 분석 평가와 함께 이 기술을 사용하여 형질전환, 선천성 및 리포터 균주의 세포 표현형을 특성화합니다. 혈청 사이토카인 분석 및 당뇨병 연구에도 적합합니다.

초록

이 논문은 란셋을 사용한 안면 정맥 정맥 천자를 통한 쥐 혈액 수집을 위한 최적화된 프로토콜을 제시하여 꼬리 정맥 및 후안와 샘플링과 같은 다른 일반적인 기술에 대한 신속하고 최소 침습적이며 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 이 기술은 마우스 표현형 분석, 혈청 사이토카인 분석 및 당뇨병 연구와 같이 반복 샘플링이 필요한 연구에 특히 유리합니다. 이 프로토콜은 효율적이고 최소한의 특수 장비가 필요하며 생쥐의 고처리량 세포 분석에 매우 적합합니다. 우리의 주요 응용 분야는 유세포 분석을 사용한 형질전환, 선천 및 리포터 마우스의 표현형을 분석하는 것이며, 여기에서 항체 염색 및 tdTomato 리포터 마우스로 입증되었습니다. 이 논문은 동물 준비부터 샘플 분석까지 전체 절차를 간략하게 설명합니다. 주요 단계에는 3mm 란셋을 사용한 채혈, 세포 용해, 염색 및 유세포 분석 프로파일링이 포함됩니다. 안면 정맥 천자는 윤리적 연구 관행을 지원하는 동시에 수집 효율성을 향상시킵니다. 이 실용적이고 적응 가능한 방법은 쥐 혈액 샘플링 및 세포 분석과 관련된 광범위한 실험 프로토콜에 적합합니다.

서론

효율적이고 재현 가능하며 최소 침습적인 채혈은 많은 쥐 연구, 특히 반복 샘플링이 필요한 연구에 필수적입니다. 이 프로토콜은 안면 정맥 정맥 천자를 사용하여 소량의 혈액을 수집한 후 적혈구 용해, 항체 염색 및 유세포 분석을 수행하는 간소화된 방법을 제공합니다. 이 워크플로는 기술적 복잡성을 최소화하면서 처리량이 많은 애플리케이션에 적합합니다.

안와 후 출혈이나 꼬리 정맥 절개와 같은 많은 채혈 방법은 열, 마취1 및 장기간의 취급 시간을 포함하는 절차가 필요할 수 있으며, 이는 동물에게 심각한 고통을 줄 수 있습니다2. 대조적으로, 란셋을 이용한 안면 정맥 정맥 천자는 윤리적이고 재현 가능한 실험 설계를 지원하는 간단하고 신속한 대안을 제공합니다. 이 방법은 마우스의 소량 혈액 샘플링을 위한 인도적인 대안으로 이전 연구에서 검증되었습니다3.

우리는 TdTomato 리포터 마우스 및 MD4-IgHEL 마우스를 포함한 형질전환 및 리포터 마우스의 면역 세포를 표현형화하여 이 방법을 설명합니다. 후자는 CD19 및 IgM 동종형인 IgMa에 대한 항체로 염색해야 합니다.

이 프로토콜은 혈액 세포 프로파일링을 위해 개발되었지만 적혈구 용해 단계를 생략하여 혈청 사이토카인 분석, 특이적 항체 검출 또는 포도당 측정을 포함한 다른 용도에 쉽게 적용할 수 있습니다. 전반적으로 이 기술은 데이터 품질과 실험 효율성을 향상시키는 동시에 동물의 고통을 최소화하므로 다양한 연구 응용 분야에서 광범위하게 유용합니다.

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프로토콜

생쥐는 AAALAC 인증 기관인 다트머스 히치콕 의과대학의 특정 병원균이 없는 환경에 사육되었으며 기관 동물 관리 및 이용 위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 사용되었습니다.

1. 재료 수집

  1. 각각 1.5mL의 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액(멸균수로 희석된 10X RBC 용해)이 들어 있는 5mL 배양 튜브를 준비합니다. 마우스당 하나의 튜브를 사용하십시오.
  2. 3mm 란셋 상자(마우스당 란셋 1개)를 모으십시오.
  3. 거즈 스펀지 한 상자(마우스당 거즈 스펀지 1개)를 모으십시오.
  4. 이송 피펫과 0.5mM EDTA가 포함된 1x HBSS가 포함된 50mL 원뿔형 튜브를 수집합니다(최대 20마리의 마우스에 충분).
    참고: 이 완충액은 용해 반응을 중지하는 데 사용됩니다. 완충액이 표현형 분석에만 필요하고 추가 다운스트림 분석이 아닌 경우 HBSS 대신 pH 7.2-7.4의 대부분의 중성 완충액을 사용할 수 있습니다.
  5. 얼음 양동이, 추가 1x RBC 용해 완충액, 추가 5mL 튜브 및 이송 피펫을 가져옵니다.

2. 마우스 및 튜브 라벨링

  1. 각 케이지 카드와 마우스에 각 튜브의 라벨에 해당하는 표현형 식별자로 라벨을 붙여 어떤 결과가 어떤 마우스와 상관관계가 있는지 구별하는 데 도움을 줍니다. 일반적으로 사용되는 식별자에는 튜브의 표시에 해당하는 생쥐 꼬리의 다양한 영구 마커 색상(예: 빨간색, 파란색, 녹색, 검은색)이 포함됩니다.
    참고: 표현형 분석을 위해 항상 제어 마우스를 포함하십시오. 리포터 마우스의 경우 음성 리포터 대조군이 있는지 확인하십시오. 형질전환 마우스의 경우, 야생형 마우스를 대조군으로 포함한다.
  2. 채혈 직후 튜브를 보관할 수 있도록 라벨이 붙은 튜브를 근처에 얼음 양동이가 있는 랙에 배치합니다.
  3. 절차에 필요한 모든 란셋을 엽니다.
  4. 절차에 필요한 모든 거즈 스펀지를 엽니다.

3. 마우스 취급 및 샘플 수집

  1. 주로 사용하는 손을 사용하여 마우스의 꼬리를 잡고 와이어 공급 선반이나 평평한 표면에 놓습니다.
  2. 주로 사용하지 않는 검지와 엄지손가락을 사용하여 꼬리에서 경추 부위를 향해 움직여 마우스를 쥐어마 쥐어짜십시오.
  3. 나머지 손가락을 사용하여 꼬리를 고정하고 마우스 움직임을 최소화합니다.
  4. 주로 사용하는 손을 사용하여 열린 3mm 란셋을 회수합니다.
  5. 입 바로 너머에 있는 작은 털이 없는 부분을 찾아 귀 쪽으로 직선을 그립니다. 선이 눈의 바깥쪽 모서리와 교차하는 곳에서 멈춥니다(그림 1).
  6. 충분한 혈액 공급을 보장하기 위해 이 교차점에 란셋을 삽입하십시오.
  7. 란셋의 평평한 측면 가장자리를 사용하여 혈액 한 방울을 수집합니다.
  8. 혈액 샘플과 함께 전체 란셋을 RBC 용해 완충액이 들어 있는 라벨 튜브에 넣습니다.
  9. 튜브를 부드럽게 저어 전체 샘플이 완충액에 혼합되도록 합니다. 혼합이 불완전하면 응고 및 데이터 품질 저하가 발생할 수 있습니다.
  10. 거즈 스펀지를 사용하여 천자 부위에 5-10초 동안 부드러운 압력을 가합니다.
  11. 마우스를 새장으로 되돌립니다.
  12. 혈액 대 용해 완충액 비율을 1:10 이상으로 유지합니다.
  13. 각 추가 마우스에 대해 이 섹션의 단계를 반복합니다.

4. 샘플의 용해, 준비 및 분석

  1. 용해 시작 후 7-10분 동안 기다렸다가 약 2mL의 1x HBSS를 0.5mM EDTA(또는 기타 배지)와 함께 첨가합니다.
  2. 튜브를 400g에서 5분 동안 원심분리 합니다. 이 시간 동안 항체 칵테일을 준비하십시오.
  3. 상청액을 버리십시오.
  4. 겸자를 사용하여 튜브에서 란셋을 제거합니다.
  5. 원하는 세포 집단을 식별하도록 설계된 항체 칵테일 30μL를 추가합니다.
    참고: MD4 IgHEL 마우스의 표현형을 분석하기 위해 당사의 칵테일은 HBSS 1mL, IgMa PerCP cy-5.5 25μL 및 CD19 APC 25μL로 구성되었습니다.
  6. 2-3초 동안 소용돌이를 일으켜 세포를 재현탁하고 4°C에서 25-30분 동안 배양합니다.
  7. 유세포 분석기를 켜고 실험의 필요에 맞게 유동 플롯을 구성합니다.
    참고: 목표가 표현형 분석인 경우 염색 후 세포를 회전시킬 필요가 없습니다.
  8. 이송 피펫을 사용하여 각 샘플에 150-25μL의 HBSS 또는 기타 배지를 추가합니다. 필요한 경우 DAPI를 1.μg/mL의 최종 농도로 첨가할 수 있습니다(DAPI 함유 배지 10μL 사용).
  9. 획득 직전에 각 샘플을 2-3초 동안 소용돌이치게 합니다.
  10. 용해가 효과적인 경우 100,000 세포를 목표로 8,000-10,000 events/s의 데이터를 수집합니다.
  11. 그림 2 및 그림 3에 표시된 대로 수집된 데이터를 분석합니다.

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결과

유세포 분석을 사용하여, 그림 2 는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 준비된 야생형(WT) 및 PF4-Cre TdTomato 리포터 마우스로부터 용해된 혈액을 보여줍니다. 첫 번째 흐름 플롯 세트는 셀 세분성을 반영하는 측면 산란(SSC)과 셀 크기를 나타내는 순방향 산란(FSC)을 표시합니다. 세포 파편과 혈소판은 축의 기점 근처에서 관찰되는 반면, 림프구는 더 세분화된 호중구에 비해 작게 보입니다. 파편과 살아있는 세포 사이의 뚜렷한 분리는 효과적인 적혈구 용해와 양호한 샘플 무결성을 나타냅니다. 리포터 마우스는 FSC(Forward Scatter)에 대한 형광 강도(리포터 채널로부터)를 플로팅하여 평가할 수 있습니다. 그림 2에서 예상한 바와 같이, PF4-Cre 마우스는 WT 마우스와 달리 세포 ...

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토론

이 최적화된 안면 정맥 채혈 프로토콜은 꼬리 정맥 또는 안와 후 출혈과 같이 일반적으로 사용되는 다른 방법에 대한 효율적이고 간단한 대안을 제공합니다. 프로토콜은 간단하고 간단하지만 몇 가지 중요한 단계를 주의 깊게 따라야 합니다. 올바르게 실행하기 위한 가장 중요한 단계는 천자 부위4의 올바른 배치입니다. 뺨의 적절한 위치를 목표로 삼으면 마우스의 고통을 최소화하면서 충분한 혈류가 보장됩니다. 혈액 샘플을 사전 냉각된 용해 완충액에 즉시 증착하는 것도 응고를 방지하고 세포 무결성을 보존하는 데 필수적입니다. 용해된 샘플을 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하는 것은 분석을 위한 생존 세포의 적절한 분리 및 회수를 위해 중요합니다.

수년간의 사용에 걸쳐 데이터 품질과 재현성을 향상시키기 위해 몇 가지 개선 사항이 도입되었습니다. 절차 전반에 걸쳐 모든 배지와...

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공개 사항

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 국립 보건원 보조금: R35 HL155458(CVJ)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APC 항마우스 CD19 항체바이오레전드152410CD19 장갑 운반
원심분리기 5810 R, 로터 없음, 120 V, 50/60 Hz에펜도르프22625501원심분리기
Dermacea 거즈 스펀지 8겹 2" x 2"코비디엔441211과즈 퐁
일회용 점차 이송 피펫피셔브랜드오전 13-711-91트랜스퍼 피펫
ErgoOne 싱글 채널 피펫 (200 & micro; L)USA 사이언티픽7100-2200피펫
에틸렌디아미네테트라아세트산 (0.5 M 용액/pH 8.0)피셔브랜드BP2482-100EDTA 5 M  그리고 nbsp;
FACSymphony A3 셀 분석기BD 생명과학660937플로우 사이토미터
피셔브랜드  아날로그 보텍스 믹서피셔브랜드02-215-414소용돌이
골든로드 동물 란셋 3mm 멸균 5개 트레이 200개골든로드GR 3MM란셋 3mm
그라페 겸자파인 사이언스 툴즈11051-10겸자
행크' s 균형 잡힌 소금 용액, 칼슘과 마그네슘 없이 1X코닝21-021-CVRHBSS
PerCP/시아닌5.5 안티마우스 IgMa  항체바이오레전드408612IgMa PerCP cy-5.5
적혈구 용해 완충제 (10배)바이오레전드420301적혈구 용해 완충기
캡이 없는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관피셔브랜드FB1496110배양관
샤피 영구 마커, 끌 끝샤피38254페이지샤피  
USP 멸균수 검사 완료 및 nbsp;코닝25-055-CI세포 배양 등급 물
팁원 피펫 팁 리필 (200 & 마이크로; L 내추럴 베벨드USA 사이언티픽1111-1730피펫 팁

참고문헌

  1. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
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  4. Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
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