포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

유도성 유전자 발현 시스템과 같은 합성 생물학 도구는 생물학 연구에 상당한 기여를 했습니다. 조정 가능하고 가역적이며 정확한 방식으로 유전자 발현을 조절하는 능력은 단백질 생산 1,2,3,4,5,6, 세포 형태 7,8,9,10,11,12, 대사 경로 13,14,15의 제어를 향상시킬 수 있습니다^,16,17,18 및 바이오 제조 및 치료 응용을 위한 기타 표적. 화학적 유도성 시스템은 잔류^19,20 또는 표적을 벗어난 효과를 가질 수 있습니다. 화학 첨가제는 또한 매우 비싸고 추가적인 다운스트림 정제 공정으로 인해 산업적으로 확장하기 어려울 수 있습니다 21,22,23. 광유도성 유전자 발현 시스템은 바이오제조 관행을 위한 확장 가능하고 정확한 방법을 제공할 수 있습니다 24,25,26,27.

많은 광유도성 유전자 발현 시스템은 다양한 응용 분야(28,29,30,31,32,33,34,35,36) 및 청색(^35,37,38), 적색/원적외선 ^12,39의 파장에서 유용한 합성 생물학 도구로서 개발되어 왔으며,⁴⁰ 또는 녹색⁴¹ 표시등. CRISPR 기반 광유전학적 유전자 조절의 경우, 전달되는 개별 가이드 RNA(gRNA)의 양을 수정하면 내인성 유전자의 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있습니다^.42, 다양한 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44와 같은 트랜스활성화 단백질 또는 이들의 융합체⁴⁷도 사용할 수 있어 광유전학적 시스템의 모듈성을 증가시킬 수 있다. 복잡하고 얽힌 생물학적 경로 12,40,48,49,50,51,52,53을 조사하기 위해 이러한 알려진 구성 요소의 다양한 조합을 테스트할 수 있습니다. 또한, 상이한 세포주는 동일한 시스템⁽⁵²)으로 유도의 차이를 나타낼 수 있다. 유도 수준이 다르면 유전자 발현의 정밀한 제어에 있어 유전자 발현 또는 민감도가 불충분할 수 있으므로 새롭거나 생물학적으로 더 관련성이 높은 세포주에서 최적의 광유전학적 시스템을 찾기 위해서는 엄격한 테스트가 필요합니다. 광유전학적 유전자 조절의 속도가 빨라지고 적용 가능성이 확대됨에 따라 이러한 다양한 시스템을 신속하게 특성화하는 것이 필수적입니다.

광유전학적 도구를 특성화하는 현재 방법은 유전자의 안정적이거나 일시적인 발현을 사용합니다^12,54. 안정적으로 발현되는 세포주를 생성하고 최대 발현을 위해 시스템 역학을 최적화하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 일시적인 발현은 특히 다성분 광유전학 시스템을 테스트할 때 빠르고 가치 있는 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 크립토크롬 2(CRY2)와 크립토크롬 상호 작용하는 기본 나선 루프 나선 N-터미널(CIBN)으로 구성된 청색광 활성화 CRISPR-dCas9 이펙터(LACE)³⁷ 시스템을 사용했습니다. 이는 HEK293T(인간 배아 신장 세포)^37,38, CHO-DG44(차이니즈 햄스터 난소 세포)⁵⁵ 및 C2C12(마우스 근모세포 세포)³⁸과 같은 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 데 사용되었습니다. 모듈식 (modular) 특성은 일시적인 표현 및 높은 처리량 방법을 통해 시스템 성능을 신속하게 특성화하는 데 이상적입니다. 예를 들어, LACE와 같은 다성분 시스템은 유도를 개선하기 위해 질량비의 최적화가 필요할 수 있으며, 이는 일반적으로 광유전학적 시스템 특성화에 사용되지 않는 단계입니다.

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 LACE(2pLACE)³⁸ 시스템의 신속한 최적화 및 특성화를 자세히 설명합니다. 이 설정에서 2pLACE는 HEK293T 세포에서 형광 리포터인 eGFP(향상된 녹색 형광 단백질)의 발현을 제어합니다. 활성화는 Lukasz Bugaj와 동료들이 설계하고 구성한 96D 프린팅 LED 어레이인 OptoPlate-96을 사용하여 검은색 유리 바닥 3웰 플레이트에서 수행됩니다 56,57,58,59. 이 프로토콜은 특히 2-플라스미드 시스템의 서로 다른 질량 비율로 최대 발현을 최적화합니다. 또한 시스템 (tunability) 과 전체 동적 범위 (dynamic range) 를 조사하기 위해 다양한 광도를 제어하는 사용자 친화적 인 코드가 포함되어 있습니다. 유세포 분석은 데이터 수집 및 분석에 사용됩니다. LED 어레이를 위한 플라스미드 구조물 및 3D 프린팅 재료를 생성하기 위한 프로토콜은 이전 간행물^54,56에서 찾을 수 있습니다. 이러한 방법은 빛 유도성 유전자 발현 시스템을 특성화하기 위한 빠르고 처리량이 많은 파이프라인을 강조합니다.

1. 96웰 형식의 HEK293T 세포 도금

1. 생물 안전 캐비닛에서 표백제 폐기물 용기, 혈청학적 피펫, 피펫 보조기, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS), 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 Dulbecco 변형 Eagle's 배지(DMEM) 및 합류 HEK293T 세포가 포함된 T-75 세포 배양 플라스크를 수집합니다. 배지를 37°C로 예열합니다.
2. T-75 플라스크에서 도립 현미경을 통해 합류가 약 80%-100% 합류하는지 확인합니다.
3. 생물학적 안전 캐비닛에서 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 사용한 배지를 흡인합니다. 플라스크의 표면이나 플라스틱을 만지지 마십시오. 사용한 배지와 흡인기는 폐기물 용기에 폐기하십시오.
4. 약 10mL의 DPBS를 플라스크 모서리로 흡인하고 표면 주위를 부드럽게 휘젓어 세포를 부드럽게 세척합니다. 플라스크에서 DPBS를 흡인하고 세척제와 흡인기를 폐기물 용기에 버립니다.
5. 1.5mL의 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하여 플라스크 표면을 덮고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 플라스크를 가볍게 두드려 표면에서 세포를 풉니다.
6. 플라스크에 8.5mL의 신선한 DMEM을 추가합니다. 모든 응집체가 위아래로 흡인하여 분해될 때까지 혈청학적 피펫으로 세포를 재현탁하고 혼합합니다.
7. 9mL의 세포 현탁액을 15mL 원추형 튜브에 수집합니다.
   1. 플라스크에 9mL의 신선한 DMEM을 넣고 37°C 및 5%_CO2의 인큐베이터에 넣습니다.
8. 혈구계를 사용하여 부유 세포 10μL와 트리판 블루 염료 10μL를 1:1 비율로 혼합하여 세포 농도를 계산합니다. 이 값을 사용하여 플레이트에 시드할 수 있는 충분한 세포를 준비합니다.
9. 고성능 #1.5 검정색 96웰 유리 바닥판의 각 웰에 대해 100μL에 ~35,000개의 세포를 시드하고 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.

2. 2pLACE 형질감염 최적화

1. 1웰 및 10% 초과분의 경우 11μL의 따뜻한 무혈청 DMEM(SFM)을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다.
2. CRY2-eGFP 사용: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 및 9:1과 동일한 CIBN-gRNA 플라스미드 질량비, SFM의 분취량에 대한 총 DNA의 각 웰에 대해 110ng를 분취합니다(표 1).
3. 양성 대조군으로서, 동일한 질량의 CMV-eGFP 플라스미드를 SFM의 다른 분취량에 분취합니다.
4. 각 웰에 대해 형질감염 시약 희석을 위해 SFM 11μL를 분취합니다.
5. DNA와 형질감염 시약의 1:3 질량(μg) 대 부피(μL) 비율로 형질감염 시약을 준비합니다.
6. 희석된 형질감염 시약을 희석된 DNA에 첨가하고 실온에서 12분 동안 배양하여 형질감염 복합체를 만듭니다.
7. ~20 μL의 형질감염 복합체를 각 웰에 추가합니다. 우물 벽에 닿지 않도록 하십시오.
8. 플레이트를 알루미늄 호일로 싸서 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.

3. 2pLACE 활성화

1. 이러한 설정을 사용하여 원하는 웰을 조명하도록 마이크로컨트롤러 입력 코드를 수정합니다(보충 코딩 파일 1, 147 - 158행).
   1. LED 강도: 9.27mW/^cm2 (보충 코딩 파일 1, 200 - 215행).
   2. 펄스 길이: 1초(보충 코딩 파일 1, 280 - 290행).
   3. 펄스 주파수: 0.067Hz(15초마다)(보충 코딩 파일 1, 264 - 278행).
      알림: 파장 설정은 설치된 LED 유형에 따라 결정됩니다.
2. OptoPlate의 3D 프린팅 뚜껑에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 캐비닛에서 건조시킵니다.
3. 암실 빨간불 램프를 켜고 96웰 플레이트를 생물안전 캐비닛에 넣고 뚜껑을 건조된 3D 프린팅 뚜껑으로 교체합니다.
   참고: 형질감염 효율을 추정하기 위해 형광 현미경을 사용하여 선택적으로 CMV-eGFP 세포를 볼 수 있습니다.
4. 96웰 플레이트를 가져와 LED 어레이에 놓아 LED 어레이 장치를 구성합니다. 플레이트가 제자리에 고정되었는지 확인합니다.
5. 마이크로컨트롤러, LED 및 팬 포트를 전원에 연결합니다.
6. 70% 에탄올을 전선에 조심스럽게 뿌리고 물기를 닦습니다.
7. LED 어레이 장치를 37°C 및 5% CO₂ 에서 24시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이터가 밀봉되었을 때 LED가 의도한 대로 켜지고 전선이 팽팽하지 않은지 확인하십시오.

4. 유세포 분석 준비

1. 적색광 환경에 있는 동안 OptoPlate를 꺼내 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다
   참고: 선택적으로 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 광 유도를 시각적으로 확인할 수 있습니다.
2. 각 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 흡인합니다.
3. 30μL의 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리하고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
4. 단일 세포가 될 때까지 각 웰을 100μL 콜드 FACS 완충액(PBS의 1% FBS)과 혼합합니다.
5. 각 샘플을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.
6. V-바닥 96웰 플레이트를 실온에서 10분 동안 164 x g 으로 원심분리합니다.
7. 펠릿을 방해하지 않고 80μL의 상청액을 흡인합니다.
8. 200μL의 콜드 FACS 완충액을 첨가하여 펠릿을 재현탁합니다.
9. 가벼운 단열을 위해 V-바닥 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다.
10. 운송을 위해 접시를 얼음이 담긴 스티로폼 상자에 넣습니다.

5. 유세포 분석 게이팅 및 데이터 수집

1. 뒷면의 스위치를 사용하여 유세포 분석기를 켜고 컴퓨터에서 해당 유세포 분석 소프트웨어를 엽니다.
2. 시스템 시작 프로그램을 실행하고 샘플 로더에 2mL의 DI 물을 로드합니다(보충 그림 1A).
3. 제공된 QC 비드를 사용하여 품질 관리(QC)를 실행합니다(보충 그림 1B).
4. 유세포 분석기가 플레이트 샘플링 모드에 있는지 확인합니다(보충 그림 1C).
5. 샘플 웰을 설정하고 지정합니다(보충 그림 1D).
6. 다음 산점도와 표를 만듭니다(보충 그림 2A).
   1. 측면 산란(SSC-A) 대 전방 산란(FSC-A).
   2. SSC-H 대 SSC-A.
   3. SSC-A 대 FITC-A.
   4. FITC-A 통계 테이블(보충 그림 2B).
7. V-바닥 플레이트를 세포 분석기의 플레이트 로더에 끼웁니다.
8. 형질감염되지 않은 웰을 선택하고 초기화를 클릭한 다음 실행을 클릭합니다. 부피 샘플 속도가 10μL/min인지 확인합니다(보충 그림 2C).
9. SSC 및 FITC 전압을 조정하여 SSC-A 대 FSC-A 플롯에서 관심 모집단을 중앙에 배치합니다(보충 그림 2C).
   1. 관심 있는 건강한 세포 집단을 게이트하기 위해 다각형을 만듭니다(보충 그림 2D).
   2. SSC-H 대 SSC-A 플롯에서 이중항 판별을 위한 게이트할 다각형을 만듭니다.
   3. FITC 전압을 조정하여 형질감염되지 않은 세포를 SSC-A 대 FITC-A 플롯의 왼쪽에 배치합니다(보충 그림 2D).
10. 형질감염되지 않은 나머지 웰에 대해 반복하고 Mean FITC-A 데이터를 기록합니다.
11. 형질감염된 CMV-eGFP 웰을 선택하고 실행을 클릭합니다.
12. FITC 전압을 조정하여 SSC-A 대 FITC-A 플롯에서 자가형광 세포와 형광 세포를 모두 캡처합니다.
    1. 형질감염되지 않은 세포에서 초기 게이트를 참조하면서 형광이 없는 세포에 대해 형광 세포를 게이트하는 다각형을 만듭니다(보충 그림 2E).
13. 200초에 도달하거나 이벤트가 10,000에 도달할 때까지 60μL/min으로 샘플을 자동 기록합니다(보충 그림 2F).
14. Mean FITC를 CSV 파일로 내보내고 데이터를 분석합니다.
15. Daily Clean 옵션을 통해 유세포 분석기를 청소합니다(보충 그림 2G).

6. LED 강도 최적화

1. 마이크로컨트롤러 스크립트를 편집하여 원하는 LED 강도를 테스트합니다(보충 코딩 파일 1, 200-215행).
   참고: 마이크로컨트롤러 스크립트의 값과 관련된 동등한 LED 강도는^{다른 곳에서 보고됩니다 38}. 다른 LED를 사용할 때 자체 보정이 필요할 수 있습니다.
2. 스크립트에 표 2에 설계된 대로 (보충 코딩 파일 1, 200-215행)에 다음 값이 포함되어 있는지 확인하고 코드를 마이크로컨트롤러에 업로드합니다.
3. 1-5단계를 반복합니다.

이전 문헌 37,38,55의 워크플로 요소를 채택하여 OptoPlate-96의 고처리량 동시 조명을 추가하고 포유류 세포에서 광유도 유전자 발현 시스템을 신속하게 최적화하는 파이프라인을 시연했습니다(그림 1).

유도성 유전자 발현 시스템의 경우 높은 동적 범위는 절대 온 및 끄기(누출) 발현 외에도 중요한 성능 지표입니다. 형질감염된 세포의 형광 이미징을 통해 빛 활성화 세포와 어둠 속에 보관된 세포 사이의 eGFP 발현 차이를 정성적으로 관찰할 수 있습니다(그림 2). 1:9의 비율은 5:5의 비율에 비해 최대 eGFP 발현이 눈에 띄게 적습니다. 또한 5:5 비율에서 누출이 증가하는 것을 관찰할 수 있습니다. 구성적으로 발현되는 eGFP(CMV-eGFP) 형질감염 세포와 형질감염되지 않은 세포의 형광 이미징은 형질감염 효율성과 시스템의 유도 및 누출 발현을 각각 맥락화하는 데 유용한 양성 및 음성 대조군입니다. 형광 이미징을 사용하면 블루라이트로 유전자 발현의 성공적인 형질감염 및 활성화를 신속하게 확인하고 검증할 수 있어 유세포 분석 전에 귀중한 체크포인트를 제공할 수 있습니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 평균 형광 강도(MFI)와 동적 범위를 정량화할 수 있습니다.

세포를 빛 활성화한 후 FACS 완충액으로 준비하고 유세포 분석을 통해 분석합니다. HEK293T 세포는 약 11-15μm이므로 FSC 이득은 500이고 SSC 이득은 125(보충 그림 2C)로 건강한 세포 집단을 중심에 둡니다. 전압이 높을수록 건강한 세포 집단보다는 파편을 분석합니다. 우리의 실행은 첫 번째 모집단 게이트(P1)에서 일관되게 ~60% 이상의 이벤트를 가지고 있습니다(그림 3A-D). 건강한 세포 집단이 SSC-A 대 FSC-A 플롯에서 대부분의 사건을 구성하면 사건의 밀도를 확인하여 집단의 대부분을 식별할 수도 있습니다(보충 그림 3A). 그런 다음 SSC-H 대 SSC-A 플롯을 통해 이중항 식별을 수행할 수 있으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과에 매우 중요합니다60,61. 이 시스템에서 우리는 일반적으로 P1에서 게이팅된 이벤트의 95% 이상이 일중항임을 발견했습니다(그림 3A-D). SSC-A 대 FITC-A 플롯에서 형질감염되지 않은 세포는 일반적으로 플롯 중앙의 왼쪽에 있으며 인구 <0.1%)을 갖도록 게이팅됩니다(그림 3A). 그런 다음 eGFP 양성 세포가 형질감염되지 않은 샘플에서 비어 있던 게이트를 채워 MFI의 단일 세포 분석 측정을 초래합니다(그림 3B). 적절한 게이트와 전압을 설정하기 위해 음성 및 양성 대조군을 수집하면 동일한 게이트를 사용하여 2pLACE가 있는 샘플을 분석하여 자가형광 세포를 안정적으로 배제할 수 있습니다(그림 3C,D). 여기서, eGFP 양성 세포의 집단 비율은 CMV-eGFP의 경우 ~99%, 2pLACE 형질감염 세포의 경우 ~57%였습니다. 최종 게이트는 또한 PE-A 채널에서 사용하여 고형광 세포가 포획되도록 할 수 있습니다(보충 그림 3B).

테스트하기로 선택한 또 다른 비율은 3:7이었습니다. 검증 단계로, 유세포 분석 전에 형광 현미경 이미지를 촬영하고 CMV-eGFP보다 적은 것으로 예상되는 2pLACE로 eGFP 발현 유도를 위한 성공적인 형질감염을 관찰했습니다(그림 4A). 2pLACE의 유세포 분석 데이터를 수집한 후, 청색광 활성화 유전자 발현을 누출 유전자 발현과 비교할 수 있습니다(그림 4B). 3.1단계에 나열된 설정을 사용하여 현미경으로 정성적으로 볼 수 있는 증가된 형광 신호와 일치하는 청색광 활성화 후 발현이 ~3배 증가하는 것을 관찰할 수 있었습니다. 또한, 형질감염 효율은 건강한 단일 세포의 ~60%에서 % eGFP 양성 집단 또는 부모 비율을 측정하여 간접적으로 볼 수 있습니다(그림 4C).

이 프로토콜을 전체적으로 구현하면 최대 동적 범위 및 조정 가능한 표현을 위한 최적의 질량 비율(그림 5A)과 광도(그림 5B)를 식별할 수 있습니다. 6:4 미만의 질량비는 더 큰 동적 범위(3.5-4.5)를 나타낸 반면, 6:4 이상의 질량비는 배경 증가 및 최대 eGFP 발현 감소로 인해 동적 범위 감소를 나타냈습니다. 최대 표현과 높은 동적 범위 모두에 대해 3:7의 비율이 선호됩니다. 3:7 미만의 비율은 유사한 배수 유도를 보였지만 전반적인 최대 발현은 더 적었습니다. 이전에 보정된 광도 값38 (표 2)을 사용하여 다양한 광도에 대한 유전자 발현 수준을 특성화할 수 있습니다. 빛의 강도는 또한 MFI가 ~3mW/cm2에서 포화되는 eGFP의 발현 수준을 제어했습니다. 이 이상의 광도는 ~9 및 11mW/cm2에서 볼 수 있는 일부 샘플의 광표백으로 인해 다양한 MFI 값을 가질 수 있습니다.

그림 1: 광유전학적 시스템을 테스트하는 고처리량 실험의 일반 파이프라인. 세포를 검은색 96웰 플레이트에 24시간 동안 파종합니다. 그런 다음 세포를 DNA와 형질감염 시약의 12분 배양 기간으로 형질감염시킵니다. 형질감염 24시간 후, 블루라이트 활성화를 위해 플레이트를 OptoPlate-96 위에 놓습니다. 원하는 청색광 활성화 지속 시간 후, 세포는 유세포 분석을 위해 적색광 환경에서 준비됩니다. 유세포 분석 데이터는 어둠 속에서 또는 청색광으로 처리된 eGFP 양성 세포의 평균 형광 강도 그래프로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: HEK293T 세포에서 온 및 꺼짐 상태에서 2pLACE의 대표적인 형광 현미경 이미지. CRY2-eGFP: CIBN-gRNA의 다양한 질량 비율을 eGFP 발현 수준에 대해 테스트했습니다. 세포를 청색광(ON)에 노출시키거나 24시간 동안 어둠 속에 보관하였다(OFF). 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 형질감염되지 않은(UT), CMV-eGFP 및 2pLACE HEK293T 세포의 대표적인 유세포 분석 산점도. 유세포 분석은 플레이트 로더 기능을 사용하여 수행되었습니다. (A) HEK293T 세포는 전방 산란(FSC-A) 및 측면 산란(SSC-A)을 기반으로 게이팅되었습니다. SSC-A 대 FSC-A 플롯의 이벤트 농도는 등고선 플롯(보충 그림 3A)을 사용하여 시각화하여 건강한 모집단을 게이팅하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이중항 판별은 선형 게이트를 사용하여 SSC-H 대 SSC-A 플롯에서 수행되었습니다. 최종 플롯은 형질감염되지 않은 샘플을 참조하여 형광 세포를 게이트했습니다. (B) 세포는 (A)와 같이 게이팅되어 통계표에서 형광 집단 및 형광 강도를 표시했습니다(보충 그림 2B). (C,D) 2pLACE-형질감염된 세포는 P3 게이트를 통해 별도로 게이팅되었습니다. 자홍색 집단은 모든 eGFP 양성 세포를 나타냅니다(보충 그림 3B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: HEK293T 세포에서 빛 유도 eGFP 발현의 정성적 및 정량적 분석. (A) 2pLACE 또는 CMV-eGFP 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포의 형광 현미경 이미지. (B) 청색광 또는 어두운 조건에서 유지되는 세포에서 eGFP의 평균 형광 강도(MFI)의 정량화. (C) 유세포 분석 게이팅 분석을 통해 측정된 eGFP 양성 세포의 백분율. 게이팅은 형질감염되지 않은 세포의 <0.1%가 eGFP 양성 역치 내에 속하는 결과를 가져왔습니다. 유세포 분석 데이터는 평균값을 나타내고 오차 막대는 4개의 기술 반복실험의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 2pLACE 및 청색광 강도의 대표적인 질량 비율의 유세포 분석 . (A) CRY2-eGFP: CIBN-gRNA의 다양한 질량 비율을 HEK293T 세포에 형질감염시킨 다음 프로토콜의 3단계에서 보고된 것과 동일한 설정을 사용하여 청색광에 노출되거나 어둠 속에 보관했습니다. 각 조건은 3개의 생물학적 반복의 평균입니다. (B) 청색광 강도의 함수로서의 유전자 발현의 대표적인 추세. 각 조건은 6개의 기술 반복실험의 평균입니다. 평균 형광 강도는 eGFP를 발현하는 세포의 유세포 분석기 게이팅을 통해 정량화됩니다. 모든 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 플라스미드 비율의 경우, MFI 통계적 유의성은 플라스미드 비율의 밝음과 어두움을 비교하는 일원 요인 t-검정 을 사용하여 계산되었습니다. 빛 강도의 경우 어두운(OFF) 상태와 비교하여 일원 분산 분석과 Tamhane의 T2 사후 검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산했습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p <0.0001, *****p < 0.00001 및 ns는 유의하지 않습니다. 이 수치는 Garimella et al.38에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 예제 농도를 사용한 웰당 CRY2-eGFP 및 CIBN-gRNA 플라스미드의 양. 부피량은 웰당이며 실험에서 샘플 또는 반복실험의 수에 따라 수정할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 청색광 강도에 대한 권장 값. 코드는 보충 코딩 파일 1 (215-228행)에서 찾을 수 있습니다. 등가 강도 값은 광 파워 미터를 사용하여 이전에 보고된 교정 데이터를 사용하여 계산됩니다. 각 강도 수준에는 6개의 기술 반복실험이 있습니다. 행 G 및 H는 CMV-eGFP 및 형질감염되지 않은 대조군 웰을 위한 것입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 프로토콜의 5.1-5.5단계. (A) 시스템 시작 프로그램을 실행합니다. (B) 형광단 비드를 이용한 품질 관리 표준화. (C) 튜브 샘플링에서 플레이트 로더 모드로 전환. (D) 샘플 우물로 라벨링할 우물 선택; 이 예에서는 35개의 웰이 선택되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 프로토콜의 5.6-5.14단계. (A) 광산란 플롯 설정: 건강한 세포 집단 게이팅을 위한 FSC-A 대 SSC-A, 이중항 판별을 위한 SSC-A 대 SSC-H, 자가형광 및 eGFP 양성 세포 게이팅을 위한 SSC-A 대 FITC-A. (B) 평균 형광 강도를 측정하기 위해 FITC-A 데이터를 수집하기 위한 통계 테이블을 설정합니다. (C) 표시할 이벤트 탭에서 중지 규칙을 강조 표시합니다. 느린 샘플 유속을 확인하고, 플레이트를 배출 및 로드하고, 유세포 분석기 프로브를 초기화하고, 획득 전압을 조정합니다. (D) 그림과 같이 각 인구를 게이트하기 위해 다각형을 만듭니다. (E) 적절한 수의 우물을 추가합니다. (F) 설정 및 게이트가 완료되면 자동 녹화 를 클릭합니다. (G) 모든 샘플이 수집되고 통계를 내보낸 후 Daily Clean 을 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: P4(자홍색)의 녹색 이벤트로 시각화된 캡처된 게이트 내의 모든 세포의 검증. (A) eGFP 양성 모집단 게이트(P3) 내에서 건강한 모집단의 등고선 플롯. 세포는 주로 빨간색 영역에 집중되어 있으며 바깥쪽으로 감소합니다. (B) 게이팅 P4를 위한 SSC-A 대 PE-A 플롯, 모든 형광 이벤트가 FITC-A 플롯에서 설명되는지 확인하기 위한 추가 검사를 제공합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: 위의 프로토콜에 설명된 모든 속성을 구현하는 Arduino 코드의 예. 이 파일은 표 2의 권장 LED 강도 값을 사용하여 모든 LED 위치를 활성화합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.