방법 논문

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

DOI:

10.3791/68779

⸱

2025년 11월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

초록

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유도 유전자 발현 도구는 인간 건강 및 생명 공학 분야에서 새로운 응용 분야를 열 수 있지만 현재 옵션은 종종 비용이 많이 들고 되돌리기 어렵고 바람직하지 않은 표적 이탈 효과가 있습니다. 광유전학적 시스템은 빛 반응성 단백질을 사용하여 조절자의 활동을 제어하여 "스위치 플립"으로 발현을 제어합니다. 이 연구는 포유류 유전자 발현의 조정 가능하고 가역적이며 정밀한 제어를 제공하는 단순화된 광 활성화 CRISPR 이펙터(2pLACE) 시스템을 최적화합니다. OptoPlate-96은 단일 세포 분석 및 2pLACE의 신속한 최적화를 위해 유세포 분석을 통해 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 연구는 HEK293T 세포에서 OptoPlate-96과 함께 2pLACE 시스템을 사용하여 동적 범위를 최대화하기 위한 최적의 성분 비율을 식별하고 청색광 강도 반응 곡선을 찾는 방법을 보여줍니다. 다른 포유류 세포와 다른 광유전학적 시스템 및 빛의 파장에 대해 유사한 워크플로를 개발할 수 있습니다. 이러한 발전은 바이오 제조 응용 분야를 위한 광유전학 도구의 정밀도, 확장성 및 적응성을 향상시킵니다.

서론

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유도성 유전자 발현 시스템과 같은 합성 생물학 도구는 생물학 연구에 상당한 기여를 했습니다. 조정 가능하고 가역적이며 정확한 방식으로 유전자 발현을 조절하는 능력은 단백질 생산 1,2,3,4,5,6, 세포 형태 7,8,9,10,11,12, 대사 경로 13,14,15의 제어를 향상시킬 수 있습니다,16,17,18 및 바이오 제조 및 치료 응용을 위한 기타 표적. 화학적 유도성 시스템은 잔류19,20 또는 표적을 벗어난 효과를 가질 수 있습니다. 화학 첨가제는 또한 매우 비싸고 추가적인 다운스트림 정제 공정으로 인해 산업적으로 확장하기 어려울 수 있습니다 21,22,23. 광유도성 유전자 발현 시스템은 바이오제조 관행을 위한 확장 가능하고 정확한 방법을 제공할 수 있습니다 24,25,26,27.

많은 광유도성 유전자 발현 시스템은 다양한 응용 분야(28,29,30,31,32,33,34,35,36) 및 청색(35,37,38), 적색/원적외선 12,39의 파장에서 유용한 합성 생물학 도구로서 개발되어 왔으며,40 또는 녹색41 표시등. CRISPR 기반 광유전학적 유전자 조절의 경우, 전달되는 개별 가이드 RNA(gRNA)의 양을 수정하면 내인성 유전자의 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있습니다.42, 다양한 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44와 같은 트랜스활성화 단백질 또는 이들의 융합체47도 사용할 수 있어 광유전학적 시스템의 모듈성을 증가시킬 수 있다. 복잡하고 얽힌 생물학적 경로 12,40,48,49,50,51,52,53을 조사하기 위해 이러한 알려진 구성 요소의 다양한 조합을 테스트할 수 있습니다. 또한, 상이한 세포주는 동일한 시스템(52)으로 유도의 차이를 나타낼 수 있다. 유도 수준이 다르면 유전자 발현의 정밀한 제어에 있어 유전자 발현 또는 민감도가 불충분할 수 있으므로 새롭거나 생물학적으로 더 관련성이 높은 세포주에서 최적의 광유전학적 시스템을 찾기 위해서는 엄격한 테스트가 필요합니다. 광유전학적 유전자 조절의 속도가 빨라지고 적용 가능성이 확대됨에 따라 이러한 다양한 시스템을 신속하게 특성화하는 것이 필수적입니다.

광유전학적 도구를 특성화하는 현재 방법은 유전자의 안정적이거나 일시적인 발현을 사용합니다12,54. 안정적으로 발현되는 세포주를 생성하고 최대 발현을 위해 시스템 역학을 최적화하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 일시적인 발현은 특히 다성분 광유전학 시스템을 테스트할 때 빠르고 가치 있는 통찰력을 제공합니다. 여기에서는 크립토크롬 2(CRY2)와 크립토크롬 상호 작용하는 기본 나선 루프 나선 N-터미널(CIBN)으로 구성된 청색광 활성화 CRISPR-dCas9 이펙터(LACE)37 시스템을 사용했습니다. 이는 HEK293T(인간 배아 신장 세포)37,38, CHO-DG44(차이니즈 햄스터 난소 세포)55 및 C2C12(마우스 근모세포 세포)38과 같은 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하는 데 사용되었습니다. 모듈식 (modular) 특성은 일시적인 표현 및 높은 처리량 방법을 통해 시스템 성능을 신속하게 특성화하는 데 이상적입니다. 예를 들어, LACE와 같은 다성분 시스템은 유도를 개선하기 위해 질량비의 최적화가 필요할 수 있으며, 이는 일반적으로 광유전학적 시스템 특성화에 사용되지 않는 단계입니다.

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 LACE(2pLACE)38 시스템의 신속한 최적화 및 특성화를 자세히 설명합니다. 이 설정에서 2pLACE는 HEK293T 세포에서 형광 리포터인 eGFP(향상된 녹색 형광 단백질)의 발현을 제어합니다. 활성화는 Lukasz Bugaj와 동료들이 설계하고 구성한 96D 프린팅 LED 어레이인 OptoPlate-96을 사용하여 검은색 유리 바닥 3웰 플레이트에서 수행됩니다 56,57,58,59. 이 프로토콜은 특히 2-플라스미드 시스템의 서로 다른 질량 비율로 최대 발현을 최적화합니다. 또한 시스템 (tunability) 과 전체 동적 범위 (dynamic range) 를 조사하기 위해 다양한 광도를 제어하는 사용자 친화적 인 코드가 포함되어 있습니다. 유세포 분석은 데이터 수집 및 분석에 사용됩니다. LED 어레이를 위한 플라스미드 구조물 및 3D 프린팅 재료를 생성하기 위한 프로토콜은 이전 간행물54,56에서 찾을 수 있습니다. 이러한 방법은 빛 유도성 유전자 발현 시스템을 특성화하기 위한 빠르고 처리량이 많은 파이프라인을 강조합니다.

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프로토콜

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1. 96웰 형식의 HEK293T 세포 도금

  1. 생물 안전 캐비닛에서 표백제 폐기물 용기, 혈청학적 피펫, 피펫 보조기, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS), 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 Dulbecco 변형 Eagle's 배지(DMEM) 및 합류 HEK293T 세포가 포함된 T-75 세포 배양 플라스크를 수집합니다. 배지를 37°C로 예열합니다.
  2. T-75 플라스크에서 도립 현미경을 통해 합류가 약 80%-100% 합류하는지 확인합니다.
  3. 생물학적 안전 캐비닛에서 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 사용한 배지를 흡인합니다. 플라스크의 표면이나 플라스틱을 만지지 마십시오. 사용한 배지와 흡인기는 폐기물 용기에 폐기하십시오.
  4. 약 10mL의 DPBS를 플라스크 모서리로 흡인하고 표면 주위를 부드럽게 휘젓어 세포를 부드럽게 세척합니다. 플라스크에서 DPBS를 흡인하고 세척제와 흡인기를 폐기물 용기에 버립니다.
  5. 1.5mL의 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하여 플라스크 표면을 덮고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 플라스크를 가볍게 두드려 표면에서 세포를 풉니다.
  6. 플라스크에 8.5mL의 신선한 DMEM을 추가합니다. 모든 응집체가 위아래로 흡인하여 분해될 때까지 혈청학적 피펫으로 세포를 재현탁하고 혼합합니다.
  7. 9mL의 세포 현탁액을 15mL 원추형 튜브에 수집합니다.
    1. 플라스크에 9mL의 신선한 DMEM을 넣고 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣습니다.
  8. 혈구계를 사용하여 부유 세포 10μL와 트리판 블루 염료 10μL를 1:1 비율로 혼합하여 세포 농도를 계산합니다. 이 값을 사용하여 플레이트에 시드할 수 있는 충분한 세포를 준비합니다.
  9. 고성능 #1.5 검정색 96웰 유리 바닥판의 각 웰에 대해 100μL에 ~35,000개의 세포를 시드하고 37°C 및 5% CO2 의 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.

2. 2pLACE 형질감염 최적화

  1. 1웰 및 10% 초과분의 경우 11μL의 따뜻한 무혈청 DMEM(SFM)을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다.
  2. CRY2-eGFP 사용: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 및 9:1과 동일한 CIBN-gRNA 플라스미드 질량비, SFM의 분취량에 대한 총 DNA의 각 웰에 대해 110ng를 분취합니다(표 1).
  3. 양성 대조군으로서, 동일한 질량의 CMV-eGFP 플라스미드를 SFM의 다른 분취량에 분취합니다.
  4. 각 웰에 대해 형질감염 시약 희석을 위해 SFM 11μL를 분취합니다.
  5. DNA와 형질감염 시약의 1:3 질량(μg) 대 부피(μL) 비율로 형질감염 시약을 준비합니다.
  6. 희석된 형질감염 시약을 희석된 DNA에 첨가하고 실온에서 12분 동안 배양하여 형질감염 복합체를 만듭니다.
  7. ~20 μL의 형질감염 복합체를 각 웰에 추가합니다. 우물 벽에 닿지 않도록 하십시오.
  8. 플레이트를 알루미늄 호일로 싸서 37°C 및 5% CO2 의 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.

3. 2pLACE 활성화

  1. 이러한 설정을 사용하여 원하는 웰을 조명하도록 마이크로컨트롤러 입력 코드를 수정합니다(보충 코딩 파일 1, 147 - 158행).
    1. LED 강도: 9.27mW/cm2 (보충 코딩 파일 1, 200 - 215행).
    2. 펄스 길이: 1초(보충 코딩 파일 1, 280 - 290행).
    3. 펄스 주파수: 0.067Hz(15초마다)(보충 코딩 파일 1, 264 - 278행).
      알림: 파장 설정은 설치된 LED 유형에 따라 결정됩니다.
  2. OptoPlate의 3D 프린팅 뚜껑에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 캐비닛에서 건조시킵니다.
  3. 암실 빨간불 램프를 켜고 96웰 플레이트를 생물안전 캐비닛에 넣고 뚜껑을 건조된 3D 프린팅 뚜껑으로 교체합니다.
    참고: 형질감염 효율을 추정하기 위해 형광 현미경을 사용하여 선택적으로 CMV-eGFP 세포를 볼 수 있습니다.
  4. 96웰 플레이트를 가져와 LED 어레이에 놓아 LED 어레이 장치를 구성합니다. 플레이트가 제자리에 고정되었는지 확인합니다.
  5. 마이크로컨트롤러, LED 및 팬 포트를 전원에 연결합니다.
  6. 70% 에탄올을 전선에 조심스럽게 뿌리고 물기를 닦습니다.
  7. LED 어레이 장치를 37°C 및 5% CO2 에서 24시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이터가 밀봉되었을 때 LED가 의도한 대로 켜지고 전선이 팽팽하지 않은지 확인하십시오.

4. 유세포 분석 준비

  1. 적색광 환경에 있는 동안 OptoPlate를 꺼내 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다
    참고: 선택적으로 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 광 유도를 시각적으로 확인할 수 있습니다.
  2. 각 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 흡인합니다.
  3. 30μL의 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리하고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
  4. 단일 세포가 될 때까지 각 웰을 100μL 콜드 FACS 완충액(PBS의 1% FBS)과 혼합합니다.
  5. 각 샘플을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다.
  6. V-바닥 96웰 플레이트를 실온에서 10분 동안 164 x g 으로 원심분리합니다.
  7. 펠릿을 방해하지 않고 80μL의 상청액을 흡인합니다.
  8. 200μL의 콜드 FACS 완충액을 첨가하여 펠릿을 재현탁합니다.
  9. 가벼운 단열을 위해 V-바닥 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다.
  10. 운송을 위해 접시를 얼음이 담긴 스티로폼 상자에 넣습니다.

5. 유세포 분석 게이팅 및 데이터 수집

  1. 뒷면의 스위치를 사용하여 유세포 분석기를 켜고 컴퓨터에서 해당 유세포 분석 소프트웨어를 엽니다.
  2. 시스템 시작 프로그램을 실행하고 샘플 로더에 2mL의 DI 물을 로드합니다(보충 그림 1A).
  3. 제공된 QC 비드를 사용하여 품질 관리(QC)를 실행합니다(보충 그림 1B).
  4. 유세포 분석기가 플레이트 샘플링 모드에 있는지 확인합니다(보충 그림 1C).
  5. 샘플 웰을 설정하고 지정합니다(보충 그림 1D).
  6. 다음 산점도와 표를 만듭니다(보충 그림 2A).
    1. 측면 산란(SSC-A) 대 전방 산란(FSC-A).
    2. SSC-H 대 SSC-A.
    3. SSC-A 대 FITC-A.
    4. FITC-A 통계 테이블(보충 그림 2B).
  7. V-바닥 플레이트를 세포 분석기의 플레이트 로더에 끼웁니다.
  8. 형질감염되지 않은 웰을 선택하고 초기화를 클릭한 다음 실행을 클릭합니다. 부피 샘플 속도가 10μL/min인지 확인합니다(보충 그림 2C).
  9. SSC 및 FITC 전압을 조정하여 SSC-A 대 FSC-A 플롯에서 관심 모집단을 중앙에 배치합니다(보충 그림 2C).
    1. 관심 있는 건강한 세포 집단을 게이트하기 위해 다각형을 만듭니다(보충 그림 2D).
    2. SSC-H 대 SSC-A 플롯에서 이중항 판별을 위한 게이트할 다각형을 만듭니다.
    3. FITC 전압을 조정하여 형질감염되지 않은 세포를 SSC-A 대 FITC-A 플롯의 왼쪽에 배치합니다(보충 그림 2D).
  10. 형질감염되지 않은 나머지 웰에 대해 반복하고 Mean FITC-A 데이터를 기록합니다.
  11. 형질감염된 CMV-eGFP 웰을 선택하고 실행을 클릭합니다.
  12. FITC 전압을 조정하여 SSC-A 대 FITC-A 플롯에서 자가형광 세포와 형광 세포를 모두 캡처합니다.
    1. 형질감염되지 않은 세포에서 초기 게이트를 참조하면서 형광이 없는 세포에 대해 형광 세포를 게이트하는 다각형을 만듭니다(보충 그림 2E).
  13. 200초에 도달하거나 이벤트가 10,000에 도달할 때까지 60μL/min으로 샘플을 자동 기록합니다(보충 그림 2F).
  14. Mean FITC를 CSV 파일로 내보내고 데이터를 분석합니다.
  15. Daily Clean 옵션을 통해 유세포 분석기를 청소합니다(보충 그림 2G).

6. LED 강도 최적화

  1. 마이크로컨트롤러 스크립트를 편집하여 원하는 LED 강도를 테스트합니다(보충 코딩 파일 1, 200-215행).
    참고: 마이크로컨트롤러 스크립트의 값과 관련된 동등한 LED 강도는다른 곳에서 보고됩니다 38. 다른 LED를 사용할 때 자체 보정이 필요할 수 있습니다.
  2. 스크립트에 표 2에 설계된 대로 (보충 코딩 파일 1, 200-215행)에 다음 값이 포함되어 있는지 확인하고 코드를 마이크로컨트롤러에 업로드합니다.
  3. 1-5단계를 반복합니다.

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결과

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이전 문헌 37,38,55의 워크플로 요소를 채택하여 OptoPlate-96의 고처리량 동시 조명을 추가하고 포유류 세포에서 광유도 유전자 발현 시스템을 신속하게 최적화하는 파이프라인을 시연했습니다(그림 1).

유도성 유전자 발현 시스템의 경우 높은 동적 범위는 절대 온 및 끄기(누출) 발현 외에도 중요한 성능 지표입니다. 형질감염된 세포의 형광 이미징을 통해 빛 활성화 세포와 어둠 속에 보관된 세포 사이의 eGFP 발현 차이를 정성적으로 관찰할 수 있습니다(그림 2). 1:9의 비율은 5:5의 비율에 비해 최대 eGFP 발현이 눈에 띄게 적습니다....

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토론

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이 프로토콜은 포유류 세포에서 다성분 일시적 유전자 발현의 광유전학적 제어를 입증하여 다른 연구자들이 형광 리포터를 사용하여 모듈식 광유전학적 시스템을 신속하고 동시에 특성화할 수 있도록 합니다.

이 경우, 2-플라스미드 광유도 시스템은 HEK293T 세포에서 eGFP의 발현에 최적화되었습니다. 성공적인 공동 형질감염을 위해서는 최고의 형질감염 효율을 위해 파종 밀도와 질량비를 최적화하는 것이 필수적입니다. 이것은 컨플루언스가 분화를 유도할 수 있는 줄기 세포 배양에서 이를 구현할 때 특히 중요하며62,63,64 세포 배양이 균질하지 않은 경우 데이터 분석의 불일치를 초래할 수 있습니다. 세포의 줄기가 유지되는 경우, 배지 조성이 또한 세포

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공개 사항

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저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NASA 협력 협약 NNX16AO69A를 통한 중개 연구 연구소와 Good Foods Institute의 지원을 받습니다. 이 프로젝트는 NCI P30 CA093373(종합 암 센터) 및 S10OD018223(Beckman Coulter "Cytoflex" 세포 분석기)의 자금 지원으로 Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke 및 Ashley Karajeh의 기술 지원을 받아 UC Davis 유세포 분석 공유 자원 연구소의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리관VWR10025-724
10 mL 시약 저장소VWR77395-252
10 mL 혈청학적 피펫VWR75816-100
1000 & mu; L 필터 팁VWR76322-154
15 mL   고성능 원심분리관, 평평한 캡VWR89039-664
1931-C 광출력 계뉴포트1931-C
2mL 혈청학적 피펫VWR75816-104
20 & mu; L 필터 팁VWR76322-134
200 & mu; L 필터 팁VWR76322-150
50 mL 고성능 원심분리기 튜브, 평평한 캡VWR89039-656
96웰 V-바텀 플레이트브랜드 플레이트781661
A21, LED 빨간 전구블루스 전구해당 없음적색광원
아두이노 IDE 소프트웨어아두이노해당 없음
생명안전 캐비닛, 클래스 II누에어해당 없음
브라이트-라인 혈구계하우서 사이언티브3110
세포 카운팅 슬라이드바이오래드1450016
세포 배양 플레이트 96-웰, #1.5H 유리 바닥판셀비스P96-1.5 H-N
CytExpert 소프트웨어벡먼 쿨터해당 없음
CytoFLEX 일일 QC 형광구 사용 준비 완료벡먼 쿨터C657194 & deg; C
CytoFLEX-S 플로우 사이토미터 (보라색 4개, 파란색 2개, 노란 그린 4개, 빨간색 3개 채널)벡먼 쿨터C09766
둘벡코의 인산염 완충 식염수 분말, 칼리컴, 마그네슘 없음피셔 사이언티브21600069실내 온도
에펜도르프 원심분리기 5804에펜도르프그리고 nbsp; 022622501V-바닥판 원심분리기 단계
에펜도르프 원심분리기 5810R에펜도르프22625501
에펜도르프 리서치 플러스, 8채널, 가변 볼륨, 30 - 300 & 뮤; L에펜도르프3125000052
에펜도르프 리서치 플러스, 단일 채널, 가변 볼륨, 100 - 1000 & mu; L에펜도르프3123000063
에펜도르프 리서치 플러스, 싱글 채널, 가변 볼륨, 2 - 20 & 뮤; L에펜도르프3123000039
Eppendorf Research plus, 단일 채널, 가변 볼륨, 20 - 200 & mu; L에펜도르프3123000055
범용 실험실 라벨링 테이프VWR89097-920
Gibco DMEM, 분말, 고혈당피셔 사이언티브121000614 & deg; C
깁코 트리판 블루 용액, 0.4%피셔 사이언티브15-250-061실내 온도
Gibco Value Heat 비활성화 FBS피셔 사이언티브A5256901-20 & 도; C
Gibco, 트립신-EDTA (0.05%), 동물성 EDTA, 1X, 페놀 레드, 500 mL깁코25300062-20 & 도; C
HEK293T 셀ATCCCRL-11268-80 & 도; C, 액체 질소
실험실 마커, 마이크로노바VWR89205-944
금속 데스크 램프단순한 설계해당 없음빨간 불을 위한 램프
옵토플레이트-96LAB메이커해당 없음
피펫 보조 XP드럼몬드4-000-101
플라스미드: CIBN-gRNA해당 없음해당 없음-20 & 도; C
플라스미드: CMV-eGFP해당 없음해당 없음-20 & 도; C
플라스미드: CRY2-eGFP해당 없음해당 없음-20 & 도; C
폴리젯 DNA 시험관 형질전환 시약피셔 사이언티브NC15361174 & deg; C
T-75 세포 배양 플라스크VWR10062-860
워터 재킷 CO2 인큐베이터VWR10810-884

참고문헌

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